MOLEKULARNA MEDICINA
• Grana medicine koja razvija metode dijagnostike i tretiranja bolesti kroz razumijevanje razumijevanje funkcije gena, proteina proteina i drugih
molekula. Ova grana se zasniva na istraživanju koja pokazuju kako oređeni geni, molekule i celularne funkcije postaju postaju abnormalni u
različitim bolesnim stanjima 1
• Zdravlje i bolest ljudi iz molekularne perspektive • Razumijevanje, genoma, genske regulacije i ekspresije,
genetskog inženjeringa koji se moze koristiti u ijagnostici i terapiji
Povezanost gena, proteina i delijskih struktura i njihove • Povezanost funkcije
• Molekularna meicina se zasniva na istraživanjima i
objašnjava kako oređeni geni, molekule i delijske funkcije postaju abnormalne u bolesti (karcinom)
2
Nukleinske Nukleinske kiseline Struktura i uloge
Prof.. r. Prof r. Emina E mina Kiselja Kiseljakovid kovid
3
• Polimeri nukleotida
• Uloga nukleinskih kiselina – očuvanje i prenos genetičke informacije – biosinteza proteina
– katalitička funkcija • Uloga nukleotida u – metabolizmu,
– razmjeni materije i energije 4
• Nukleozid –N-glikozidi purinskih i pirimidninskih baza i riboze (deoksiriboze) –
• βN-glikozidna veza C-1’ šedera sa N1 pirimidinskih i N9 purinskih baza
• Nukleotid – fosfatni ester nukleozida • Esterifikacija OH grupe na C5’ ili C3’ kod ostatka riboze
5
• Polinukleotidi – povezivanje mononukleotida preko
fosfatnih grupa graedi fosfoiesterske veze
• Primarna struktura –redoslijed vezivanja nukleotida u polinukleotidni lanac.
• Sekundarna struktura – prostorna organizacija. Dva polinukleotidna lanca obavijena oko centralne ose
formirajudi vostruku spiralu. Polinukl. lanci postavljeni antiparalalno.
• Baze su unutar spirale i međusobno se komplementarno
vežu
6
PURINSKE baze
7
Građa nukleinskih kiselina • DNK
• RNK
• Šeder - deoksiriboza
• Šeder – riboza
• Baze: ACGT
• Baze: ACGU
• Dvostruki niz
• Jednostruki niz
• Hemijski stabilna
• Hemijski nestabilna
8
9
Dvostruka zavojnica nastaje zahvaljujudi vodikovim vezama između purinskih i pirimidinskih baza (AT parovi) i (GC parovi). Između AT parova veza je dvostruka, a između GC parova trostruka. Na svakih 10 nukleotida se formira obrtaj spirale.
• Kod eukariota organizacija DNK
molekula je nešto komplikovanija. DNK molekul je veoma ugačak, prosječno 2.5 metara.
• Način na koji je ovo mogude je
zahvaljujudi proteinima koji se zovu histoni
10
• Genom sarži nasljenu informaciju – uputstvo za funkcionisanje organizma.
• Osnovni nosilac “genetičke
informacije” izuzev RNK virusa. • Informacija “zapisana” u preciznom slijedu nukleotida
o kojih je građena DNK
• DNK se nalazi u jedru, a RNK u citoplazmi. Analizom difrakcije molekule DNK javlja se u tri forme.
Najzastupljeniji , fiziološki oblik je B.
molekula.
• Struktura i organizacija
omogudava najvažnije osobine: autokataliza (autoreprodukcija), heterokataliza (kontrola metabolizma) i mutabilnost (promjenljivost). 11
Semikonzervativna replikacija
5′ → 3′ 1000 nukleotida u sekundi!!
12
13
•leading strand se proužava u pravcu replikacione viljuške, jenostavnim oavanjem nukleotia u nizu prema rastudem 3′ kraju. •Suprotno, lagging strand, se proužava suprotno o replikacijske viljuške i sinteza novog lanca se vrši iskontinuirano, formirajudi kratke segmente koji se kasnije povezuju. DNA polimeraza
14
Helikaza – DNK enzim koji razdvaja strane dvostrukog heliksa Replikacija se ešava pomidu va mehanizma; 1. Kontinuirana sinteza : nakon što primaza doda kratki RNK prajmer, DNK polimeraza III dodaje nukleotide na 3′ kraj voedeg lanca. DNK polimeraza I potom zamijeni RNA prajmer sa DNK nukleotidima. 2. Diskontiunirana sinteza: primaza dodaje kratke RNK prajmere (zeleno) ispred 5′ zaostajudeg „lagging ” lanca. DNK polimeraza III dodaje nukleotide do prajmera dok se praznina ne popuni. DNK polimeraza I zamijeni RNA prajmer sa DNK nukleotidima, i DNK ligaza poveže kratke segmente
nukleotia na zaostajudem lancu.
A DNA replication fork. 15
CENTRALNA DOGMA GENSKE EKSPRESIJE Ekspresija informacija
koiranih u genima se vrši u dvije faze: transkripcija gdje RNK polimeraza katalizira
stvaranje iRNK čija je nukleotidna sekvenca gena komplemetarna sekvenci DNK; translacija u kojoj ribozomi sintetiziraju polipeptidni
lanac, čije aminokiselinska sekvenca oređena specifičnim rasporeom nukleotida u iRNK. 16
17
TRANSKRIPCIJA
18
Procesiranje mRNK (“splajsing”)
19
20
TRANSLACIJA aminoacil-tRNA sintetaza
peptidil transferaza
21
22
MEHANIZMI REPARACIJE DNK Preko 50 različitih enzima uključeno u popravak 1. direktni popravak – izravni obrat hemijske reakcije odgovorne za oštećenje DNA /reverzna reparacija 2. popravak izrezivanjem (ekscizijski popravak) oštedeni io DNK se enzimima izreže i ispravi ponovnim popunjavanjem ispravnim nukleotidima – popravak izrezivanjem baza – popravak izrezivanjem nukleotida – popravak krivo sparenih baza
3. rekombinacijski popravak – DIMER T-T – izopači DNK molekulu (2 Timina zajeno) – NUKLEAZA – izrezuje oštedeni io lanca – DNK POLIMERAZA – ispunjava izrezani dio novim nukleotidima – DNK LIGAZA – povezuje novi dio sa ostatkom DNK molekule
Tokom 24h više hiljaa oštedenja DNK; samo 0,1% se fiksira u genomu 23
24
Bolesti uzrokovane deficitnom reparacijom DNK Xeroderma pigmentosum - autosomno recesivno;
osjetljivost na UV zračenje. Na koži se javljaju pjege, zone atrofije i keratoze, prisutna fotofobija i konjuktivitis (1:250 000) Ataxia telangiectasia –autosomno recesivno
osjetljivost na rentgensko i UV zračenje. Promjene na koži, poremedaji imuniteta i ranom pojavom različitih tumora (1:30 000) Fanconijeva anemija - autosomno recesivno; osjetljivost na hemijsko-fizičke agense koji
ovoe o pojave ukrštenih veza DNK lanca. pancitopenija, mikrocefalija, mikroftalmija,
neostatak palca, urođene malformacije srca i bubrega; česta leukemija. (1:350 000). 25
•
Hereditarni nonpolipozni kolorektalni karcinom (HNPCC) je uobičajena
forma nasljenog kolorektalnog karcinoma Naslijeđuje se autosomno ominantno kao rezultat efektnog „defective mismatch repair (MMR)” proteina. HNPCC se javlja u 2-5% svih kolorektalnih karcinoma.
•
Kolorektalni karcinom kod pacijenata sa HNPCC se javlja u ranijoj dobi
života i karakterizira se povedanim rizikom za nastanak rugih karcinoma (endometrij, ovarij, abdomen hepatobilijarni trakt, pankresas, urinarni
trakt, prostata, koža it.
26
Mehanizmi naslijeđivanja; promjene genskog materijala - mutacije
27
Menelijansko naslijeđivanje Na osnovu tipa hromozoma na kome se nalaze geni koji
oređuju ispoljavanje neke osobine: • autosomno dominantno
• autosomno recesivno • vezano za X hromosom – dominantni i recesivno • vezano za Y hromosom
28
Autosomno dominantno (monogensko) • Dominantni alel oređuje sintezu nekog
•
proteina-ispoljavanja osobine i dovoljno prisutvo samo jednog dominantnog alela za fenotip. Potpuno dominantno naslijeđivanje-alel se isto ispoljava i u homo- i u heterozigotnom stanju Oba spola obolijevaju-ispoljavaju karakt.
• • Postojanje gena znači bolest, svaki
oboljeli obično ima oboljelog roitelja.
• Sposobnost uvrtanja jezika, Rh+ krvne grupe
• Ahonroplazija, policistična bolest •
bubrega, familijarna hiperholesterolemija Progerija
Vjerovatnoda • 50% oboljele djece 29
30
Osteogenesis Imperfecta Type I • Ekstremna fragilnost kostiju • Deficit sinteze kolagena koja vodi do abnormalnog formiranja
koštanog matriksa • Mutacije u COL1A1 ili COL1A2 ovoe o smanjene količine normalnog kolagena
Samo 25 % formiranog trostrukog heliksa kolagena je funkcionalno
Gain-of-function mutation is achondroplasia p.Gly380Arg
• Mutation in the fibroblast growth factor type 3 receptor (FGFR3) leads to Achondroplasia (a form of dwarfism)
• FGFR3 promotes differentiation of cartilage into bone. • Gain-of-function mutation constitutively activates the receptor causing premature conversion of the growth plate into bone.
Nepotpuno dominantno pokazuje
ominantni alel koji se različito ispoljava u homozigotnom i u heterozigotnom stanju
Vjerovatnoda za ispoljavanje autosomno dominantih osobina dva heterozigota
• 75% oboljelih • 25% zdravih • Marfanov sindrom • Huntingtonova bolesti • Polidaktilija, sindaktilija • Ahonroplastični patuljasti rast • Astigmatizam
Dominantni homozigot i zdravi partner daju 100% rizik ispoljavanja osobina 33
• Rijetko kongenitalno oboljenje – naslijeđuje se po tipu ominantno
autosomno, Incienca 4 u 100 000 živorođene jece • Sinaktilija, sreišnji rascjep šake ili stopala; aplazija/hipoplazija falangi metakarpalnih i metatarzalnih kostiju
Ectrodactyly lobster foot 34
Autosomno recesivno Recesivno oboljenje se ispoljava jedino ako je mutacija prisutna u oba genska alela (homozigot)
Vjerovatnoda • 25% normalni • 50% nosioci -zdravi • 25% oboljeli Oba spola obolijevaju
35
Urođene greške metabolizma i bolesti deponovanja:
Galaktozemija
Cistična fibroza Albinizam Bolest srpastih eritrocita
Vjerovatnoda • 50% nisu nosioci • 50% nosioci 36
Autozomno-recesivno nasledjivanje • Okulokutani albinizam
37
Dominantni alel za albinizam - B recesivni alel - b test – dva normala reditelja mogu imati albino dijete XBXb (Majka) XBY(Otac)
Ključ:
Normalni muški
Afektirani muški
Normalni ženski
Nosliac ženski
38
PRAVILA X-VEZANOG RECESIVNOG NASLEĐIVANJA
• 1. incienca oboljenja je znatno veda ko muškaraca muškaraca
nego ko žena (8:1) • 2. oboljeli sinovi obično imaju zrave majke, tako a po roičnom se i kod ovih osobina sredu prekii u poroičnom stablu
• 3. mutirani alel obijaju sve kderke o svog oca, ali ga ne ispoljavaju ispoljavaju
• 4. mutirani alel se nikaa ne prenosi sa očeva na sinove.
39
Naslijeđivanje vezano za X hromosom Recesivno – bolest se javlja kod
muškaraca sa mutiranim genom; veda incienca nego ko žena • žene nosioci mogu imati različitu fenotipsku ekspresiju
• • • • • •
Dushenn-ova muskularna distrofija Fabrijeva bolest Hemofilija A i B Daltonizam Fragilni X hromozom hromozom Vitamin D rezistentni rahitis dominantno 40
41
Dominantno • Jena kopija „oboljelog“ alela na X hromozomu
• Oba spola mogu biti pogođena • pogođeni muškarci sa normalnim suprugama imaju normalne sinove i sve
oboljele kderke • Oboljele majke- svaka trunoda 50%
šansa a potomak naslijei bolesni alel
• Muškarci imaju teže simptome nego
žene • Fenotipska ekspresija je uočena va puta češde ko ženskog nego muškog spola
42
Dominantno naslijeđivanje, primjer : •Vertikalna transmisija – svaka generacija je pogođena • Pogođeni roitelji imaju pogođenu i nepogođenu jecu X-vezano:
• pogođene samo žene • polovina ženske jece pogođena • očekuje se a polovina muške jece bue pogođena • GDJE SU? II:1 Philip Ward
III:1 Patricia
III:2 Victoria
I:1 Frank Bradley
II:2 Mary
III:3 William
IV:1 Gavin
IV:2 Alice
I:2 Edith
II:3 Joan
III:4 Alison
III:5 Lauren
IV:3 Sinead
II:4 William Severn
III:6 Wayne
II:5 Jayne
III:7 Sharon
III:8 Jason
• Ostala spolno vezana svojstva Recesivna svojstva: 1. Adrenoleukodistrofija (ALD) - poremedaj metabolizma
masnih kiselina u peroksisomima; nakupljanje ugolančastih masnih kiselina u tkivima 2. G6PD deficijencija - nedostatak enzima glukoza-6-fosfat
ehirogenaze važan za metabolizam, a ovoi o spontane hemolize eritrocita. 3. Menkesov sindrom (kinky hair syndrome) - dovodi do nedostatka iona bakra u organizmu; smanjen rast,
nerazvijenost živčanog sustava, blijea, rijetka i kovrčava kosa. 4. XLA (X- vezana agamaglobulinemija) - potpuni nedostatak
limfocita B pa uopde nemaju imunoglobulina u krvi (antitijela)
44
Naslijeđe vezano za Y hromosom Dlakavost ušiju Prenosi se sa očeva na sinove i nema prekia u poroičnom stablu Azospermija
45
Non-menelijansko naslijeđivanje • Mitohondrijalno naslijeđivanje • mtDNA se naslijeđuje preko majke na potomke jer se
mitohonrije naslijeđuju preko jajnih delija • Oboljenja koja se javljaju ko poremedaja na nivou mtDNK su “mitohonrijalne” bolesti koje obuhvataju neuromuskularne, promjene CNS-a
• Multifaktorijalno naslijeđivanje • ogovorno više gena, ne slijei Menelijanska pravila,
interakcija omadina i okruženja • Kongenitalna: poremedaji neuralne tube, rascjep usne i nepca, bolesti srca, KVB, DM 1 i 2, karcinomi dojke i kolona, astma,
alergije, šizofrenija, bipolarni poremedaj, autoimune bolesti 46
Mutacije • Promjene u molekularnoj strukturi pojedinih gena • sve nasljedne varijabilnosti imaju izvor u mutacijama
genetičkog materijala • Promjena sekvenci DNK u genomu • Mutacije se mogu naslijediti • Iznenana genska promjena koja nije naslijeđena o roitelja,
ali može biti naslijeđena • genska (tačkasta) mutacija rezultat je promjene nastale unutar jenog gena i može izazvati nastanak novog alela • Mutabilnost pojeinih gena varira, prosječno 10 -5
47
TIPOVI MUTACIJA • Hromozomske vs. Genomske • Somatske vs. Germinativne • Spontane vs. Inducirane
MOLEKULARNA OSNOVA GENSKIH MUTACIJA • • • •
do promjena u sastavu baza DNA dolazi na 3 načina: adicijom jenog ili više nukleotinih parova delecijom jenog ili više nukleotinih parova supstitucijom jednog nukleotidnog para drugim (tranzicija i transverzija) 48
TIPOVI MUTACIJA VELIČINA GENETIČKOG MATERIJALA • Genske - zamjena jednog nukleotida drugim, “point mutacije”, delecije i insercije • Hromozomske - obuhvataju vede ijelove hromozoma, čitave hrom. ili garniture hromozoma • Genomske - mutacije na nivou celog genoma
VRSTA PROMJENA • strukturne: 1. supstitucione: a) tranzicije, b) transverzije 2. delecije TRANZICIJA – Pu → Pu, ili Pi →Pi 3. duplikacije TRANSVERZIJA – Pu → Pi, ili Pi →Pu • rearanžmani gena: 1. unutar gena 2. broj gena po hromozomu 3. translokacije 4. inverzije 49
PORIJEKLO MUTACIJSKIH PROMJENA
• Spontane (greška pri replikaciji, bez poznatog razloga) • Indukovane
VRSTE I TIPOVI ĆELIJA • Somatske – promjene u somatskim delijama i ne prenose se na potomstvo • Germinativne –promjene na spolnim delijama i prenose se na potomstvo VRSTE PROMJENA • Dominantne- ispoljavaju se u heterozigotnom stanju • Recesivne – ispoljavaju se u homozigotnom stanju
PREMA JAČINI DJELOVANJA NA FENOTIP • tihe, neutralne, štetne, letalne
51
GENSKE MUTACIJE PREMA AKTIVNOSTI GENA I PROTEINSKIM PRODUKTIMA • samesense – zamjena baza u DNA tripletu koja ne mijenja redosljed aminokiselina u polipeptidu
• missense – promjena smisla – promjena u kodonu dovodi do ugradnje druge aminokiseline u polipeptidni lanac
• nonsense – besmislena mutacija - umjesto kodona za aminokiselinu nastaje prijevremeni stop kodon; protein je
skraden i ne obavlja funkciju • frameshift mutacija - aicijom ili elecijom jenog ili više nukleotia olazi o pomaka u okviru čitanja genske šifre na ribozom i sa tog mjesta prevođenje teče pogrešno
52
Posljedice missense mutacija zavise o tome gdje se desila; ako je u pitanju strukturni gen – aktivni centar enzima,
Efekti supstitucije
vjerovatno de se promijeniti stepen aktivnosti tog enzima Anemija srpastih eritrocita je posljedica mutacije u genu za β lanac hemoglobina jer se zamjene kodoni GAG (glutaminska kiselina) GTG (valin)
53
Frameshift mutacija izazvane delecijom jednog baznog para
Delecija jednog baznog para
54
Frameshift mutacija izazvane insercijom jednog baznog para
Insercija jednog baznog para
55
• TIPOVI MUTACIJA I DETEKCIJA • delecije: gubitak dijela gena; detekcija - test hibridizacije ili PCR metoda (npr. parcijalna delecija gena za distrofin kod
Duchenn i Becker mišidne istrofije) • duplikacije: dupliranje dela gena; detekcija - test hibridizacije ili PCR metoda
• tačkaste (point) mutacije – digestija sa restrikcijskim
enonukleazama, “Single-strand conformation polymorphism (SSCP)” promjena migracije mutirane sekvence gena pri elektroforezi u poliakrilamidnom gelu i sekvencioniranje
• ekspanzija trinukleotidnih ponovaka – neurološke bolesti
56
PODJELA MUTACIJA PREMA IZRAŽENOSTI • tihe mutacije - ne oražavaju se na fenotipu • neutralne mutacije - imaju benigni efekt (genski polimorfizmi
koji aju razlike u boji očiju ili kose kao i u osobinama ličnosti) • patogene mutacije - dovode o pojave bolesti ili čak smrti jedinke
57
SPONTANE MUTACIJE • rezultat grešaka tokom replikacije DNA; rijetke promjene -formiranje pogrešnog para
-spontana insercija ili delecija baza
• hemijske promjene u DNA molekuli -depurinacija
-deaminacija
INDUCIRANE MUTACIJE - promjene u DNA izazvane mutagenim tvarima (radijacija i hemikalije) - mogu biti opasne jer ošteduju genetički materijal svih živih organizama 58
HROMOSOMSKE MUTACIJE • predstavljaju veliku promjenu u genomu • mogu se odnositi na promjenu strukture ili broja hromosoma
TIPOVI STRUKTURNIH PROMJENA HROMOZOMA • delecije - nastaju gubitkom segmenta hromozoma; obično letalne, čak i u heterozigota • duplikacije – nastaju kada je neki segment prisutan više od 2 puta u diploida; najčešde zbog grešaka tokom “krosingovera” • inverzije – nastaju zbog preokreta u redosljedu gena nakon 2 loma u istom hromosomu
• translokacije –premještanjem segmenta s jenog hromosoma na nehomologni hromosom 59
PROMJENE BROJA HROMOSOMA • poliploidija - duplicira se čitav set hromosoma va ili više puta • aneuploidija - promjena broja pojedinih hromosoma u setu -najčešde nastaje zbog nerazvajanja kromosoma -obično rezultira abnormalnim fenotipom -stepen abnormalnosti zavisi od hromosoma u višku/manjku
• ko ljui može zahvatiti autosome ili spolne hromosome
60
