Guia Tercera Parte

Universidad Nacional de San Luis

Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia Departamento de Química

Area de Química Orgánica “Dr. Antonio T. D’Arcangelo”

QUIMICA ORGANICA II Licenciatura en Bioquímica Licenciatura en Biología Molecular GUIA DE ESTUDIO DIRIGIDO GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS MATERIAL COMPLEMENTARIO

- AÑO 2010 -

ANEXO

TABLAS DE ESPECTROSCOPIA FUNDAMENTACION TEORICA MINIMA DE LABORATORIOS

Química Orgánica II

Tablas IR - RMN

64


Tablas IR - RMN

65


Tablas IR - RMN

66


Tablas IR - RMN

67


EM. Fundamentos Teórico-Prácticos

Un rompecabezas en la Química Orgánica

Hasta ahora hemos aprendido a formular estructuras orgánicas con la información obtenida al perturbar la distribución electrónica (espectros UV-Visible), los niveles vibracionales rotacionales (espectros IR), o las orientaciones de spin de los núcleos de hidrógeno (espectros 1 H-RMN). Sin embargo, para nada usamos los de los átomos que constituyen una molécula orgánica. Al respecto, tratemos de dar una respuesta a las siguientes preguntas: a.- ¿Qué compuesto orgánico responde a 16 unidades de masas? El metano (CH4 ) y ningún otro. b.- ¿Qué compuesto orgánico responde a 32 unidades de masas? Rápidamente diríamos el metanol (CH 3OH), pero el etileno- d 4 (C2D4 ), el etano- d 2 (C2H4D2 ), la hidrazina (N2H4 ) y el silano (SiH4 ) tienen la misma masa nominal. c.- ¿Qué compuestos orgánicos responden a 60 unidades de masas? Entre otros mencionaremos al 1-propanol (CH 3CH2CH2OH), 2-propanol (CH3CH2OHCH3 ), fluoruro de alilo (FCH2CH=CH2 ), etilendiamina (H2NCH2CH2NH2 ), metiletiléter (CH3OCH2CH3 ), formiato de metilo (CH 3OCOH), ácido acético (CH 3COOH), urea (CO(NH2 )2 ), etc.. Vemos claramente que a medida que aumenta la masa del sistema, las posibles soluciones crecen fabulosamente, y la utilidad del peso molecular, como herramienta estructural, es sumamente pobre. Ahora bien, admitamos tener un rompecabezas, la condición preestablecida es que disponemos del número de masa total de la molécula. para el 1-propanol, y permítasenos sumar en forma parcial de acuerdo con la notación química, algunos fragmentos del mismo: CH3-CH2-CH2-OH CH3-CH2-CH2-O CH3-CH2-CH2CH3-CH2-

= = = =

60 59 43 29

CH3-CH2-CH2-OH -CH2-OH -OH

= = = =

15 45 31 17

Son soluciones los números: 60, 59, 45, 43, 31, 29, 17 y 15. Para el metiletiléter: CH3-O-CH2-CH3 CH3-O-CH2CH3-OCH3-

= = = =

60 45 31 15

-O-CH2-CH3 -CH2-CH3 -CH3

Son soluciones los números: 60, 45, 31, 29 y 15.

= = =

45 29 15



Para la urea: O H 2N

C

=

NH2

60

O H 2N

C

O H N

=

59

H N

H 2N

C

N

=

58

NH2

=

59

N

C

NH2

=

58

NH2

=

40

=

16

O

O H 2N

C O

O

C

H 2N

=

40

C

=

16

H2N

Son soluciones los números: 60, 59, 58, 40 y 16. Es decir, que en el caso de tener los números podemos diferenciar los tres compuestos de peso molecular 60. En forma simplificada, la es como el rompecabezas planteado, de donde se recibe información ponderal de las masas correspondientes a las moléculas y a sus fragmentos de demolición.

La espectrometría de masas (EM) no es una técnica espectroscópica en sentido estricto, puestos que no implica absorción de radiación electromagnética, y permite utilizar cantidades de muestra inferiores a los nanogramos (10 -9 gramos). En su forma más habitual, la muestra se introduce en el interior de una cámara de alto vacío (Esquema 1) donde se vaporiza y una pequeña cantidad de la misma penetra en la fuente de iones del espetrómetro. En este punto, las moléculas neutras (M) atraviesan un haz de electrones de elevada energía (70eV; 1600 kcal/mol), el impacto con estos electrones provoca que las moléculas se ionicen por pérdida de un electrón generando un catión radical (M +. ) denominado . La mayoría de las moléculas orgánicas sufren una única ionización. M molécula neutra

+

-

e (70 eV)

M

+

catión radical (ion molecular)

haz ionizante

Esquema 1

-

2 e



Una vez que han adquirido carga, los iones pueden ser acelerados a altas velocidades por acción de campos eléctricos, mientras que las moléculas no ionizadas permanecen en la cámara y son evacuadas por la bomba de vacío. Los iones acelerados entran seguidamente en un campo magnético en el cual sufren una deflexión que da como resultado una trayectoria circular. El radio de curvatura (R) de dicha trayectoria depende de la intensidad del campo magnético (H), y esta intensidad puede variarse para ajustar la curvatura de la trayectoria a la del analizador. De esta forma los iones pueden pasar por una rendija al colector donde son finalmente detectados y cuantificados. La intensidad del campo magnético necesaria para dirigir los iones a través de la rendija depende de la masa de estos. Por lo tanto a una determinada intensidad de campo magnético sólo los iones de cierta masa pasaran por la rendija del colector, los demás colisionaran con las paredes del interior del espectrómetro. Finalmente, la llegada de los iones al colector se traduce electrónicamente en una señal que queda registrada. "El espectro de masas es una representación de las señales de distinta relación masa - carga (m/z) en abscisas, frente a la intensidad de dicha señal en ordenadas". La intensidad es una medida del número relativo de iones (Abundancia) detectados para cada valor de m/z . Como normalmente sólo se generan especies de carga unidad ( z=1 ), m/z equivale a la masa del ion detectado. Las ecuaciones básicas que describen el comportamiento de un ión bajo las condiciones señaladas son: •

La energía cinética de un ión formado viene dada por la expresión:

•

La energía potencial del mismo cuando se acelera por un campo eléctrico:

En donde : = masa = velocidad

.

carga eléctrica = dif. de potencial

Es válido escribir: (1)

2 zV / m

donde vemos que la velocidad del ión formado es directamente proporcional a su carga y al potencial de aceleración e inversamente proporcional a su masa. Cuando dicho ión penetra en la zona del campo magnético ( H ), es válido indicar que la fuerza centrífuga será igual a la fuerza centrípeta, o sea: : intensidad de campo magnético

(2)

En donde radio de curvatura de la trayectoria del ión

Esta ecuación podemos escribirla: y remplazando el valor de en (1) tenemos: de donde: es la relación masa : car a

Vemos que para un cierto ión ( )siendo y constante, hay un radio de curvatura ; para un ión de masa mayor ( ) el radio de curvatura ( ) es mayor, o sea será Para poder “pesar” los iones en espectrometría de masas debemos ionizar la muestra. No podemos trabajar sobre especies neutras, pues ellas no pueden ser aceleradas. En general, al ionizar la muestra se forman tantos iones positivos como negativos. La experiencia ha



demostrado una mayor utilidad en el trabajo con los iones positivos, por eso los negativos son descargados y eliminados del sistema.

La espectrometría de masas no proporciona únicamente información sobre el ión molecular sino también sobre las unidades estructurales que lo forman. Dentro del espectrómetro, la sección destinada a elaborar los iones gaseosos recibe el nombre de “cámara de ionización” . La muestra orgánica en estudio, normalmente se vaporiza por un discreto calentamiento y condiciones de alto vacío (10 -5-10-6 torr, aproximadamente 10 -10 atm). En estas condiciones, las moléculas neutras al estado de vapor son transformadas en iones. El vapor es bombardeado por un haz de electrones provenientes de un filamento de tungteno a temperaturas del orden de los 2000°C y una energía de los electrones emitidos del orden de los 70eV (electrón voltios). Este sistema de ionización recibe el nombre de “fuente de impacto electrónico” . Como la energía del haz ionizante es muy superior a la requerida para romper los enlaces orgánicos normales, algunas moléculas ionizadas se rompen en todos los fragmentos posibles, tantos neutros como ionizados. Esta fragmentación da lugar a un número adicional de señales en el espectro de masas , todas ellas de masa menor que la del ión molecular del cual derivan. El pico más intenso del espectro recibe el nombre ó se denomina “pico base” y a su intensidad se le asigna el valor 100. Las intensidades del resto de las señales se representan en porcentajes respecto de la intensidad del pico base. El pico base de un espectro de masas puede ser debido al ión molecular ó a una fragmentación cualquiera . Por ejemplo, si (metano)es bombardeado con un haz electrónico de energía 10,95 eV, observamos en el espectro de masas un solo pico a 16 unidades de masa, correspondiente al peso molecular (Figura 1). En cambio, si se irradia con 70 eV el espectro del metano es el que aparece en la Figura 2.

Como se observa, la energía del haz electrónico es la suficiente para ionizar y fragmentar la muestra, de lo contrario la espectrometría de masas resultaría ser una técnica extremadamente costosa para determinar solamente el peso molecular. El espectro de metano (Figura 2) contiene



además del pico del ión molecular, picos correspondientes a las especies CH3+ ( m/z = 15), CH 2+. ( m/z = 14), CH+. ( m/z = 13) y C+. ( m/z = 12). Estas se forman a través de un esquema de fragmentación que se indica, cuya abundancia relativa, indicada por la altura de los picos en el espectro, da idea de la facilidad de su formación. Puede observarse que la ruptura o escisión del primer enlace C-H es relativamente fácil, el pico m/z 15 llega al 85% de la abundancia del ión molecular, que en este caso es el pico base. La ruptura o escisión de más enlaces C-H es progresivamente más difícil y los correspondientes iones presentan una abundancia relativa inferior.

Observando con detenimiento el espectro de masas de metano, hay un pequeño pico de 1,1% a 17 que se asigna a una especie (M+1) +.. ¿Cómo es posible tener un ión molecular que presente una unidad de masa adicional?. La respuesta reside en el hecho de que el carbono no es isotópicamente puro. Aproximadamente el 1,1% del carbono natural corresponde al isótopo de 13C, responsable del pico adicional. En el espectro de masas de etano, la altura del pico (M+1) +., a 31, es de aproximadamente un 2,2% de la del ión molecular. Este hecho se justifica estadísticamente. La probabilidad de encontrar un átomo de 13C en un compuesto que contenga dos átomos de carbono es el doble de la esperada para una molécula con un único carbono. Para un compuesto con tres carbonos sería el triple, y así sucesivamente. El espectro de masas de la estrona (una hormona estrogénica natural de 18 átomos de carbono), la altura del pico (M+1) +. es el 19,8% (18x1,1%) de la intensidad de M +. Una regla sencilla aplicable a moléculas orgánicas que no posean heteroátomos isotópicamente heterogéneos es que el pico (M+1) +. presenta una intensidad (respecto de M + ) del 1,1 x n %, donde n es el número de átomos de carbono de la molécula. Otros elementos presentan también distribuciones isotópicas:   

Deuterio 2H con una abundancia cercana al 0,015%; Nitrógeno 15N: 0,366%; Oxígeno 18O: 0,204%; 17O: despreciable.

Estos isótopos contribuyen también a la intensidad de los picos de masas superiores a M , aunque en menor proporción que el 13C. +.

El fluor y el yodo son isotópicamente puros. Sin embargo el cloro ( 35Cl: 75,53%, 37Cl:24,47%) y el bromo ( 79Br: 50,54%, 81Br:49,46%) existen como mezclas de dos isótopos y dan lugar a una distribución isotópica del ión molecular característica.



1-bromopropano, BrC 3H 7

El espectro de masas del 1-bromopropano (Figura 3) presenta dos picos de intensidades parecidas a 122 y 124, y un solo pico muy pequeño a 123 que corresponde a la suma de las masas atómicas promedio de los elementos en la tabla periódica. ¿Por qué?. La verdadera composición isotópica de la molécula es prácticamente una mezcla 1:1 de C 3H779Br y C3H781Br. De manera similar, los espectros de los monocloroalcanos presentan dos iones moleculares separados por dos unidades de masas en una proporción 3:1. ello se debe a la presencia de aproximadamente un 75% de R- 35Cl y un 25% de R- 37Cl. Estas distribuciones de señales son por demás útiles para diagnosticar la presencia de cloro o brono. En resumen: las moléculas pueden ionizarse por medio de un haz de electrones de 70eV que genera cationes radicales que se aceleran en un campo eléctrico y pueden separarse gracias a las diferentes trayectorias que experimentan en un campo magnético. En un espectrómetro de masas, este efecto se emplea para determinar la masa molecular. El ión molecular va normalmente acompañado de fragmentos de masa inferior y de picos debidos a la presencia de isótopos menos abundantes. En algunos casos, como ocurre en los compuestos con cloro y bromo, puede existir más de un isótopo en cantidades sustanciales.

Al recibir el impacto electrónico las moléculas . Los fragmentos resultantes pueden a su vez dar lugar a otros menores. . Las fragmentaciones (demoliciones del esqueleto molecular) pueden ser clasificadas como: 

de homólisis : X

Y

X

+ Y

Clivaje de una unión σ (sigma) con localización de un electrón en cada fragmento. Estos fragmentos no se detectan en espectrometría de masas. . 

de heterólisis : X

Y

X

+ Y

Química Orgánica II 


de hemi-hetrólisis : X

Y

X

+ Y

(Clivaje de una unión sigma ionizada) Notación para los iones en E.M.

Presentaremos algunos ejemplos: 

para el caso de etileno: H

H C

ó

C

H

H

H

H C

C

H

H2C

ó

CH2

H

Debe tenerse en cuenta que son más fáciles de remover los electrones π que los σ. 

Para etano:

H

H

H

C

C

H

H

H

ó

H

m/z = 30

H

H

C

C

H

H

H

ó

H

H

H

C

C

H

H

H

Consideramos solo la ionización del enlace Carbono-Carbono

m/z = 30

m/z = 30

La notación entre corchetes, si bien es muy utilizada no refleja la realidad pura, indica un total de 15 electrones sigma, mientras que las otras son algo más correctas al indicar solamente 13. 

Para benceno: +

ó

ó

+

ó

los electrones π son más fáciles de remover 

Para ciclohexanona : O

O ó



Para clorociclohexano: Cl

Cl ó

En los dos últimos ejemplos, los electrones n son los más fáciles de remover.



En espectrometría de masas, algunos tipos de compuestos podrán acomodar mejor que otros la carga positiva y tener así un tiempo de vida mayor. Normalmente esto se observa cuando dicha carga puede deslocalizarse. En consecuencia: cuanto mayor es la vida media, mayor es la abundancia (mayor intensidad del pico). Ejemplos: 

para 1,3-butadieno: Catión radical: (Notaciones mas correctas) ó

ó

Para las últimas estructuras hay posibilidad de deslocalización.



para benceno (como catión radical): ...............



para naftaleno: ............

............

La facilidad relativa de fragmentación puede comprobarse en los espectros de masas de los hidrocarburos isómeros n -pentano, 2-metilbutano y 2,2-dimetilpropano. En cada caso, el pico correspondiente al ión molecular ( m/z =72) es de poca intensidad, sin embargo, los espectros de los tres compuestos son muy diferentes (Figura 4).



El pentano presenta fragmentaciones indiscriminadas de enlaces carbono-carbono. Además de las señales del ión molecular se observa una señal a m/z = 57 (M-CH3 )+, seguida de otras que indican la progresiva pérdida de unidades CH 2, m/z = 43 (M-CH2-CH3 )+ y m/z = 29 (CH3-CH2 )+. Estas señales se encuentran rodeadas de grupos de otras de menor intensidad que indican la presencia de 13C (M+1)+. y la pérdida de hidrógenos: (M-1)+, (M-2)+, etc. C3H7+,

CH3+ ,

H 3C

H2 C

H2 C

H2 C

CH

M , C2H5+ ,

C4H9+ ,

El espectro de masas del 2-metilbutano presenta una distribución de fragmentos similar a la del pentano, sin embargo las intensidades relativas de los picos son distintas. Así hay una señal (M-1)+ de mayor tamaño a m/z =71 y otra muy intensa a (M-alquilo) + a m/z =57 y 43, debido a la relativa estabilidad de los cationes producidos por las fragmentaciones preferentes en el centro más sustituido situado en C-2


EM. Fundamentos Teórico-Prácticos CH3

CH3 CH

H3C

H2 C

H 3C

CH3

C4H9+ ,

C H

- C2 H 5

M ,

Carbocatión secundario estable por resonancia

C2H5+ ,

([M-CH3+])

La preferencia de fragmentación en carbonos sustituidos se acentúa, todavía más, en el espectro de masas del 2,2-dimetilpropano. En este caso, la pérdida de un radical metilo del ión molecular produce el catión 1,1-dimetiletilo ( ter -butilo) como pico base a m/z 57. Esta fragmentación se da tan fácilmente que el ion molecular apenas es visible. El espectro también presenta picos a m/z 41 y 29, resultado de reorganizaciones de carbocationes. CH3 H3C

C

CH3 H3C

CH3

CH3

- CH3

CH3

Carbocatión terciario muy estable por resonancia

C

M ,

La fragmentación de enlaces relativamente débiles es fácilmente observable en los espectros de masas de los haloalcanos. El fragmento iónico (M-X) + suele ser el pico base en los espectros de estos compuestos. Un fenómeno similar se observa en el espectro de masas de los alcoholes, que eliminan agua para dar un pico de elevada intensidad (M-H 2O)+. situado a 18 unidades de masas del ion molecular. Por ejemplo: veamos el E.M. del 1-butanol

H3C

H2 H C C H

CH2

H3C

H2 H C C

O

CH2

H3C

H2 H C C

CH2

O H

H

H

ó

- H2O

M ,

H3C

H2 H C C

CH2

[M-H2O] ,

Además, enlaces unidos al grupo carbinol también se disocian fácilmente por medio de un proceso denominado que conduce a hidroxicarbocationes estabilizados por resonancia:


EM. Fundamentos Teórico-Prácticos H 2 H2 C C

H3C

CH2 O

H2 C

H3C

CH2 +

CH2

H

H2C

OH

H2C

OH

OH

El intenso pico que se observa a m/z 31 en el espectro EM del 1-butanol se debe al catión hidroximetilo ( +CH2OH) que se genera por una fragmentación en α. También aparecen fragmentos como el ion propilio ( m/z 43) y el 2-propenilo ( m/z 41) que provienen de la fragmentación en α. H 3C

H 3C

H2 C

H2 H C C

C H

CH2

H C

CH3 + H2C

CH 2

CH2

O

O

H

H3 C

+

CH2

H2 C

H2C

H C

H3 C

CH2

CH2

H C

CH3

H

El esquema de fragmentación del grupo carbonilo resulta a menudo útil en la identificación de estructuras. Por ejemplo, los espectros de masas de las cetonas isómeras 2pentanona, 3-pentanona y 3-metil-2-butanona revelan unas fragmentaciones claras y muy características. La fragmentación en α vuelve a predominar dando lugar al correspondiente y a un . O fragmentación

fragmentación α

O

C

R

R´

C

O

R

C

O

- R´

- R

R

α

R

C

R´

C

O

Catión acilio

Los cationes acilio se forman con facilidad debido a la estabilización por resonancia. Dichos fragmentos proporcionan información valiosa sobre el tipo de grupos alquilo de la cetona.



a)

O b) a)

R + ´R

C

O

´R

C

O

R´ + R

C

O

R

C

O

C

R

b)

R´

En el espectro de masas de la 2-pentanona pueden observarse los dos picos procedentes de la fragmentación en α y además un fragmento adicional generado a partir de una transposición de Mc Lafferty que veremos más adelante. O

H3C

CH2

M ,

CH2

C

CH3 + H3C

H2C

H2C

CH3

CH3

CH2

CH2 +

H3C

C

O

C

O



Además de: H O

γ CH2

OH

CH2

β

+

CH2 H3C

C α H2

H3C

CH2

CH2

En el espectro de la 3-pentanona aparece una única fragmentación en α debido a la simetría de la molécula. El pico a m/z 29 se debe en parte al ión CH 3-CH2+ que se genera a partir del catión CH3-CH2CO+ por pérdida de CO. O C H3C

CH2

CH2 CH 3

CH 3 CH2 + H3C

H2 C

C

O

H3 C

H2C

M ,

C

O

- CO

CH3 CH2

En el espectro de la 3-metil-2-butanona sólo aparecen las dos fragmentaciones en α. CH3 O

CH3 CH + H3C

C

O

HC

C

C H3C

CH CH3

M ,

CH3

CH3 + H3C

O

H3C

CH3

CH C

O

CH3

- CO

CH3 CH CH3

Así es posible diferenciar fácilmente la 2-pentanona de la 3-pentanona, la fragmentación en α de la 2-pentanona da dos iones acilio a m/z 43 y 71, mientras que la 3-pentanona da uno a m/z 57. Sin embargo en el espectro de la 2-pentanona está presente un pico adicional de cierta intensidad a m/z 58, como consecuencia de la pérdida de un fragmento molecular (neutro) de peso m/z 28. “Este fragmento no se encuentra presente en ninguno de los espectros de los otros dos isómeros y es característico de la presencia de hidrógenos situados en posición γ (gamma)respecto del grupo carbonilo” .

Los compuestos que presentan la característica estructural de poseer hidrógenos situados en posición γ respecto del grupo carbonilo y además la suficiente flexibilidad para permitir que dichos hidrógenos se ubiquen próximos al carbonilo experimentan una fragmentación que se denomina transposición de .


R

EM. Fundamentos Teórico-Prácticos γ

H

HC

R

O

OH

CH

β

+

H2C

αC H

CH2

R'

H2C

R'

2

En esta reacción, el ión molecular de la cetona se fragmenta en dos, un fragmento neutro y un catión radical, a través de un proceso unimolecular. La transposición de McLafferty da lugar a un alqueno y a una forma enólica de una nueva cetona. En el caso de la 2-pentanona se produce etileno y el enol de la 2-propanona cuyo catión radical aparece a m/z 58. En rigor, la transposición de McLafferty la sufren compuestos insaturados de formula general: H A

D

donde , y pueden ser una combinación de carbono, oxígeno, nitrógeno y azufre.

C R'

B

El proceso implica ruptura del enlace alílico ( α-β ) y transferencia de Hγ al doble enlace ionizado. Por ejemplo: fragmentación del catión-radical del 1-penteno: H CH

CH2

HC

CH2

CH3 HC

CH2

+

CH2

CH2

C H2 H CH

CH2

HC

CH2 C H2

CH3 HC

CH2

+ CH2

CH2



Interpretar las fragmentaciones responsables de los picos marcados en los espectros de masas de pentanal, ácido pentanoico y pentanoato de metilo que se muestran a continuación.

Consideremos los compuestos con las siguientes fórmulas moleculares: C 7H14, C6H10O, C5H6O2 y C5H10N2. Todos poseen la misma masa nominal, es decir, el mismo número entero redondeado, y por lo tanto los cuatro deberían presentar un ion molecular a m/z 98. Sin embargo, las masas atómicas de los elementos están calculadas a partir de las masas de sus isótopos naturales, que no son números enteros. De modo que, si empleamos las masas atómicas de los isótopos de C, H, O y N más abundantes (ver tabla) para calcular la masa exacta de cada una de las fórmulas moleculares anteriores, observaremos diferencias significativas. 98,1096 : 1,00783 : 12,00000 : 14,0031

98,0732 : 15,9949 : 31,9721 : 34,9689

98,0368 : 36,9659 : 78,9183 : 80,9163

98,0845 Masas exactas de diversos isótopos habituales



Efectivamente, los modernos espectrómetros de masas de alta resolución son capaces de distinguir iones que difieren tan solo en unas pocas milésimas de unidades de masa. Por lo tanto, se puede determinar la masa exacta de cualquier ión molecular o fragmento iónico. Existen programas informáticos que comparan este valor experimental con los calculados para moléculas con masa aproximada al mismo valor entero y determinan cual de esas fórmulas se ajusta mejor a la masa observada.


Extracción de Cafeína

Trabajo Práctico de Laboratorio EXTRACCIÓN DE CAFEÍNA DEL TÉ Y SU PURIFICACIÓN La cafeína (1,3,7-trimetilxantina) es un un compuesto alcaloidal, que en la realización de este trabajo, se ha de extraer de las hojas de té. Se presentan a continuación algunas relaciones estructurales de cafeína con núcleos heterocíclicos fundamentales y su vinculación con otros compuestos íntimamente relacionados, asimismo se exponen algunas propiedades y usos de la misma . La cafeína pertenece al grupo de los “alcaloides de núcleo purínico”: N

N

6

1 2

N 5

7

4

9

8

3

N H

N

N

N

m-diazina ó pirimidina

N

H N

N

N

N H

m-diazol ó imidazol

Núcleo de Purina

El núcleo de purina (introducido por Emilio Fisher), del cuál se exponen arriba sus dos formas en equilibrio tautomérico, contiene los anillos de pirimidina y de imidazol. Las purinas, compuestos derivados de dicho núcleo son la clase más importante de compuestos conteniendo dos anillos heterocíclicos condensados. Derivados aminados y oxhidrilados de purina están ampliamente distribuidos tanto en animales como en plantas, ya sea en forma libre o combinados; así como ejemplo el conocido ácido úrico es la 2,6,8-trihidroxipurina. Si analizamos el núcleo de la purina por teoría de la resonancia : N

N

N

N

N

N

N N H

N

N

N H

N N

N H

N H

N N

N

N

H

N N

N

N

N

N

N N H

N H

Observamos que las posiciones 2, 6 y 8 son centros con déficit de electrones, por lo que son susceptibles de sustitución nucleófila.



aminados e hidroxilados, todos ampliamente distribuidos en la naturaleza (tanto en animales como en plantas), en forma libre o combinada. Como ejemplo tenemos:

La xantina, de la que se muestran dos formas tautoméricas, es la 2,6-dihidroxipurina: O

OH H N

N

HO

N

HN O

N

2,6-dihidroxipurina

H N

Xantina

N H

N

2,6-purinodiona

Las N-metilxantinas son importantes alcaloides, entre ellos encontramos cafeína, teofilina y teobromina. La cafeína (1,3,7-trimetilxantina) se encuentra presente en té ( Camelia sinensis), café (Coffea arabica), yerba mate ( Ilex paraguariensis), en hojas, semillas y frutos; como en muchas otras plantas. Este compuesto tiene acción estimulante sobre el sistema nervioso central (más activa que la de teofilina y teobromina), acción diurética y es cadioestimulante (actúa por estímulo directo del músculo cardíaco). La dosis efectiva de cafeína para un efecto estimulante es de 150 a 250 mg, que son los ingeridos en 1 ó 2 tazas de café o de té. Al ingerir cafeína se absorbe por vía intestinal y se distribuye muy rápidamente, siendo su tiempo vida media de 3-7 horas. La cafeína no se acumula en el torrente sanguíneo, ni el organismo la almacena, ya que es metabolizada



dimetilúrico que se degradan a urea eliminándose por orina, muchas horas después de haber sido consumida. Así en el organismo el 80 % se transforma en urea y el resto se excreta inalterada o parcialmente demetilada. La dosis fatal de cafeína ha sido de 10 g, pero ninguna muerte a causa de ella ha sido informada. Constituye un antídoto de barbitúricos. El uso de bebidas conteniendo cafeína se ha ido incrementando de tal manera que la producción de cafeína natural (obtenida de residuos de té, de productos secundarios de café descafeinado, de hollín del tostado de café, etc.) y sintética, en USA alcanza a varios millones de toneladas. Algunos contenidos de cafeína en productos de origen vegetal son aproximadamente: granos de café: 1,5 %; yerba mate: 1 %; hojas de té: 5 %. La teofilina (1,3-dimetilxantina) se encuentra principalmente en hojas de té. Tiene un carácter ácido más fuerte que el de fenol, y la sal resultante de la combinación de 8cloroteofilina con benadril (difenilmetil-dimetilaminoetíl éter) se conoce comercialmente como dramamina, droga utilizada para combatir mareos por movimientos. Se utiliza la teofilina como base libre o en sales dobles en angina pectórica, estados asmáticos y como diurético. La teobromina (3,7-dimetilxantina) se halla presente principalmente en el cacao (Theobroma cacao) en un 1,5-2 %; y en pequeñas cantidades en el café y en el té. Tiene uso como diurético. Se exponen a continuación las formulas de estos tres compuestos: O H3C

O

N

N CH3

Cafeína

O

CH3 N

H3C

N

O

O H N

N

N CH3

Teofilina

N

N

HN O

CH3

N

N

CH3

Teobromina

Relación estructura química - actividad farmacológica: Hay en estas tres Nmetilxantinas una gran correlación entre posición de los grupos metilos y las acciones farmacológicas. El grupo metilo (Me) de la posición 1 tiene acción estimulante sobre el sistema nervioso central; Me de la posición 3 acción diurética y Me de la posición 7 acción cardioestimulante. En cafeína, con tres metilos en posiciones 1, 3, 7 se dan las tres acciones.


Compuestos Heterocíclicos

Trabajo Práctico de Laboratorio

Reducci ón de acetofenona mediada por alcohol -deshidrog enasas dependientes de NAD(P)H - Anális is por CG-FID.

Las deshidrogenasas son oxido-reductasas, clasificadas como E.C.1.1.1. que catalizan la reducción de grupos carbonilos u oxidación de alcoholes. Los sustratos naturales de estas enzimas son etanol, lactato, glicerol, etc. y los correspondientes compuestos carbonílicos. Para exhibir su actividad catalítica, las enzimas requieren de coenzimas tales como NADH (E.C.1.1.1.1) o NADPH (E.C.1.1.1.2) a partir de los cuales transfieren el hidruro al carbono carbonílico del sustrato, o NAD(P)+ como aceptor de hidruro de un alcohol. La mayoría de las deshidrogenasas unen el cofactor en un dominio proteico conservado denominado pliegue de Rossman (Fig. 1), el cual consta normalmente de una hoja β paralela de 6 cadenas y 4 hélices α asociadas. El dinucleótido NAD se une en una conformación extendida a través de enlaces de hidrógeno y puentes salinos.

Figura 1. Cofactor NADH y pliegue de Rossman de la lactato deshidrogenasa.

Tanto el NAD+ como el NADH absorben radiación del espectro electromagnético en la zona del ultravioleta debido a que presentan en su estructura la base púrica adenina,


Compuestos Heterocíclicos

longitud de onda mayor de 339 nm. Esta diferencia en el espectro de absorción del ultravioleta entre la forma reducida y oxidada de la coenzima permite medir de manera simple y rápida la conversion de uno a otro estado de oxidación en ensayos enzimáticos con un espectrofotómetro a 340 nm. Existen cuatro patrones estereoquímicos que permiten la transferencia del hidruro desde el cofactor NAD(P)H al sustrato (Fig. 2). Con las enzimas E 1 y E 2 , el hidruro ataca por la cara si del carbonilo, mientras que con E 3 y E 4 , el hidruro se transfiere por la cara re, lo que resulta en la formación de los correspondientes ( R) y ( S ) alcoholes, respectivamente. Por otro lado, E 1 y E 3 transfieren el hidruro pro- R de la coenzima (deshidrogenasas del tipo A), y E 2 y E 4 utilizan el hidruro pro-S del anillo de nicotinamida (deshidrogenasas del tipo B).

cara cara

Figura 2. Esquema de la transferencia estereoquímica del hidruro a partir del NAD(P)H al carbono carbonílico de una cetona (S: sustituyente pequeño; L: sustituyente grande).

Dado que las alcohol deshidrogenasas se encuentran de manera ubicua en los organismos vivos, su actividad catalítica será evaluada en la reducción asimétrica de una cetona xenobiótica proquiral. Para ellos se emplearán raíces frescas de zanahoria, que como la mayoría de los sistemas celulares, satisfacen todos los requerimientos para el funcionamiento de la enzima y el reciclado del cofactor. El procedimiento de biotransformación es muy simple y resulta ser una alternativa al uso de levaduras de cerveza, dada la alta disponibilidad del material vegetal, uso de agua como medio de reacción sin el agregado de fuentes de hidrato de carbono y la simpleza del proceso de purificación y recuperación de productos, ya que no hay formación de espuma.


Cromatografía Gaseosa

Cromatografía gaseosa (CG) INTRODUCCIÓN La cromatografía Gaseosa (CG) es una técnica utilizada para la separación y análisis de mezclas de sustancias volátiles o que puedan transformarse químicamente de modo que reúnan esta condición. Los componentes básicos de un cromatógrafo de gases se muestran en la figura 1.

1 - Depósito de Gas y Controles de flujo / Presión. 2 - Inyector (Vaporizador) de la muestra. 3 - Columna Cromatográfica y Horno de la Columna. 4 - Detector. 5 - Amplificador de Señal. 6 - Registro de la Señal (Registrador o Computador).

Figura 1 - Esquema de un cromatógrafo de gases. La muestra es vaporizada e introducida en un flujo de un gas denominado fase móvil (FM), gas de arrastre o carrier. Este flujo de gas con la muestra vaporizada pasa por un tubo conteniendo la fase estacionaria FE (columna cromatográfica), donde ocurre la separación de la mezcla. La FE puede ser un sólido absorbente (cromatografía Gas-Sólido) o, más comúnmente, una película de un líquido poco volátil, soportado sobre un sólido inerte (cromatografía Gas-Líquido con Columna Empaquetada o Rellenada) o sobre la propia pared del tubo (cromatografía Gaseosa Capilar). Las sustancias separadas salen de la columna transportadas por el gas de arrastre y pasan por un detector; dispositivo que genera una señal eléctrica proporcional a la cantidad del material eluído. El registro de esta señal en función del tiempo es el cromatograma, en donde las sustancias aparecen como picos con áreas proporcionales a sus masas, lo que posibilita el análisis cuantitativo (Figura 2).

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Figura 2 - Ejemplo de un cromatograma. a)-Instrumentalización básica: Los constituyentes básicos de un sistema cromatográfico son: - Gas de Arrastre: La función principal del gas de arrastre es transportar la muestra a través de la columna. Debe ser inerte en las condiciones usadas y no debe interaccionar químicamente con la muestra. Una segunda función es actuar como matriz en el detector, por lo que es muy importante su compatibilidad con el mismo. Los gases más usados son N 2 , He o Ar. La medida y control del flujo del gas carrier son esenciales para lograr una buena separación. El flujo de gas de arrastre debe ser constante durante el análisis. La medida de flujo de la fase móvil se puede controlar mediante el uso de un sencillo dispositivo denominado flujímetro, que utiliza burbujas de jabón. -Sistema de Introducción de la muestra: En CG, la sección del cromatógrafo gaseoso donde se introduce la muestra es el inyector (vaporizador o cámara de vaporización). En la versión más simple, se trata de una pieza de metal que contiene un orificio con un septum, generalmente de caucho de silicona, por la cual las muestras líquidas o gaseosas pueden ser inyectadas con microjeringas. Las muestras sólidas pueden disolverse en un solvente apropiado. El inyector debe calentarse a una temperatura mayor del punto de ebullición de los componentes de la muestra, para que la muestra se volatilice completa e instantáneamente y sea introducida en la columna. Si la temperatura fuera excesivamente elevada, puede ocurrir la descomposición de la muestra. La cantidad de muestra inyectada depende de la columna y del detector empleado. Para columnas empaquetadas, volúmenes de 0,1 µl a 3,0 µl de muestra líquida son típicos. Los volúmenes altos perjudican la calidad de la inyección (alargamiento de los picos) o saturan la columna cromatográfica. Para la cromatografía gaseosa de alta resolución (CGAR), los volúmenes de inyección deben ser del orden de nanolitros. Sin embargo, no existe un medio simple de medirse

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semejante volumen pequeño con la precisión necesaria. Así, los inyectores para CGAR son dotados de un "divisor de muestra", de modo que apenas una fracción del volumen inyectado (típicamente entre 1/10 e 1/300) llega a la columna, siendo descartado lo restante. -Muestra: Debe reunir las condiciones de estabilidad térmica, baja polaridad y alta presión de vapor; esto se consigue para muchos casos mediante la derivatización química de las muestras, por ejemplo formando ésteres a partir de grupos ácidos u obteniendo trimetilsilil éteres a partir de alcoholes. - Columna cromatográfica y control de la temperatura del horno: Después de inyectada y vaporizada, la muestra ingresa en la columna cromatográfica, donde es efectuada la separación. En la CG la "afinidad" de un soluto por la FM es determinada por la volatilidad del soluto, su presión de vapor, que es función de la estructura del compuesto y de la temperatura. Modificándose la temperatura, se altera también la presión de vapor y, por consiguiente, la "afinidad" de una sustancia por la FM. Si la temperatura de la columna fuera excesivamente baja, todos los constituyentes de la muestra tendrán presiones de vapor muy bajas y permanecerán casi todo el tiempo disueltos en la FE, haciendo que su migración por la columna sea muy lenta. El resultado puede ser un tiempo excesivo de análisis y picos muy anchos y bajos (cuanto más tiempo la sustancia pasa en la columna, más se dispersa). Eventualmente, el compuesto no puede salir de la columna. Por otro lado, una temperatura muy elevada también implica presiones de vapor muy grandes y los compuestos apenas pasan algún tiempo disuelto en la FE, saliendo muy rápidamente de la columna sin ser separados. Así, la temperatura de la columna es una condición que debe ser ajustada para obtenerse una determinada separación. Además de las consideraciones sobre la separación, la temperatura usada debe ser compatible con la FE empleada, pues las FE líquidas se volatilizan o se degradan con temperaturas excesivas. La temperatura de la columna debe controlarse estrictamente, para asegurar la reproductibilidad de los análisis. En el caso de muestras que contienen constituyentes con presiones de vapor muy diferentes, si la temperatura se ajusta para la separación apropiada de los compuestos menos volátiles (temperaturas altas), los volátiles serán retenidos muy poco y no serán separados. Por otro lado, si se hace el ajuste para separar los volátiles (temperaturas bajas), los constituyentes pesados se presentarán sobre la forma de picos excesivamente anchos y bajos o serán retenidos en la columna. Este problema puede contornarse usando la programación lineal de temperatura (PLT), a través del cual la temperatura de la columna va aumentándose gradualmente durante el análisis. La PLT permite separaciones de muestras muy complejas (petróleo, aceites esenciales, etc.), no analizables con temperatura constante de la columna (CG Isotérmica). - Detector : El último bloque de un CG es el detector, que será discutido detalladamente más adelante.

b)- Parámetros fundamentales: Las características fundamentales de un sistema de CG son: retención-selectividad, eficiencia y resolución

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- Retención y Selectividad: En CG, el parámetro de retención es el tiempo de retención, t r . Este es definido como el tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y el máximo del pico cromatográfico. Aunque la sustancia no interactuase de alguna forma con la FE, su tiempo de retención no sería nulo, porque pasaría algún tiempo entre su inyección y su pasaje por el detector. Este tiempo corresponde al tiempo que el gas de arrastre demora para recorrer la columna, y es denominado tiempo de retención del compuesto no retenido (o tiempo muerto), t m . El parámetro que realmente refleja las características físico-químicas de retención de un determinado compuesto es el ' tiempo de retención descontado del tiempo muerto, llamado de tiempo de retención ajustado t r :

La selectividad, capacidad de un sistema de diferenciar dos compuestos, es definida por:

Siendo una característica que, en CG, se asocia más a la columna cromatográfica. - Eficiencia: En CG, la eficiencia es expresada por el número de platos teóricos, que es calculado usándose el parámetro de retención (t r ) y el ancho del pico cromatográfico en este caso, el ancho de la base, ω b :

La altura equivalente a un plato teórico es calculada por: h = L / n. Siendo L la longitud de la columna cromatográfica. La dependencia de h con la velocidad de la FM es descrita por la ecuación de Van Deemter:

Donde V = L / t m es la velocidad del gas de arrastre. El término A está relacionado con el agrandamiento del pico y el término B con la difusión molecular del soluto en la fase móvil. - Resolución: En CG, la resolución entre dos sustancias es la proporción entre la diferencia de los tiempos de retención y el promedio de los anchos de las bandas y esta definida como:

c)-Fases estacionarias: En CG existe un gran número de fases estacionarias líquidas y sólidas disponibles comercialmente, de modo que la naturaleza de la FE es la variable más importante en la optimización de la selectividad. Las FE líquidas son las más utilizadas en CG. FE sólidas (carbón activado, sílica, tamices moleculares y polímeros porosos) son aplicadas para la separación de gases y compuestos de bajo peso molecular. En principio, para que un líquido sea usado como FE en CG este debe ser poco volátil (presión de vapor hasta 0,1 mmHg a la temperatura de trabajo) y térmicamente estable.

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Para que esta fase pueda ser usada en una separación en particular, ella necesita: - tener baja volatilidad y estabilidad térmica - ser un buen solvente para los componentes de la muestra, caso contrario el efecto será el mismo que el de la temperatura excesivamente elevada de la columna (los compuestos permanecerán casi todo el tiempo en el gas de arrastre, siendo eluidos muy rápidamente y sin separación); - ser un buen solvente diferencial, esto es, además de disolver bien a todos los constituyentes de la muestra, hacerlo con solubilidades suficientemente diferentes para que ellos puedan ser separados; y - ser químicamente inerte con relación a la muestra. En general, FE con estructuras similares a la de la muestra disolverán mejor sus constituyentes, proporcionando mejores selectividades y separaciones. Las FE más populares son las siliconas. Las siliconas son polímeros sumamente estables e inertes, lo que las vuelve especialmente apropiadas a la CG. En esta clase, los polidimetilsiloxanos son los menos polares. La substitución de los grupos metilos en la cadena por otros grupos (fenilo, ciano, trifluoropropilo, etc.) proporciona FE con polaridades crecientes. Comercialmente, están disponibles bajo varias denominaciones. SE-30, OV-1 y DC-200 son nombres comerciales para polidimetilsiloxanos de fabricantes diferentes. Otra clase de FE importante son los poliglicoles. Son polímeros de etilenglicol y epóxido, preparados con diferentes tamaños de cadena polimérica. Son FE moderadamente polares, apropiados para la separación de alcoholes, aldehidos, éteres, etc. La denominación comercial "Carbowax" designa la serie de poliglicoles más conocidos (p. ej., Carbowax 20M es polietilenglicol con peso molecular medio de 20.000.000 g/mol). Un tercer grupo importante de FE son los de poliésteres. Son obtenidos por condensación de diácidos con glicoles. Son fases altamente polares. Las fases más comunes de esta categoría son el succinato de dietilenglicol (DEGS) y el adipato d e dietilenglicol (DEGA).

d)-Columnas La columna cromatográfica es el lugar donde ocurre la interacción entre la muestra y la FE. Existen dos geometrías básicas de columnas para CG: las columnas empaquetadas (o rellenadas), y las columnas tubulares abiertas (o capilares). - Columnas empaquetadas: la FE líquida es depositada bajo la forma de una película delgada y uniforme sobre las partículas de un soporte apropiado. El soporte debe ser un sólido poroso con gran área superficial, inerte y de buena resistencia mecánica. El tamaño de las partículas y de los poros debe ser lo más uniforme posible. El material más empleado como soporte es la tierra de diatomeas, esqueletos fósiles de algas microscópicas (diatomáceas), compuestos principalmente de SiO 2 amorfo y trazas de óxidos metálicos. Muchas veces, el material es sometido a tratamientos químicos para disminuir su actividad superficial, y volverlo más inerte. La tierra de diatomeas preparada para soporte de CG es comercializada con el nombre de "Chromosorb", entre otros. Para preparar una columna empaquetada, el material de relleno (FE sobre soporte) es colocado de la forma más uniforme y compacta posible ("empaquetado") en un tubo de longitud y diámetro apropiados. Los materiales más usados para los tubos de las columnas son de acero

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inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulación más fácil. Si el material de relleno no es colocado en la columna de forma compacta y uniforme, los espacios vacíos resultantes funcionaran como cámaras de dilución para la muestra. El resultado será picos más anchos y menor eficiencia. El tamaño de la columna es variable. Típicamente son usadas columnas con diámetros internos de 1 mm a 4 mm y 1 m a 3 m de longitud. Cuanto más larga la columna, mayor la eficiencia; sin embargo, también aumenta el tiempo de análisis. Columnas muy largas ofrecen una resistencia muy alta al pasaje del gas, exigiendo presiones excesivamente altas. Además de la naturaleza de la FE y de la calidad del empaquetamiento, existen dos variable importantes que influyen en el desempeño de una columna empaquetada: - El porcentaje de la FE en el material de relleno. El porcentaje de la FE sobre el soporte es un parámetro que debe controlarse rígidamente. Si la cantidad de la FE fuese muy baja, se expondrán partes de la superficie del soporte a la muestra, que puede ser absorbida. El resultado es el agrandamiento o deformación de los picos. Esto es, cuanto más cantidad de FE, mayor es la retención. La selectividad también aumenta, aunque a expensas del aumento del tiempo de análisis y disminución de la eficiencia. Actualmente, columnas conteniendo de 2 % a 10 % de FE son las más usadas, difícilmente se usan columnas con más de 30 %. - El diámetro de las partículas del soporte. Cuanto más pequeño el diámetro de las partículas del soporte, mayor la eficiencia de la columna. También, es importante la uniformidad de las partículas. Los rellenos con partículas cuya distribución según su tamaño es muy grande no serán muy eficaces. Normalmente, se usan soportes con 80-100 mesh (149 µm a 177 µm de diámetro) o 100-120 mesh (125 µm a 149 µm). Si fuese usado soporte con partículas excesivamente pequeñas, la resistencia al pasaje de gas será mu y alta. - Columnas tubulares abiertas: (genéricamente denominadas "columnas capilares"), la FE es depositada en la forma de una película sobre la superficie interna de un tubo fino. Su gran ventaja sobre las columnas empaquetadas es que, por el hecho de ser tubos abiertos, pueden hacerse columnas capilares de grandes longitudes. Como, cuanto mayor la longitud, más platos teóricos contiene la columna (y mayor su eficiencia), las columnas capilares son mucho más eficientes que las empaquetadas. Normalmente, se encuentran columnas de 5 m hasta 100 m, aunque ya se ha fabricado una columna con 2175 m. Pueden usarse tubos metálicos, de vidrio o de sílica fundida, siendo actualmente preferidos los últimos por su flexibilidad e inercia química. En las columnas empaquetadas, el desempeño es afectado por el diámetro y uniformidad de las partículas del relleno y por la carga de FE. En las columnas capilares, son importantes el diámetro interno de la columna y el espesor de la película de la FE. Cuanto más fina sea la columna, más eficiente ella será. Sin embargo, columnas muy estrechas soportan poca FE, lo que disminuye su selectividad. Típicamente, se usan columnas con diámetros internos entre 0,1 mm y 0,5 mm. El espesor de la película de la FE equivale al porcentaje de FE en las columnas empaquetadas, de manera que cuanto mayor es el espesor de la película, mayor será la retención y la selectividad. Películas excesivamente espesas causan el agrandamiento de los picos y tiempos de análisis grandes. Normalmente, se utilizan películas de 0,1 µm a 3,0 µm. Las FE son las mismas usadas para las columnas empaquetadas. Muchas veces, para minimizar las pérdidas de la fase por volatilización durante el uso, la FE es fijada a las paredes del tubo por algún medio. Puede polimerizarse parcialmente a la fase después de la deposición (fases inmovilizadas) o entonces enlazarla químicamente a las paredes (fase enlazada).

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La capacidad de procesamiento de muestra de las columnas capilares es más pequeña que en las columnas empaquetadas. Dependiendo de la columna, esta puede saturarse con cantidades muy pequeñas como 0,001 µl de muestra. En la inyección directa de volúmenes de muestra de este orden, debe recurrirse al artificio de la división de la muestra en la inyección. Sin embargo, el uso de la división de muestra presenta algunos inconvenientes. Es difícil ajustar reproduciblemente la proporción de la división (fracción de la muestra inyectada que entra en la columna), lo que puede provocar errores en el análisis cuantitativo. Además de eso, las muestras conteniendo constituyentes con volatilidades muy diferentes pueden ser alterados por la división: la fracción de la muestra que realmente va para la columna se enriquece con los componentes menos volátiles. Dada la gran eficiencia de las columnas capilares, pueden realizarse separaciones de mezclas sumamente complejas: fracciones de petróleo, esencias, muestras biológicas, etc. En el caso específico de análisis de interés ambiental (por ejemplo, poluentes en aguas y aire), es casi obligatorio su uso. La tendencia actual es que la mayoría de los análisis se hagan con el uso de columnas capilares. Esto no significa que las columnas empaquetadas están siendo abandonadas, aun así su uso debe restringirse a aplicaciones específicas.

e)-Detectores: El detector es un dispositivo que indica y cuantifica los componentes separados por la columna. Un gran número de detectores han sido descritos y usados en CG. Existen, sin embargo, algunas características básicas comunes para describir su desempeño: - Selectividad: Algunos detectores presentan respuestas para cualquier sustancia diferente del gas de arrastre que pasa por este. Estos son los llamados detectores universales. Por otro lado, existen detectores que sólo responden a compuestos que contengan un determinado elemento químico en su estructura, que son los detectores específicos. Entre estos dos extremos, algunos detectores responden a ciertas clases de compu estos (detectores selectivos). - Ruido: Son los desvíos y oscilaciones en la línea de base (señal del detector cuando sólo pasa el gas de arrastre). Puede ser causado por problemas electrónicos, impurezas y suciedades en los gases y en el detector, etc. Por mejor que sea el funcionamiento del sistema, siempre existe ruido. - Tipo de Respuesta: Algunos detectores presentan una señal que es proporcional a la concentración del soluto en el gas de arrastre; en otros, la señal es proporcional a la fracción de masa del soluto que entra en el detector. Esto depende del mecanismo de funcionamiento de cada detector. - Cantidad Mínima Detectable (CMD): Es la cantidad de muestra mínima para generar una señal dos veces más intensa que el ruido. Es una característica intrínseca del detector. Cuanto menor la CMD, más sensible es el detector. - Factor de Respuesta: Es la intensidad de señal generada por una determinada masa de soluto, que depende del detector y del compuesto estudiado. Puede visualizarse como la inclinación de la recta que correlaciona la señal con la masa de un soluto (curva de calibración). Cuanto mayor es el factor de respuesta, más confiable el análisis cuantitativo. (Reproducibilidad) - Rango Lineal Dinámico: Es la razón entre la menor y la mayor masa entre las cuales el factor de respuesta de un detector para un soluto es constante, esto es, donde la curva de calibración es lineal. Los dos detectores más significativos en CG son el Detector por Conductividad Térmica (DCT) y el Detector por Ionización en llama (DILL).

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Detector por conductividad térmica (DCT): El funcionamiento del DCT esta basado en el hecho que la velocidad de pérdida de calor de un cuerpo caliente para un cuerpo más frío es proporcional, entre otros factores, a la conductividad térmica del gás que separa estos cuerpos. Un filamento metálico muy delgado (de W, Au o aleación W-Re) es calentado por el pasaje de una corriente eléctrica constante. Este filamento está colocado dentro de un orificio en un bloque metálico (celda), calentado a una temperatura más baja que aquella del filamento, por donde el gas de arrastre proveniente de la columna pasa continuamente. Mientras pasa gas de arrastre puro por la celda, la proporción de pérdida de calor del filamento para el bloque es constante y la temperatura del filamento no varía. Cuando un componente es eluido de la columna, este sale mezclado con el gas de arrastre y pasa por el detector. Si la conductividad de esta mezcla es diferente de aquella del gas de arrastre puro, el filamento pasa a perder calor para el bloque en una proporción diferente de aquella del equilibrio. Por ejemplo, si la proporción de pérdida de calor disminuye, el filamento se calienta cuando la muestra es eluida. El calentamiento del filamento causa una variación en su resistencia eléctrica y la resistividad de un metal aumenta con la temperatura. El filamento es montado en un circuito puente de Wheatstone, que transforma la variación en resistencia eléctrica del filamento en una variación de voltaje, que es colectada en un registrador generando el cromatograma. El DCT es un detector universal, sensible a la concentración del soluto en el gas de arrastre. Generalmente, cuando se usa DCT, el gas de arrastre es He. Por el hecho de que estos gases tienen conductividades térmicas altas, las mezclas gas de arrastre más soluto siempre tendrán conductividades térmicas menores que la del gas de arrastre puro, lo que impide señales negativas, además de obtenerse factores de respuesta más grandes. Sin embargo, es considerado un detector poco sensible. La CMD de un modelo moderno, 6 para propano, es de 400 pg/ml de gas de arrastre, con un rango lineal de 10 . A pesar de eso, el hecho de ser universal, barato y de funcionamiento simple, lo hace extremamente útil para análisis que no necesitan de alta sensibilidad. Detector por ionización en llama (DILL): Durante la quema de un compuesto orgánico, son formados varios iones y como consecuencia, la llama resultante se hace conductora de electricidad. El funcionamiento del DILL está basado en este fenómeno. El gas de arrastre saliendo de la columna cromatográfica es mezclado con H2 y quemado con aire o O2 . La llama resultante queda contenida entre dos electrodos, polarizados por un voltaje constante. Como la llama de H2 forma pocos iones, este es un pésimo conductor eléctrico y casi ninguna corriente pasa entre los electrodos. Al eluir un compuesto orgánico, este es quemado y son formados iones en la llama, que pasa a conducir corriente eléctrica. La corriente eléctrica resultante, del orden de pA, es amplificada y constituye la señal cromatográfica. Casi todos los compuestos orgánicos pueden ser detectados por el DILL. Apenas sustancias no inflamables (CCl 4 , H2 O) o algunas pocas que no forman iones en la llama (HCOOH) no dan señal. Así, este es un detector prácticamente universal. De una manera general, cuando el compuesto tiene enlaces C-H, mayor es su respuesta (mayor sensibilidad). Este detector es mucho más sensible que el DCT, porque dependiendo del compuesto, pueden ser detectados entre 10 pg e 400 pg, con un 7 rango lineal dinámico de 10 . Probablemente es el detector más usado en CG.

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Guia Tercera Parte

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