glucosinolatos en maca peruvian.docx

BIOTECNOLOGÍA Y METABOLITOS SECUNDARIOS EN peruvianum Chacón. “ MACA” Angela Renee Arias Ramírez.

Lepidium

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CAPITULO III ANTECEDENTES III.1.- DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA.-

El género Lepidium incluye aproximadamente aproximadamente 175 especies, especies, distribuidas en prácticamente todos los continentes, excepto la Antártida, siendo uno de los más grandes dentro de las crucíferas. Las especies de América del Norte, Australia y Europa han sido estudiadas extensamente, pero se sabe muy poco de las especies endémicas Andinas (Quiros 1999).

Gloria Chacón (1990) menciona que en el Perú, de acuerdo a Ferreira (1986), existían 11 especies clasificadas del género Lepidium Lepidium a la la que que agrega agrega Lepidium peruvianum Chacón como una nueva especie. De acuerdo a Rea (1992, citado por Quiros y colb. 1996) la maca fue domesticada hace cerca de 2000 años en San Blas, Junín. Siendo, según Bonnier (1986, citado por Chacón 1990), una de las primeras plantas domesticadas en el Perú.

La maca parece haber jugado un papel importante en la economía prehispánica, y durante los primeros cien años de la colonia formó parte de los tributos exigidos por el Encomendador (Chacón, 1990). III.1.1.- CLASIFICACIÓN CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA.

DIVISION

:

ANGIOSPERMAE

CLASE

:

DICOTYLEDONEAE

SUBCLASE

:

ARCHICHLAMYDEAE ARCHICHLAMYDEAE

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BIOTECNOLOGÍA Y METABOLITOS SECUNDARIOS EN peruvianum Chacón. “ MACA” Angela Renee Arias Ramírez.

Lepidium


ORDEN

:

PAPAVERALES

FAMILIA

:

BRASSICACEAE

GENERO

:

Lepidium

ESPECIE ESPECIE

:

Lepidium Lepidiu m peruvian um Chacón. Chacón. Sp. Nov. Nov. Antes L. meyenii Walp.

NOMBRE NOMBRE COMUN COMUN

:

MACA, MACA-MACA, MACA- MACA, MAINO, AYAK CHICHIRA , AYAC AYAC WILLKU WILLKU,, GINSE GINSENG NG PERUAN PERUANO. O.

III.1. 2.- DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

La maca, según Aliaga (1988), es una planta de comportamiento bienal en la sierra alta, (no se tienen referencias respecto a su comportamiento en menores altitudes) siendo autógama, cleistógama, con una fase reproductiva de 5 meses con una floración que dura dos meses. Las flores se abren en series sucesivas, presentando cuatro cuatro etapas: flor cerrada con anteras anteras sin dehiscencia, dehiscencia, flores cerradas con anteras con dehiscencia, flor abierta con estructuras florales en pleno desarrollo, flor abierta con estructuras florales entrando en senescencia. Esta fase reproductiva es precedida por una fase vegetativa de 8 meses, que se inicia con la siembra de la semilla, en la que se produce el ensanchamiento ensanchamiento de los hipocótilos. El cultivo de estas dos fases se da generalmente entre los meses de setiembre y junio en dos años consecutivos (Aliaga, 1999).

La raíz es napiforme (Beltrán y colb. Citado por Obregón, 1998), descrita como tubérculo hipocotíleo por Piñas (1994) recibiendo también el nombre de hipocótilo (Aliaga 1995, 1995, 1997; Tello y colb. 1992; Quiros, 1996), según León (1964), éste es un eje carnoso derivado del hipocótilo cuya parte superior

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termina en una superficie plana de la que brotan de 6 a 15 hojas; mientras la inferior es cónica y se a larga en una raíz ancha y fuerte con dos áreas irregulares en la mitad inferior, de donde nacen las raicillas.

Los colores de maca más frecuentes son: amarillo, morado, medio morado (la parte superior morada y la inferior blanca) y negro (León, 1964) pero se pueden encontrar también maca de color rosado, crema-morado, amarillonegro, plomo, y raras veces morado-negro (Aliaga, 1999), el color preferido por los campesinos y el mercado es el color amarillo (León, 1964 y Aliaga, 1999).

El tallo es acaule, mientras las hojas son a rrosetadas, pecioladas, compuestas bipinnatisectas, con foliolos opuestos y dimórficas: En la fase vegetativa son grandes (10 – 15 cm de largo) y muy reducidas (menos de 5 cm) en la fase reproductiva (Tello y colb. 1992 y Aliaga, 1999).

La inflorescencia es un racimo compuesto, raramente simple (Piñas 1994), con el eje floral corto. Las flores, pequeñas y blancas, son perfectas, con cuatro sépalos, cuatro pétalos, 2 estambres fértiles y cuatro estaminodios y un ovario súpero bicarpelar y bilocular, con un óvulo en cada lóculo de placentación axilar. Su fórmula floral es: KC4 4 A2-4G2

(León, 1964 y Aliaga,

1995).

El fruto es una silícula de dehiscencia longitudinal con 2 semillas ovoides de 2-3 mm de ancho y 4 – 5 mm de largo (Beltrán y colb. Citado por Obregón, 1998) el color de las semillas varía del amarillo-naranja al marrón oscuro (Aliaga, 1999).

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III.1.3.- NÚMERO DE CROMOSOMAS

Tello y colb. (1992) sugirieron que la maca era un hexaploide de n = 8 con 54 – 56 cromosomas, pero en 1996, Quiros y colb. observaron, en células madres de plantas en floración, 32 pares de cromosomas; concluyendo que la maca es un poliploide disómico del número cromosómico básico del género: n = 8, siendo así un octoploide: 2n x 8 = 64 cromosomas. III.1.4.- DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

A pesar que la maca crece a altitudes mayores de los 3500 m.s.n.m e inclusive en regiones en las que ni siquiera las papas amargas pueden sobrevivir, altitudes que se encuentran a lo largo de la Cordillera de los Andes (National Research Council. 1989); el cultivo de la maca (luego de la colonia), estuvo restringido a los departamentos de Junín y Pasco, en las regiones suni y puna, principalmente en las laderas circundantes al lago de Junín; a altitudes de 4100 – 4450 m.s.n.m. (Tello 1992); y en menor grado en otras localidades de estos departamentos desde los 3400 m.s.n.m.

Los datos de los cronistas y las memorias de tributos, sugieren que la distribución del cultivo era amplia en los territorios altoandinos, pero el área de cultivo de la planta disminuyó progresivamente hasta que entre 1777 y 1778, Hipólito Ruiz lo circunscribe la región de Chinchaycocha (Castro, 1990). Esta tendencia se mantuvo hasta la década de los ochenta, en la que el área de cultivo de la planta era de apenas 25 Has (Aliaga, 1999). En la década de los 90 esta tendencia se revirtió al crecer la demanda de la planta, y su cultivo se extendió a otros departamentos del Perú, de tal manera que actualmente la maca se está cultivando en Puno, Ayacucho, Huancavelica, Huánuco y Apurímac (Aliaga, 1999).



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III.1.5.- IMPORTANCIA NUTRICIONAL

La maca es la única especie del género Lepidium cuya raíz es utilizada como alimento, aunque las hojas de otras especies son usadas como verduras (National Research Council. 1989), además, dentro de los tubérculos y raíces andinos, es una de las especies con mayor valor alimenticio; con un alto contenido de aminoácidos esenciales, comparables con los recomendados por la FAO – OMS, siendo altos sus valores de lisina, tirosina y fenilalanina. La fracción grasa es rica en ácido linoleico utilizado por el organismo para la biosíntesis de ácidos grasos esenciales. Por otro lado, los niveles de minerales de la planta son altos comparados con otras especies (Pizza y colb. 1998). (Ver apéndice) III.2.- METABOLITOS SECUNDARIOS.

Se definen como metabolitos secundarios a aquellos compuestos que no tienen una función reconocida en el mantenimiento de los procesos fisiológicos fundamentales de los organismos que los sintetizan (Robert y colb. 1991).

Entre las funciones que cumplen estos metabolitos están: proteger la planta de lo s d ep re da do re s, com pet ir ventajosamente con otras plantas, atraer polinizadores y simbiontes y brindarles protección contra diferentes tipos de estrés a los que se vean sometidas (Loyola y Vargas, 1985, citados por Robert y colb. 1991). Las evidencias de una estricta regulación metabólica de estos productos nos indicaría que cumplen un rol importante en la sobrevivencia de las plantas



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III.2.1.- GLUCOSINOLATOS.

Los glucosinolatos son una clase tioglucósido s

restring idos a las

dicotiledóneas limitados a pocas familias y en algunos casos a ciertos géneros y especies (Kjaer, 1973), los que son almacenados en diferentes tejidos de la planta, siendo una fuente significativa del contenido de azufre y minerales de la planta (Josefsson, 1970; citado por Rodman, 1981), se encuentran en muchos cultivos comerciales y junto con la enzima que los degrada, la mirosinasa, conforman un sistema que define fitoquímicamente al orden de las Capparales (Hegnauer, 1986; citado por B ones y Rossiter, 1996); estando presente en mu cha s b ra ssi cac ea s e conómicamente importantes, como la mostaza, calabazas, brócoli, nabo, etc. El daño mecánico, infecciones o ataque de pestes produce, como una respuesta de defensa de la planta, el rompimiento celular que exponen los glucosinolatos almacenados a la acción de las enzimas que los degradan,

las

mirosinasas,

produciendo

isotiocianatos,

nitrilos,

cianoepitioalcanos y tiocinatos dependiendo del pH y/u otros factores (Fig 1) (Bones y Rossiter, 1996). Estos compuestos disminuyen la palatibilidad de las hojas para herbívoros no específicos como aves y babosas, pero aumenta la susceptibilidad del tejido a insectos específicos como los escarabajos alados, (Mithen y col. 1995)

La primera revisión de la presencia de glucosinolatos en varias especies fue hecha por Kjaer en 1960, con actualizaciones periódicas (Xenophon y colb., 1981), en 1973, Kjaer puntualizó:

“entre el vasto número de productos

secundarios vegetales, aquellos que presentan una distribución discontinua junto con un llamado inmediato a los sentidos humanos (olor, sabor, color) han adquirido, por razones obvias, una posición prominente en discusiones acerca de los méritos de tales productos para propósitos de clasificación y, más fundamentalmente, consideraciones filogenéticas. Los glucosinolatos ........



Lepidium


constituyen un grupo con algunas de las características anteriores.”....... “La complejidad sistemática de numerosos taxa productores de glucosinolatos, por ejemplo dentro de Cruciferae, es un reto para nuestro entendimiento de la posición biológica e importancia de este grupo de constituyentes vegetales químicamente bien definido y en constante crecimiento”.

Hace ya varias décadas, se ha deseado reducir el contenido de tioglucósidos en Brassicáceas mediante métodos de cultivo, pues la presencia de algunos de ellos son indeseables por algunos efectos tóxicos de los productos de su degradación (Josefsson, 1967), tales como nitrilos, isotiocianatos, tiocianatos, epitionitrilos y vinil oxazolidinetionas (Bones y Rossiter, 1996), así como por su sabor; mientras que otros vienen siendo estudiados por sus propiedades terapéuticas. Actualmente, la concentración de glucosinolatos puede ser manipulada genéticamente, disminuyéndola para mejorar la palatabilidad del cultivo, como en el caso de la colza, o, aumentándola como se trata de hacer en brócoli con el glucosinolato g l u c o r a f a n i n a , q u e a l h i d r o l i z a r s e f o r m a s u l f u r o f a n o co n a c t i v i d a d anticancerígena (Quiros, 1999).

Las especi es del género Lepidium son usualmente ricas en bencil isotiocianatos (Daxenbichler y colb., 1964) y en el caso de la maca, Jonhs (1981), sugiere que las propiedades potenciadoras de la fertilidad se deben a los productos de los glucosinolato s de maca, los isotiocianat os aromáticos, bencilisotiocia nato y el p-metoxibencil isotiocianato, el último de los cuales también se encuentra en mashua.

Químicamente, los glucosinolatos son compuestos hidrosolubles, tienen el mismo núcleo el cual consiste en un tioglucósido unido al carbón de una oxima sulfonada y un grupo funcional R que deriva de aminoácidos siendo éste



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el carácter variable (Bones y Rossiter, 1996) y de cuya estructura depende la actividad biológica del glucosinolato al determinar la naturaleza de los productos resultantes del daño de los t ejidos de la planta, (Mith en y colb., 1 995). La naturaleza de este grupo R los divide en dos grupos: los glucosinolatos aromáticos (alquil, alquenil, hidroxialquenil, w- m etiltioalkenil) y los alif áticos (bencil, bencil sustituido), el grupo sulfato le imparte fuertes propiedades ácidas, por lo que los glucosinolatos se presentan como aniones contrabalanceados por un catión, la glucosa y sus formas aniónicas, los hacen compuestos no volátiles e hidrofílicos, se han identificado más de 100 glucosinolatos; todos ellos se diferencian sólo en la cadena lateral R. (Bones y Rossiter, 1996). Por el gran número de glucosinolatos, se usan nombres semisistemáticos, en los que el nombre de la cadena R es seguido por el sufijo “glucosinolato”,

Los glucosinolatos provienen del metabolismo de los

- aminoácidos,

α

Valina, Alanina, Leucina, Isoleucina, Fenilalanina, Tirosina y Triptofano (Kjaer, 1973), en una serie de reacciones en las que el grupo carboxilo se pierde y el carbón

α

se transforma en el carbón central del glucosinolato (Larsen, 1981),

aunque solo siete corresponden a aminoácidos proteicos (antes mencionados), los restantes derivan de modificaciones de la cadena lateral, que probablemente a nivel de glucosinolato o derivan de aminoácidos no pr oteicos (Chapple, y colb., 1994 y Larsen, 1981).

Para el aislamiento y análisis de los glucosinolatos se han desarrollado muchas técnicas, como la cromatografía en papel Kjaer 1970, cromatografía de capa fina, cromatografía de gases, además de procesos que involucra el estudio de los productos de la degradación enzimática, aunque la gran variabilidad de los productos de la degradación enzimática pueden causar resultados erróneos, (Larsen, 1981).



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El tratamiento de los glucosinolatos con AgNO3 o Hg(Oac)2 resulta en la producción de

-D-glucosa y derivados de la plata o el mercurio los que

α

nuevamente pueden ser descompuestos en nitrilos, (Larsen, 1981)

Los glucosinolatos se encuentran usualmente en toda la planta en vacuolas celulares, pero presumiblemente en las semillas maduras y dormantes ricas en glucosinolatos y que presumiblemente no presentan vacuolas acuosas aún no se ha definido su localización celular (Rodman, 1981).

Lockwood y Belkhiri, (1991), revisaron la clasificación de crucíferas de Argelia, de acuerdo a sus glucosinolatos, reclasif icando el gén ero Isatis y reubicando el género Sinapsis fuera de Brassicaria, esto demuestra pues, el valor taxonómico de estos compuestos. III.2.1.1.- EL SISTEMA MIROSINASA – GLUCOSINOLATO

Las enzimas que hidrolizan los glucosinolatos son las mirosinasas y estas están invariablemente depositadas en toda la naturaleza con el sustrato. (Kjaer, 1973), así, sin excepción conocida, los glucosinolatos están acompañados en la planta por esta enzima. Las miro sinasas se encuentran en idioblastos especializados ricos en proteínas llamados células de mirosina (Rodman, 1981) que se encuentran en el tejido parenquimático (Bonnes y Rossiter, 1996), éstos se tiñen de rojo intenso con el reactivo de Millon. (Fahn, 1979; citado por Rodman, 1981) de tal manera que los dos componentes se encuentran separados hasta que se produce daño tisular o autolisis, generando durante la masticación los productos de defensa de la planta (Purrington, 2000).

Este sistema fue observado por primera vez en semillas de mostaza, (Kjaer, 1968) posteriormente fue encontrado en todas las Brassicáceas, y en la



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familias Caparaceae, Tropaeolaceae, Caricaceae, entre otras. Por otro lado se ha encontrado en los hongos Aspergillus sydowi y Aspergillus niger , en la bacteria Enterobacter cloacae, en teji dos de mam íferos y en lo s áfi dos que atacan crucíferas Lipaphis erisimi y Brevicoryne brassicae. Pero estas enzimas parecen no estar relacionadas con las enzimas de las plantas (Bones y Rossiter, 1996).

S – Glu R – C NOSO3 H2O

mirosinasa S

R –C

+

D - Glu

NOSO3

Isotiocianatos

nitrilos

cianoepitioalcanos

tiocianato

FIG. 1.- Hidrólisis de los glucosinolatos por la mirosinasa. (Fuente: Bonnes y Rossiter. 1996. The Myrosinase – Glucosinolate System, its Organization and Biochemistry. Physiologia Plantarum. 97:194 -208 )

La degradación de los glucosinolatos mediada por la mirosinasa puede producir: a) isocianatos, cuando la hidrólisis se produce en un pH normal; b) nitrilos, cuando la hidrólisis ocurre a pH ácido; c) cianoepitioalcanos, cuando la mirosinasa se presenta con una pequeña proteína conocida como proteína epitioespecificadora; d) tiocianatos, que son producidos solo por tres de los glucosionatos que se dan en la naturaleza, los allyl, bencil, y 4(metiltio)butilglucosinolatos.



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MacGibbon y Allison en 1970 detectaron por electroforesis en gel separando varias isoenzimas de mirosinasas, ellos trabajaron con 7 especies de Rhoeadales, cada especie tenia un patrón diferente con 1 a 4 bandas. También encontraron que este patrón variaba de acuerdo a la parte de la planta de la cual se hicieran los extractos.

Diferentes estudios de las mirosinasas demuestran que el patrón de estas enzimas puede variar no solo de acuerdo a la especie, sino también de acuerdo al órgano y edad de la planta, pero se sabe poco de la razón fisiológica de esta diferencia.(Bonnes y Rossiter, 1996). Se ha postulado que las isoenzimas particulares corresponden a condiciones endógenas encontradas en las plantas, o al organismo blanco o a los glucosinolatos que predominan en el tejido.(Bonnes y Rossiter, 1996). III.2.2.- ALCALOIDES

Los alcaloides forman una amplia y variada familia de metabolitos secundarios de moléculas no relacionadas entre sí, siendo de gran importancia económica debido a sus propiedades farmacológicas, las mismas que han sido usadas desde la prehistoria hasta la actualidad. Son los metabolitos mas frecuentes en el reino vegetal, habiéndose encontrado cerca de 10,000 alcaloides en aproximadamente 20 por ciento de plantas con flores, principalmente dicotiledóneas herbáceas (Hopkins, 1999).

Se clasifican como alcaloides a aquellas sustancias básicas con uno o más átomos de nitrógeno en su sistema cíclico, que manifiestan actividad farmacológica (Lock, 1994)

La mayoría de los alcaloides provienen del metabolismo de los aminoácidos, principalmente tirosina, triptofano, arginina y lisina, y aunque



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algunos alcaloides se encuentran en varios géneros o aún en una familia, la mayoría de las especies presentan un patrón único, genéticamente determinado. Por otro lado su distribución está restringida a determinados órganos de la planta, como raíces, hojas o frutos jóvenes (Hopkins, 1999).

No se ha determinado aún cual es la función de los alcaloides en la planta, aunque se le asignan rol defensivo, debido a que la mayoría son amargos, lo cual es considerado universalmente como un carácter repelente. Todos son biológicamente activos, muchos significativamente tóxicos y otros con propiedades antibióticas. Frecuentemente los tejidos que acumulan alcaloides son los más vulnerables, o son tejidos periféricos que pueden ser atacados por herbívoros (Hopkins, 1999), pero el hecho que cerca de 80% de las plantas no contienen alcaloides hace suponer que estos no son vitales para todos los organismos vivientes (Lock, 1994).

Para la extracción de alcaloides se aprovecha su carácter básico, utilizando soluciones acuosas o alcohólicas ligeramente ácidas, para obtener el extracto crudo de alcaloides; pudiendo previamente liberarlos con soluciones de amoniaco y carbonato de sodio, para extraerlos luego con solventes orgánicos.(Lock, 1994)

Las técnicas de separación de alcaloides más comunes son la cromatografía de capa fina o delgada aunque en los noventa se generalizó el uso de Sephadex LH-20 por elución y la cromatografía líquida de alta perfomance (HPLC). Los sistemas solventes son muy variados y el agente revelador de uso general es el reactivo de Dragendorff, cuya aplicación produce manchas generalmente de color naranja (Lock 1994).

La Dra. Gloria Chacón, (1961, 1990) demostró la presencia de alcaloides



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en Lepidium peruvianum, para demostrar la acción fecundadora del extracto alcaloideo de maca, lo inoculó en ratas obteniendo una marcada estimulación de la maduración los folículos de Graaf y engrosamiento del endometrio. Posteriormente Yllesca, (1994), en un estudio fitoquímico de la planta encontró 3 alcaloides en los extractos metanólico y butanólico de maca de los ecotipos amarillo, rojo y negro. En 1993, Garró y col. obtuvieron cuatro fracciones de alcaloides por cromatografía de capa fina. Por otro lado Dini y colb., (1994), detectaron por cromatografía de capa fina de un extracto alcalino de polvo de maca realizado en cloroformo 3 fracciones positivas al reactivo de Dragendorff. Sin embargo la presencia de alcaloides en maca aún es discutida y no se ha determinado su estructura. III.3.- CULTIVO DE TEJIDOS

El cultivo de tejidos como técnica consiste en aislar una porción de planta y proporcionarle las condiciones apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Es en realidad un conjunto de diversas técnicas mediante las cuales un explante, es decir una parte separada de la planta, se cultiva asépticamente en un medio de composición definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. (Roca y Mroginski, 1991).

Los principios de esta técnica están contenidos en la teoría celular de Schleiden y Schwann (1839, citados por Gautheret, 1982) que postula que la célula es capaz de tener autonomía y totipotencia, lo que fue demostrado en células somáticas con la observación de la formación y cicatrización de callos en áreas donde la planta sufre cortes (Gautheret, 1982).

Los primeros intentos de establecer cultivos de tejidos vegetales fueron realizados por el botánico alemán G. Haberlandt (1902, citado por Gautheret



Lepidium


1982), quien trabajó con células de palizada, pelos glandulares y pelos de estambres de Tradescantia; pero aunque logr ó que las células sobrevivieran en tr e 20 a 27 día s, no tu vo crecimiento celular, probablemente debido a que eligió nutrientes relativamente simples y a que eligió células altamente diferenciadas (Dodds y Roberts, 1982). Recién en 1934, mucho después que en 1912 Carrel diseñara el método para cultivar células animales; que Gautheret logra los primeros resultados exitosos en el cultivo de tejidos del cambium en Acer pseudoplatanus, Salix capraea y Sambucus nigra (Gautheret 1982) y White demuestra el crecimiento ilimitado de las puntas cortadas de raíces de tomate (Dodds y Roberts 1982).

Los primeros logros del cultivo de tejidos fueron los de formación de callos indiferenciados, que podían crecer ilimitadamente a través de subcultivos, por lo que se puso mucho énfasis en la determinación de los requerimientos nutricionales para el crecimiento sostenido (Dodds y Roberts 1982). Para entonces ya se había descubierto la auxina IAA (Went, 1926, citado por Gautheret, 1982) y en las décadas siguientes se estudiaron diversas sustancias que favorecían el crecimiento celular de los tejidos cultivados in vitro (Gautheret 1982) se descubrió la kinetina y otras hormonas que recibieron el nombre de citoquininas (Dodds y Roberts 1982) , hasta que en 1962, Murashigue y Skoog propusieron una solución de minerales asociada a auxinas y citoquininas que permite el crecimiento de la mayoría de tejidos (Gautheret 1982).

También se inició una serie de estudios en organogénesis e histogénesis, que sentaron las bases de la micropropagación cuando Ball en 1946 descubrió el principio de la propagación vegetativa determinando cuales eran los t ipos de meristemos que eran capaces de generar plantas completas. En 1964, Morel aplicó estos principios en la propagación clonal de orquídeas. (Gautheret 1982).



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Muir (1953 – 1954, citado por Dodds y Roberts 1982) encontró que los callos que eran trasladados a un medio líquido se convertían en suspensiones celulares, desarrollándose luego muchas técnicas de cultivo de células aisladas y de otro tipo de cultivos, como el de anteras, de microsporas, el aislamiento y cultivo de protoplastos y otros. (Dodds y Roberts 1982).

Actualmente el cultivo de tejidos se aplica entre otros:

a) Estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines. b) Bioconversión y producción de compuestos útiles. c) Incremento de la variabilidad genética. d) Obtención de plantas libres de patógenos. e) Propagación de plantas. f) Conservación e intercambio de germoplasma. III.3.1.- CULTIVO DE CALLOS

El establecimiento del cultivo de tejidos depende del tipo de explante usado, y la elección de éste dependerá del objetivo perseguido y la especie vegetal utilizada. Para la obtención de callos se puede utilizar cualquier tipo de explante que contenga células nucleadas, y éste se seleccionará en función a razones

prácticas

como

disponibilidad,

facilidad

de

manipulación,

homogeneidad, baja contaminación, respuesta in vitro; esta respuesta puede variar con el genotipo de las plantas, su estado de desarrollo, edad ontogénica y tamaño del explante (Roca y Mroginski, 1991). A las dos o tres semanas de incubación empieza a formarse, en las regiones de corte, el callo, una masa amorfa desdiferenciada de células parenquimáticas de pared delgada (Dodds y Roberts 1982), y sigue creciendo cubriendo el explante en unos casos, y en otros desintegrándose a medida que el callo crece (Nuñez y Ochoa, 2000). Este crecimiento depende de la relación entre la planta de origen, el medio de cultivo,



Lepidium


las condiciones ambientales y

el tiempo de incubación; algunos callos crecen

fuertemente lignificados y de textura dura, mientras otros se rompen fácilmente en pequeños fragmentos, estos callos son llamados friables (Dodds y Roberts, 1995), estos callos son los mejores para la iniciación de cultivos celulares.

El establecimiento de un callo a partir de un explante, puede dividirse en tres fases de desarrollo: Inducción, en la que el metabolismo es estimulado antes de la mitosis; división celular en el que las células del explante revierten a un estado meristemático; y por ultimo diferenciación celular y expresión de algunas vías metabólicas que llevan a la formación de metabolitos secundarios (Dodds y Roberts, 1995).

La formación de callos en plantas intactas, normalmente está controlada por hormonas endógenas, las auxinas y citoquininas, por lo que para su inducción in vitro en explantes vegetales sin causar estrés, depende de la introducción de reguladores de crecimientos en el medio de cultivo (Nuñez y Ochoa, 2000).

Los otros factores más importantes para el éxito de esta tecnología son: e l e xplante y el medio de cultivo, es decir, los componentes esenciales y opcionales que contenga. Los nutrientes esenciales consisten en las sales inorgánicas, fuentes de carbono y energía, vitaminas y fitohormonas (Gamborg y Shyluk, 1981). Otros componentes como compuestos nitrogenados, ácidos orgánicos y sustancias complejas pueden ser importantes pero son opcionales.

Después de que el callo ha crecido por un tiempo en asociación con el tejido original, es necesario subcultivar el callo a medio fresco. El crecimiento en el mismo medio por un tiempo prolongado lleva al agotamiento de los



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nutrientes, la gradual desecación del agente gelificante y a la acumulación de metabolito que pueden resultar tóxicos para el callo (Dodds y Roberts, 1995).

Los subcultivos sucesivos usualmente son llevados a cabo cada seis semanas, con cultivos mantenidos en medio agar a 25°C o más, pero en realidad este tiempo varía con la tasa de crecimiento del callo (Dodds y Roberts, 1995).

Carhuaz en 1997 (comunicación personal),

indujo callos en maca,

utilizando un factorial de cuatro citoquininas (BAP, KIN, ZEA y 2ip) y cuatro auxinas (IIA, IBA, NAA y 2,4-D) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0, 100 ìM, concluyendo que el 2,4-D en el rango de 0.1 – 10.0 ìM el regulador más efectivo para promover la formación de callos, coincidiendo con Gamborg y colb. (1981), quienes indican un rango óptimo de 1- 5 ìM para la acción del 2,4-D y con Flick y colb. (1983), que también señalan al 2,4-D y a la kinetina como los reguladores más efectivos para la inducción de callos en Brassicáceas. III.3.2.- HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO

Se l la ma h or mo na o fi to ho rm on a a a quellas sustancias orgánicas naturales que a bajas concentraciones ejercen una profunda influencia en los procesos fisiológicos de la planta (Hopkins, 1999), mientras que las sustancias sintéticas con las mismas propiedades son llamadas reguladores de crecimiento, y no son consideradas como hormonas vegetales (Dodds y Roberts, 1995).

Se conocen cinco grupos de hormonas: auxinas, giberelinas, citoquininas, ácido absícico y etileno (Hopkins, 1999). De estas las auxinas y citoquininas son las mas usadas en el cultivo de callos, mientras las giberelinas son usadas con poca frecuencia y generalmente en cultivos de meristemos apicales. De igual



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modo el ácido absícico y el etileno se usan con poca frecuencia (Dodds y Roberts, 1995).

En la familia Brassicaceae se encuentran muchas especies económicamente importantes, en muchas de ellas se han inducido callos, incluyendo a Bra ssi ca ole rac ea, B. nap us y Arabidopsis thaliana,

los

requerimientos para inducir callos en esta familia pueden ser cubiertos con muchas hormonas, con un amplio rango de concentraciones, estas concentraciones y la hormona a ser elegida, así como l a respuesta de crecimiento varía con la especie y el genotipo. Sin embargo, usualmente se utiliza una auxina y una citoquinina, (Flick y colb., 1983), dentro de las citoquininas la más usada es la Kinetina, mientras que la auxina utilizada con más frecuencia es 2,4-D, de igual modo, la relación auxina:citoquinina más eficiente para la inducción de callos es de 1 (Flick y colb. (1983). III.3.2.1- AUXINAS

Las auxinas (del griego auxein = incrementar) fueron identificadas por primera vez por Went en 1926, quien describió la acción elongadora del IAA en coleóptidos de avena. Posteriormente se hallaron mas auxinas naturales, de las cuales la más usada en cultivo de tejidos es el IAA, y otras sintéticas o reguladores de crecimiento de las cuales las más usadas son el 2,4 -D, el NAA y el IBA (Krikorian, 1991).

Los efectos de las auxinas más importantes para el cultivo de tejidos son el crecimiento celular y la elongación celular. Algunos tejidos sólo forman callos en respuesta a una auxina en particular, siendo a veces necesario utilizar altas concentraciones de auxina para la iniciación del callo, aunque en el caso del 2,4D, se ha observado efectos inhibitorios a concentraciones mayores a 1 mg/litro.



Lepidium


Este regulador es la auxina más efectiva para la proliferación de callos usándose a concentraciones de 10

-7

– 10

-5

M y aún en ausencia de una

citoquinina exógena (Yeoman y Forche, 1980).

Además de inducir la proliferación celular, el 2,4 -D tiende a suprimir la morfogénesis del callo, por lo que su uso no es recomendado para estudios de diferenciación (Yeoman y Forche, 1980). En Arabidopsis thaliana, la brassicacea mas estudiada, la auxina mas usada en la obtención de callos en diferentes explantes es el 2,4-D, sea junto a una citoquinina o a leche de coco (Morris y Altmann, 1994). III.3.2.2.- CITOCININAS

En 1954 Skoog y Miller descubrieron un compuesto muy activo en la promoción de la citocinesis, el que se formaba por la descomposición parcial de ADN, llamándolo cinetina (Kinetina, KIN) y propusieron el término cinina para denominar las sustancias naturales y sintéticas que presentaban el mismo tipo de actividad biológica. Posteriormente para evitar confusiones con la sustancia usada en cultivo de tejidos animales, se optó por el nombre citocinina para estas sustancias (Krikorian, 1991).

Las citoquininas se caracterizan por su habilidad para estimular la división celular en el cultivo de tejidos cultivo, induciendo la división celular sincrónica a las 18 h (Szweykowska, 1974), y, en presencia de una auxina, estimular la formación de brotes e inhibir el enraizamiento (Dodds y Roberts, 1995).

Las citoqu ininas mas usadas son la kineti na y la zeatina, siendo compuestos sintéticos, mientras la zeatina es una citoquinina natural (Dodds y Roberts, 1995).



Lepidium


Hay excepciones en el requerimiento de auxinas y citoquininas, así algunos cultivos no requieren de una auxina exógena y otros requieren de una auxina y no de una citoquinina (Dodds y Roberts, 1995). Se ha observado además que en todos los casos las citoquininas a altas concentraciones (10 –25 mg/l) inhiben la formación de callos (Yeoman y Forche, 1980).

En Lepidium peruvianum, Carhuaz (1997, comunicación personal) utilizó un factorial de medios con cuatro auxinas (IAA, IBA, NAA, y 2,4-D) y cuatro citoquininas ( BAP, KIN, ZEA, Y 2ip) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0 y 100 µM,

utilizando como explantes, la raíz, hoja, peciolo e hipocótilo.

III.3.3.- EL EXPLANTE

Los requerimientos hormonales para la iniciación del callo dependen del origen del tejido aislado (explante), los explantes que contienen células del cambium pueden formar callos sin adición de reguladores de crecimiento; pero la mayoría de los explantes requiere de uno o más reguladores de crecimiento para iniciar la formación de callos (Dodds y Roberts, 1995). Esta respuesta también depende del estado fisiológico del tejido y del tiempo de escisión, (Yeoman y Forche, 1980).

Los explantes pueden ser clasificados de acuerdo a sus requerimientos exógenos de la siguiente manera: 1) auxinas 2) citoquininas 3) auxinas y citoquininas 4) extractos naturales complejos (Dodds y Roberts, 1995). III.3.4.- CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS

Las plantas siguen siendo una importante fuente comercial de metabolitos secundarios, pero en algunos casos estas plantas no han sido sujetas a



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programas

intensivos de mejoramiento genético y se presentan además

problemas técnicos y económicos para su cultivo (Dodds y Roberts, 1995).

El cultivo de tejidos puede ser una alternativa para producir metabolitos secundarios cuya extracción a partir de las plantas que los producen puede resultar difícil o económicamente inviable, sea por el largo tiempo de espera necesario, por el riesgo de sobreexplotación al que se expone el cultivo; por las pequeñas cantidades de compuesto presente en la planta o por los controles a los que se someten a las plantas productoras (Robert y colb., 1991). Por otro lado el cultivo de tejidos puede ser utilizado para mejorar el cultivo de estas plantas (Dodds y Roberts, 1995).

La noción de que una línea celular altamente productiva podía ser seleccionada para generar compuestos útiles fue introducida en la década de 1970, en la década de los ochenta, las Universidades de Kyoto y Kitasato en cooperación con la industria privada, produjero n shikonina de Lithospermum erythrorhyzon y saponinas de ginseng respectivamente (Hara, 1996).

La producción de shikonina, un pigmento que se extrae de las raíces de la planta asiática Lithospermum erythrorhyzon es un ejemplo de la efectividad del uso del cultivo de tejidos vegetales en la producción de metabolitos secundarios. En la planta el rendimiento de shikonina, además de ser muy bajo, depende de la distribución geográfica y el clima, habiendo sufrido una rápida disminución en su población. Luego de establecer una estrategia de producción in vitro, la empresa petroquímica Mitsui del Japón logró la primera pr oducción industrial del compuesto, vendiendo a 4000 dólares el kilo de shikonina producida in vitro (Robert y colb., 1991).



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En la década de los noventa el número de compuestos producidos por cultivo de tejidos aumentó y la mejora de la tecnología Hara permitió obtener compuestos raros en los recursos vegetales naturales. Un ejemplo de esta tecnología es la producción comercial, por Kao, de un polisacárido tuberoso usado en cosméticos (Hara, 1996).

Actualmente exi sten al menos tres programas de búsqueda

de

compuestos con actividad biológica, llevados a cabo por las industrias farmacéuticas, cada año varios cientos de plantas son colectados y se intenta en ellas la inducción de callos, con un éxito de cerca al 50%. Cerca del 10% de los callos muestra alguna forma de actividad ( Schripsema, y colb., 1996).

Todo el proceso desde la colección hasta la obtención de un compuesto puro es estimado entre los 2 y 4 años. Algunos resultados de estas búsquedas han sido publicado s y patentados , como el alcaloid e jatrorrhizina y los dehidrodiconiferil alcohol glucósidos aislados de cultivos celulares de Plagiorhegma dubium Maxim (Schripsema y colb., 1996).

La búsqueda de nuevos compuestos a nivel de callos tiene la ventaja de reducir el número de cultivos de interés, muchas veces el paso de callos a suspensiones celulares representa una reducción considerable de los niveles de ciertos metabolitos secundarios, ocurriendo algunas veces la pérdida completa de productividad para ciertos productos, lo que no significa que los cultivos celulares no sean capaces de producir compuestos de interés, por el contrario, Ruyter y Stöckingt (1989 citados por Schripsema y colb., 1996) demostraron que los cultivos celulares son una excelente fuente de nuevos compuestos.

Las ventajas esperadas del cultivo de tejidos en la producción de metabolitos secundarios son las siguientes:



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•

Producción a escala industrial

•

Producción de sustancias difíciles de obtener por extracción o por síntesis química

•

Reducción de los costos de producción a largo plazo

•

Eliminación de la dependencia en materia de importación

•

Producción continua y controlada de sustancias independiente- mente de los factores del medio ambiente.

•

Precios estables

•

Posibilidad de realizar la producción cerca de las fábricas de procesamiento final y de los mercados.

Se ha estudiado también la posibilidad de aumentar significativamente la productividad del cultivo usando un medio de inducción (para la producción de los metabolitos secundarios) (Becker, 1987). III.4.- CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es la técnica analítica usada para la separación de mezcla s y sustan cias, por adsorci ón s electi va ( Microsoft® Encarta® Online Encyclopedia 2001) y fue descubierta por el botánico ruso Michael Tswett en 1903, quien descubrió que los pigmentos de las plantas podían separarse al filtrarlos con éter de petróleo a través de una columna de carbonato de calcio. Pero el desarrollo de esta técnica empieza realmente en 1931, cuando, posteriormente otros investigadores introducen otros materiales como las columnas de silicagel, papel (Randerath, 1968).

Actualmente se usa un amplio rango de técnicas cromatográfi cas de acuerdo a los adsorbentes usados, la cromatografía de columna utili za sílica, alúmina y sílica gel; en la cromatografía de capa fina el adsorbente se encuentra



Lepidium


sobre un vidrio o una película plástica, mientras que en la cromatografía de papel, una muestra líquida fluye sobre el papel adsorbente. Otras técnicas cromatográficas son: la cromatografía gas-líquida, que permite la separación de sustancias que pueden ser volatizadas; la cromatografía iónica donde un gas puede ser descompuesto en iones que interactúan con el a dsorbente; la cromatografía de permeación de gel usa un adsorbente con poros de tamaño uniforme, y finalmente, la cromatografía líquida de alto donde

el

adsorbente

es

líquido,

esta

perfomance (HPLC)

técnica es ampliamente usada

actualmente (Microsoft® Encarta® Online Encyclopedia 2001). III.5.- ELECTROFORESIS EN GEL

La electroforesis en gel es un método de separación, en el que las partículas cargadas migran hacia un electrodo de carga opuesta bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado externamente. Este movimiento se realiza en interacción con la matriz circundante, la cual actúa como un filtro molec ular, generándose como consecuencia, tasas d iferenciales de migración para las proteínas contenidas en una muestra (Garfin, 1990).

Los primeros trabajos de electroforesis fueron realizados en soportes de pap el y ace tat o de celu los a, y se uti liz aron p rincipalmente para separar aminoácidos, péptidos y mezclas proteicas mal separadas por cromatografía (Freifelder, 1979), los soportes pueden ser relativamente inertes, como papel, acetato de celulosa, silicagel, alúmina y celulosa y actuar como tamices moleculares como son los geles de almidón, agarosa y poliacrilamida (Hames, 1981, citado por Gálvez, 1990). El método más utilizado es la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), por proporcionar un tamaño de poro controlable, ser repetible y de alta resolución (Garfin, 1990).



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Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización del monómero de acrilamida y un co-monómero de ligamiento cruzado, la N,N’ -metilenbisacrilamida. Esta polimerización es catalizada por un sistema generador de radicales libres, compuesto por persulfato de amonio, que actúa como iniciador, y un acelerador, el tetrametiletilendiamida TEMED, que causa la formación de radicales libres a partir del persulfato de amonio, los que a su vez catalizan la polimerización del gel (Garfin, 1990). Otro agente donante de radicales libres es la riboflavina, pero a diferencia del persulfato de amonio requiere de luz y oxígeno, agentes que convierten la convierten a su forma leuco, la cual inicia la polimerización (Gálvez, 1990).

Los poros se forman por la naturale za del enlace cruzado entre la acrilamida y la bisacrilamida, y su tamaño disminuye a medida que la concentración de acrilamida aumenta, determinando sus propiedades como tamiz.

La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños, formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utili za la electroforesis denaturante (SDS – PAGE)(Garfin, 1990).

La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños, formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas



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de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utili za la electroforesis denaturante (Garfin, 1990), en la cual se utilizan detergentes iónicos como el SDS (sodium dodecyl sulfato) el mismo que neutraliza la cargas de la proteína de tal forma que las proteínas migran por efecto de su peso molecular, las muestras en este caso deben ser tratadas con SDS y un tiol, como el me rcaptoetanol. (Gálvez, 1990).

El método más popular es el SDS-PAGE desarrollado por Laemmli en 1970 (Garfin, 1990), el cual consiste en un método discontinuo con dos tipos de geles: un gel de separación y uno de concentración, ambos geles tienen diferentes porosidades y pH, sirviendo el segundo como un medio anticonvectivo, donde la muestra se apila antes de pasar al gel de separación que se halla inmediatamente debajo y que posee un tamaño de poro más pequeño. Además, se utilizan diferentes buffers para el gel y los electrodos, esta discontinuidad permite concentrar grandes volúmenes de muestra en el gel de concentración, resultando en una mejor resolución (Laemmli, 1970).


glucosinolatos en maca peruvian.docx

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