UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS -
“ESPE”
Microbiología I Nombre: Andrés Acosta
NRC: 3310
Título: Frotis y tinción simple y diferencial de levaduras Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, asa bacteriana, azul de metileno. Resumen: Se realizó dos frotis de Saccharomyces cerevisiae cerevisiae (levadura) en distintos portaobjetos aprendiendo el método método correcto para esta técnica. Luego Luego se llevó cada placa a diferente tinción (simple y diferenciada) para distinguir las diferencias entre estas técnicas. Una vez teñidas las placas se las observo al microscopio con en el lente 100X con aceite de inmersión. Introducción Antecedentes: Para lograr la identificación de levaduras ya sea con fines de diagnóstico o estudios taxonómicos se ve la necesidad de observar sus estructuras con gran nitidez y contraste, es por esto que se util izan una variedad de compuestos químicos que nos permitan logran en general una tinción diferencial entre las paredes y el citoplasma de las células (González, Diamont , & Guitiérrez , 2011). Justificación: La práctica se llevó a cada para conocer y practicar el método correcto para realizar un adecuado frotis evitando contaminar tanto la muestra como el área de trabajo. Además, para lograr observar al microscopio la diferencia de una tinción simple y una tinción diferencial en Saccharomyces cerevisiae, cerevisiae, identificando las estructuras que se puedan llegar a apreciar. Marco Teórico: Las tinciones se clasifican en: tinción simple, cuando toda la muestra se tiñe con un solo colorante y se tiñe de un solo color; y tinción diferencial, cuando se observa más de un color ya que se hace uso de varios colorantes (López , y otros, 2014). Objetivos General: Realizar el frotis y tinción simple y diferencial de levaduras. Específicos - Llevar a cabo la técnica de frotis aprendida en laboratorio con Saccharomyces cerevisiae. cerevisiae. - Aplicar la tinción simple y diferencial es muestra de Saccharomyces cerevisiae. cerevisiae. Hipótesis: Al realizar la tinción de muestras de levadura se logrará apreciar sus estructuras al ser observadas en el microscopio. Materiales y métodos: En el laboratorio de microbiología se realizó la práctica de frotis y tinción simple y diferencial de levaduras el 8 de noviembre de 2017, a cargo de la Lic. Alma Koch y Andrés Acosta.
Para realizar el frotis de dos placas, primero se esterilizó el asa bacteriana con el uso del mechero Bunsen y se tomó la muestra de un tubo con cultivo de Saccharomyces cerevisiae esterilizando la boca del tubo en el mechero, después se introdujo el asa bacteriana para tomar un poco de muestra, se esterilizó nuevamente la boca del tubo y tapo. Se esparció la muestra en un portaobjetos con ayuda del asa bacteriana, inmediatamente se la esterilizó y el portaobjetos con el frotis listo se secó cerca de la llama del mechero. Una vez seco se fijó la muestra pasando la placa por el fuego cuatro veces. Una vez fijada la muestra en el portaobjetos se realizó la tinción simple, se colocó etanol al 40% por 1 minuto, azul de metileno por 2 minutos y etanol al 10% por 5 segundos, se enjuago con una piseta y secó a presión con papel toalla. Para la tinción diferencial, se colocó etanol al 40% por 1 minuto, hidróxido de sodio (KOH) 1M por 20 minutos, azul de metileno por 2 minutos y etanol al 10% por 5 segundos, se enjuago con una piseta y secó a presión con papel toalla. Ambas placas se observaron al microscopio con los lentes objetivo 4X, 10X, 40X y 100X con aceite de inmersión (Gamazo, López, & Díaz , 2005). Resultados: En la placa con tinción simple al ser observado con el lente objetivo 100X se logró identificar algunas estructuras de levaduras como núcleo y pared celular, en esta placa se observó también objetos extraños llamadas artefactos, todo esto se puede apreciar en la figura 1. En la placa con tinción diferencial se identificó de mejor manera el núcleo teñido de un color azul intenso, además se observó vacuolas de un color azul tenue, como se ve en la figura 2.
Figura 1 Saccharomyces cerevisiae con tinción simple observada a 100X y presencia de artefactos en el campo óptico
Figura 2 Saccharomyces cerevisiae con tinción diferencial observada a 100X
Discusión: Para poder observar muestras de microorganismo se debe realizar adecuadamente la técnica del frotis cuidando en todo momento evitar la contaminación tanto del área de trabajo con las muestras y placas con las que estamos trabajando (Gamazo, López, & Díaz , 2005). La diferencia fundamental entre una tinción simple y una tinción diferencial, es que en la simple se puede observar las estructuras de las levaduras con menos detalle que en la diferencial ya que en esta se realiza una coloración de contraste para poder apreciar más a detalle las estructuras internas y externas de las levaduras (González, Diamont , & Guitiérrez , 2011). Conclusiones - Llevar a cabo la técnica del frotis no implica mucha complejidad, pero sí manejo del espacio de trabajo.
- La tinción simple ayudó a la observación de levaduras diferenciándolas del campo óptico y a identificar con poco detalle sus estructuras, mientras que la tinción diferencial además permitió ver con mayor detalle las estructuras de la célula. Bibliografía Gamazo, C., López, I., & Díaz , R. (2005). Manual práctico de microbiología. Barcelona : Elsevier España. González, M., Diamont , D., & Guitiérrez , B. (2011). Técnica de tinción de estructuras fúngicas con colorantes vegetales con una alternativa no contaminante. Bioagro, 65-68. López , L., Hernández , M., Colín , C., Ortega, S., Cerón , G., & Franco, R. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología . Investigación en Discapacidad , 10-18.
