FOTOSÍNTESIS Miriam Contreras, Daniela Luis, Joskua Malfavón, Jassihel Ordaz, y Diego Villagrán. Equipo 1. Laboratorio de Bioquímica Dinámica, Ingeniería en Biotecnología, Coatzacoalcos, México.
Introducción La fotosíntesis es un proceso que metabólico que realizan las plantas, las cianobacterias y algunos protistas para convertir energía lumínica a química y almacenarla en enlaces de azúcares (Carter, 2014). En los organismos eucariontes se realiza en los cloroplastos, y se lleva a cabo siguiendo la reacción general: 𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑎𝑟 + 6 𝐻2 𝑂 + 6𝐶𝐶𝑂2 → 𝐶6 𝐻12 𝑂6 + 6𝑂2 + 𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 Por cada 6 moléculas de agua y 6 moléculas de dióxido de carbono se producen una molécula de glucosa y 6 moléculas de oxígeno. La fotosíntesis no es un proceso simple y consta de múltiples etapas. Las primeras etapas se conocen como reacciones lumínicas y se encargan de convertir la energía solar en energía química produciendo oxígeno como producto de desecho, y se da en las membranas de los tilacoides. Las segundas reacciones se conocen como Ciclo de Calvin (o reacciones de oscuridad) y producen moléculas de azúcar utilizando el CO2 y los productos de alto contenido energético de las reacciones lumínicas, siendo llevadas a cabo en el estroma. La absorción de la luz se logra gracias a pigmentos: la clorofila es un pigmento verde común a todas las células fotosintéticas, la cual es “apoyada” por
pigmentos accesorios que absorben la energía que la clorofila no absorbe (Farabee, 2007). Con ésta práctica se pretende un acercamiento al complejo e importante proceso de la fotosíntesis, para ello se realizarán diferentes procedimientos, empezando por la identificación de los cloroplastos en las células vegetales vivas mediante el uso del microscopio, seguida de una identificación de los pigmentos fotosintéticos mediante una técnica de separación llamada cromatografía y terminando con la medición de la tasa fotosintética mediante un ensayo de discos flotantes. Los discos de hoja normalmente flotan. Cuando los espacios de aire se infiltran con una solución, la densidad de la hoja se incrementa y los discos se precipitan. La solución de infiltración incluye una pequeña cantidad de bicarbonato de sodio. Los iones de bicarbonato sirven como una fuente de carbono para la fotosíntesis. Durante el proceso de la fotosíntesis se libera oxígeno del interior de la hoja, cambiando así, que el disco flote. La respiración celular por su parte consume oxígeno y se da al mismo tiempo que la fotosíntesis; la velocidad que se demoran los discos precipitados en flotar es una medida indirecta de la tasa de fotosíntesis.
Metodología
Identificación de cloroplastos
Se cortó una hoja de elodea, se colocó en un portaobjetos, se agregó una gota de agua, se cubrió con el cubreobjetos y se observó en el microscopio con los objetivos 10x y 40x.
Identificación de clorofila por cromatografía
En un vaso de precipitado de 250 ml se colocó etanol hasta alcanzar un centímetro de profundidad y se cubrió con un vidrio de reloj para crear una atmósfera alcohólica en su interior. Se cortaron hojas de espinaca y se trituraron en mortero junto a 5 ml de acetona, siendo macerados hasta crear una mezcla homogénea; esta mezcla se filtró usando una gasa hasta obtener un líquido. En un pedazo de papel filtro de 2 X 10 cm se marcaron dos líneas paralelas en cada borde con un lápiz. Con un tubo capilar se colocó muestra en una de las líneas marcadas. Se introdujo el papel filtro con la muestra hacia abajo dentro del vaso con alcohol (evitando tocar las paredes y procurando que la muestra no entrara en contacto con el solvente). Con el papel en forma vertical se dejó correr el solvente por absorción en el papel filtro hasta alcanzar la línea superior. Finalmente, se retiró el papel y se dejó secar a temperatura ambiente para poderrealizar el cálculo de Rf para cada pigmento separado.
Ensayo de disco flotante para comprobar la fotosíntesis
Se dispusieron en un vaso de precipitado 20 ml de una solución de bicarbonato de sodio al 0.2%, mientras que en otro vaso se disponían 20 ml de agua destilado, los
cuales se usaron como control del experimento. Se adicionaron 5 ml de jabon líquido al vaso con bicarbonato, humedeciendo la superficie hidrofóbica de la hoja y permitiendo que las soluciones penetren el interior de los tejidos. Se cortaron con un sacabocados alrededor de 15 discos uniformes de hoja de espinaca fresca para cada ensayo, evitando obtener discos conteniendo parte de venas centrales. Se seleccionaron los discos, se removió el pistón de la jeringa y se colocaron dentro los discos para después volver a colocar el pistón y se empujó para dejar un pequeño volumen de aire para los discos de hoja. Se succionó un pequeño volumen de bicarbonato de sodio y se resuspendieron los discos. Se puso el dedo índice en la abertura de la jeringa y se jaló el pistón para crear un vacío que se conservó durante 10 segundos, logrando que el bicarbonato se infiltrara en los espacios de aire de los discos de hoja. Se colocaron los discos y la solución dentro de un vaso de precipitado y se adicionaron 10 ml de la solución de bicarbonato de sodio. Para el tratamiento control se infiltraron los discos únicamente con agua y jabón líquido sin adicionar bicarbonato. Para finalizar, se colocaron ambos tratamientos, previamente etiquetados, en una fuente de luz y se empezó a contabilizar el tiempo, contando después de cada minuto el número de discos que flotaron, continuando con el conteo hasta que todos los discos se encontraban a flote. Resultados El valor de retención (Rf) se define como el ratio de la distancia recorrido por el soluto y la distancia recorrida por el solvente a través del papel (Mifsud, 2002), siendo ambas distancias medidas a partir de la línea base en la cual se colocó
inicialmente la muestra. Cada compuesto tiene un valor Rf específico para un solvente y concentración específicos, lo cual es muy útil para identificación de compuestos desconocidos (Mifsud, 2002). Con 6.5 cm de desplazamiento para el soluto proveniente de las hojas de espinacas y 7.8 cm para el desplazamiento del etanol se obtuvo un valor de Rf = 0.83. Con respecto al ensayo de disco flotante, el valor de ET50 fue igual a 7. Tabla 1.- Ensayo de disco flotante
Tiempo (min) 0 1 2 3 4 5 7 9 10
Discos flotando 1 2 2 3 4 7 8 13 16
Gráfico 1.- Ensayo de disco flotante
Ensayo de discos flotantes 20 15 10
disminuyendo la densidad y permitiendo que los discos floten, lo cual pudo observarse en la realización de la práctica. El valor de Rf = 0.83 es bastante cercano a 0.9, valor propio del caroteno, pero difiere al valor de la clorofila, puede ser que sólo hayamos registrado la distancia del pigmento carotenoide, ya que sólo se anotó de una línea en vez de todas las que se obtuvieron con la cromatografía de papel. Conclusiones La cromatografía de papel indicó que las hojas poseen varios pigmentos, siendo uno de ellos un carotenoide con Rf = 0.83. En cuanto a la prueba de disco flotante ET50 = 7. Bibliografía Carter, J. S. (13 de Enero de 2014). Photosynthesis. Obtenido de UC – Clermont Biology Home Page: http://biology.clc.uc.edu/courses/b io104/photosyn.htm Farabee, M. (2007). What is photosynthesis? Obtenido de Photosynthesis: http://www2.estrellamountain.edu /faculty/farabee/BIOBK/BioBook PS.html
5 0 -5 0
5
10
Discusión A medida que la solución de bicarbonato de sodio entra en la hoja y obliga al aire a salir la masa adicional hace que los discos se hundan en la solución. A medida que la fotosíntesis ocurre, el oxígeno producido llena los espacios intercelulares,
Mifsud, S. (30 de Agosto de 2002). RF Values. Obtenido de Chemistry: Chromatography: http://www.marzkreations.com/Chemistry/160Chemistry.html
