Fluorescencia Tp 2

Técnicas Analíticas Instrumentales

Trabajo Trabajo Práctico Nº 2

Espectroscopia de Fluorescencia Fluorescencia

RESUMEN En el siguiente trabajo se aprendió el manejo de aparatos tales como el Nanodrop !!! "espectro#luorímetro$ % Nanodrop &!!! "Espectro#otómetro$' (on los resultados obtenidos se armaron grá#icas % cur)as de calibración* por medio de las mismas se +alló la concentración de una muestra incógnita'

INTRODUCCIÓN

,a #luoresceína "(2!-&2./$ del grupo de la 0antinas es una molécula +idrosoluble de color roji1o intenso* sus enlaces doble conjugados captan un #otón de alta energía % lo de)uel)en como #otón de baja energía produciendo #luorescencia' ,a #luorescencia es un tipo particular de luminiscencia la cual consigue la e0citación mediante la absorción de energía en #orma de radiación electromagnética denominada #otón' na de sus características es absorber las radiaciones en la longitud de onda del 3 % transmitir a longitudes más largas en el 3 3isible* es decir* absorben #otones con una determinada energía % liberan #otones con una energía menor' Este proceso es inmediato* donde el tiempo de absorción % emisión ronda en los &!  segundos* cuando se cesa la radiación también cesa el #enómeno de #luorescencia' En el procedimiento la lu1 emitida es #iltrada* recogida % medida por un detector* normalmente un tubo #otomultiplicador "P6T$* % cuanti#icada en unidades relati)as de #luorescencia "7F$' E0isten )ariables 8ue se deben tener en cuenta para reali1ar las mediciones* estas a#ectan la #luorescencia tales como9 la estructura* temperatura* sol)ente* p-* concentración % 8uenc+ing "se re#iere a cual8uier proceso 8ue disminu%e la intensidad de un #luoró#oro sin cambiar el espectro de emisión$' n método e#ecti)o para descubrir la concentración de una muestra incógnita es +acer diluciones seriadas de la muestra madre o stoc:* medir sus absorbancias % luego aplicar la ecuación de ,ambert4;eer teniendo ciertos recaudos en las limitaciones' n #actor 8ue se debe tener en cuenta es la detección de puntos discrepantes ")alor e0tremo 8ue sobresale del resto de los )alores de un conjunto de datos$ o puntos correspondientes a concentraciones mu% ele)adas' Aun8ue no todos los puntos discrepantes a#ectan de igual manera a la recta de calibrado tiene muc+a más in#luencia los puntos situados en los e0tremos 8ue los situados en el inter)alo' ,a presencia de estos
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL  A partir de 5 diluciones seriadas &=2 de una solución madre de #luoresceína P6>2*!?gr=mol en !*&6 en P;@ "bu##er #os#ato salino P. p->B$ se lle)ó a cabo un barrido de emisión de las distintas soluciones a tra)és de un nanodrop !!! % un barrido de absorción de las mismas a tra)és de un nanodrop &!!!' El primer procedimiento se reali1ó por medio de una micropipeta calibrada* se tomó cada dilución seriada en un orden creciente de concentración* para no arrastrar muestra entre pipeteos % a#ectar la concentración* se insertó cuidadosamente en un nanodrop !!' 4 

El barrido se reali1ó en un rango de !!4B/! nm* a partir de los datos proporcionados por el detector los 7F "relati)e #luorescence units$ se constru%ó un grá#ico de 7F )s concentración de las muestras % se obtu)o la ecuación de la línea de tendencia % el )alor de 72' ,uego se procedió a calcular la concentración de una muestra incógnita de #luoresceína' En el barrido de absorción de diluciones seriadas de #luoresceína se obtu)o el espectro de absorción en un rango de 22!4B/! nm de las diluciones seriadas % se determinaron sus longitudes de onda má0ima' ,uego se constru%ó una cur)a de calibración "absorbancia )s concentración$* % se procedió a calcular la ecuación de la recta lineal de lambert4beer se eliminó los puntos discrepantes de la misma para reducir el margen de error % se usó esa

ecuación para calcular la muestra incógnita la cual se interpolo al grá#ico de regresión lineal'

RESULTADOS &' Espectroscopia 343I@I;,E * resultado obtenidos con el Nanodrop !! * se mide absorbancia de las diluciones seriadas de #luoresceína'

@e eligió una longitud de onda donde las muestras absorban en todos los puntos de #orma continua

longit! !e on!a

concentraci"n #M$

a%sor%ancia

2 nm

!*!!!B5&2/

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!*!2/

2*&?

@e e0trapolan los resultados a una grá#ica 9

Para mejorar la regresión lineal se descartaron los puntos discrepantes correspondientes a los )alores de absorbancia 2*&? % 2*&C2 %a 8ue los mismos no pertenecen a la porción lineal de la cur)a* no puede considerarse al aplicar la ecuación de ,ambert4;eer %a 8ue no es )álida más allá de dic+a línea'

@e +acen los cálculos de la ecuación de la recta para a)eriguar la concentración de la muestra incógnita9

 &'()*+,*X -)+./)0 Donde la )ariable  indica la absorbancia %G la )ariable 0G indica la concentración'  Absorbancia "2 nm$ > &*?B &*?B4!*&!B > H  !/*C/

 X' /+,,1 2.) M "(.N(ENT7A(IJN 6E@T7A IN(JKNITA$ 3(

7edondeamos cumpliendo con método de ci#ras signi#icati)as a  *2.)  M 3(

@e interpolo la muestra incógnita en el grá#ico de regresión lineal demostrando 8ue concuerda con dic+a recta9

2$ @e reali1ó las distintas mediciones de la misma diluciones de la muestra de #luoresceína* pero esta )e1 con un Espectro4ot"5etro el instrumento utili1ado #ue el nanodrop &!!! 9

@e plantea utili1ando como en el caso anterior la utili1ación de la ecuación de la recta para calcular la concentración de la muestra stoc: o madre 9 7F"@T!(L$> C//2*

 &'62.) 3/7/0+1 0

Donde la )ariable % indica el 7F %G la )ariable 0G indica la concentración' 0> C//2*2 M ?B*5 > *2.)3( M "concentración muestra incógnita$   20&! B

@e interpolo la muestra incógnita en el grá#ico de regresión lineal demostrando 8ue concuerda con dic+a recta9

DISCUSIÓN  Anali1ando los resultados obtenidos se obser)ó 8ue la intensidad de #luorescencia medida en unidades de 7F no se registró en las muestras uno* dos % oc+o' ,a intensidad de #luorescencia es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente "relación lineal$* debido a 8ue al +aber ma%or n
oc+o % la siete' A medida 8ue se anali1ó las muestras más concentradas se obser)ó un incremento de la absorbancia +asta un punto en 8ue la má8uina no detectó emisión' Esto sucedió a partir de la muestra dos* lo cual se pudo deber a 8ue una de las limitaciones de la ,e% es 8ue solo se puede aplicar a diluciones de mu% baja concentración* %a 8ue a altas concentraciones la distancia entre partículas absorbentes es tan pe8uea 8ue se produce una modi#icación en la distribución de cargas de las mismas* lo 8ue se traduce en una alteración en la capacidad de absorción a una longitud de onda determinada'

CONCLUSIÓN @e conclu%e 8ue la intensidad de #luorescencia % absorbancia son directamente Proporcionales a la concentración de la muestra si las soluciones se encuentran en los límites de )alide1 la le% de ,ambert ;eer'

8I8LIOGRA9ÍA Ouímica .rgánica *7alp+ ''Fessenden % oan @' Fessenden* Editorial Iberoamericana*&C52 Principios de Análisis Instrumentales "se0ta edición$Q Douglas A' @:oog % F'ames -ollerQ 2!!5'  Análisis Ouímicos 6étodos Técnicas Instrumentales 6odernasGQ Francis % Annic: 7ouessacQ 2!!Q 6acKraR4-ill