Espe Espect ctro rosco scopí pía a de Fluor Fluores esce cenci ncia a
Ana Denicola
DIAGR DIAGRAMA AMA DE JABLO JABLONSK NSKII (1898(1898-198 1980) 0)
relaja relajació ciónn vibrac vibracion ional al S2
conv conver erssión ión int interna erna IC relaja relajació ciónn vibrac vibracion ional al cruc cruce e int inters ersiste istema mass ISC T1
S1 kNR IC
h
A
h
kNR ISC F
h
P
S0 fluorescencia
fosforescencia
DIAGR DIAGRAMA AMA DE JABLO JABLONSK NSKII (1898(1898-198 1980) 0)
relaja relajació ciónn vibrac vibracion ional al S2
conv conver erssión ión int interna erna IC relaja relajació ciónn vibrac vibracion ional al cruc cruce e int inters ersiste istema mass ISC T1
S1 kNR IC
h
A
h
kNR ISC F
h
P
S0 fluorescencia
fosforescencia
LUMINISCENCIA
emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado
Se alcanza el estado excitado por absorción de luz en: FLUORESCENCIA
estado estad o singulet singuletee excitado, excitado, transición transición permitida, permitida, ns
FOSFORESCENCIA
estado triplete excitado, transición prohibida, ms
QUIMIOLUMINISCENCIA se alcanza el estado excitado por una reacción química
10-8 s 10-15 s 10-3 s
LA CLAVE ES LA ESCALA DE TIEMPO DE LOS PROCESOS: • ABSORCION: ~ 10-15 seg • CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg • FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg • FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transición “prohibida” por simetría) • RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg Los pasos propiamente dichos de absorción y de emisión son extremadamente rápidos, tanto que los núcleos no llegan a moverse (principio de Franck-Condon ). La absorción sólo da información del entorno inmediato a la molécula que absorbe. La relajación vibracional por lo general es mucho más rápida que la fluorescencia, entonces la molécula se relaja completamente y (en general) sólo vemos la emisión desde el estado S1. La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de movimientos moleculares, por eso el espectro de fluorescencia posee información de un entorno más amplio que el de absorción.
FLUORESCENCIA • 1er. paso: absorción o excitación energía suficiente para llegar a nivel electrónico superior S1 o S2 λ exc ESTADO EXCITADO
• 2do. paso: emisión de luz energía radiativa emitida menor que la absorbida, λ em > λ exc
Corrimiento de Stokes
RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA: Q = # fotones emitidos / # fotones absorbidos 0
kNR)
donde kNR son todos los procesos de decaimiento no radiativos TIEMPO DE VIDA: tiempo promedio que un fluoróforo pasa en el estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier vía) = 1 / (kF +
kNR)
TIEMPO DE VIDA NATURAL: es el tiempo de vida si sólo volviera por fluorescencia n
= 1 / kF
se puede calcular a partir de n
=
/Q
y Q:
Rendimiento (Q) = fotones emitidos fotones absorbidos
<1
= constante de velocidad de emisión = constante de velocidad de decaimiento no radiativo
= tiempo de vida intrínseca o natural , sin ningún proceso no radiativo
= tiempo de vida medida
Parámetros a medir en fluorescencia • Intensidad de fluorescencia (ISS) • Espectros de excitación y emisión (I F •
vs λ )
λ max(ex), λ max(em)
• Rendimiento cuántico de fluorescencia ( Q) • Vida media del fluoróforo (τ)
• Anisotropía (r) (tiempo de correlación rotacional) • Eficiencia RET (E) (distancia de Föster)
Intensidad de fluorescencia (estado estacionario) ISS
Iluminación continua
Intensidad resuelta en el tiempo (τ)
Pulso de luz
ESPECTROFLUORÍMETRO
ESPECTROFLUORÍMETRO
FUENTE DE LUZ
Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (lase, LED)
MONOCROMADORES excitación y emisión
vs FILTROS
ancho de banda polarizadores DETECTOR
tubo fotomultiplicador (PMT)
MUESTRA geometría de iluminación de la muestra
La medida de IF es relativa a la geometría del equipo
Usar soluciones diluidas A < 0..05
Control con solo solvente
Usar adecuada λ exc, filtro, conc. fluoróforo
Filtrar la solución
Intensidad de Fluorescencia y concentración del fluoróforo
Efecto de filtro interno
Cuantificación del fluoróforo midiendo Intensidad de fluorescencia I F IF (λ ex, λ em) = IA
Φ
Z
Z = factor instrumental Φ=
rendimiento cuántico de F
IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l) ε
= coef. Absortividad a λ exc
c = concentración del fluoróforo
Si Aλ << 1
⇒
IA = I0 (2.3 ε c l)
IF (λ ex, λ em) = I0 IF
Φ
Z 2.3 ε c l
es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas
Fluoróforos en bioquímica • Fluorescencia intrínseca fluorescencia natural, propia del sistema
• Fluorescencia extrínseca agrego a la muestra un fluoróforo externo (sonda fluorescente)
Fluorescencia en: • Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano. Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP y derivados.
• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se
agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI) o fosfolípidos marcados
• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas
liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)
Fluorescencia en: • NAD(P)H • FAD, FMN • Piridoxal fosfato (PLP) • Clorofilas • Indicadores fluorescentes (pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)
4.7 ns en solución (2.3 ns FMN) 0.3-1 ns unido a prot.
0.4 ns en solución 1-5 ns unido a DH
Phe
Abundanc ia: 3.5%
ex = 260 nm, em= 282 nm (Q. ~ 5) Insensib le al entorno
Tyr
Abundanc ia: 3.5%
ex = 275 nm, em= 303 nm (Q. ~ 220) Insensible al entorno, quencheable Ionizable, tiro sinato emite (
Trp
Abundanc ia: 1.1%
ex = 295 nm, em= 350 nm (Q. ~ 770) Sensi ble al ento rno , quencheable Varias
Sondas fluorescentes para proteínas
Fluoresceína (y Rodaminas) absorbe y emite en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1
DNS-Cl sensible a polaridad del entorno, fluorescencia polarizada
Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH
Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos
Bases modificadas fluorescentes
GFP = Green Fluorrescent Protein
Formación espontánea del fluoróforo al plegarse
Relajación por solvente Transferencia de energía
X
hν
X*
Quenching Transferencia de carga Disociación de H+
hν’
(ns)
Formación de complejos Formación de oligómeros
Efectos del solvente y del entorno local sobre la fluorescencia
H = hexano CH = ciclohexano T = tolueno EA = acetato de etilo Bu = butanol
Efectos del solvente y del entorno
k
>> 1/τ
k∼
1/τ
Corrimientos de Stokes dinámicos
Ecuación de Lippert-Mataga
hcΔν
=
2Δ f a3
( μ E − μ G ) 2 + const
El fluoroforo es consideredo un dipolo en un medio continuo de constante dieléctrica (permitividad) uniforme Materiales dieléctricos, conductores y medios biológicos
Solvatación de iones Saturación dieléctrica en las cercanías del ión
Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej. unión a proteína)
HSA = albúmina humana ANS = Anilinonaftalensulfonato (fluoróforo muy sensible a la polaridad entorno)
Cambio en la emisión por cambio de solvente o cambio del entorno (ej. unión a proteína)
Determinar constantes de unión de un ligando si este es fluorescente y su fluorescencia cambia con la unión o si la fluorescencia intrínseca cambia por efecto de la unión de un ligando
Emisión del triptofano es sensible al entorno (ej. desnaturalización de proteína)
N = nativa U = desplegada “unfolded”
