Universidad Católica Santa Maria Facultad de Ciencias Farmaceúticas, Bioquímicas y Biotecnológicas Arequipa
Extracción y Purifcacion de Flavonoides a partir de pétalos de Rosa Lenny rana Sarmiento S!nc"e# Resumen Se realizó una extracción por Soxhlet de los pétalos de rosas rojas, primero se hace un desengrasado con éter que fue desechada, luego la extracción con etanol, la que se concentro y ltro, se hizo un reextracción con Acet Acetat ato o de Etilo Etilo por por tres tres ece eces, s, se dese desech cha a la fase fase eter eterea ea y se con conser sera a la fase fase aceti cetica ca!! Se ag agrregó egó cloroformo para formar un precipitado, se ltra y a la fase precipi ipitada se le resuspen pende en solucion ion etanolic lica! "rocede cedemo mos s a hacer cer las prue#as de identicación y determinación, como lo es la reacción de Shinoda y la reacción con el $ricloruro de Aluminio!
Summary Extr Extrac acti tion on by Soxh Soxhle lett o red rose rose peta petals ls you you made made,, frst frst degreasing ith ether hich as discarded is, ater extraction ith ethanol, hich as concentrated and flter, made a re! extraction extraction ith ethyl acetate three times, discarded the ether phase phase and and the aceti acetic c phase phase is prese preserv rved" ed" #hlor #hloroo oorm rm as as added to orm a precipitate, is fltered and the precipitated phase as resuspended in ethanol solution" $e proceed to ma%e identifcation tests and determination, as is the reaction o Shinoda and reaction ith aluminum trichloride"
&ntroducción 'os 'os (a (avo vono noide ides s lato sensu sensu son pigmen pigmentos tos casi casi univers universales ales en los vegeta vegetales" les" #asi siempre hidrosolubles, son responsables de la coloración de las (ores, rutos y a veces de las ho)as" *si ocurre con los (avonoides amarillos +chalconas, auronas, (avonoles amarillo amarillos, s, con los antocia antocianósi nósidos dos ro)os, ro)os, a-ules a-ules o violeta violetas" s" Si no son direct directame amente nte visibles, contribuyen a la coloración por su papel de copigmentos. asi ocurre con las
(avonas y (avonoles incoloros /ue copigmentan y protegen a los antocianósidos" En algunos casos, la -ona de absorción de la molecula se situa en el ultravioleta próximo. la 0coloración1 se percibe 2nicamente por los insectos /ue se sienten asi efca-mente atra3dos y guiados hacia el néctar y obligados por lo tanto a asegurar el transporte del polen /ue condiciona la supervivencia de la especie vegetal" 'os (avonoides se encuentran también en la cut3cula oliar y en las células epidérmicas de las ho)as, asegurando asi la protección de los te)idos contra los eectos nocivos de las radiaciones ultravioletas"
4istribución y locali-ación 4istribución 'a presencia de (avonoides en las *lgas no se ha demostrado hasta el momento" *un/ue son recuentes en 5ryophytas +6usgos y 7ep8ticas, se trata de (avonoides stricto sensu, mayoritariamente de $ y C$heterósidos de (avonas y de derivados $ urónicos" En Pteridophytas no es mayor la variedad estructural de (avonoides, las Psylotales y Selaginellales se caracteri-an por la presencia de bi(avonoides, las E/uisetales por la proantocianidoles" 'os $heterosidos de (avonoles dominan en los 7elechos /ue, seg2n algunos autores, elaboran asimismo chalconas o proantocianidoles" En 9ymnospermas, los proantocianidoles son bastante constantes y se observa la presencia, en #ycadales y #onierales +a excepción de Pinaceae de bi(avonides, ausentes en 9netales: la distribución de estos compuestos y de heterosidos de (avonas y (avonoles /ue los acompa;an var3a netamente, en este caso, en unción del órgano+le;o, corte-a, ho)as" 'a diversidad estructural de (avonas es m8xima en *ngiospermas. as3 una treitena de tipos de (avonoides se han podido identifcar en las *steraceae"
'ocali-ación 'os heterósidos de (avonoides, hidrosolubles, se acumulan en las vacuolas y, seg2n las especies, se concentran en la epidermis de las ho)as o se reparten entre la epidermis y el mesoflo +aun/ue estos dos te)idos pueden acumular de manera especifca estructuras dierentes, como se ha podido demostrar en algunos cereales" En el caso de las (ores, se concentran en las células epidérmicas" #uando los (avonoides se encuentran en la cuticula oliar, se trata casi siempre de geninas libres cuya lipoflia se incrementa por la metilación, parcial o total, de los grupos hidroxilo" Esto se refere sobretodo a plantas de regiones aridas o semi8ridas, generalmente provistas de estructuras secretoras"
Estructura =u3mica =uimicamente, estas sustancias son de naturale-a enólica y se caracteri-an por poseer dos anillos arom8ticos bencénicos unidos por un ouente de tres atomos de carbono, con la estructura general
C 6 −C 3 −C 6 '
los cuales pueden ormar o no un tercer anillo" 'os
anillos son denominados *, 5 y #: los atomos de carbono individuales son reeridos por
un sistema numérico, el cual utili-a n2meros ordinarios para los anillos * y # y n2meros primos para el anillo 5" 'os (avonoides naturales suelen presentar al menos tres hidroxilos enólicos y se encuentran generalmente combinados con a-ucares en orma de glucosidos, aun/ue también se presentan con relativa recuencia como agliconas libres +>,?" @arios subgrupos de (avonoides son clasifcados de acuerdo con la sustitución del anillo #" En esta clasifcación son de suma importancia el estado de oxidación del anillo heteroc3clico y la posición del anillo 5+?,A"
'os tipos de (avonoides est8n relacionados por una ruta biosintetica com2n, la /ue incorpora precursores de las rutas del shi/uimato y la acetato!malonato +B,C" Posteriores modifcaciones ocurren en varios estados, lo /ue resulta en la extensión de la hidroxilacion, metilación, isoprenilacion, dimeri-ación y glicosilacion, produciendo D! glicosidos y #!glicosidos"
Flavonas y (avonoles Presentes en vegetales y son los (avonoides mas comunes, distribuidos en todos los pigmentos amarillos de las plantas a pesar de los carotenoides
Flavanonas y (avanonoles Son incoloros o solo ligeramente amarillos, son compuestos /ue existen en muy pe/ue;as cantidades por eso son los (avonoides menos conocidos"Sus glicósidos son bien conocidos hesperidina y naringina! extraidos de la corte-a de los rutos c3tricos"
*ntocianinas Siempre se encuentran como glicósidos: después de la clorofla, son el grupo mas importante de pigmentos en las plantas visibles al o)o humano y proporcionan el color malva, rosa, violeta y a-ulado a numerosas (ores y rutos , como la fresa, la rosa, las manzanas y la ua constituyen hasta aproximadamente AG de su masa seca"
Propiedades 3sico!/u3micas, extracción Solubilidades y extracción *un/ue por regla general, los heterósidos son hidrosolubles y solubles en alcoholes, muchos de ellos poseen una escasa hidrosolubilidad +rutósido, hesperósido" 'as geninas son, en su mayor3a, solubles en disolventes org8nicos apolares: cuando contienen al menos un grupo enólico libre, se disuelven en disoluciones de hidróxidos alcalinos" 'os (avonoides lipóflos de los te)idos superfciales de ho)as +o de rondes se pueden extraer directamente con disolventes de polaridad media +diclorometano: seguidamente habr8 /ue separar las ceras y grasas /ue se extraen simult8neamente +se puede lavar en principio con hexano pero la selectividad de este disolvente no es absoluta" 'os heterosidos pueden extraerse, normalmente en caliente, con acetona o alcohol +etanol, metanol a los /ue se adiciona agua+? a CG seg2n /ue la droga sea resca o seca" Se puede seguidamente reali-ar una evapori-acicon al vacio y, cuando el medio contenga solo agua, proceder a una serie de extracciones li/uido!li/uido con disolventes no miscibles con el agua. con éter de petróleo /ue elimina clorofla y l3pidos: con dietileter /ue extrae las geninas libres: con acetato de etilo /ue arrastra la mayor3a de los heterósidos" 'os a-ucares libres permanecen en la ase acuosa )unto con, en caso de racaso, los heterósidos mas polares" 'a separación y purifcación de los dierentes (avonoides se unda en las técnicas cromatogr8fcas habituales +sobre poliamida, celulosa, gel de Sephadex, etc"" *l igual /ue para la mayor3a de metabolitos secundarios de los vegetales, la #'*R constituye en estos 2ltimos a;os el método de elección en el arsenal de las técnicas de aislamiento de heterosidos (avonicos +ases reversas #H o #>H con disolventes se tipo agua !o acetonitrilo, o I7F! J metanol J acido acético"
Propiedades biológicas 'a principal actividad atribuida a los (avonoides es la de ser 0 enoactios1, es decir, ser capaces de disminuir la permeabilidad de los capilares sangu3neos y aumentar su resistencia" En animal, pueden reducir la sintomatolog3a de una hipovitaminosis # esperimental" Esta propiedad le ha valido, durante un tiempo, el nombre de 0vitamina P1" *l no ser vitaminas +una carencia en (avonoides no ocasiona ning2n s3ndrome especial, se habla de 0actores vitam3nicos P1 o, me)or aun, de 0actores P1" Estos términos, ambiguos, tienden a no utili-arse. en la actualidad, a estod productos naturales y a sus derivados /ue los diccionarios especiali-ados incluyen ba)o la denominación general de 0vasculoprotectores y venotonicos1 se les denomina 0venotropos1" Este interés de los (avonoides en controvertido. as3, la F4* %Food & 'rug Administration(no les reconoce ninguna actividad: adem8s la lectura de tratados cl8sicos de armacolog3a no permite durar sobre la escasa importancia /ue, por regla general, se atribuye a su valor terapéutico"
&nhibición de la histidina descarboxilasa por el /uercetol o la naringenina: &nhibición de la elastasa: &nhibición de la hialuronidasa, por las (avonas y sobre todo por los proantocianidoles, lo /ue permite conservar la integridad de la sustancia undamental de la pared vascular: &nhibición no especifca de la catecol!D!metiltranerasa, lo /ue aumenta la cantidad de catecolaminas disponibles y provoca por tanto un aumento de la resistencia vascular: &nhibición de la osodiesterasa del *6Pc /ue explicar3a, entre otras y pro parte, su actividad antiagregante pla/uetaria: &nhibición de la aldosa reductasa! de la /ue se sabe /ue se encuentra implicada en la patogenia de la catarata &nhibición in vitro de la protein!%inasa sobre todo por la luteolina:
Dtras propiedades de los (avonoides, a menudo presentados como antiin(amatorios lo /ue es compatible con lo /ue se conoce como sus interacciones +in vitro con los polinucleares y los trombocitos o también con el metabolismo del acido ara/uidónico,
los (avonoides pueden ser antialérgicos, hepatoprotectores +isobutrina, hipidulina, (avanolignanos, antiespaspodicos sobre ileon de cobaya estimulado por diversos agonistas +(avonoides de tomillo y de otras 'amiaceae, hipocolesterolemiantes, diuréticos, antibacterianos, antivirales in vitro, etc" Kn pe/ue;o numero de (avonoides son anticancer3genos e inhibidores del crecimiento de células tumorales in vitro. pueden interaccionar con los en-imas del metabolismo xenobiotico, poseer eectos anti!iniciadores yLo antipromotores o incluso ser citost8ticos, es decir, citotóxicos" 'a mayor3a de los (avonoides son, in vitro, antimutagenicos: a contrario, algunos (avonoles son, sobre los mismos modelos, mutagenicos" 'as variaciones de actividad en unción de las caracter3sticas estructurales no permiten ninguna generali-ación"
Ktili-ación de Flavonoides en Ierapeutica Pese a los resultados parciales proporcionados por test bio/u3micos o por estudios de armacolog3a animal, la realidad de la efcacia cl3nica de la mayor3a de los (avonoides y, a orftiori, de la de las drogas /ue los contienen! casi nunca ha sido correctamente establecida" 'os ensayos en el hombre /ue no son normalmente mas /ue meras 0observaciones1!, no se reali-an siempre de acuerdo con las normas actualmente en vigor para este tipo de pruebas" Knicamente un pe/ue;o numero de moléculas puras o de extractos estandari-ados ha podido demostrar una efcacia sintom8tica moderada a pesar de la sub)etividad de los s3ntomas y de la importancia del eecto placebo en el principal tipo de patolog3a involucrada" 'os (avonoides se utili-an sobre todo en el terreno capilar!venoso. solos o asociados, son constituyentes habituales de vasculoprotectores y venotonicos y de tópicos utili-ados en (obologia" En general las especialidades /ue se disponen en la actualidad en el mercado poseen las indicaciones o propuestas de empleo siguiente.
Iratamiento de s3ntomas relacionados con la insufciencia venolin8tica +pesadey dolores de pierna Iratamiento de los signos uncionales debidos a la crisis hemorroidal" 6e)or3a de los transtornos de ragilidad capilar a nivel de la piel +pete/uias: tratamiento de apoyo de transtornos uncionales de la ragilidad capilar" Iratamiento de metrorragias debidas a la contracepción por microprogestagenos y de metrorragias debidas a la utili-ación de dispositivos intrauterinos, después de su exploración cl3nica o paraclinica" Propuesto en transtornos ligados a la circulación retiniana yLo coroidiana" Iratamiento del linoedema de miembro superios consecuente al tratamiento radio/uirurgico del c8ncer de mama"
'os expertos se ponen de acuerdo para subrayar /ue los venotropos carecn de interés demostrado en la prevención de transtornos trófcos en pacientes /ue poseen varices en los miembros ineriores y en la cicatri-ación de ulceras de las piernas" En la insufciencia venosa, no poseen indicación en ausencia de sintomatolog3a uncional: no eximen de una terapéutica etiológica y patogénica"
Pigmentos involucrados en la Rosa Ro)a %)osa *allica sp+( 'as *ntocianinas son los pigmentos mas importantes responsables del color ro)o de las rosas" Estos pigmentos pueden causar /ue los petalos se observen rosados, ro)os, violeta o a-ules, dependiendo de la copigmentacion /ue se presente" 'a copigmentacion es la interaccion de antocianinas con (avonoides y otros compuestos como metales, alcaloides, taninnos y polisac8ridos" 'a pigmentación de los te)idos vegetales también se aecta por el p7 y la temperatura +Mungmin et al", ?H" #ompuestos como las antocianinas y los enoles son sinteti-ados con base a inormación genética y estadio de desarrollo de la planta, e in(uenciado por actores ambientales como disponibilidad de nutrientes, temperatura y radicación lum3nica" 'a mayor3a de los (avonoides protegen a las células de los da;os ocasionados por la luK@ y también est8n involucradas en la deensa de la planta en otras situaciones de estrés, como heridas o ata/ue de patógenos +9roteold, ?N" #uando algunas (ores inician el proceso de senescencia, sus petalos cambian de color" Este cambio de color puede disminuir el valor estético de la (or y puede ser utili-ado como par8metro de senecencia" 'a modifcación del color puede ser causada por cambios bio/u3micos de los pigmentos, por el grado de copigmentacion y por cambios en el p7 de los petalos" Entre una de las maniestaciones de estos enómenos bio/u3micos se puede mencionar el ennegrecimiento de los petalos de la rosa ro)a, lo cual ocurre debido a la oxidación ade (avonas, antocianinas y otros enoles +7alevy y 6aya%, >OO"
6étodos Experimentales de extracción 'os (avonoides en general se extraen de muestras secas y molidas" 'a muestra se desengrasa inicialmente con éter de petróleo ó n!hexano, y el marco se extrae con etanol puro o del G" Este 2ltimo es recomendado para garanti-ar la extracción de los m8s polares" El extracto obtenido se evapora con calentamiento no superior a los CQ# y se le hacen particiones sucesivas con éter et3lico, acetato de etilo y n! butanol" 'os (avonoides apolares /uedan en la ase etérea, los medianamente polares en la ase acetato de etilo y los m8s polares en el nbutanol" #ada una de estas tres racciones se puede anali-ar por cromatogra3a en capa na '(()* y 7P'# en ase reversa"
Se pesaron Cg de pétalos de rosas, se somete a una extracción con éter por Soxhlet, por A ciclos para el desengrasado y luego continuamos la extracción con Etanol por C ciclos"
El extracto etanolico es evaporado a se/uedad y suspendido en agua destilada hirviendo a >ml con agitación" 'a suspensión acuosa es fltrada por papel y el fltrado se lleva a una re extracción con *cetato de Etilo, por tres veces cada una con ?ml" 'a ase *cética contiene los (avonoides los cuales precipitan al agregarle #loroormo" Filtrar el precipitado, y el residuo re disolverlo en Etanol para las pruebas de identifcación"
Reacción de Shinoda o #ianidina #aracteri-a compuestos de estructura ben-opirona" Si la al3cuota del extracto se encuentra en alcohol como es el caso! se diluye con >ml de 7#l concentrado y un pedacito de cinta de 6agnesioQ" 4espues de la reacción se espera Cminutos, se a;ade >ml de alcohol am3lico, se me-clan ases y se de)a reposar hasta /ue se separen"
Si la al3cuota del extracto se encuentra en agua, se procede de la misma manera, a partir de la adicion del 7#l concentrado" El ensayo se considera positivo, cuando el alcohol am3lico se colorea de amarillo, naran)a, carmelita o ro)o" &ntensos en todos los casos"
Reaccion con el Fe#lA CG Ktili-ar una solución acuosa de rutina, a;adirle gotas del reactivo de Fe#lA CG" Dbservar a la lu- K@ con y sin vapores de amoniaco en un cromatograma"
Resultados y discusiones 4iscusión de resultados 'as antocianinas son mas estables en un medio acido /ue en un medio neutron o alcalino" En medio acido a p7 >, la orma predominante es la del ion (avilio, el cual da el color ro)o, cuando esta es sometida a p7 basico o alcalino, el ion (avilio es susceptible al ata/ue nucleoflio por parte del agua, produciendose la pseudobase carbinol, esto es a p7 B"C y seguido se orma la chalcona, las dos ormas son incoloras" * un p7 se produce la base /uinoidal, el cual da una coloracion a-ul debido a cambios conormacionales y a la estabili-acion de los electrons de @alencia del cation (avilio y la resonancia del anillo aromatico
B
3
"
En el caso de la reaccion de Shinoda, el extracto de Rosas en contacto con el acido clorhidrico con las #intas de 6agnesio metalico se genera hidrogeno, este ultimo reduce al (avonoide lo cual se reconoce por la coloracion rosada" En la reaccion de coloracion con Fe#lA, la muestra de extracto de Rosas cambio a una coloracion ro)a rosada" Esto se debe a /ue la naturale-a polienólica de los (avonoides, especifcamente compuestos con orto!dienoles, lleva a la ormacion de coloraciones variadas en presencia de Fe#lA, /ue en este caso por presentar antocianinas produce una coloracion ro)a rosada"
#onclusiones >" 'as dierentes especies vegetales estudiadas, en especial las drogas de estas, como. los petalos de rosas: presentan dierentes tipos de (avonoids, utili-ados hoy en las industrias con fnes terapeuticos, alimentarios, etc" ?" 6ediante los metodos de extraccion y las reaccion de identifcacion, las rosas presentan heterosido (anonico antocianina" A" 'a muestra problema de (avonoides, presenta una relacion de (u)o determinado, cercano a los estandares empleado en K@"
5ibliogra3a
5RK
ONB #atedra de Farmacognosia y medicina Iradicional, guia de practicas! Farmacognosia, ?>? 'D#, D" &nvestigacion Fito/uimica, 6etodo en el Estudio de Productos OOB, pp">>B!>A
