FISIOLOGIA DO CICLO ESTRAL Prof. Paulo Bayard Dias Gonçalves Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências Rurais Departamento de Clínica de Grandes Animais Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal 97105-900 Santa Maria, RS RS
INTRODUÇÃO O conhecimento do ciclo estral e sua regulação é fundamental para o Médico Veterinário desempenhar suas atividades em reprodução animal, tanto na clínica como na implementação de biotecnologias e manejos reprodutivos adequados. Atualmente, as novas técnicas de biologia molecular estão permitindo um avanço rápido e significativo no entendimento dos eventos que ocorrem durante os ciclos reprodutivos. De certa forma, esses conhecimentos são importantes para o homem poder desenvolver tecnologias capazes de retirar o máximo de produtividade para nutrição humana; em contra partida, se torna difícil acompanhar essa evolução e as avalanches de conhecimentos que ocorrem todo o dia, formando exímios especialistas ou generalistas com conhecimentos amplos, mas superficiais. Conciliar o conhecimento específico com uma noção do todo é uma tarefa difícil de todos Médicos Veterinários independente da área de atuação. Nesse sentido, o ciclo estral é uma pequena porção do processo reprodutivo de uma fêmea. Segundo Robinson & Shelton (1991), três ciclos estão envolvidos na reprodução animal, o ciclo da vida, o ciclo reprodutivo anual e o ciclo estral. No ciclo da vida, estão incluídas as fases fetal, a pré-puberdade, a puberdade, a reprodutiva e a senescência. No ciclo reprodutivo anual, estão envolvidas as diferentes épocas do ano, considerando a disponibilidade alimentar e maior quantidade de luz. Em bovinos, o fotoperíodo não é tão importante quanto em ovinos e eqüinos, mas tem sido responsabilizado, direta ou indeiretamente, pela melhor atividade reprodutiva durante a primavera e verão. Nesta revisão, o ciclo estral vai ser abordado mais detalhadamente, mas serão revisados alguns fatores importantes da fase fetal e puberdade para o início da ciclicidade reprodutiva.
FOLICULOGÊNESE Com a formação dos cordões sexuais, nos bovinos aproximadamente aos 30 dias de
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gestação e nos ovinos aos 20 dias de gestação, as células somáticas que acompanharam a trajetória das células germinativas até a crista genital, circundam o gameta e o isolam através de uma membrana basal (Rüsse, 1983). Recentemente, acreditava-se que a produção de oócitos em uma fêmea mamífera cessava durante a vida fetal. No entanto, Johnson et al. (2004) demonstraram que ovários de camundongas jovens e adultas possuem células germinativas em atividade mitótica, renovando a população de oócitos disponíveis ao crescimento folicular e ovulação. Caracterizando cada fase do desenvolvimento folicular, o folículo primordial em bovinos é formado pelo gameta e por algumas células somáticas planas, podendo haver algumas cubóides (ou células da pré-granulosa) e pela membrana basal. O folículo primário apresenta um maior tamanho, a presença de uma camada com um maior número de células somáticas, sendo todas de formato cubóide e o início da transcrição de alguns genes importantes para tradução de proteínas que serão utilizadas durante o crescimento do oócito, incluindo aquelas responsáveis pela formação da zona pelúcida. Com a continuação da multiplicação das células da granulosa vão formando-se várias camadas ao redor do oócito, organizando-se, assim, o folículo secundário (Buccione et al., 1990). A interação entre as células da granulosa e o gameta é de fundamental importância para o desenvolvimento do oócito (Cain et al., 1995), as trocas metabólicas entre esses dois tipos de células ocorre através dos complexos intercomunicantes (Eppig et al, 1989). Em bovinos, os folículos pré-antrais iniciam seu desenvolvimento durante a vida fetal. Aos 180 dias de gestação, o número desses folículos atinge seu máximo, decrescendo rapidamente após o nascimento (Erickson, 1966a; Erickson, 1966b). O crescimento folicular ocorre de uma forma contínua, somente poucos folículos conseguem chegar a ovulação, a maioria degenera, diminuindo o estoque de oócitos. O desenvolvimento do folículo pré-antral, seguido pela formação do antro, maturação do oócito e ovulação é um acontecimento raro, sendo observado em menos de 0,1% do total de folículos (Ireland, 1987). A atresia pode ocorrer em qualquer fase do desenvolvimento folicular, inclusive nos folículos primordiais (Rajakoski, 1965). Em bovinos, fetos com 210 dias já apresentam todos os estádios de desenvolvimento folicular, inclusive folículos terciários (Carámbula et al., 1999). Esse é um fato importante, evidenciando que o desenvolvimento folicular não é critico no desempenho reprodutivo, tendo em vista que desde o desenvolvimento fetal e, posteriormente, em animais pré-pubere, adulto em diferentes condições nutricionais, gestação e pós-parto ocorre desenvolvimento folicular, mas somente em animais adultos em boas condições nutricionais ocorre a ovulação. Assim sendo, o crítico é fazer com que os níveis hormonais sejam adequados para fazer com que o folículo dominante chegue a ovulação.
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PUBERDADE Puberdade tem sido definida como um processo pelo qual uma fêmea torna-se capaz de reproduzir. De uma maneira mais específica, a puberdade é o momento em que ocorre a primeira ovulação com manifestação estral, seguida pelo desenvolvimento de um corpo lúteo funcional (para revisão Robinson & Shelton, 1991; Foster & Nagatani, 1999). Esse processo é gradual e a primeira ovulação geralmente não é precedida de manifestação estral e o primeiro corpo lúteo tem um período de permanência e atividade mais curto. Trabalhos dos anos 80 demonstraram que o ovário e hipófise têm capacidade de responder a ação de hormônios e iniciar a suas atividades antes da puberdade. O hipotálamo foi responsabilizado por bloquear a reprodução antes da puberdade por apresentar uma hipersensibilidade ao estrógeno, o que causaria um feedback negativo mesmo em baixas concentrações desse hormônio.
Na realidade, o que se sabe é que durante a puberdade ocorrem mudanças no padrão de liberação de GnRH, sendo mais freqüentes os pulsos de GnRH, o que estimula a secreção de gonadotrofinas e, conseqüentemente, a produção de esteróides pelos ovários, fazendo com que reinicie o ciclo. A idade, a estação do ano em espécies poliestricas estacionais e nutrição são alguns fatores que interferem no momento da puberdade. A nutrição é um dos fatores fundamentais. Animais bem nutridos atingem a puberdade mais precoce do que aqueles que sofrem restrições alimentares. O sinal metabólico que determina o momento da puberdade não está ainda definido, mas têm vários candidatos como leptina, glicose, insulina e IGF-I (insulinlike growth factor I) que estão envolvidos nesse mecanismo. Provavelmente, não há um único fator, mas vários fatores responsáveis pelo controle metabólico que determina o momento da puberdade.
CICLO ESTRAL O ciclo estral, em bovinos, apresenta uma duração de 18 a 24 dias, sendo mais comum 21 dias. O ciclo pode ser dividido em fase luteínica e folicular de acordo com a atividade e presença de um folículo ou corpo lúteo. No entanto, essas fases não são evidentes tendo em vista que não há uma fase exclusiva de atividade folicular e nem uma fase exclusiva de atividade luteínica. Didaticamente, o ciclo poderá ser dividido em quatro fases, sendo essas denominadas de próestro com duração de aproximadamente 3 dias, estro de 6 a 18 horas, metaestro 2 dias e diestro 15 dias. O ciclo estral é dinâmico, havendo crescimento folicular constante durante todo o ciclo. Os eventos observados no ovário de uma fêmea em resposta as mudanças hormonais podem ser observadas na Figura 1 e o perfil hormonal durante o ciclo estral pode ser verificado na Figura 2 (para revisão Gonçalves et al. 2002).
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o i C
s o o t i n e C v E
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Dias do Ciclo Legenda Figura 1. Folículo resgatado Folículo em atresia Folículo dominante Folículo dominante em atresia Folículo ovulatório Luteinização Desenvolvimento do Corpo Lúteo Corpo Lúteo em atividade Luteólise Figura 1. Eventos ovarianos que ocorrem durante o ciclo estral em uma vaca.
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24 h
24 h
Ov
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Dias do Ciclo Progesterona
Estradiol
LH
FSH
Figura 2. Perfil hormonal durante o ciclo estral. O dia zero foi considerado o dia do estro.
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DINÂMICA FOLICULAR E REGULAÇÃO DO GnRH O conhecimento da dinâmica folicular em bovinos proporciona subsídios que permitem o controle racional da reprodução, possibilitando entre outros procedimentos, manipular o ciclo estral, induzir o cio pós-parto e utilizar outras biotecnologias com maior eficácia. A dinâmica folicular começou a ser melhor entendida a partir de estudos realizados com a ultra-sonografia, a qual permite um monitoramento ovariano sem necessidade de aplicar técnicas invasivas. Com base nesses estudos, será realizada uma breve discussão a respeito do início, número, duração, divergência, seleção e atresia folicular, bem como algumas aplicações desse conhecimento. Para estudos com ultra-sonografia, a emergência de uma onda folicular tem sido definida como o último dia em que o futuro folículo dominante apresenta 4-5 mm de diâmetro (para revisão, Ginther et al., 1996). Inicialmente, Rajakoski (1960) propôs a ocorrência de duas ondas foliculares durante o ciclo estral bovino, utilizando métodos de observação visual e histológicos. Com o emprego da ultra-sonografia em estudos de dinâmica folicular, no início dos anos 80, pode ser constatado que uma vaca apresenta geralmente duas a três ondas e raramente uma ou quatro ondas foliculares. Ciclos estrais com três ondas foliculares têm maior duração do que aqueles com duas ondas. Em ciclos com duas ondas, um folículo dominante inicia o crescimento no dia do estro (dia 0) e pára de crescer aproximadamente no dia 6 do ciclo, regredindo em torno do 13° dia. Aproximadamente no 10° dia do ciclo, o segundo folículo dominante inicia o seu crescimento e culmina com a ovulação no estro seguinte. Esses períodos apresentam grande variabilidade em um mesmo indivíduo, entre indivíduos e conforme a condição nutricional (Santos, 1993). Dois ou mais folículos, iniciam seus crescimentos a partir de um diâmetro aproximadamente de 4-5 mm e um desses folículos se destaca em tamanho até o momento em que o segundo maior folículo começa a decrescer. Nesse momento de divergência folicular, no qual o folículo dominante segue seu crescimento e o segundo maior folículo atinge o seu maior tamanho, iniciando sua regressão, o FSH atinge o mais baixo nível, em conseqüência da inibição causada pelos hormônios estrógeno e inibina produzidos pelo folículo dominante. A diminuição do FSH por esses hormônios é decorrente de uma ação direta na hipófise anterior, diminuindo a expressão do gene que codifica para a subunidade beta do FSH, através de redução da transcrição e da estabilidade do mRNA (Roche, 1996). A principal característica do folículo dominante é uma maior atividade das proteases específicas para IGFBP (proteínas ligadoras de fator de crescimento semelhante a insulina), do que nos subordinados, liberando IGF o que, provavelmente, potencialize ou permita a ação das gonadotrofinas em estimular o crescimento e
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diferenciação folicular, resultando no estabelecimento da dominância (Rivera & Fortune, 2001; Rivera et al., 2001). Na fase final de desenvolvimento folicular, após a dominância, é observada a expressão de receptores de LH na camada de células da granulosa (Webb & England, 1982; Evans & Fortune, 1997). Nessa fase o folículo dominante se torna também dependente de LH. O folículo dominante secreta mais que 80% do estradiol e também é responsável por 55% da inibina liberada na circulação (Campbell et al., 1991a). As mudanças da arquitetura intracelular desses folículos também refletem a alta capacidade de produção de hormônios, já que eles apresentam três vezes mais área de retículo endoplasmático liso, aumento de cinco vezes na área do sistema de Golgi e o dobro de membranas mitocondriais, quando comparado com folículos antrais pequenos (McNatty et al., 1992). Além do IGF, inibina, ativina e outros fatores estão envolvidos no mecanismo endócrino, a seleção da dominância folicular, importantes na regulação autócrina e parácrina do folículo. O crescimento do folículo dominante e o incremento da produção de estrógeno são caracterizados pela diminuição nos níveis de inibina, ativina e IGFBP, simultaneamente com o aumento de IGF-I livre. Há evidências de que a inibina e ativina e IGFBP têm efeito negativo na ação das gonadotrofinas no folículo e que os diferentes padrões de secreção de FSH e LH regulam esses fatores na seleção, dominância e perda de dominância do folículo dominante (Knight, 1991; Erickson et al., 1994; Roche, 1996). Nesse folículo, há um aumento da produção de estrógeno (folículo estrógeno-ativo) e, paralelamente, há o desenvolvimento de receptores para LH nas células da granulosa, incremento nos níveis de IGF-I e diminuição nas concentrações de ativina, inibina e IGFBP. No entanto, no folículo atrésico, ocorre inversão nos níveis desses fatores. Com base nesses estudos, conclui-se que a seleção, dominância e perda de dominância de folículos dominantes estão reguladas por mecanismos endócrinos, autócrinos e parácrinos. Esse conhecimento possibilita o entendimento de vários fenômenos que são observados na prática e na aplicação de algumas tecnologias. O efeito endócrino é observado pela aplicação de FSH, induzindo a superovulação, ou seja, se os níveis de FSH forem mantidos, mais de um folículo se torna dominante e resulta em ovulação. No entanto, os resultados de superovulação são extremamente baixos se a aplicação de FSH for realizada na presença de um folículo dominante. Um outro aspecto prático é a ovulação no pós-parto e o reinício do ciclo estral. Nas condições de criação extensiva, as vacas em pós-parto freqüentemente encontram-se em estado corporal dois (considerando um escore de 1 a 5, Wildmann et al.,1982) ou/e em catabolismo e apresentam crescimento folicular, mas não ovulam, fenômeno esse muito semelhante ao que ocorre na puberdade. Há evidências que as baixas concentrações de estrógenos são capazes de modularem o GnRH de maneira que não ocorra a ovulação antes da puberdade. Apesar de pouco
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se conhecer a respeito do mecanismo que inibe o reinício do ciclo no pós-parto, pode-se considerar uma certa similaridade com o que ocorre antes da puberdade. A ação do estrógeno não é diretamente nos neurônios responsáveis pela síntese de GnRH. O estrógeno, por não possuir receptores nessas células, provavelmente atue em outros neurônios que tenham ação nos neurônios que sintetizam o GnRH. Várias hipóteses já foram postuladas e, basicamente, envolvem a inibição ou ativação de neurohormônios que estimulam ou inibem o GnRH. Os primeiros trabalhos sugeriram que os estrógenos podem ter ação em neurônios responsáveis pela liberação de norepinefrina, o qual estimula a liberação de GnRH, ou de opióides e dopamina, que por sua vez inibem a liberação desse hormônio. O efeito dos opióides na secreção de LH está bem determinado pelos trabalhos que utilizaram nalaxone, um inibidor de opióides endógenos. No entanto, os neurônios do GnRH também não possuem os subtipos dos receptores clássicos de opioides (µ, κ e δ). Assim sendo, o efeito da β-endorfina, de inibir o LH e ser revertido pelo nalaxone, ocorre por meios indiretos, provavelmente, utilizando outros neurohormônios. O fato da β-endorfina inibir o LH serviu de base para responsabilizar os opióides pelo atraso na puberdade e no reinicio do ciclo no pós-parto em animais com baixo escore corporal. Novos estudos têm demonstrado que o hormônio responsável por regular a liberação de GnRH, refletindo o estado nutricional e as reservas energéticas é um hormônio derivado dos adipócitos, denominado leptina. Em várias espécies animais, incluindo os ovinos, camundongos, ratos e primatas, foi demonstrado que, em baixas condições nutricionais, os níveis de leptina e gonadotrofinas estão relativamente baixos, sendo revertidas as concentrações de FSH e LH após aplicação exógena desse hormônio. Apesar de sua ação na liberação de gonadotrofinas, não há evidências de receptores para leptina nos neurônios do GnRH. Esses receptores são coexpressados nos neurônios hipotalâmicos que expressam o Pro-opiomelanocortina (POMC; exemplo
de
hormônios
derivados
dessa
proteína
são
β-endorfina
e
hormônio
adrenocorticotrofina) e o neuropeptideo Y (NPY). Assim, há relevantes evidências de que a leptina é o sinal metabólico para inibir a atividade reprodutiva em condições nutricionais deficientes e reservas energéticas inadequadas (para revisão Cunningham et al., 1999). Independente de ocorrer ovulação, a dinâmica folicular é observada nas diferentes fases do ciclo reprodutivo. Folículo terciário pode ser observado no ovário de feto bovino a partir dos 210 dias de gestação (Carámbula et al., 1999). A associação entre níveis de FSH e emergência de um folículo dominante é comprovado em animais pré-púberes, entre 6 e 8 meses, durante a prenhez e no período pós-parto (Evans et al., 1994; Adams et al., 1994; Ginther et al., 1996). Assim sendo, esses conhecimentos são fundamentais para antecipar o cio, principalmente no
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período pós-parto, apesar de nos faltarem ainda subsídios para indução de cio de uma maneira eficaz em diferentes condições nutricionais. Esses conhecimentos proporcionaram a geração de tecnologias que possibilitam um melhor aproveitamento do material genético disponível, como a punção folicular em bezerras, novilhas pré-púberes, vacas prenhes e no período pós-parto.
CONCLUSÕES A evolução dos conhecimentos sobre o ciclo estral e a dinâmica folicular tem servido para explicar fenômenos observados na rotina de campo e para o desenvolvimento de tecnologias aplicadas à reprodução animal. A partir dos conhecimentos básicos dos ciclos reprodutivos, novas biotecnologias e modernos sistemas de manejos reprodutivos vêm sendo desenvolvidos para incrementar a eficiência reprodutiva de nossos rebanhos. Na prática, essas metodologias desenvolvidas para melhorarem o desempenho da reprodução bovina não tem sido adotadas de uma maneira ampla e eficiente para produzir uma maior quantidade de carne bovina, em conseqüência das políticas econômicas do País e, principalmente, pela ausência de apoio do setor industrial da carne bovina ao produtor.
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