Objetivos: • Extraer ADN del Bazo de cerdo. Fase Experimental: - Picamos con la ayuda de un cuchillo los 50g de bazo de cerdo y luego lo mezclamos con 00 m! de amortiguador salino Na"l 0#$5%# amortiguado con citrato de sodio 0#0$5% a &'(durante un minuto. - "entri)ugamos la sus&ensi*n m+xima en re,oluci*n &or $5 minutos. - 'omogenizamos el &reci&itado con 00 m! de amortiguador salino. - Desechamos el sobrenadante sobrenadante combinamos combinamos y sus&endimos los sedimentos con Na"l mol! hasta obtener un ,olumen )inal de 00 m!# en la cual la mayor/a del material debe disol,erse. - emo,imos los sedimentos &or centri)ugaci*n durante $5 minutos. - Agitamos la soluci*n continuamente con un &olicial a1adiendo al mismo tiem&o un ,olumen de agua destilada. - En,ol,imos el &reci&itado )ibroso en el extremo social y lo de2amos secar en un ,aso 3u/mico &or 40 minutos. Durante ese tiem&o el grumo se deshidrat* &arcialmente y el l/3uido remanente se sec* con &a&el )iltro. -Disol,imos la desoxirribonucleo&rote/na en a&roximadamente $00 m! de Na"l mol!. Agregamos Agregamos un ,olumen igual de la mezcla de cloro)ormoalcohol cloro)ormoalcohol am/lico 67$8 homogenizamos durante 40 minutos. - "entri)ugamos la emulsi*n a m+xima re,oluci*n re,oluci*n durante $5 minutos y recogimos la ca&a su&erior acuosa o&alescente8. - !a recolecci*n se hizo &or succi*n cuidadosa de )orma tal 3ue no se agitara la &rote/na &resente en la inter)ase de los dos l/3uidos. - e&et e&etimo imos s dos dos ,eces ,eces m+s m+s el tratam tratamien iento to con sol,e sol,ent nte e org+n org+nico icos s y recog recogimo imos s el sobrenadante en un ,aso 3u/mico. Preci&itamos Preci&itamos el ADN agitando lentamente lentamente el sobrenadante sobrenadante con dos ,eces el ,olumen del alcohol en)riado en un ba1o de agua )r/a8 y rotamos el &olicial hasta 3ue las )ibras se enrollaran. - 9acamos el &olicial y &resionamos &resionamos cuidadosamente cuidadosamente el ADN )ibras contra las &aredes del ,aso 3u/mico &ara ex&rimir el sol,ente. - !a,amos )inalmente el &reci&itado introduciendo el &olicial en una serie de sol,entes ex&rimiendo el exceso en la )orma descrita. - :inalmente los cuatro sol,entes utilizados )ueron etanol al (0;# etano al <0;# etano absoluto y =ter. Resultados: El ADN no )lota libremente dentro del n>cleo de una c=lula. Est+ asociado con una gran ,ariedad de &rote/nas y est+ re,estido en una membrana celular. En las c=lulas animales# el ADN tambi=n est+ contenido en una membrana nuclear. Para &oder extraer el ADN de una c=lula# &rimero deben retirarse las membranas y &rote/nas asociadas# y des&u=s se&ararse de manera )/sica del ADN (Relovera, 1988). El &rocedim &rocedimient iento o se inici* inici* homogen homogenizan izando# do# centri)u centri)ugand gando o la muestra muestra mediante mediante una centri)ugadora centri)ugadora con una soluci*n soluci*n de homogenizaci*n homogenizaci*n Na"l 0#$5% con citrato citrato de sodio 0#0$5% a &'(. !a centri)ugaci*n centri)ugaci*n &roduce la rotura de las c=lulas de los l os te2idos u *rganos de la muestra escogida y la liberaci*n del contenido celular# donde se encuentran los +cidos nucleicos.
Desechamos el sobrenadante combinamos y sus&endimos los sedimentos con Na"l mol! hasta obtener un ,olumen )inal de 00 m!# en la cual la mayor/a del material se disol,i*# remo,imos los sedimentos &or centri)ugaci*n durante $5 minutos y agitamos la soluci*n continuamente con un &olicial a1adiendo al mismo tiem&o un ,olumen de agua destilada. 9eg>n Fernánde (199!) el ADN cromos*mico &reci&itado y los restos celulares se &ueden retirar del ADN &l+smido soluble en una soluci*n &or medio de la centri)ugaci*n# un &roceso donde gira a alta ,elocidad 3ue causa 3ue los s*lidos entren en el )ondo de un tubo como un &erdig*n# lo 3ue &ermite 3ue se se&are el l/3uido arriba con el ADN &l+smido. Al en,ol,er el &reci&itado )ibroso en el extremo social y lo de2amos secar en un ,aso 3u/mico &or 40 minutos. Durante ese tiem&o el grumo se deshidrat* &arcialmente y el l/3uido remanente se sec* con &a&el )iltro. "e#$n Fernánde (199!) cuando se realiza una )iltraci*n es &ara se&arar y eliminar las estructuras celulares de mayor tama1o. !a soluci*n )iltrada contiene los +cidos nucleicos# &ero toda,/a con)inados en los n>cleos. El ob2eti,o de un &roceso de aislamiento y &uri)icaci*n de DNA es conseguir se&arar esta mol=cula del resto de las macromol=culas &rote/nas# l/&idos y &olisac+ridos8 &resentes en el interior de las c=lulas. 9e a1adieron $00 m! de Na"l mol! 3ue solubiliz* las membranas nucleares y )acilit* la liberaci*n de los +cidos nucleicos. 9eg>n Fonse%a (199&) el sodio es un ion cargado &ositi,amente. En una soluci*n de cloruro de sodio# la mesa de sal# &or e2em&lo# la mol=cula de cloruro de sodio se se&ara en iones de sodio y iones de cloro. El ADN# &or otro lado# tiene altas cargas negati,as. !a carga altamente negati,a de la mol=cula de ADN es neutralizada &or los iones de sodio &ositi,os en la soluci*n. En otras &alabras se dis&ersan las li&o&rote/nas de las membranas y desnaturalizan com&le2os &rote/nicos. !as sales de la soluci*n de lisis# neutralizan las cargas negati,as 3ue inician la &reci&itaci*n de los +cidos nucleicos. Agregamos un ,olumen igual de la mezcla de cloro)ormoalcohol am/lico 67$8 homogenizamos durante 40 minutos. "entri)ugamos la emulsi*n a m+xima re,oluci*n durante $5 minutos y recogimos la ca&a su&erior acuosa o&alescente8. !a neutralizaci*n de cargas negati,as de ADN 3ue ocurre al agregar una soluci*n de Na"l % &ermite 3ue se &reci&ite en alcohol. 9in la sal# el ADN &ermanece cargado negati,amente y estar+ en la &arte acuosa de la soluci*n. 9i esta mezcla se centri)uga# el ADN &l+smido &reci&itado se ,ol,er+ un &erdig*n en el )ondo del tubo. !a &orci*n de agua &uede retirarse y el ADN &uede regresar a la soluci*n# o resus&enderse# en una soluci*n di)erente en la concentraci*n deseada. "uando se centri)uga la muestra obtenida# as/ se consigue se&arar una )ase s*lida# &ellet restos de c=lulas# &rote/nas# l/&idos8 de una )ase acuosa# sobrenadante# 3ue contiene +cidos nucleicos# hidr*)ilos y solubles en agua debido a sus gru&os )os)ato. ("errano, 19''). !a recolecci*n se hizo &or succi*n cuidadosa de )orma tal 3ue no se agitara la &rote/na &resente en la inter)ase de los dos l/3uidos# re&etimos dos ,eces m+s el tratamiento con sol,ente org+nicos y recogimos el sobrenadante en un ,aso 3u/mico y &reci&itamos el ADN agitando lentamente el sobrenadante con dos ,eces el ,olumen del alcohol en)riado en un ba1o de agua )r/a8 y rotamos el &olicial hasta 3ue las )ibras se enrollaran. Al a1adir iso&ro&anol o etanol muy )r/o se &roduce una deshidrataci*n y total &reci&itaci*n de los +cidos nucleicos insolubles en alcohol. !os +cidos nucleicos se sit>an y ,isualizan en la inter)ase agua-alcohol. El alcohol en la soluci*n de &reci&itaci*n se utiliza &ara remo,er la concentraci*n residual de sales y &romo,er la &reci&itaci*n del
+cido nucleico. "uando se trata de muestras con ba2a concentraci*n de +cidos nucleicos# com>nmente se utiliza un ,olumen de muestra de iso&ro&anol# en lugar de dos ,ol>menes de muestra cuando se traba2a con etanol. !a &reci&itaci*n del ADN es casi inmediata en &resencia de la sal y el alcohol (illarreal, 199). :inalmente sacamos el &olicial y &resionamos cuidadosamente el ADN )ibras contra las &aredes del ,aso 3u/mico &ara ex&rimir el sol,ente y la,amos el &reci&itado introduciendo el &olicial en una serie de sol,entes ex&rimiendo el exceso en la )orma descrita# los sol,entes utilizados )ueron etanol al (0;# etano al <0;# etano absoluto y =ter. El &roducto )ilamentoso 3ue obtu,imos no es ADN &uro ya 3ue est+ mezclado con )ragmentos de AN y &rote/nas. ?na extracci*n &ro)esional se realiza a1adiendo enzimas 3ue )ragmentan las mol=culas de AN e im&iden 3ue se unan al ADN. En este caso las &rote/nas y las grasas 3uedaban en la &arte acuosa de la mezcla y el ADN asciende hasta llegar al alcohol. El ADN es una mol=cula larga y tiende agru&arse# de all/ la )acilidad &ara retirarla. ?na extracci*n @&ro)esional@ se realiza a1adiendo enzimas 3ue )ragmentan las mol=culas de AN e im&iden 3ue se unan al ADN. :actores 3ue a)ectan el rendimiento# calidad y &ureza del ADN7 cantidad de material de &artida# n>mero de co&ias de las mol=culas de AN o "antidad de te2ido o condiciones en las 3ue se encuentra el material de inicio )resco# congelado# )i2ado8 o contaminantes e inter)erentes en el material biol*gico.
