COMPLEXOS DE FERRO Introdução
Complexos
Também designados por compostos de coordenação, são a espécie MLn que se forma quando um átomo ou ião M (metálico) se une a um ou mais ligandos. O átomo ou ião metálico é o elemento central, enquanto que os iões ou moléculas que se lhe ligam são os ligandos. Define-se o elemento central com o estado de oxidação formal (obtém-se somando a carga de todos os ligandos e subtraindo à carga do complexo) e a configuração electrónica. Os ligandos são moléculas ou iões que se ligam ao elemento central que têm de ter pares de eletrões não partilhados ou orbitais moleculares ocupadas, cujos eletrões possam ser doados ao átomo central. Conforme o modo de coordenação ao metal podem ser monodentados (coordenam-se por um só átomo) ou bi- …, tri-…, polidentados (coordenam-se por 2, 3 ou mais átomos respectivamente). Os ligandos polidentados podem tamém ser designados quelantes, pois forma-se um anel de quelação que engloba engloba o metal, um dos átomos doadores do ligando, a sua cadeia respectiva e um outro átomo doador do ador do ligando, sucessivo. Existem também ligandos ambidentados, ou seja, ligandos que têm mais que um possível átomo doador, mas só podem usar um deles de cada vez (pelo menos para o mesmo metal). O número de átomos que se liga directamente ao metal define o número de coordenação. Consoante este número os complexos têm diferentes tipos de geometria: linear (NC=2), geometria em T, Y ou triangular (NC=3), tetraédrica ou quadrangular plana (NC=4), pirâmide quadrangular ou bipirâmide trigonal (NC=5), octaédrica, prisma trigonal ou hexagonal (NC=6), entre outras para números de coordenação elevados (7,8 e 9). O número de coordenação 6 é dos mais frequentes, sendo a geometria mais comum a octaédrica, pois é a preferida do ponto de vista electrónico e estereoquímico. Quanto ao isomerismo, trata-se da existência de complexos com a mesma fórmula molecular, mas que diferem entre si de várias formas possíveis. Existem vários tipos de isomerismo: o o
Geométrico: Diferem no arranjo dos ligandos; Óptico: Fazem rodar o plano da luz polarizada em direcções opostas – um dos isómeros é a imagem no espelho do outro;
1
o
o o
Ionização: Os produtos sólidos têm a mesma estequiometria, mas originam diferentes iões ao serem dissolvidos; dissolvidos; Coordenação: O arranjo dos ligandos à volta do elemento central é diferente; Ligação: Um ou mais dos ligandos coordenam-se por diferentes átomos doadores.
Ferro
Os metais de transição são moderadamente reactivos, combinando-se muitas vezes com enxofre, oxigénio e hidrogénio quando aquecidos. O ferro é um metal de transição cujo número atómico é o 26 e a configuração electrónica [Ar]3d64s2. Apresenta diversos estados de oxidação, +6 ,+3 e +2. É um elemento muito reactivo no seu estado puro e forma complexos com relativa facilidade. É essencial para a maioria dos seres vivos e sabe-se que num ser humano adulto (massa de 70kg) existem 4,2 mg de Ferro. Devemos ingerir entre 12 a 18 mg de ferro por dia, no entanto só parte é que é absorvida. Por falta de ferro podem surgir doenças, nomeadamente anemia, mas também por acumulução deste metal (hemocromatose). Algumas das funções do ferro nos elementos biológicos são: funções catalítica, por exemplo em reacções de oxi-redução, (há enzimas activados pelo ferro através de uma fraca ligação), metaloenzimas (enzimas com ligações fortes a metais como o Ferro ou complexos de metais), transporte de oxigénio no sangue (Hemoglobina), armazenamento de oxigénio no sangue (Mioglobina e Ferritina). Para resumir estas e outras funções do ferro apresenta-se o seguninte esquema que identifica e classifica as metalobiomoléculas de ferro, mostrando também os principais exemplos. Estas biomoléculas de ferro, proteínas ou não, que desempenham diversas e importantes funções na maioria dos seres vivos.
1. Moléculas não proteicas Sideróforos - O ferro é essencial para todos os organismos vivos mas está pouco diponível
por se encontrar maioritariamnte no estado de oxidação 3 em compostos químicos pouco soluveis em agua; por isso os seres vivos desenvolveram técnicas para solubilizar e transportar o Fe 3+ para o seu uso.
2
o
o o
Ionização: Os produtos sólidos têm a mesma estequiometria, mas originam diferentes iões ao serem dissolvidos; dissolvidos; Coordenação: O arranjo dos ligandos à volta do elemento central é diferente; Ligação: Um ou mais dos ligandos coordenam-se por diferentes átomos doadores.
Ferro
Os metais de transição são moderadamente reactivos, combinando-se muitas vezes com enxofre, oxigénio e hidrogénio quando aquecidos. O ferro é um metal de transição cujo número atómico é o 26 e a configuração electrónica [Ar]3d64s2. Apresenta diversos estados de oxidação, +6 ,+3 e +2. É um elemento muito reactivo no seu estado puro e forma complexos com relativa facilidade. É essencial para a maioria dos seres vivos e sabe-se que num ser humano adulto (massa de 70kg) existem 4,2 mg de Ferro. Devemos ingerir entre 12 a 18 mg de ferro por dia, no entanto só parte é que é absorvida. Por falta de ferro podem surgir doenças, nomeadamente anemia, mas também por acumulução deste metal (hemocromatose). Algumas das funções do ferro nos elementos biológicos são: funções catalítica, por exemplo em reacções de oxi-redução, (há enzimas activados pelo ferro através de uma fraca ligação), metaloenzimas (enzimas com ligações fortes a metais como o Ferro ou complexos de metais), transporte de oxigénio no sangue (Hemoglobina), armazenamento de oxigénio no sangue (Mioglobina e Ferritina). Para resumir estas e outras funções do ferro apresenta-se o seguninte esquema que identifica e classifica as metalobiomoléculas de ferro, mostrando também os principais exemplos. Estas biomoléculas de ferro, proteínas ou não, que desempenham diversas e importantes funções na maioria dos seres vivos.
1. Moléculas não proteicas Sideróforos - O ferro é essencial para todos os organismos vivos mas está pouco diponível
por se encontrar maioritariamnte no estado de oxidação 3 em compostos químicos pouco soluveis em agua; por isso os seres vivos desenvolveram técnicas para solubilizar e transportar o Fe 3+ para o seu uso.
2
Na realidade esta stecnicas são ligandos que formam complexos deste ião com constantes de estabilidade elevadas; Esses ligandos são agentes complexantes não proteicos para capturar ferro libertados para o exterior pelas bacterias. A transferência do ferro complexado para o microorganismo requer o reconhecimento de sideroforos. Como muitos desses microorganismos são patogénicos e precisam de ferro para se propagarem vão buscá-lo ao hospedeiro. Para evitar essa captura o hospedeiro impede a sintese de sideroforos, sendo ujjma das estrategias adoptadas a subida da temperatura corporal, pois a produçao daqueles ligandos diminui para temperaturas de 37 graus.
2. Proteínas
-De transporte e armazenamento a) Transferencia electronica - Proteínas Fe-S Estas proteínas estão envolvidas em processos de transferência electrónica e são agregados com a composição FenSm onde n =m = 2=4, ocorrendo nalguns casos o sistema Fe3S4. São sistemas A ferredoxina é um exemplo de um sistema ferro enxofre. Ferredoxina do tipo cloroplasto, F2S2.
- Citocromos
São estruturas químicas de grupos heme presentes em todos os seres vivos que, tal como as proteínas de ferro-enxofre, também são responsáveis por tr ansferirem electrões. O processo de transferencia de electrões envolve a variação do estado de oxidaçao do ferro no centro centro hémico. hémico. Estão envolvidos na respiraçao anaerobia e aerobia, fotossíntese das plantas e cianobactérias, redução da meta hemoglobina nos eritrócitos para regenerar a forma funcional da hemoglobina. Citocromo c- transferencia electrónica do citocromo c1 para a oxidase do citocromo c no processo finsal de fosforilaçao oxidativa (imagem)
b) Coordenação com moléculas não metálicas -Hemeritrina: Hemeritrina- Embora a sobrevivencia da maioria maior ia dos organismos
dependa da difusao de O2 e CO2 entre as celulas e o exterior, outros seres vivos necessitam de metalobiomoléculas para o transporte e armazenamento de O2. 3
Um exemplo é a biomolécula hemeritrina que ocorre no sangue de invertebrados marinhos geralmente na forma octaedrica. São proteinas não hemicas, em que a captura do O2 é acompanhada pela oxidaçao dos centros metalicos e formaçao de OOH-. - Hemoglobina: a hemoglobina está presente nos glóbulos vermelhos, capta o O2 nos pulmões e transporta-o no sangue arterial para os pulmões. Nos musculos vermelhos o O2 é transferido da hemoglobina para a mioglobina, que, ao ter maior afinidade para o O2 consegue armazená-lo e /ou transportá-lo para os mitocondrios. A hemoglobina desoxigenada e parcialmente oxigenada tem diferenças estruturais, estado tenso e relaxado respectivamente; o estado relaxado tem maior afinidade pelo O2, explicando o conhecido efeito de cooperatividade, pois aumenta a afinidade para o O2 das subunidades desoxigenadas. Em ambas as formas o estado de oxidação do ferro é +2, sendo que o ferro se ajusta mais ao anel de porfirina na forma oxigenada, pois o numero de coordenaçao é 6 e a estrutura octaedrica.
c) Coordenação com iões metálicos -Ferritina: Como o ferro não está muito disponível para os seres vivos, existem
proteínas como a ferritina que armazenam o ferro no organismo de modo a ficar acessivel e não ter efeitos tóxicos. Em bacterias podem ainda ter fosfato e ferro hémico e chamam-se bacterioferritinas. Existem ainda proteínas transportadoras de ferro, as transferrinas, de várias classes que o transportam a vários tecidos.
Enzimas
É comum a presença de ferro em enzimas como Oxidorredutases (catalisam reacções de transferência de electrões) e Liases (adiçao de grupos a duplas ligações ou formaçao de duplas ligações por remoçao de grupos) Por exemplo, a regulação do enzima acotinase, que participa no TCA, é feita através da adição de um ferro ao centro de ferro-enxofre, convertendo uma forma inactiva (três ferros) numa forma activa (quatro ferros). Em resumo, o ferro está presente nos vários organismos em várias formas desempenhando papeis importantes para manter as funções de algumas biomoléculas.
Complexo Tris(oxalato) ferrato(III) de potássio
É um complexo de ferro com 3 ligandos bidentados, o oxalato, C 2O42- . 4
Desta forma este complexo assume a estrutura octaédrica, visto que o seu número de coordenação é 6. Uma das suas propriedades é o paramagnetismo. Aplicações: Pode ser utilizado como catalisador ou estabilizador em processos e produtos químicos, como revestimento para vidro, para processos sintéticos de acrílicos, adesivos acrílicos, resinas de epóxido,poliuretanas, combustíveis, borrachas de silicone, entre outros, processos de polimerização, oligomerização e transesterificação de olefinas.
Procedimento •
•
•
•
•
•
•
Para a realização desta actividade experimental utilizou-se o sulfato ferroso amoniacal que é um sal duplo (2 catiões). Escolheu-se este sal porque é solúvel em água e mais barato que o sulfato de ferro. Para além disso este sal tem menos tendência a ser oxidado ao ar a Ferro (III). A oxidação de soluções de Ferro (II) é muito dependente do pH, ocorrendo mais rapidamente a pH elevado. Os iões de amónio fazem com que a solução fique ligeiramente acídica, o que desacelera o processo de oxidação. O primeiro passo do procedimento consistiu na dissolução de sulfato ferroso amoniacal em água quente acidificada com ácido sulfúrico diluído. O aumento da temperatura facilitou a dissolução do sal e a água acidificada favoreceu o equilíbrio de OH- e H+, impedindo a formação de precipitado (hidróxido de ferro). Seguidamente adicionou-se uma solução quente de ácido oxálico em água, para formar oxalato de ferro (FeC 2O4.2H2O ). Aqueceu-se a mistura até ferver e deixou-se precipitar o sólido amarelo (oxalato de ferro). Lavou-se o precipitado repetidamente com água, com o objectivo de retirar o excesso de ácido e sais. Adicionou-se oxalato de potássio monohidratado em água, que levou à desacidificação do meio para que os grupos OH - resultantes da adição de peróxido de hidrogénio se ligassem ao ferro (passo seguinte). A adição excessiva de ácido oxálico levaria a uma acidificação do meio, o que impossibilitaria a oxidação do ferro, uma vez que este só se oxida em pH neutro. Gota a gota, adicionou-se peróxido de hidrogénio agitando continuamente a solução e mantendo a temperatura abaixo dos 40 0C. A adição de peróxido de hidrogénio oxidou o Ferro II a Ferro III. A temperatura foi mantida abaixo dos 40 0C para evitar a formação de óxidos por decomposição do peróxido. Após ter sido adicionado todo o peróxido de hidrogénio, aqueceu-se a mistura até quase à fervura, o que levou à formação de um precipitado castanho de hidróxido férrico indesejado. 5
•
•
•
•
Adicionou-se, então, gota a gota, uma solução saturada de ácido oxálico para redissolver o precipitado formado. A contínua adição do ácido levou à formação do complexo. Redissolveu o precipitado de hidróxido de ferro que se formou durante a adição de peróxido de hidrogénio. Filtrou-se a solução quente e adicionou-se etanol, que diminuiu a solubilidade do sal, levando à estabilização do complexo. Deixou-se cristalizar o complexo no escuro, pois este complexo é fotossensível. Filtraram-se os cristais verdes e lavaram-se os mesmos com acetona, que eliminou o etanol anteriormente adicionado e ajudou a secar rapidamente os cristais.
•
Deixaram-se secar os cristais ao ar e no escuro.
•
Determinou-se o rendimento.
•
•
•
•
Seguidamente realizaram-se diversas reacções com os iões Fe(II) e Fe(III) e outros reagentes como o hidróxido de sódio, amónia, tiocianato de amónio e oxalato de sódio e observou-se a cor das soluções e se havia ou não precipitado. Realizaram-se também reacções com hexacianoferrato (II) e (III) e observaram-se os resultados. Adicionaram-se reagentes como tiocianato de amónio e hidróxido de sódio a complexos de fluoreto de ferro e observou-se se houve mudança de cor e/ou formação de precipitado. Por fim fizeram-se reacções com iodeto.
Resultados
Síntese do complexo tris (oxalato) ferrato (II) de potássio 1) Dissolução de sulfato ferroso amoniacal
Após este passo e até nova indicação consideramos que o ferro em solução é ferro (II). 2) Adição de ácido oxálico
O precipitado amarelo é o complexo oxalato de ferro (II) dihidratado. 6
3) Adição de oxalato de potássio
Considera-se que as águas que rodeavam o complexo estão agora dispersas no meio. O precipitado laranja é o complexo tris (oxalato) ferrato (II).
4) Adição gota-a-gota de peróxido de hidrogénio
Obteve-se o complexo tris(oxalato) ferrato (III) e, devido à oxidação do peróxido de hidrogénio obteve-se também hidróxido de ferro (III). Reacções redox
5) Adição de ácido oxálico saturado
Adição de solução saturada de ácido oxálico de forma a redissolver o precipitado de hidróxido de ferro que se formou durante a adição de peróxido de hidrogénio. O complexo de tris(oxalato)ferrato (III), em que o ferro está ligado a três oxalatos apresentando isómeros ópticos.
Cálculo do reagente limitante Reagente Sulfato de ferro amoniacal Ácido oxálico Oxalato de potássio
Massa (g)
Massa Molecular (g/mol)
Estequiometria
Número de moles
15,15
392,14
1
0,0386
7,54
126,07
1
0,0838
10,06
184,24
2
0,0273
7
Peróxido de hidrogénio
0,02 dm3
1,667 mol/dm3
0,5
0,08335
Uma concentração de peroxide de hidrogénio 20 volumes é equivalente a 1.667 mol/dm3. Foram adicionados 20 mL deste reagente (0,002 dm 3). Isto prova que o reagente limitante é o oxalato de potássio; O oxalato de potássio doa iões oxalato, tal como o ácido oxálico, que posteriormente é adicionado na forma concentrada – não há controlo sobre a quantidade de iões oxalato (a quantidade de iões oxalato pode advir de várias espécies, sendo mais impreciso calcular o rendimento com o reagente limitante); Para maior precisão, no cálculo do rendimento utilizou-se o sulfato de ferro amoniacal. •
•
•
Cálculo do rendimento
Reacções características dos iões ferro (II) e ferro (III)
1) Reacções dos iões ferro (II) e ferro (III) NaOH - Verifica presença de ferro em solução e qual a espécie Tiocianato - Providencia um teste extremamente sensível para iões de Ferro (III)
8
Fe (II)
Reagente
Fe(III)
Cor
Precipitado
Cor
Precipitado
NaOH
Verde escuro*
Sim
Laranja
Sim
Excesso NaOH
Verde escuro*
Não dissolve
Laranja + escuro
Não dissolve
Amónia
Verde sujo
Sim
Laranja escuro
Sim
Excesso amónia
Verde sujo
Não dissolve
Laranja escuro
Não dissolve
Tiocianato de amónio
-
-
Vermelho sangue
Não
Oxalato de potássio
-
-
Amarelo esverdeado
Não
+ tiocianato de amónio
-
-
Amarelo esverdeado
Não
* este composto é branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxigénio
(produto maioritário) Como o ligando é ambidentado pode gerar complexos do tipo Nada acontece com a adição de mais tiocianato de amónio, já que o complexo formado (tris(oxalato) ferrato (III)) é muito estável (a sua formação é favorável). Não se consegue deslocar a esfera de coordenação do ferro. Existem algumas justificações para o facto do tiocianato não conseguir substituir o oxalato na ligação ao ferro. 9
De acordo com as posições relativas dos ligandos na série espectroquímica, pode inferir-se que o ligando C2O42- forma uma ligação mais estável que o SCN-, uma vez que é um ligando mais forte. Comparando as constantes de estabilidade do complexo com os dois ligandos isto é confirmado.
Força iónica
Ligando
log (K) (25ºC)
C2O42-
0,5
7,53 ± 0,1
SCN-
0
0,9 ± 0,1
F-
0
6,0
OH-
0
11,81 ± 0,03
Sendo o oxalato bidentado, também está favorecida a ligação do “segundo” átomo de
oxigénio ao ferro – efeito entrópico.
2) Reacções com
Fe (II)
Fe(III)
Reagente Cor
Precipitado
Não K4[Fe(CN)6]
Azul escuro*
(mas deveria ter precipitado)**
K3[Fe(CN)6]
Azul escuro + (azul de Turnbull)***
sim
Cor
Precipitado
Azul escuro ++
Sim
(azul da Prússia) Amarelo (amarelo da Prússia)
*este composto é branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxigénio **não se terá observado precipitado por não se ter adicionado quantidade suficiente de reagente ***com o tempo este azul transforma-se em azul da Prússia 10
Dissolveu
Amarelo da Prússia é um oxidante poderoso. K4[Fe(CN)6] - ferrocianeto de potássio, gera iões Fe2+
Após oxidação do ferro, formou-se ferrocianeto férrico (azul da Prússia), a partir de ferrocianeto ferroso.
Forma-se o complexo ferrocianeto férrico.
K3[Fe(CN)6] – ferricianeto de potássio, gera iões Fe 3+
Primeiro formou-se um complexo azul, muito instável, conhecido como azul de Turnbull (Turnbull’s Blue) – ferricianeto ferroso. Este complexo é rapidamente convertido em ferrocianeto férrico (azul da Prússia).
Forma-se um complexo chamado amarelo da Prússia, ferricianeto férrico.
3) Complexo de fluoreto com ferro (III) Fe(III)
Reagente Cor
Precipitado
NaF
Transparente
Não
+ tiocianato de amónio
Laranja escuro
Não
+ NaOH
Laranja
Sim
NaF:
11
Obteve-se hexafluoro ferrato(III). +SCN-:
não reage A cor laranja registada (quando a solução se deveria ter mantido incolor) deve-se ao facto de algum do fluor não ter reagido com o ferro formando o complexo, reagindo antes com o tiocianato. +NaOH:
A adição de NaOH leva à formação de precipitado (hidróxido de ferro (III)) e leva o meio a ficar de novo incolor. O meio fortemente básico, devido à presença de NaOH, tem a capacidade de “destruir” o
complexo formado.
De acordo com as posições relativas dos ligandos na série espectroquímica, pode-se inferir que o ligando OH- possui a capacidade de substituir o F -, formando um complexo mais estável, sendo um ligando mais forte. Comparando as constantes de estabilidade do complexo com os dois ligandos isto é confirmado. Ligando
Força iónica
log (K) (25ºC)
C2O42-
0,5
7,53 ± 0,1
SCN-
0
0,9 ± 0,1
F-
0
6,0
OH-
0
11,81 ± 0,03
4) Reacção com o iodeto
12
Fe(III)
Reagente Cor
Precipitado
KI
Laranja
Não
CHCl3
2 fases: aquosa superior amarela, orgânica inferior roxa
Sim (fase orgânica)
NaF + KI
Incolor
Não
CHCl3
Incolor (evidência de separação por fases)
Não
Reacções redox
não reagiu Fe(III)+KI+CHCl3: •
•
•
A adição de CHCl3 provoca uma separação por fases, distinguindo-se uma fase aquosa superior e uma fase orgânica inferior; Extraiu-se o iodo para a fase orgânica pois este é apolar - ocorre formação de precipitado na solução violeta da fase orgânica, correspondente ao iodo; Em fase aquosa, observa-se o aparecimento de uma cor amarelo torrado diferente da característica do Fe(III), que corresponde à forma aquosa do Iodo molecular (I 3-).
Adição de Fe(III)+NaF+KI+CHCl3: •
Em primeiro lugar, o flúor liga-se ao ferro formando um complexo incolor e muito estável ( );
•
A modificação do estado de complexação do ferro faz com que se crie uma resistência à redução: é modificado o potencial de redução do ferro, aumentando-o para superior ao do iodeto e assim o iodeto não consegue reduzir o Fe 3+.
13
Conclusão
Cálculo do reagente limitante Massa (g)
Massa Molecular (g/mol)
Estequiometria
Número de moles
15,15
392,14
1
0,0386
7,54
126,07
1
0,0838
Oxalato de potássio
10,06
184,24
2
0,0273
Peróxido de hidrogénio
0,02 dm3
1,667 mol/dm3
0,5
0,08335
Reagente Sulfato de ferro amoniacal Ácido oxálico
Uma concentração de peroxide de hidrogénio 20 volumes é equivalente a 1.667 mol/dm3. Foram adicionados 20 mL deste reagente (0,002 dm 3). Isto prova que o reagente limitante é o oxalato de potássio; O oxalato de potássio doa iões oxalato, tal como o ácido oxálico, que posteriormente é adicionado na forma concentrada – não há controlo sobre a quantidade de iões oxalato (a quantidade de iões oxalato pode advir de várias espécies, sendo mais impreciso calcular o rendimento com o reagente limitante); Para maior precisão, no cálculo do rendimento utilizou-se o sulfato de ferro amoniacal. •
•
•
Cálculo do rendimento
Composto modelo
14
A estrutura do complexo sintetizado pode de certa forma ser um modelo para simulação das propriedades do ferro em sistemas biológicos, dado que o complexo está coordenado com oxigénios (ambiente idêntico ao que rodeia as moléculas transportadoras de oxigénio). Encontram-se semelhanças entre o complexo sintetizado e os sideróforos. A formação de complexos de Ferro está dependente da força dos ligandos (posição na série espectroquímica) Quanto mais elevada a constante de estabilidade do complexo com dado ligando mais favorecida é a sua formação.
15
MIOGLOBINA: EXTRACÇÃO, PURIFICAÇÃO E DOSEAMENTO DE PROTEÍNA Introdução: Proteína em estudo: Mioglobina: Proteína hémica monomérica (uma só cadeia polipeptídica); Massa molecular de 16,7 kDa; A sua estrutura secundária consiste maioritariamente em hélices α (cerca de 70%); Encontra-se no músculo cardíaco e esquelético; Função primária – armazenamento de oxigénio (O2) e fornecimento do mesmo em caso de necessidade energética; Possui 153 aminoácidos e um único grupo hémico (protoporfirina IX de ferro), que consiste na associação de uma porfirina com um átomo de ferro. Grupo heme: O heme é um grupo prostético contendo um átomo de ferro, o componente de muitas proteínas. O grupo heme é constituído por uma parte orgânica (protoporfirina) e o por um átomo de ferro. A protoporfirina é constituída por 4 anéis pirrólicos, ligados por pontes de metano, para formar um anel tetrapirrólico. O átomo de ferro liga-se à protoporfirina através de interacções com os átomos de azoto dos anéis pirrólicos. Em condições normais, o ferro encontra-se no estado de oxidação 2+, o podendo formar duas ligações extra, uma de cada lado do plano do grupo heme (5ª e 6ª posições de coordenação). Na mioglobina, a 5ª posição de coordenação vai ser ocupada pelo anel imidazole de um resíduo de histidina (His-93) presente na cadeia polipeptídica ( proximal histidine) e a 6ª posição pode garantir a ligação ao oxigénio. In vivo, a Mb existe maioritariamente em duas formas: desoxi-Mb (desoximioglobina),
« sem oxigénio ligado, e oxi-Mb (oximioglobina). Fora de um sistema biológico, a forma oxi-Mb (Fe2+-O2-Mb) pode ser convertida a met-Mb (Fe 3+-H2O-Mb), através da libertação de uma molécula de O 2 e ligação de H 2O. Objectivo: Extrair e purificar a mioglobina a partir de tecido animal. Calcular a quantidade de mioglobina no tecido de partida. Técnicas utilizadas: Centrifugação •
•
Uso da força centrífuga para sapara partículas por sedimentação; Partículas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes;
Espectroscopia UV-Visível 16
•
•
Trata-se da espectroscopia de absorção em que são utilizados comprimentos de onda da região do ultra violeta à região do visível. Este método consiste na medição da quantidade de radiação absorvida, traduzindo-se esta medição em valores de absorvência. A maior aplicação deste método é a determinação de concentrações de compostos, e para esse efeito, é utilizada a lei de Lambert-Beer, que nos dá a concentração da substância em função da absorvência num determinado intervalo de linearidade (A= εlc).
Cromatografia de exclusão molecular •
•
•
•
Separação dos agentes redox da mioglobina; Separação de moléculas tendo por base o tamanho (Mr) e a forma (raio de Stokes) das moléculas; Uso do Gel Sephadex G-25; Em primeiro lugar elui a Oxi-Mb e a Met-Mb e depois o agente oxidante ou redutor.
Método de Lowry
Usado para a determinação da concentração proteica, através da construção de rectas de calibração; O princípio do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre(II), e produz um composto com absorção máxima em 750nm. É um método muito sensível.
Procedimento:
Colocar 10 g de carne picada e 20 mL de tampão fosfatos (20mM pH 5,6) num tubo de centrífuga Ler Abs a 635, 580, 542 e 505 nm. O restante sobrenadante é dividido em duas partes
Misturar com uma vareta, durante cerca de 1 minuto. Traçar espectro UV/Vis (250-800 nm) de S, diluindo S 1:3 com o tampão inicial
Centrifugar a 5000 rpm, durante 60 minutos (Rotor JA20)
Remover e guardar o sobrenadante (S) com uma pipeta de Pasteur.
17
1. Serve para provocar a ruptura celular e promover a libertação da mioglobina. Deve evitar-se uma mistura agressiva ou prolongada pois pode libertar ácidos gordos e/ou ácidos nucleicos, o que é indesejável 2. A centrifugação separa as partículas por sedimentação; devem equilibrar-se cada dois tubos diametralmente opostos antes de se por a centrifugar. 3. Não pipetar a camada superior acumulada, caso exista, pois trata-se de gordura que não interessa aproveitar. 4. Os picos de absorção para os complexos de mioglobina são para a 635 e 505 nm (para a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina reduzida), na região do visível.
18
Resultados: Tubos
BSA
Absorvências Proteína ( diluída 1:20)
0,810 0,742 0,539 0,327 *Fracções recolhidas da coluna de filtração em gel. 1 2 3 4
0,431 0,383 0,310 0,258
F1+F2*
1,007 0,902 0,608 0,341
1. Cálculo da massa de proteína total na carne
Massa da carne: 10,07g [BSA] = 0,5 mg/mL
BSA 1- 200 µL de BSA → [] = 0,5 mg/mL – Massa = 100 µg 2- 150 µL de BSA + 50 µL de água → [] = 0,375 mg/mL – Massa = 75 µg 3- 100 µL de BSA + 100 µL de água → [] = 0,25 mg/mL – Massa = 50 µg 19
4- 50 µL de BSA + 150 µL de água → [] = 0,125 mg/mL – Massa = 25 µg TOTAL: 200 µL + 2 mL de reagente C + 200 µL de reagente D = 2,4 mL Ex. Cálculo da massa do tubo 2:
Curva de calibração:
Curva de calibração - BSA 1 0.9 0.8 0.7 0.6 s b 0.5 A 0.4 0.3 0.2 0.1 0
y = 0.0081x + 0.0766 R² = 0.9525
0
20
40
60
80
100
120
Massa (mg)
Através da recta de calibração calcula-se a massa de proteína:
Diluições: 1 –
2 –
20
3 –
4 –
Média dos valores de concentração calculados: (0,219 + 0,252 + 0,288 + 0,448) / 4 = 0,3 mg/mL
Na cuvette colocou-se 1 mL de uma solução anterior com 2,4 mL. Calculou-se então a massa de proteína nessa solução: 0,3 mg – 1 mL X – 2,4 mL X = 0,72 mg de proteína.
0,1 mL da solução de 2,4 mL foram retirados do sobrenadante diluído, que tinha 20 mL. Assim, no sobrenadante diluído tem-se: 0,72 mg – 0,1 mL Y – 20 mL Y = 14,4 mg de proteína.
O sobrenadante tinha sofrido uma diluição de 1:20, logo a massa de proteína no sobrenadante é: 14,4 mg – 1 mL Z – 20 mL Z = 288 mg de proteína no sobrenadante. 21
2. Cálculo da massa de mioglobina
No cálculo da massa de mioglobina, considera-se que toda a mioglobina que se aplicou na coluna cromatográfica foi oxidada, logo a mioglobina oxidada equivale à mioglobina total presente.
Massa de proteína na cuvette:
Diluições: 1 –
2 –
3 –
4 –
Média dos valores de concentração calculados: (0,574 + 0,68 + 0,656 + 0,652) / 4 = 0,64 mg/mL
22
Na cuvette colocou-se 1 mL de uma solução anterior com 2,4 mL. Calculou-se então a massa de mioglobina nessa solução: 0,64 mg – 1 mL X – 2,4 mL X = 1,536 mg
0,2 mL da solução de 2,4 mL foram retirados de uma solução de 10 mL. Assim, tem-se: 1,536 mg – 0,2 mL Y – 10 mL Y = 76,8 mg
Na coluna inseriu-se 1mL de sobrenadante diluído, da qual se retiraram 2 mL, pelo que a massa de proteína no sobrenadante diluído é: 76,8 mg – 1 mL Z – 2 mL Z = 152,4 mg
O sobrenadante tinha sofrido uma diluição de 1:20, logo a massa de mioglobina no sobrenadante é: 23
152,4 mg – 1 mL W – 20 mL W = 3048 mg de mioglobina.
Conclusões:
Massa de proteína em 10g de carne: 288 mg Massa de mioglobina em 10g de carne: 3048 mg O resultado obtido não é coerente, o que pode dever-se a erros experimentais e ao facto de nenhum valor de absorvência da mioglobina estar contido na recta de calibração com BSA, podendo estar o valor da massa de mioglobina sobrestimado.
Dado que ocorreram erros experimentais e os valores das massas obtidos não são correctos, nada se pode concluir a partir do grau de pureza.
24
MIOGLOBINA: ESPECTROSCOPIA UV-VISÍVEL Introdução: Proteína em estudo: Mioglobina: Proteína hémica monomérica (uma só cadeia polipeptídica); Massa molecular de 16,7 kDa; A sua estrutura secundária consiste maioritariamente em hélices α; Encontra-se no músculo cardíaco e esquelético; Função primária – armazenamento de oxigénio (O2) e fornecimento do mesmo em caso de necessidade energética; Possui 153 aminoácidos e um único grupo hémico (protoporfirina IX de ferro), que consiste na associação de uma porfirina com um átomo de ferro. Grupo heme: O heme é um grupo prostético contendo um átomo de ferro, o componente de muitas proteínas. O grupo heme é constituído por uma parte orgânica (protoporfirina) e o por um átomo de ferro. A protoporfirina é constituída por 4 anéis pirrólicos, ligados por pontes de metano, para formar um anel tetrapirrólico. O átomo de ferro liga-se à protoporfirina através de interacções com os átomos de azoto dos anéis pirrólicos. Em condições normais, o ferro encontra-se no estado de oxidação 2+, podendo formar duas ligações extra, uma de cada lado do plano do grupo heme (5ª e 6ª posições de coordenação). Na mioglobina, a 5ª posição de coordenação vai ser ocupada pelo anel imidazole de um resíduo de histidina (His-93) presente na cadeia polipeptídica ( proximal histidine). In vivo, a Mb existe maioritariamente em duas formas: desoxi-Mb (desoximioglobina),
sem oxigénio ligado, e oxi-Mb (oximioglobina). No primeiro estado, a 6ª posição de coordenação do ferro do heme encontra-se desocupada sendo que a ligação de uma molécula de O2 causa uma ligeira alteração conformacional, alterando o estado da mioglobina para oxi-Mb. Fora de um sistema biológico, a forma oxi-Mb (Fe 2+-O2-Mb) pode ser convertida a met-Mb (Fe 3+-H2O-Mb), através da libertação de uma molécula de O2 e ligação de H 2O.
Oxi e Met – Mioglobina Oxi-Mb •
•
•
•
Forma reduzida de Mb; Presente na superfície da carne fresca - cor vermelha; O O2 liga-se na posição 6 de coordenação do ferro do grupo heme; Apresenta picos a 542 nm e 580 nm 25
•
Na região de Soret os picos são a 417nm e 348nm.
Met-Mb Forma oxidada de Mb; •
•
•
•
•
•
Presente na carne mais “envelhecida” – cor castanha;
O H2O liga-se na posição 6 de coordenação do ferro do grupo heme; Forma-se nas zonas com baixa concentração de O 2 ; Apresenta picos a 504 nm e 635 nm; Na região de Soret o pico é a 409nm.
Os picos da região de Soret permitem encontrar a razão oxi-Mb/met-Mb. Reacções redox Pode ocorrer interconversão das formas Oxi a Met, por acção de agentes oxidantes (1), numa reacção onde um electrão do ferro é doado ao agente oxidante, ou de Met a Oxi por acção de agentes redutores (2), que doam um electrão ao ferro. •
Objectivo: Extrair e identificar a oxi-Mb e a met-Mb através das suas propriedades espectrais. Estudo da reacção redox de interconversão.
Técnicas utilizadas: Centrifugação •
•
Uso da força centrífuga para sapara partículas por sedimentação; Partículas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes;
Espectroscopia UV-Visível
Trata-se da espectroscopia de absorção em que são utilizados comprimentos de onda da região do ultra violeta à região do visível. Este método consiste na medição da quantidade de radiação absorvida, traduzindo-se esta medição em valores de absorvência. A maior aplicação deste método é a determinação de concentrações de compostos, e para esse efeito, é utilizada a lei de Lambert-Beer: A=εlc, que nos dá a concentração da substância em função da absorvência num determinado intervalo de linearidade.
26
Cromatografia de exclusão molecular •
•
• •
Separação dos agentes redox da mioglobina; Separação de moléculas tendo por base o tamanho (Mr) e a forma (raio de Stokes) das moléculas; Uso do Gel Sephadex G-25; Em primeiro lugar elui a Oxi-Mb e a Met-Mb e depois o agente oxidante ou redutor.
Procedimento:
Colocar 10 g de carne picada e 20 mL de tampão fosfatos (20mM pH 5,6) num tubo de centrífuga Ler Abs a 635, 580, 542 e 505 nm. O restante sobrenadante é dividido em duas partes
Misturar com uma vareta, durante cerca de 1 minuto. Traçar espectro UV/Vis (250-800 nm) de S, diluindo S 1:3 com o tampão inicial
Centrifugar a 5000 rpm, durante 60 minutos (Rotor JA20)
Remover e guardar o sobrenadante (S) com uma pipeta de Pasteur.
5. Serve para provocar a ruptura celular e promover a libertação da mioglobina. Deve evitar-se uma mistura agressiva ou prolongada pois pode libertar ácidos gordos e/ou ácidos nucleicos, o que é indesejável 6. A centrifugação separa as partículas por sedimentação; devem equilibrar-se cada dois tubos diametralmente opostos antes de se por a centrifugar. 7. Não pipetar a camada superior acumulada, caso exista, pois trata-se de gordura que não interessa aproveitar. 8. Os picos de absorção para os complexos de mioglobina são para a 635 e 505 nm (para a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina reduzida), na região do visível.
27
28
Resultados:
Espectro experimental da mioglobina: Os picos 33, 35 e 36 são característicos da forma reduzida da mioglobina, Oxi-Mb, sendo que pico 33 corresponde à zona de Soret. O pico 34 é caracteristico da forma oxidada da Mioglobina, Met-Mb, correspondendo ao seu pico na zona de Soret. •
•
Espectro experimental da mioglobina oxidada (Met-Mb): Os picos observados, 405, 575 e 623, são os correspondentes aos teóricos nos comprimentos de onda 409, 504 e 635. Foi ainda medida a absorvência a 409 nm, correspondente ao pico teórico da zona de Soret da Met-Mb, tendo sido obtido o valor de 1,945. •
•
Espectro experimental da mioglobina reduzida (Oxi-Mb): Os picos observados, 411, 539 e 577, são os correspondentes aos teóricos nos comprimentos de onda 417, 542 e 580. Foi ainda medida a absorvência a 417 nm, correspondente ao pico teórico da zona de Soret da Oxi-Mb, tendo sido obtido o valor de 1,386. •
•
29
Comprimento de onda 409 417 505 542 546 580 635
Abs sobrenadante 1,870 1,848 0,455 0,488 0,451 0,311
Abs Oxi-Mb 1,392 1,386 0,215 0,244 0,239 0,221 0,109
Abs Met-Mb 1,945 1,412 0,332 0,272 0,266 0,222 0,194
Cálculo da concentração de Oxi-Mb e Met-Mb na amostra inicial Primeiro foram calculadas as concentrações para a Oxi-Mb e Met-Mb que foram isoladas a partir da cromatografia de exclusão molecular. Os valores de para a Oxi-Mb e de para a Met-Mb foram retirados do protocolo experimental.
[Oxi-Mb] a 417 nm
Como se realizou previamente uma diluição 1:3, a concentração de Met-Mb na amostra inicial será então três vezes a calculada acima
[Met-Mb] a 409 nm
Como se realizou previamente uma diluição 1:3, a concentração de Met-Mb na amostra inicial será então três vezes a calculada acima
[Oxi-Mb] e [Met-Mb] na amostra inicial (sobrenadante) Valores de
ε a e nm para os dois estados da miolobina
Oxi-Mb
30
Os valores utilizados são correspondentes à absorvência da Oxi-Mb a 409 nm e à [OxiMb] calculada anteriormente. Met-Mb
Os valores utilizados são correspondentes à absorvência da Met-Mb a 417 nm e à [Met-Mb] calculada anteriormente.
Cálculo das concentrações na amostra inicial Valores de absorvência do sobrenadante a 409 e 417 nm.
Como se realizou previamente uma diluição 1:3, as concentrações na amostra inicial serão então três vezes a calculada acima
31
Razão Oxi-Mb/Met-Mb
A mioglobina encontra-se maioritariamente na sua forma reduzida, Oxi-Mb, onde uma molécula de O2 se liga na posição 6 de coordenação do ferro do grupo heme.
Conclusões:
•
•
•
•
•
•
•
A mioglobina encontra-se maioritariamente na sua forma reduzida, Oxi-Mb, onde uma molécula de O2 se liga na posição 6 de coordenação do ferro do grupo heme.
Pelos espectros obtidos verificou-se um sucesso parcial da extracção da mioglobina reduzida e oxidada; No espectro da mioglobina oxidada os picos de absorção são aos comprimentos de onda 575 e 623 nm e deveriam ser a 504 e 635 nm; No espectro da mioglobina reduzida os picos de absorção são aos comprimentos de onda 539 e 577 nm e deveriam ser a 542 e 580 nm; Os picos das bandas de Soret da mioglobina oxidada são: Teórico - 409, prático – 405; Os picos das bandas de Soret da mioglobina reduzida são: Teórico - 417 , prático – 411; Apesar dos valores não corresponderem exactamente , verificou-se para o espectro da Met-Mb o desaparecimento dos picos de absorção da Oxi-Mb e vice-versa, revelando que não há contaminação das fracções obtidas.
32
FTIR E FLUORESCÊNCIA Introdução: Luminescência: Emissão de luz a partir de uma substância que ocorre a partir de estados
excitados. É formalmente dividida em duas categorias – Fosforescência e Fluorescência – dependendo da natureza do estado excitado.
A fosforescência é a emissão de luz a partir da excitação de um electrão para um estado de tripleto excitado. O electrão excitado tem o mesmo spin que o seu par da orbital do estado fundamental. As transições para o estado fundamental são proibidas - não tem “permissão” de spin - e as taxas de emissão são muito lentas, por isso os tempos de vida da fosforescência são tipicamente entre milissegundos e segundos. A fluorescência é a emissão de luz a partir da excitação de um electrão para um estado de singuleto excitado. O electrão excitado tem spin oposto do seu par do estado fundamental. Consequentemente, o regresso ao estado fundamental é permitido – há “permissão” de spin – e ocorre rapidamente pela emissão de um fotão. As taxas de emissão são tipicamente de 10 8 s -1, pelo que o tempo de vida típico da fluorescência é cerca de 10 ns (10 x 10 -9 s).
Fluorescência
Serve para o estudo de moléculas biológicas (estado das membranas biológicas, vesículas, proteínas células vivas, etc.). É um processo com grande sensibilidade de detecção, sendo possível trabalhar a muito baixas concentrações. Quando comparado com o doseamento espectrofotométrico é mais sensível já que reflecte as propriedades do microambiente da molécula no estado excitado sendo que este é influenciado pelo pH, temperatura, pressão, ligações de hidrogénio. A fluorescência ocorre tipicamente a partir de compostos aromáticos, como os apresentados na figura abaixo.
33
O processo que ocorre entre a absorção e emissão de luz é usualmente descrito pelo diagrama de Jablonski:
S0, S 1 e S2 correspondem respectivamente ao estado fundamental, primeiro e segundo níveis de energia. Em cada um destes níveis electrónicos os fluoróforos (molécula ou parte de uma molécula que emite fluorescência seguindo a excitação com a luz) podem existir em diferentes níveis de energia vibracionais (0, 1, 2, etc.). As transições entre estados são representadas como linhas verticais. Um fluoróforo é geralmente excitado para níveis vibracionais elevados de S 1 ou S2. Com algumas excepções, as moléculas são rapidamente relaxadas para o estado vibracional mais baixo de S1. Este processo é denominado conversão interna e ocorre em cerca de 10 -12s ou menos. Como os tempos de vida da fluorescência são geralmente cerca de 10 -8s, a conversão interna é completada antes da emissão. O regresso ao estado fundamental ocorre tipicamente de um estado excitado vibracional baixo de S1 para os níveis vibracionais altos de S 0, com a emissão de fotões. Rapidamente o electrão passa para os níveis vibracionais baixos de S 0, voltando ao estado fundamental.
34
As moléculas do estado S 1 podem sofrer uma conversão de spin para o primeiro estado tripleto (T1). A emissão a partir de T 1 é a fosforescência. A conversão de S 1 para T1 é denominada cruzamento inter-sistemas (ocorre entre dois estados vibracionais isoenergéticos pertencentes a estados electrónicos com diferentes multiplicidades).
Características da Fluorescência: Efeito da polaridade do solvente A polaridade do solvente e o microambiente têm profundos efeitos nos espectros de emissão dos fluoróforos.
Desvio de Stokes Geralmente o comprimento de onda de emissão é maior do que o de excitação. Uma causa habitual para o desvio de Stokes é o rápido decaimento para o nível vibracional mais baixo de S1. Os fluoróforos geralmente passam para os níveis vibracionais mais elevados de S0, resultando numa posterior perda de energia de excitação. Para além destes efeitos, os fluoróforos podem sofrer desvios de Stokes devido a efeitos dos solventes, reacções do estado excitado, formações de complexos e transferência de energia. o
Os efeitos do solvente diminuem a energia de emissão devido à estabilização do estado excitado pelas moléculas do solvente polar. O fluoróforo tem um maior momento dipolar no estado excitado ( μE) do que no estado fundamental ( μG). Depois da excitação os dipolos do solvente podem reorientar-se ou sofrer relaxação à volta de μE, o que diminui a energia do estado excitado. À medida que a polaridade do solvente aumenta, este efeito é também aumentado, resultando numa emissão a menor energia. Por esta razão, quando se altera a polaridade do solvente, os espectros de emissão sofrem desvios. Em geral, apenas fluoróforos que são polares têm uma grande sensibilidade a solventes polares. Os fluoróforos apolares não sofrem desvios de Stokes com a variação da polaridade do solvente. O tempo de vida de fluorescência é geralmente muito maior do que o tempo necessário para a relaxação do solvente. Por esta razão, as moléculas do solvente reorientamse à volta do dipolo do fluoróforo, e dão-se desvios nos espectros de emissão. Assim, estes espectros são muito mais sensíveis ao ambiente e à polaridade do solvente do que os espectros de absorção/excitação. A absorção/excitação ocorre a uma velocidade muito grande, pelo que não há tempo para que as moléculas do solvente se reorganizem, não havendo desvios nos espectros que se obtêm.
35
Excepções à Regra da Imagem no Espelho
Geralmente os espectros de absorção e emissão são a imagem um do outro no espelho. No entanto, existem várias excepções a regra que se devem aos seguintes factores: A emissão dá-se a partir duma espécie diferente da espécie que absorveu o fotão (isto é, dá-se uma reacção no estado excitado). A emissão dá-se sempre a partir da espécie protonada, logo, no caso desta excepção, a espécie protonada não é a que recebeu o fotão; A emissão dá-se a partir dum estado diferente daquele que resultou da absorção (a emissão dá-se geralmente a partir de S1, logo, neste caso, a molécula pode ter sido excitada para S2); O espectro de absorção corresponde a duas transições quase iso-energéticas (como por exemplo o caso do Triptofano, em que ocorre transição entre dois estados singuletos excitados de baixa energia). o
o
o
36
Tempos de vida de Fluorescência e Rendimento Quântico O tempo de vida (tempo que a molécula passa no estado excitado antes de regressar ao estado fundamental) e o rendimento quântico (número de fotões emitidos por número de fotões absorvidos) são características muito importantes de um fluoróforo. Substâncias com maiores rendimentos quânticos têm maiores emissões (mais brilhantes). O tempo de vida determina o tempo disponível para o fluoróforo interagir ou difundir-se no meio e por isso fornece informação sobre a sua emissão.
Espectrofluorímetro Com a maior parte dos espectrofluorímetros é possível registar os espectros de emissão e excitação. Estes espectros podem ser apresentados em escalas de comprimentos de onda ou de números de onda. Para a maior parte dos fluoróforos os rendimentos quânticos e os espectros de emissão são independentes do comprimento de onda de excitação. Num caso ideal, os espectros de excitação e emissão devem representar a intensidade relativa de fotões por intervalo de comprimento de onda. Para obter t al espectro “correcto” os
componentes individuais devem ter as seguintes características:
A fonte de luz deve produzir uma emissão constante de fotões a todos os comprimentos de onda; O monocromador deve passar fotões de todos os comprimentos de onda com a mesma eficiência; A eficiência do monocromador deve ser independente da polarização; O detector (tubo fotomultiplicador) deve detectar fotões de todos os comprimentos de onda com igual eficácia.
37
Espectros de excitação e emissão O espectro de fluorescência é geralmente apresentado como espectro de emissão (intensidade de fluorescência vs. número de onda). Este espectro varia muito e depende da estrutura química do fluoróforo e do solvente no qual se dissolve.
Espectro de emissão
Representa a frequência de fotões emitidos ou energia emitida a cada comprimento de onda. Para o traçar, é escolhido um comprimento de onda de excitação fixo, e de seguida é percorrido toda a gama de comprimento de onda pelo monocromador de excitação. Razões de distorção do espectro: Dependência da eficiência da emissão da energia por parte do o monocromador de emissão e do fotomultiplicador; Absorção de radiação por parte da amostra. o
Espectro de excitação
Representa a emissão relativa do fluoróforo a cada comprimento de onda de excitação.
38
Para o traçar, o monocromador de emissão é calibrado ao comprimento de onda de emissão máximo da amostra, e faz-se correr a gama de comprimentos de onda pelo monocromador de excitação. Razões de distorção do espectro: A intensidade da luz da fonte de excitação está dependente da gama o de comprimentos de onda; A eficiência da transmissão do monocromador de excitação deve-se o também à gama de comprimento de onda; o nda; A substância pode ter absorvência superior. o
Fluorescência de proteínas - O triptofano como composto modelo Nas proteínas há três aminoácidos fluorescentes: fenilalanina, tirosina e triptofano. Estes aminoácidos são relativamente raros nas proteínas. O triptofano é o fluoróforo intrínseco dominante. O número reduzido de resíduos de triptofano é provavelmente o resultado do custo metabólico da sua síntese. Uma proteína pode ter apenas um ou alguns resíduos de triptofano, o que facilita a interpretação dos dados do espectro.
Um factor importante é a sensibilidade do triptofano ao seu microambiente. Alterações no espectro de emissão do triptofano ocorrem frequentemente devido a modificações conformacionais, ligação a substratos ou desnaturação. Este resíduo é sensível a ligações de hidrogénio e sofre frequentemente “quenching” (extinção) por algumas cadeias laterais. Um factor que complica a interpretação da fluorescência das proteínas é a presença dos vários aminoácidos fluorescentes na maioria das proteínas. No entanto os espectros de emissão das proteínas são dominados pelo triptofano que absorve e emite a maiores comprimentos de onda e numa gama de comprimentos de onda maior. O triptofano tem um maior coeficiente de absortividade molar. A energia absorvida pela fenilalanina e tirosina é muitas vezes transferida para os resíduos de triptofano tripto fano da mesma proteína. A excitação das proteínas geralmente ocorre a um máximo próximo de 280 nm. Consequentemente, a fenilalanina não é excitada nesta experiência, e como o seu rendimento quântico é muito pequeno, a emissão deste resíduo é raramente observada para proteínas. A absorção de proteínas a 280 nm deve-se aos resíduos de tirosina e triptofano. A comprimentos de onda de 295 nm ou superior, a absorção deve-se principalmente ao triptofano. Este resíduo pode ser selectivamente excitado a comprimentos de onda entre 295 e 305 nm. Por esta 39
razão, efectuou-se efectuou-se a excitação da mioglobina a 295 nm e não no máximo de excitação do triptofano, evitando-se a excitação da tirosina e da fenilalanina (os outros resíduos fluorescentes). Assim, a 295 nm apenas o triptofano emite e por isso evita-se coalescência de espectros. Há, no entanto, um problema quando existem vários resíduos de triptofano em solução: os espectros de emissão dos diferentes resíduos ficam sobrepostos, cada um com um microambiente único.
Fluorescência da Mioglobina A mioglobina é uma proteína com dois resíduos de triptofano (Trp-7 e Trp-14) que se encontram no interior hidrófobo da proteína. Quando a proteína é desnaturada, estes resíduos são expostos ao solvente e como são fluoróforos polares, sofrem desvio de Stokes, havendo desvios nos espectros de emissão da mioglobina quando esta se encontra no estado nativo e desnaturado.
FTIR
FTIR - técnica Apesar de existirem técnicas que fornecem informação mais detalhada sobre a estrutura de proteínas (como a cristalografia de raios X), estas muitas vezes não podem ser aplicadas visto que as proteínas nem sempre formam um cristal de qualidade suficiente para análise. A técnica de FTIR dá também informação sobre a estrutura secundária, enquanto que a cristalografia de raios X e outras técnicas fornecem informações sobre a estrutura terciária.
40
FTIR (Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier) é uma técnica que realiza a medição do comprimento de onda e da intensidade de absorção em infravermelho por uma amostra. Compostos diferentes têm bandas de absorção características no espectro IV. Um monocromador é desnecessário, pois faz-se uso de um interferómetro que encripta todas as frequências da radiação IV num sinal único. A radiação incidente é divida em dois feixes (beamsplitter ) e o espelho móvel provoca a alteração da distância percorrida que leva à interferência entre os dois feixes. A radiação infravermelha passa pela amostra, com alguma a ser absorvida e outra a ser transmitida. O interferograma resultante representa todas as frequências medidas simultaneamente e todos os seus pontos têm informação codificada. Por fim, aplica-se a transformada de Fourier no interferograma final, obtendo-se o espectro.
Bandas do espectro As bandas observadas nos espectros IV devem-se aos movimentos vibracionais dos átomos nas moléculas que façam variar o seu momento dipolar permanente, μ. Existem várias bandas características de aminoácidos específicos, no entanto as mais importantes referentes às ligações peptídicas e que permitem um estudo da estrutura secundária são a Amida I e a Amida II, pois relacionam-se com as ligações por pontes de hidrogénio estabelecidas. A banda amida I deve-se às vibrações stretching (elongamento ) da ligação C dupla O do grupo amida; o número de onda dos fotões absorvidos é 1600-1690 cm -1 A banda amida II - deve-se às vibrações bending (dobramento) da ligação NH ; o número de onda dos fotões absorvidos é 1480-1575 cm -1 Ambos os grupos estão envolvidos em ligações por pontes de hidrogénio, que ocorrem entre diferentes elementos de estrutura secundária. Assim, a existência deste tipo de bandas e sua posterior análise em certos números de onda específicos indicam que tipo de estrutura secundária está presente.
Amida I vs Amida II A região do espectro mais sensível à estrutura secundária das proteínas é a banda da Amida I (1700-1600 cm-1), resultante inteiramente do stretching da ligação C=O das ligações peptídicas. As frequências dos componentes estão relacionados com cada tipo de motivo estrutural secundário.
41
Por outro lado, a banda Amida II deriva maioritariamente do bending da ligação no plano NH e da vibração do stretching do CN, o que mostra muito menos sensibilidade à conformação proteica.
Métodos de melhoramento dos espectros Há dificuldades na análise da banda de amida I para identificação de estruturas secundárias, devido às diferenças de frequência serem muito pequenas em relação à largura da banda; assim obtém-se um só pico irregular em vez de vários para cada tipo de estrutura secundária. Têm vindo a ser desenvolvidos métodos para melhorar este aspecto como o método de desconvolução de Fourier e o das segundas derivadas.
FTIR e mioglobina e γ-globulina Nesta actividade experimental pretendia-se identificar as bandas da Amida I que permitissem identificar as estruturas secundárias da mioglobina e comparar com as da γglobulina. A mioglobina é uma proteína cuja estrutura secundária é constituída maioritariamente por hélices α, portanto, no espectro de FTIR é esperado que o mínimo de absorção seja para número de onda 1656 cm-1 (número de onda atribuído à estrutura de hélices α em H2O). A γ-globulina é uma proteína cuja estrutura secundária é constituída maioritariamente por folhas β; no espectro de FTIR é esperado que os valores mínimos de absorção sejam para números de onda: 1624, 1627, 1633, 1638, 1642, 1691 e 1696 cm -1 e 1642 (números de onda atribuídos à estrutura de folhas β em H2O).
Procedimento:
Espectros de excitação e emissão de fluorescência do triptofano e da mioglobina
42
43
Resultados:
Espectros de fluorescência do triptofano Não se observaram diferenças significativas nos espectros de excitação do triptofano. 44
O espectro de emissão do triptofano em etanol tem um máximo a 335 nm e o do triptofano em tampão fosfatos a 350 nm. Estes espectros sofrem o efeito de relaxação do solvente. A relaxação do solvente consiste na estabilização das moléculas no estado excitado por interacção com as moléculas do solvente, sendo este efeito maior quanto maior for a polaridade do composto em causa. Como o tampão de fosfatos é mais polar que o etanol o estado excitado do triptofano em tampão é menos energético e por isso o espectro de emissão é a comprimentos de onda maiores, sendo o do etanol a comprimentos de onda menores. Isto só acontece porque o momento dipolar da molécula no estado excitado é maior do que no estado fundamental. Por a emissão em fluorescência ser mais lenta que a excitação, pode dizer-se que os espectros de emissão são mais sensíveis ao ambiente, permitindo, por exemplo, a reorientação do solvente (efeito de relaxação do solvente).
Espectros de fluorescência da mioglobina No intervalo de comprimentos de onda utilizado, apenas o triptofano (dos três aminoácidos aromáticos) é fluorescente - causa a fluorescência da mioglobina. O máximo da mioglobina nativa é semelhante ao máximo de triptofano em etanol, pois quando a proteína se encontra no estado nativo os resíduos de triptofano (os dois que a mioglobina possui) estão num microambiente relativamente apolar, no interior da proteína. O espectro de emissão da mioglobina desnaturada é semelhante ao do triptofano em tampão, pois ocorre desnaturação da mioglobina, ficando os resíduos de triptofano sujeitos a um microambiente polar, semelhante ao triptofano em tampão.
Variação da intensidade de fluorescência da mioglobina com o pH •
Existe um máximo de intensidade de fluorescência em redor do pH 4, um mínimo de intensidade de fluorescência em redor de pH 6 e a partir daí uma nova subida da intensidade.
45
•
•
•
pH 3.5: a diminuição da fluorescência pode dever-se à protonação de um carboxilo próximo, já que os dados não indicam que ocorram mudanças conformacionais; pH 4: máximo de fluorescência
pH 6: mínimo de fluorescência porque o pKa da histidina é próximo de 6 e a este pH
a cadeia lateral do resíduo é protonada; quando isto ocorre a intensidade da fluorescência é diminuída; •
•
pH 7 : estabilização devido à desprotonação de outros resíduos de aminoácidos; Diminuindo o pH: aumento da fluorescência, devido ao desenrolamento da proteína, que leva ao afastamento dos resíduos de histidina e triptofano; os resíduos de triptofano ficam mais expostos, havendo um aumento da intensidade de fluorescência.
Comparação com gráfico para a apomioglobina •
As observações feitas na aula são semelhantes às obtidas por Irace e colaboradores, embora no artigo de Irace se tenha usado apomioglobina.
Comparação com gráfico de Gryczynski e colaboradores •
•
•
O gráfico de Gryczynski e colaboradores foi feito para a mioglobina de coração de cavalo O desvio que se observa entre os espectros de pH 7 e pH 4,5 na zona do IV prova o desenrolamento da proteína, verificado também para o gráfico de Gryczynski . Ao dar-se o desenrolamento, os resíduos ficam mais expostos, havendo um aumento na intensidade de fluorescência.
FTIR Ftir mioglobina
Número de onda (
Banda característica
1536.99
Amida II
1656.56
Amida I (hélice )
3299.92
Amida A
α
Ftir globulina
Número de onda ( 615,18
Banda característica
Amida V
46
3286.12
1236.15
Amida III
1531.21
Amida II
1643.06
Amida I (folha )
β
Amida A
Comparação da estrutura secundária das proteínas obtida através de FTIR e de cristalografia de raio-X A γ-globulina é uma imunoglobulina pelo que foi usada a informação relativa à imunoglobulina G para comparação. Os resultados obtidos por FTIR estão consistentes com a tabela apresentada, no entanto não se encontraram folhas β na mioglobina
Conclusão: •
•
•
•
•
A γ-globulina é uma imunoglobulina pelo que foi usada a informação relativa à imunoglobulina G para comparação; Os resultados obtidos por FTIR estão consistentes com a tabela apresentada, no entanto não se encontraram folhas β na mioglobina.
As técnicas de fluorescência e de FTIR complementam-se; A primeira fornece informação acerca da constituição em resíduos de aminoácidos da proteína e o microambiente onde se encontram inseridos; A segunda garante uma visão sobre a estrutura secundária da proteína, conseguindo assim através da utilização destas duas técnicas uma visão única sobre a estrutura tridimensional da proteína em estudo.
47
RESPIRAÇÃO MITOCONDRIAL – RAZÃO ADP/O E RAZÃO DE CONTROLO RESPIRATÓRIO
1. Introdução Transporte electrónico e fosforilação oxidativa
A fosforilação oxidativa é uma via metabólica que utiliza a oxidação final de glúcidos, lípidos e proteínas (e a energia libertada nestas reacções de oxidação-redução) para produzir ATP, através da fosforilação de ADP. Este processo ocorre nos mitocôndrios. Nesta via ocorre transferência de electrões a partir de doadores electrónicos até aceitadores electrónicos finais, como o oxigénio – transporte electrónico.
A cadeia respiratória pode ser separada em 4 complexos enzimáticos: • NADH-Ubiquinona Redutase (Complexo I) • Succinato-Ubiquinona Redutase (Complexo II) • Ubiquinol-citocromo c Redutase (Complexo III) • Citocromo c Oxidase (Complexo IV)
Em plantas, são ainda encontradas algumas actividades alternativas aos principais complexos da cadeia respiratória – duas actividades de NADH desidrogenase (uma associada à zona interna da membrana interna e outra à zona externa da membrana interna) e uma actividade alternativa de oxidase.
Estes complexos, na presença de ubiquinona e de citocromo c, catalisam a oxidação aeróbia do NADH e do sucinato - os complexos I e II catalisam a transferência electrónica para a ubiquinona a partir de dois doadores de electrões diferentes: NADH (complexo I) e sucinato (complexo II). O complexo III leva electrões da ubiquinona reduzida ao citocromo c e o complexo IV completa a sequencia transferindo os electrões do citocromo c para o O2.
Fosforilação oxidativa – o acoplamento do transporte electrónico com a síntese de
ATP
Os complexos I, III e IV são centros de acoplamento de energia. Nestes centros de acoplamento, a energia libertada durante o transporte electrónico é conservada através da sua conversão numa força motriz protónica utilizada para bombear protões para fora da matriz mitocondrial (espaço intermembranar), ocorrendo assim uma translocação vectorial de 48
protões e a formação de um potencial electroquímico protónico de membrana, podendo então essa energia ser usada para a síntese do ATP. Esta síntese é catalisada por um complexo multienzimático, Complexo V ou ATPsintase.
Inibidores e desacopladores
A fosforilação oxidativa pode ser inibida directamente por uma série de agentes químicos. Uma classe destes compostos (caso do antibiótico oligomicina) inibe a fosforilação oxidativa e a respiração. Uma segunda classe de agentes (caso do m-clorocarbonilocianetofenilohidrazona (CCP) e 2,4-dinitrofenol (DNP)) provoca a inibição da fosforilação por desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respiração e fluxo de electrões mas não ocorre síntese de ATP (há inibição da fosforilação oxidativa mas não da respiração). Uma terceira classe inclui os inibidores específicos da cadeia de transporte electrónico (rotenona, antimicina A, cianeto).
Controlo respiratório
O sistema de fosforilação oxidativa exerce um efeito regulador na velocidade de respiração. Com efeito, as concentrações de ADP e de fosfato limitam a velocidade de transporte electrónico. Uma vez que na maioria das células o fosfato inorgânico se encontra presente em excesso, é o ADP que controla a velocidade de respiração. Nos organismos intactos, existe um alto grau de controlo respiratório e os mitocôndrios dizem-se fortemente acoplados. Quando ocorre dano estrutural no mitocôndrio perde-se este controlo.
RC (respiratory control) refere-se à razão entre as velocidades de consumo de O2 no estado e no estado 4.
49
O controlo respitatório pode ser ilustrado por uma série de cinco estados que se podem repetir ciclicamente.
estado 1 – mitocôndrios sozinhos (na presença de Pi)
estado 2 - adição de substrato, respiração baixa devido à falta de ADP (não há reentrada de protões através do ATP sintase e qualquer respiração deve-se à fuga de protões através da membrana)
estado 3 – uma quantidade limitada de ADP é adicionada, permitindo uma respiração rápida
estado 4 - todo o ADP foi convertido em ATP (fosforilação) e a respiração torna-se lenta
estado 5 – anoxia (ausência de O 2) Se a quantidade de ADP adicionado for conhecida então a captação de oxigénio
durante o estado 3 pode ser quantificada permitindo o cálculo de uma razão P/O.
Razão ADP/O
A razão ADP/O é o número de moles de ADP fosforiladas a ATP por cada dois electrões fluindo por um segmento da transferência electrónica para o oxigénio. No cálculo desta razão o oxigénio é o terminal aceitador. Razões P/O podem ser determinadas através da extensão do estado três acelerado, obtido por adição de ADP no estado 2. Quase todo o ADP é fosforilado a ATP: a razão ATP:ADP é normalmente de 100:1 quando o estado 4 é atingido e a razão moles de ADP adicionado/moles de O2 consumido pode ser calculada. 50
Técnicas
O eléctrodo de oxigénio Este eléctrodo consiste num eléctrodo de referência de Ag/AgCl e um eléctrodo de Pt, ambos imersos em KCl aquoso e separados da câmara onde se inserem as amostras apenas através de uma membrana permeável a O 2. Este é reduzido a H 2O no eléctrodo de Pt, gerando uma voltagem referente ao eléctrodo de Ag/AgCl que é proporcional à [O 2] na câmara reaccional. Cátodo: O2 + 4e-
2H O 2
Ânodo: 4Ag+ + 4Cl-
4AgCl + 4e
-
51
Objectivos: 1. A extensão da fosforilação obtida com diferentes substratos (razão ADP/O) 2. O grau de controlo respiratório 3. O efeito de diversos inibidores e de um desacoplador da cadeia de transporte electrónico
2. Procedimento
Isolamento dos mitocôndrios de batata É importante ter em conta que, sendo uma experiência em que se pretende manter a actividade mitocondrial, todas as operações devem ser feitas entre 0 e 4ºC e o processo não deve demorar mais que 1h. Nesta actividade experimental a primeira parte foi o isolamento dos mitocondrios de batata, começando por se pesar 300g de batata e cortá-la em cubos pequenos. De seguida efectuou-se a homogeneização em 250 mL de meio de isolamento num batedor eléctrico, durante apenas 2 segundos para evitar danificar estruturas e perda de actividade. Procedeu-se à filtração num funil de Buckner com uma camada de gaze e posterior centrifugação. Após a 1ªcentrifugação aproveitou-se o sobrenadante e voltou-se a centriguar a 8000g durante 10 minutos e a 4 graus. Desta vez aproveitou-se o pellet, ressuspendendo-o em meio de lavagem, juntando-se o conteúdo de diferentes tubos (dos vários grupos). Centrifugou-se novamente nas mesmas condições, aproveitou-se o pellet, ressuspendeu-se em meio de ressuspensão e prosseguiu-se à última centrifugação também a 8000g, 4 graus e durante 10 minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 4-5 mL de meio de ressuspensão. Obteve-se assim a fracção mitocondrial a ser usada no procedimento seguinte. Os meios utilizados foram os de isolamento, lavagem e ressuspensão. Estes meios contêm alguns componentes com concentrações adequadas para manter a actividade mitocondrial. O pH 6,5 é o mais adequado, o manitol 0,7 M permite a manutenção da osmoralidade do meio, a cisteína previne a oxidação de produtos fenólicos prejudiciais ao mitocôndrio, a BSA (soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratório pelo ADP e o EDTA remove metais catalisadores de reacções indesejáveis, mas inibe a respiração induzida pela cisteína, pelo que é adicionado em concentração baixa.
52
Determinação das razões ADP/O Para determinar as razões ADP/O prepararam-se várias soluções: meio recacional, substratos, ADP e o inibidor CCP. Procedeu-se à calibração do eléctrodo de oxigénio à temperatura ambiente. De seguida saturou-se o meio de reacção com ar, num agitador magnético a 20 graus. Depois deste processo adicionou-se à câmara reaccional 1,6 mL do meio reaccional e 0,2 mL de suspensão mitocondrial. Colocou-se de seguida a tampa para que o tampão subisse 1cm no canal de injecção e iniciou-se o registo até obtenção de uma linha de base estacionária. Iniciou-se o primeiro ensaio com a adição de 20 μL de succinato de sódio (substrato), registou-se uns minutos e adicionou-se 20 μL ADP, prosseguindo com o registo até o seu consumo, quando se adiciona novamente 20 μL ADP. Regista-se mais um minuto e adiciona-se CCP (inibidor). Por fim removeu-se a mistura da câmara por aspiração, limpando e enchendo a câmara com água desionizada. No ensaio seguinte o processo é o mesmo mas com a adição de + 20 μL de ascorbato de sódio+ 20 μL de citocromo c 10 mg/mL como substratos.
53
3. Resultados Calibração do eléctrodo
Calibrou-se o eléctrodo de oxigénio e determinaram-se as concentrações de oxigénio correspondentes a 0% e 100% de O 2. Foi calibrado a 100% com o meio reaccional oxigenado por agitação e a 0% com o reagente ditionito de sódio. No protocolo é fornecida uma tabela que nos dá informação sobre conteúdo em O 2 de água saturada com ar:
Tabela 1 - Conteúdo em O 2 de água saturada com ar. o
Temperatura ( C) 0 5 10 15 20 25 30 35
100% O2
O2 (ppm)
O2 (μmol/mL)
14,16 14,37 10,92 9,76 8,84 8,11 7,52 7,02
0,442 0,386 0,341 0,305 0,276 0,253 0,230 0,219
Sabendo que a temperatura ambiente é aproximadamente 25 0C, a concentração de O2 na câmara reaccional é 0,253 μmol/mL. O volume da câmara é 2 mL, pelo que é possível calcular o número de moles de O 2:
0% O2
Contam-se 77 quadrículas entre o ponto equivalente a 100% de O2 e o ponto equivalente a 0%. Assim sabe-se que 77 quadrículas equivalem a 506 nmol de O2, logo, uma quadrícula corresponde a 506/77 nmol = 6,57 nmol.
Quadrículas 77 1
n (O2) /nmol
506 6,57
54
Razão ADP/O
1. Ensaio do Succinato (Complexo II)
1. 2.
Como se quer calcular a razão ADP/O, é necessário calcular as moles de O consumidas, pelo que se tem de multiplicar por dois o número de moles calculado para O 2: 1. 59,13 x 2 = 118,26 nmol de O consumidas. 2. 32,85 x 2 = 65,7 nmol de O consumidas.
A solução preparada de ADP tinha uma concentração de 10 mM (0,01M = 0,01 mol/L = 10 mol/μL). Adicionaram-se 20 μL, logo pode calcular-se o número de moles: -8
1. 2.
ao ao
55
2. Ensaio do Citocromo c e do Ascorbato de sódio (Complexo IV)
91,98 x 2 = 183,96 nmol de O consumidas
ao Razão ADP/O
Razão ADP/O
experimental
teórica*
Succinato (1)
1,7
1,6
Citocromo c + Ascorbato
1,1
1
Substrato
*Valores apresentados nos slides de Processos de Oxidação-Redução em Bioquímica fornecidos pela professora da cadeira.
Observou-se que quando se adicionou ADP a um substrato ocorreu sempre consumo de O2, pelo que se pode concluir que houve respiração. Os valores obtidos da razão ADP/O são muito semelhantes aos valores teóricos, pelo que se pode admitir que a experiência foi bem sucedida. Ao adicionar CCP continuou a haver respiração porque, sendo este um desacoplador, provoca a inibição da fosforilação por desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respiração e fluxo de electrões mas não ocorre síntese de ATP. A razão ADP/O vai diminuindo do complexo I para o complexo IV. Isto acontece porque ao longo da cadeia são transportados para fora da matriz menos protões, havendo menos energia disponível para a síntese de ATP. Assim, para que esta não seja diminuída, a actividade da cadeia transportadora de electrões aumenta, levando ao aumento do consumo de O 2. No complexo II não ocorre transporte de protões, pelo que não há contribuição para o gradiente electroquímico, o que leva a que a razão ADP/O seja pequena.
56
No complexo IV a razão ADP/O é inferior. Isto acontece porque, ao longo da cadeia, vai ser necessário um maior consumo de oxigénio para produzir a mesma quantidade de ATP (consumir a mesma quantidade de ADP).
Controlo Respiratório • Regulação da velocidade de transporte electrónico pelo ADP; • Razão entre as velocidades de consumo de O 2 no estado 3 e no estado 4. o
o
Estado 3 – Uma quantidade limitada de ADP é adicionada, permitindo uma respiração rápida; Estado 4 – Todo o ADP foi convertido em ATP e a respiração torna-se lenta.
ontrolo espiratrio
1. Ensaio do Succinato (Complexo II)
57
Cada quadrícula (horizontal) do gráfico equivale a 1 cm e a velocidade a que o papel corre é 1cm/min, logo, sabendo que passa um tempo equivalente a 4 quadrículas na presença de ADP (4 min) e equivalente a 2,8 quadrículas na ausência de ADP pode calcular-se a velocidade de consumo de O 2 com e sem ADP. Como há dois declives correspondentes a cada caso (dois declives para presença e ausência de ADP) é necessário fazer a média dos dois valores obtidos para calcular a razão de controlo respiratório neste ensaio.
min min RC médio: (6,23 + 3,6)/2 = 4,92
2. Ensaio do Citocromo c e do Ascorbato de sódio (Complexo IV)
58
min Esta razão permite determinar a extensão do acoplamento dos mitocôndrios assim como a sua integridade funcional. Para esta parte do trabalho não foi possível encontrar valores teóricos, mas, no entanto, sabe-se que se RC>1, os mitocôndrios estão acoplados, não tendo sofrido alterações na sua funcionalidade. Nos ensaios observa-se que todos os resultados são maiores que 1, pelo que se conclui que os mitocôndrios estavam acoplados.
4. Conclusão
A razão ADP/O é o número de moles de ADP fosforiladas a ATP por cada dois electrões fluindo por um segmento da transferência electrónica para o oxigénio. A razão ADP/O vai diminuindo do complexo I para o complexo IV. Isto acontece porque ao longo da cadeia são transportados para fora da matriz menos protões, havendo menos energia disponível para a síntese de ATP, o que faz com que a actividade da cadeia transportadora de electrões aumente, levando ao aumento do consumo de O 2. No complexo II não ocorre transporte de protões, pelo que não há contribuição para o gradiente electroquímico, o que leva a que a razão ADP/O seja pequena. No complexo IV a razão ADP/O é inferior. Isto acontece porque, ao longo da cadeia, vai ser necessário um maior consumo de oxigénio para produzir a mesma quantidade de ATP (consumir a mesma quantidade de ADP). 59
Uma vez que na maioria das células o fosfato inorgânico se encontra presente em excesso, é o ADP que controla a velocidade de respiração. Nos organismos intactos, existe um alto grau de controlo respiratório e os mitocôndrios dizem-se fortemente acoplados. Quando ocorre dano estrutural no mitocôndrio perde-se este controlo. A razão de controlo respiratório permite determinar a extensão do acoplamento dos mitocôndrios assim como a sua integridade funcional. Como RC>1, os mitocôndrios estavam acoplados, não tendo sofrido alterações na sua funcionalidade.
60
RESPIRAÇÃO MITOCONDRIAL – SEQUENCIAÇÃO DA CADEIA RESPIRATÓRIA
1. Introdução Transporte electrónico e fosforilação oxidativa
A fosforilação oxidativa é uma via metabólica que utiliza a oxidação final de glúcidos, lípidos e proteínas (e a energia libertada nestas reacções de oxidação-redução) para produzir ATP, através da fosforilação de ADP. Este processo ocorre nos mitocôndrios. Nesta via ocorre transferência de electrões a partir de doadores electrónicos até aceitadores electrónicos finais, como o oxigénio – transporte electrónico.
A cadeia respiratória pode ser separada em 4 complexos enzimáticos: • NADH-Ubiquinona Redutase (Complexo I) • Succinato-Ubiquinona Redutase (Complexo II) • Ubiquinol-citocromo c Redutase (Complexo III) • Citocromo c Oxidase (Complexo IV)
Em plantas, são ainda encontradas algumas actividades alternativas aos principais complexos da cadeia respiratória – duas actividades de NADH desidrogenase (uma associada à zona interna da membrana interna e outra à zona externa da membrana interna) e uma actividade alternativa de oxidase.
Estes complexos, na presença de ubiquinona e de citocromo c, catalisam a oxidação aeróbia do NADH e do sucinato - os complexos I e II catalisam a transferência electrónica para a ubiquinona a partir de dois doadores de electrões diferentes: NADH (complexo I) e sucinato (complexo II). O complexo III leva electrões da ubiquinona reduzida ao citocromo c e o complexo IV completa a sequencia transferindo os electrões do citocromo c para o O2.
Fosforilação oxidativa – o acoplamento do transporte electrónico com a síntese de
ATP
Os complexos I, III e IV são centros de acoplamento de energia. Nestes centros de acoplamento, a energia libertada durante o transporte electrónico é conservada através da sua conversão numa força motriz protónica utilizada para bombear protões para fora da matriz 61
mitocondrial (espaço intermembranar), ocorrendo assim uma translocação vectorial de protões e a formação de um potencial electroquímico protónico de membrana, podendo então essa energia ser usada para a síntese do ATP. Esta síntese é catalisada por um complexo multienzimático, Complexo V ou ATPsintase.
Inibidores e desacopladores
A fosforilação oxidativa pode ser inibida directamente por uma série de agentes químicos. Uma classe destes compostos (caso do antibiótico oligomicina) inibe a fosforilação oxidativa e a respiração. Uma segunda classe de agentes (caso do m-clorocarbonilocianetofenilohidrazona (CCP) e 2,4-dinitrofenol (DNP)) provoca a inibição da fosforilação por desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respiração e fluxo de electrões mas não ocorre síntese de ATP (há inibição da fosforilação oxidativa mas não da respiração). Uma terceira classe inclui os inibidores específicos da cadeia de transporte electrónico (rotenona, antimicina A, cianeto).
Técnicas
O eléctrodo de oxigénio Este eléctrodo consiste num eléctrodo de referência de Ag/AgCl e um eléctrodo de Pt, ambos imersos em KCl aquoso e separados da câmara onde se inserem as amostras apenas através de uma membrana permeável a O 2. Este é reduzido a H 2O no eléctrodo de Pt, gerando uma voltagem referente ao eléctrodo de Ag/AgCl que é proporcional à [O 2] na câmara reaccional.
Cátodo: O2 + 4e-
2H O 2
Ânodo: 62
4Ag+ + 4Cl-
4AgCl + 4e
-
Objectivos:
1. A extensão da fosforilação obtida com diferentes substratos (razão ADP/O) 2. O grau de controlo respiratório 3. O efeito de diversos inibidores e de um desacoplador da cadeia de transporte electrónico
2. Procedimento
Isolamento dos mitocôndrios de batata É importante ter em conta que, sendo uma experiência em que se pretende manter a actividade mitocondrial, todas as operações devem ser feitas entre 0 e 4ºC e o processo não deve demorar mais que 1h. Nesta actividade experimental a primeira parte foi o isolamento dos mitocondrios de batata, começando por se pesar 300g de batata e cortá-la em cubos pequenos. De seguida efectuou-se a homogeneização em 250 mL de meio de isolamento num batedor eléctrico, durante apenas 2 segundos para evitar danificar estruturas e perda de actividade. Procedeu-se à filtração num funil de Buckner com uma camada de gaze e posterior centrifugação. Após a 1ªcentrifugação aproveitou-se o sobrenadante e voltou-se a centriguar a 8000g durante 10 minutos e a 4 graus. Desta vez aproveitou-se o pellet, ressuspendendo-o em meio de lavagem, juntando-se o conteúdo de diferentes tubos (dos vários grupos). Centrifugou-se novamente nas mesmas condições, aproveitou-se o pellet, ressuspendeu-se em 63
meio de ressuspensão e prosseguiu-se à última centrifugação também a 8000g, 4 graus e durante 10 minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 4-5 mL de meio de ressuspensão. Obteve-se assim a fracção mitocondrial a ser usada no procedimento seguinte. Os meios utilizados foram os de isolamento, lavagem e ressuspensão. Estes meios contêm alguns componentes com concentrações adequadas para manter a actividade mitocondrial. O pH 6,5 é o mais adequado, o manitol 0,7 M permite a manutenção da osmoralidade do meio, a cisteína previne a oxidação de produtos fenólicos prejudiciais ao mitocôndrio, a BSA (soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratório pelo ADP e o EDTA remove metais catalisadores de reacções indesejáveis, mas inibe a respiração induzida pela cisteína, pelo que é adicionado em concentração baixa.
Efeito de inibidores Pretende-se agora sequenciar a cadeia respiratório usando vários inibidores da mesma, sendo que os ensaios devem ser adequados para calcular a actividade do oxidase alternativo/respiração não inibida pelo KCN. Começou-se por adicionar na camara reaccional 1,4 mL de meio de reacção + 200 μL de mitocôndrios + 20 μL de succinato + 50 μL de ADP obtendo-se o registo do eléctrodo. Adicionou-se + 10 μL de oligomicina antes que o ADP se esgotasse e +20 μL de malonato quando começa a haver declive. A oligomicina inibe o ATP sintase ao bloquear o seu canal de protões, que é necessário para a fosforilação oxidativa de ADP para ATP (produção de energia). A inibição da síntese de ATP pára também a cadeia transportadora de electrões. O malonato é um inibidor do complexo II e a oligomicina do complexo ATP sintase. Adiciona-se agora 20 μL de malato + 20 μL de glutamato (complexo I) para verificar se a respiração retoma ou não, confirmando-se pelo registo; adiciona-se rotenona que inibe o complexo I. Adicionou-se NADH, registando-se, e + 20 μL antimicina A (para assegurar que está inibido); colocou-se na camara reaccional + 20 μL de citocromo c + 20 μL de ascorbato de sódio (substratos), registando-se e 40 μL de KCN, 20 de cada vez. Adicionou-se + 20 μL de ADP, registou-se e mais + 20 μL de succinato, que estava inibido devido ao KCN. Começa-se então um novo registo com adição de 1,4 mL de meio de reacção + 300 μL de mitocôndrios + 20 μL de succinato + 20 μL de ADP, registando-se. Adicionou-se + 20 μL de rotenona, substrato do complexo II e inibidor do complexo I. Registouse e adicionou-se +20 μL de malonato (inibidor do complexo II).
64
Adicionou-se + 20 μL de citocromo c + 20 μL de ascorbato de sódio, registou-se, adicionou-se + 20 μL de anticimina A, que é um substrato para o complexo IV e inibidor do III. Registou-se e adicionou-se 40 μL de KCN (inibidor do complexo V), 20 de cada vez.
65
3. Resultados
A utilização de inibidores causa a interrupção do fluxo electrónico, fazendo com que o s complexos fiquem reduzidos e incapazes de aceitar electrões dos que o antecedem. O resultado prático traduz-se numa redução do consumo de oxigénio.
Complexo I - NADH ubiquinona oxirredutase / NADH desidrogenase
Catalisa a transferência de 2 electrões do NADH (dador de electrões) para a ubiquinona. A este processo está associada a translocação vectorial de 4 protões. Substrato: Glutamato + Malato
Utiliza-se este substrato por possuir um sistema de transporte próprio para o interior da matriz mitocondrial, ao contrário do NADH uma vez que este não consegue atravessar a membrana interna mitocondrial. Inibidor: Rotenona
Inibidor do complexo I – Inibe a transferência de electrões do NADH para a ubiquinona (o consumo de O2 pára) ao bloquear a oxidação de NADH a NAD +.
Complexo II – Succinato: Ubiquinona oxirredutase / Succinato desidrogenase
Catalisa a transferência de 1 electrão do succinato (dador de electrões) para a ubiquinona. Substrato: Succinato Inibidor: Malonato
Inibidor do complexo II – Inibe competitivamente o succinato desidrogenase impedindo a transferência electrões do succinato para a ubiquinona.
Complexo III – Ubiquinol: Citocromo c oxirretudase / Citocromo bc 1
Transporte de 2 electrões do ubiquinol (ubiquinona reduzida) para o citocromo c. A este processo está associada a translocação vectorial de 4 protões. Substrato: Não é utilizado substrato para este complexo. Inibidor: Antimicina A
Inibidor do complexo III – Inibe a transferência de electrões do ubiquinol para o citocromo c pois liga-se ao centro de redução da quinona no complexo citocromo bc1.
66
Complexo IV – Ferrocitocromo c: oxigenorredutase / Citocromo c oxidase
Transferência de 1 electrão de cada uma de quatro moléculas de citocromo c para o O2, reduzindo-o a duas moléculas de H 2O. Substrato: Ascorbato + Citocromo c Inibidor: Cianeto
Inibidor do complexo IV – Inibe a transferência de electrões do citocromo c oxidase para o O 2 devido ao facto de se ligar ao ferro do enzima. A partir daqui a cadeia não pode ser retomada pelo que o cianeto é fatal.
Ensaio 1 Succinato (Substrato do complexo II) + Malonato (Inibidor complexo II) Malato + Glutamato (Substrato do complexo I) + Rotenona (Inibidor complexo I)
67
Ensaio 1 (2) Antimicina A (Inibidor complexo III – Para certificar que estava inibido) + Citocromo c com ascorbato de sódio (Substrato complexo IV) + KCN (Inibidor complexo IV). •
Na presença de Antimicina A ocorre respiração quando adicionado o substrato do complexo IV. Ocorre inibição quando é adicionado KCN - Inibe mas continua a haver consumo de O2 devido à presença de citocromo c oxidase alternativo.
68
Ensaio 1 (3) Succinato (Substrato complexo II) – Estava inibido devido ao KCN, pelo que se começou uma nova reacção.
69
Ensaio 2 Succinato (Substrato complexo II) + Rotenona (Inibidor complexo I) + Malonato (Inibidor complexo II) + Citocromo c com ascorbato de sódio (Substrato complexo IV) + Antimicina A (Inibidor complexo III) + KCN (Inibidor complexo IV – Inibe mas continua a haver consumo de O2 devido à presença de citocromo c oxidase alternativo).
70
Inicialmente adicionou-se Oligomicina que inibe o ATP sintase ao bloquear o seu canal de protões, que é necessário para a fosforilação oxidativa de ADP para ATP (produção de energia). A inibição da síntese de ATP pára também a cadeia transportadora de electrões. Seria de esperar que não ocorresse respiração, o que não é observado, pelo que a solução deve estar mal preparada. Através do Ensaio 1 é possível concluir que o Malonato inibe o Succinato, pelo que é o inibidor do complexo II. Adicionando seguidamente Malato + Glutamato (substratos do complexo I) observa-se a ocorrência de consumo de oxigénio mas em muito pouca quantidade. Pode concluir-se que o Malonato não inibiu então o complexo I, pois ao adicionar substratos do mesmo continuou a haver respiração, mas como foi muito pouco intensa, pode levar a considerar que houve erros experimentais na preparação de soluções. Estes resultados indicam que os complexos I e II funcionam em paralelo. Adicionando Rotenona deixa de haver respiração, pelo que se sabe que é um inibidor do complexo I. Adicionou-se depois NADH que é substrato do complexo I e das actividades alternativas do NADH desidrogenase, não se registando consumo de O 2, por o complexo I estar inibido, o que confirma que a Rotenona é inibidor do complexo I. Pelo Ensaio 1 (2) pode concluir-se que a Antimicina A não inibe o complexo IV. Adicionou-se Citocromo c + Ascorbato e observou-se um aumento da respiração, pelo que o complexo IV não é inibido pela Antimicina A. O facto de haver consumo de O 2 depois da adição destes substratos, demonstra que o inibidor do complexo III não afecta o complexo IV, portanto o complexo III é anterior ao IV na cadeia respiratória. Com a adição de KCN o complexo IV é inibido pelo que se espera que continue a haver consumo de oxigénio devido à 71
presença de citocromo c oxidase alternativo. No entanto o consumo de O 2 aumenta, pelo que se pode concluir que a solução estava mal preparada. Adicionou-se ainda Succinato (substrato para o complexo II), mas não houve respiração, uma vez que estava inibido devido à presença de KCN. A actividade do complexo II pára com a adição deste inibidor, porque ao inibir o complexo IV não vai haver consumo de oxigénio. Assim pode concluir-se que o complexo IV se situa mais à frente que o complexo II na cadeia respiratória. Começou-se então uma nova reacção, onde se adicionou Succinato, ocorrendo respiração, seguido da adição de Rotenona, não havendo diminuição da respiração, pelo que o complexo II não foi inibido pela Rotenona. Adicionando seguidamente Malonato já se observa inibição, pelo que se confirma que é inibidor do complexo II (como se já tinha observado anteriormente). Adicionou-se Citocromo c com Ascorbato de sódio (substratos do complexo IV) sendo retomada a respiração, pelo que o Malonato não inibe o complexo IV. Assim demonstra-se que os inibidores dos complexos I e II não afectam o complexo IV, ou seja, o complexo IV é posterior na cadeia respiratória aos complexos I e II. Adicionando Antimicina A nada acontece, confirmando-se que não é um inibidor deste complexo, mas, por fim, adicionando KCN já ocorre inibição, apesar de haver ainda consumo de oxigénio devido à actividade alternativa do complexo IV. Após adição de cianeto de potássio o declive das rectas voltou a aumentar, o que se deve provavelmente a uma má preparação da solução.
Quadro resumo Inibidor Substrato Rotenona
Malonato
Antimicina A
KCN
Glutamato + Malato
Succinato
Ascorbato + Citocromo c
Apesar do KCN inibir apenas o complexo IV, não vai haver respiração quando se adiciona o mesmo. Isto acontece porque pára o consumo de oxigénio ao ser adicionado este inibidor.
4. Conclusão
É possível comprovar que a Rotenona inibe o complexo I, o Malonato o complexo II, a Antimicina A o complexo III, e o KCN o complexo IV; A ordem dos complexos na cadeia respiratória é complexo I, II, III e IV; 72
Após se inibir o complexo IV não é possível retomar o fluxo de electrões pelo que se pode comprovar que este se situa no final da cadeia transportadora de electrões; Os complexos I e II são independentes um do outro, transferindo ambos os seus electrões para o complexo III.
73
INCHAMENTO MITOCONDRIAL 1. Introdução
Os mitocôndrios incham se forem suspensos num meio que não seja isotónico com a matriz. O mesmo acontece se forem colocados numa solução em que o principal soluto é permeável à membrana interna. Assim, aumentando a concentração de solutos dentro da matriz mitocondrial, favorece-se a entrada de água, havendo um aumento da pressão osmótica que leva ao inchamento do mitocôndrio. As suspensões mitocondriais dispersam a luz. Esta dispersão é principalmente função da diferença entre o índice de refracção do conteúdo da matriz e do meio de suspensão, logo, quando esta diferença diminui, a dispersão de luz também diminui. Quando o mitocôndrio incha devido à entrada de um soluto permeável ocorre uma diminuição da dispersão de luz (diminui a absorvência medida no espectrofotómetro) à medida que o índice de refracção da matriz se aproxima do índice de refracção do meio de suspensão. Os mitocôndrios são adequados para esta técnica porque as suas matrizes podem sofrer um grande aumento de volume sem rebentarem através do abrir das cristas da membrana interna. Pode, então, estudar-se o efeito de vários compostos no inchamento dos mitocôndrios, seguindo a dispersão de luz com a utilização de um espectrofotómetro UVVisível. A extensão do inchamento é medida pela diminuição da absorvência. Factores que influenciam o inchamento mitocondrial: 1. Necessidade de manter a neutralidade eléctrica. 2. O gradiente electroquímico (ΔpH + ΔΨ) promove: Sistemas de transporte que impliquem a entrada de H+ ou saída de OH- da matriz (ΔpH). Movimento de iões em resposta ao ΔΨ(dissipando o potencial).
Estratégias para o transporte de metabolitos e iões através da membrana
74
Para que ocorra inchamento mitocondrial:
Tanto o catião como o anião do principal componente osmótico do meio têm de ser permeáveis; Tem de ser mantido o equilíbrio de cargas através da membrana (neutralidade eléctrica).
Propriedades de permeabilidade da membrana mitocondrial (Brian Chappel Inchamento mitocondrial na presença de sais de amónio de ácidos fracos ou metabolitos): Os mitocôndrios comportam-se como osmómetros perfeitos; Respondem a mudanças na pressão osmótica do meio de suspensão contraindo-se ou inchando conforme a água flui através da membrana para compensar a diferença de actividade quando os osmólitos são adicionados (ou removidos) do meio externo. A membrana mitocondrial é impermeável a pequenos iões (ex: H +, K+, Na+, NH4+, Cl-, NO3-, etc.). A membrana mitocondrial é permeável a moléculas pequenas sem carga (ex: O 2, CO 2, N2, glúcidos com 3 ou 4C, etc.). Embora a membrana seja impermeável a pequenos iões, e portanto impermeável ao acetato (CH3COO-) e NH4+, é permeável ao ácido acético (CH 3COOH) e ao NH3, que são pequenas moléculas neutras.
75
Técnicas utilizadas: Centrifugação •
•
Uso da força centrífuga para saparar partículas por sedimentação; Partículas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes.
Espectroscopia UV-Visível •
•
Trata-se da espectroscopia de absorção em que são utilizados comprimentos de onda da região do ultra violeta à região do visível; Este método consiste na medição da quantidade de radiação absorvida, traduzindo-se esta medição em valores de absorvência. A maior aplicação deste método é a determinação de concentrações de compostos, e para esse efeito, é utilizada a lei de Lambert-Beer, que nos dá a concentração da substância em função da absorvência num determinado intervalo de linearidade (A= εlc).
Objectivo: Utilizar a técnica de inchamento mitocondrial (utilizando mitocôndrios de batata), observado por medidas de dispersão de luz, para verificar os processos de transporte através da membrana mitocondrial interna.
76
2. Procedimento
Isolamento dos mitocôndrios de batata
Meios utilizados
Meio de isolamento
Tampão fosfato 0,01M pH 6,5; Manitol 0,7M; EDTA 0,001 M; Cisteína 0,002 M; BSA (fracção V) 0,1% (m/v)
Meio de lavagem
Tampão fosfato 0,01M pH 6,5; Manitol 0,7M; Cisteína 0,002 M; BSA (fracção V) 0,1% (m/v)
Meio de ressuspensão
Tampão fosfato 0,01M pH 6,5; Manitol 0,7M; BSA(fracção V) 0,1% (m/v)
Observações:
pH=6,5 é o mais adequado; O manitol mantém a osmolaridade do meio, sendo 0,7 M a concentração mais adequada; A cisteína previne a oxidação de produtos fenólicos prejudiciais ao mitocôndrio; A BSA (soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratório pelo ADP ;
77
O EDTA remove metais catalisadores de reacções indesejáveis, mas inibe a respiração induzida pela cisteína – é adicionado em concentração baixa.
Procedimento
Reproduzir os resultados das experiências indicadas nas figuras; Realizar leituras espectrofotométricas: 520 nm, volume total 2,5 mL, T=30ºC.
Preparação das soluções para os ensaios espectrofotométricos Ensaios
Constituintes
1
H2O + mitocôndrios
2
KCl + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios
3
NH4Cl + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios
4
NH4CH3COO + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios
5
(NH4)3PO4 + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios
6
Malato de Amónio + + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios + rotenona + (Na)3PO4
7
Citrato de Amónio + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios + rotenona + (Na)3PO4 + malato de potássio
78
3. Resultados Ensaio 1
NH Cl 4
Ensaio de declive menor ausência de swelling
Resultado previsto: membrana impermeável a iões
Ensaio 2
Declive > declive controlo – Swelling Resultado previsto: Mitocôndrios incham
HO 2
Ensaio 3
Declive > declive controlo – Swelling Resultado incorrecto: membrana impermeável a iões 79
KCl
Ensaio 4
Declive > declive controlo – Swelling Resultado previsto: iões atravessam a membrana na forma neutra. +
-
A membrana é impermeável aos iões NH
Formam-se moléculas neutras que atravessam a membrana
No interior da membrana regressam à forma iónica
Ocorre desequilíbrio osmótico e inchamento massivo
4
e CH COO 3
NH CH COO 4
3
Ensaio 5
Declive > declive controlo – Swelling Resultado previsto: iões atravessam a membrana na forma neutra e o PO43-p passa através do transportador de H2PO4- por antiporte com OH- ou simporte com H +. 80
•
No interior da membrana as espécies regressam à forma iónica
•
Ocorre desequilíbrio osmótico e inchamento mitocondrial
(NH ) PO 4 3
4
Ensaio 6
1. Declive > declive controlo – Swelling 2. Declives semelhantes – Ausência de swelling Resultado incorrecto: Os iões do malato de amónio só atravessam a membrana depois da adição de (Na)3PO4, devido ao transportador por antiporte malato/ HPO42Inicialmente o NH4+ e malato2- não atravessam a membrana, porque são iões e o NH 4+ apesar de pode ser convertido à forma neutra não atravessa a membrana por inexistência de equilíbrio de cargas através da mesma. Ao adicionar-se rotenona impede-se o gasto do malato pelo complexo I, visto que a rotenona é um inibidor do complexo I. Ao ser adicionado (Na)3PO4 o fosfato pode entrar pelo transportador de fosfato, o que leva àq entrada do malato por simporte. Com isto já ocorre um equilíbrio de cargas na membrana, pelo que o NH 4+ já pode entrar na forma neutra, gerando-se assim swelling.
(Na)3PO4
Malato de Amónio + Rotenona
81
Ensaio 7
1. Declive > declive controlo – Swelling 2. Declives semelhantes – Ausência de swelling 3. Declives semelhantes – Ausência de swelling Resultado incorrecto: os iões de citrato de amónio só atravessam a membrana depois da adição de (Na)3PO4 e malato, devido aos transportadores antiporte malato/HPO42- e simporte malato/citrato. +
3-
NH4 e citrato não atravessam a membrana
Prevê-se inexistência de swelling
(Na) PO não leva a swelling até o malato estar presente
Adição do malato em presença de (Na) 3PO4 em quantidades catalíticas
3
4
turnover
rápido do transportador e entrada de malato
O transportador citrato permite a sua entrada por troca com o malato
O NH4 entrou como molécula neutra prevê-se inchamento mitocondrial
+
Citrato de Amónio + Rotenona (Na) PO 3
4
Malato de potássio
Possíveis erros experimentais: •
•
Preparação incorrecta das soluções de KCl, rotenona, malato de amónio e citrato de amónio; pH das soluções não coincidente com o do protocolo.
82
4. Conclusão
Apesar de a membrana ser impermeável a pequenos iões, ocorre inchamento com acetato de amónio porque o NH 4+ atravessa a membrana como NH 3 neutro e o Ac - como ácido acético, ambos através de difusão simples. Isso leva a que as concentrações de NH 4+ e de CH3COO- na matriz sejam iguais às do meio de suspensão. Assim não existe desequilíbrio de carga ou de pH durante o transporte e ocorre inchamento, uma vez que a matriz se expande para atingir equilíbrio osmótico com o meio de suspensão. Quando os mitocôndrios são colocados em soluções de fosfato de amónio incham rapidamente mas não noutros sais de NH 4. Ao se adicionarem quantidades catalíticas de fosfato de potássio ao meio contendo malato ou citrato, observa-se um inchamento rápido dos mitocôndrios. A presença de um transportador de fosfato permitiu ao H 2PO4- fazer um antiporte com o OH- ou simporte com o H+, o que fez com que o fosfato passe a membrana como se fosse uma espécie neutra. O transportador malato 2--HPO42- permite ao malato entrar, mas apenas quando uma quantidade catalítica de fosfato externo estava presente para permitir um turnover rápido do transportador de fosfato. O transportador de citrato permitiu ao H-citrato 2entrar por troca com o malato 2-, mas este processo só ocorre rapidamente se houver malato e fosfato externo suficientes para permitir um turnover dos seus transportadores. Observando a estequiometria é possível concluir que a acumulação de H 2PO4- é acompanhada pela entrada de um protão; a do malato pela entrada de dois protões e a do citrato pela entrada de três protões. Soluções com KCl e NH 4Cl não causam swelling. Na presença de ionóforos específicos seria possível a entrada de K + na matriz mitocondrial, mas apenas na ausência de Cl -.
83
Ocorrência de swelling
Ausência de swelling
Água Acetato de amónio (NH 4CH3COO) Fosfato de amónio ((NH 4)3PO4 ) Malato de amónio Citrato de amónio
Cloreto de potássio (KCl) Cloreto de amónio (NH4Cl)
84
FOTOSSÍNTESE 1. Introdução
A fotossíntese é um processo físico-químico pelo qual as plantas, algas e bactérias fotossintéticas usam a energia luminosa para sintetizar compostos or gânicos. Durante o processo fixam CO 2 e usam água para formar compostos orgânicos e produzir energia (ATP), ocorrendo em simultâneo a libertação de O 2.
Organização intracelular de sistemas fotossintéticos – algas e plantas superiores Ambas as reacções fotossintéticas (dependentes e independentes) da luz ocorrem nos cloroplastos, no caso de algas e plantas superiores. Estes contêm no seu interior vesículas, os tilacóides, que possuem nas suas membranas pigmentos fotossintéticos, que por sua vez absorvem radiação visível a comprimentos de onda característicos. O pigmento mais importante é a clorofila. Esta associa-se a proteínas de ligação específicas formando light harvesting complexes – LHC, complexos antena ou de colheita de luz.
Fotossistemas Os pigmentos fotossintéticos organizam-se em fotossistemas, existindo os fotossistemas I e II, PSI e PSII. Estes possuem: complexos antena ou de colheita de luz – LHC- e o centro reaccional fotossintético. Todas as moléculas podem absorver fotões, mas apenas um conjunto de moléculas de clorofila associadas ao centro da reacção química transformam a energia da luz em energia química – centro reaccional. Os outros pigmentos do fotossistema chamam-se complexos de colheita de luz e absorvem energia a partir da luz transmitindo-a eficientemente para o centro da reacção, por transferência de excitação. A clorofila do centro reaccional fica com um electrão a menos, que é substituído por outro electrão (de menor energia) dado por uma molécula dadora de electrões (a H 2O) ficando esta positivamente carregada. O processo causa assim uma separação de cargas e inicia-se a cadeia de oxidação redução.
Reacções nos fotossistemas O Fotossistema II é um sistema do tipo feofitina-quinona. A excitação do centro de reacção P680 leva à transferência de um electrão para a feofitina (clorofila sem o ião central Mg2+), que por sua vez o doa à quinona a, à quinona b (que se difunde) e por fim ao complexo citocromo b6f. Simultaneamente ocorre o movimento de protões através da membrana dos tilacóides. 85
A proteína solúvel que transporta os electrões entre um sistema e o outro é a plastocianina (semelhante ao cyt c do mitocôndrio). O fotossistema I tem um centro reaccional designado por P700 que passa electrões para a ferredoxina (proteína Fe-S) e consequentemente para o NADP +, produzindo assim NADPH. Para substituir o electrão que se movimentou do PSII para o PSI estes seres oxidam água a O2 – fotossíntese oxigénea. Este conjunto reaccional designa-se esquema em Z, devido à sua forma geral. O elo de ligação entre os dois fotossistemas é o complexo citocromo b 6f e a proteína solúvel plastocianina; o fluxo de electrões através do complexo leva à passagem de protões do estroma para o lúmen dos tilacóides, gerando um gradiente protónico que é uma força poderosa para a síntese de ATP pelo ATP sintase. É o processo designado por fotofosforilação.
Reacções às escuras – ciclo de Calvin Nesta fase, o ATP e o NADPH resultantes das reacções luminosas são utilizados para fixar o CO2. O processo de fixação do CO2 e conversão a glúcidos ocorre no ciclo de Calvin (elucidado por Melvin Calvin em 1950) em três passos fundamentais. O primeiro é a condensação do CO2 com o aceitador de 5 carbonos Ribulose 1,5-bifosfato, formando duas moléculas de 3 fosfoglicerato (catalisado pelo enzima rubisco). No segundo passo do ciclo O ATP e o NADPH resultantes das reacções luminosas dão entrada no ciclo neste passo reduzindo o 3-P glicerato a 3-P gliceraldeído com libertação de um Pi. Por fim, no terceiro passo, 5 moléculas de 3-P gliceraldeído e uma de ATP regeneram 1,5 bifosfato de Ribulose e a outra molécula de 3-P gliceraldeído formada usa-se para formar hexoses, como a glucose e a sacarose que podem ser usadas como energia pelo organismo fotossintético. Devido ao gasto de moléculas de ATP estas têm de ser regeneradas, o que sucede pelo transporte do fosfato de dihidroxiacetona gerado no estroma para o citosol e o transporte simultâneo de Pi do citosol para o estroma (antiporte). O Pi que regressa ao estroma é assim usado na fotofosforilação.
Nesta actividade experimental pretendia-se, a partir do isolamento de cloroplastos de espinafres: Medir a actividade fotoquímica dos PSI e PSII através da reacção de Hill; Medir o transporte electrónico fotossintético usando o viologénio de metilo como aceitador terminal de electrões; Realizar o ensaio espectrofotométrico da reacção de Hill: Determinar o conteúdo de clorofila dos cloroplastos. •
•
•
•
86
2. Procedimento
1. Isolamento dos cloroplastos das folhas de espinafres Remover as nervuras de 100 g de folhas de espinafres e cortá-las em pequenos pedaços (aprox. 5 cm).
Colocar os pedaços das folhas em água gelada sob forte iluminação cerca de 30min e então homogenizar com 100 mL de meio de isolamento num misturador "waring blender".
Filtrar a suspensão através de várias camadas de gaze e centrifugar o filtrado a 2000 g no frio durante 30 s.
Ressuspender o sedimento em 2,5 mL de meio de ensaio e guarde em gelo.
Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento cuidadosamente com meio de isolamento e centrifugar a 2000 g durante 1 min.
Apesar de ser o NADP o aceitador final de electrões, não o vamos usar porque a ferredoxina, que é o aceitador anterior, se perde no isolamento dos cloroplastos.
2. Libertação de dioxigénio pelos cloroplastos isolados usando oxidantes de Hill Acertar o zero do eléctrodo de oxigénio com ditionito de sódio e acertar o 100% de oxigénio (com 1 mL de meio de reacção e 1 mL de água) a 70% do papel de registo com o botão de ajuste fino do output, pois vai-se medir a libertação de oxigénio.
Registar a velocidade e a quantidade de total de O2 libertado.
Repetir todo o processo com quantidades crescentes de DCPIP.
Antes de efectuar as adições ao eléctrodo, envolvê-lo com folha de alumínio para que estas se efectuem no escuro.
Fazer incidir uma lâmpada de 100 watt sobre a câmara de reacção do eléctrodo interpondo um frasco com água.
Proceder do mesmo modo com o ferricianeto.
Iniciar cada experiência adicionando 1 mL de meio de ensaio ao eléctrodo, e cloroplastos de modo a obter uma suspensão com uma cor verde maçã, (cerca de 100 μL).
Adicionar 50 μL de DCPIP e água destilada até perfazer um volume final de 2 mL.
Finalmente adicionar uma quantidade suficiente de DCPIP (80 μl) para assegurar a libertação de O2 durante um certo tempo e verificar o efeito da adição de 50 μL 87 de DCMU.
Reagentes de Hill: DCPIP e ferricianeto (FeCN).
DCMU
Bloqueia a plastoquinona impedindo o fluxo de electrões para o PS I; PS II é inibido; Diminui o rendimento energético do processo.
DCPIP
Dador (e aceitador) artificial de electrões (azul quando oxidado/ incolor quando reduzido); Pode substituir o NADP+.
3. Viologénio de Metilo como aceitador terminal de electrões
Consumo de dioxigénio com viologénio de metilo como aceitador de electrões
Adicionar na câmara do eléctrodo 1 mL de meio de reacção, 100 μL de cloroplastos, 100 μL de viologénio de metilo e 0,8 mL de água destilada (volume final 2 mL).
Medir a velocidade de consumo de oxigénio.
Repetir o ensaio adicionando também 50 μL de azeto de sódio para inibir o catalase.
Observar o efeito da adição de quantidades variáveis (25, 50 e 100 μL) de viologénio de metilo e comentar os resultados.
Caso a preparação esteja contaminada com catalase fazer os ensaios seguintes na presença de azeto de sódio.
Viologénio de metilo – Não necessita da ferredoxina.
Aceitador final de electrões – Consome dioxigénio; Permite o seguimento do transporte electrónico no processo da fotossíntese.
Inibidor do catalase.
NaN3
88
Observa-se o consumo de dioxigénio. Se a solução estiver contaminada com peroxissomas, o catalase está presente, havendo uma diferença no consumo de dioxigénio. Assim tem de se adicionar um inibidor do catalase (NaN 3).
Actividade do PS I medida com viologénio de metilo
Adicionar à câmara do eléctrodo 1 mL de meio de reacção, 50 μL de cloroplastos, 50 μL de MV e 900 μL de H2O e medir a velocidade de consumo do dioxigénio.
Adicionar 50μLde DCMU para bloquear a actividade do PS II e notar o que acontece.
Adicionar 25 μL de ascorbato e 80 μL de DCPIP de modo a que a cor azul desapareça.
Comentar os resultados e discutir o que acontece em cada fase da experiência.
Medir a velocidade de consumo do dioxigénio e comparar as duas velocidades de consumo de dioxigénio.
Ascorbato
Dador de electrões (acção conjunta com o DCPIP); Antioxidante (dador de electrões para O2-).
4. Ensaio espectrofotométrico da reacção de Hill
Adicionar a uma cuvette de espectrofotómetro, 1,5 mL de meio de reacção, 20 μL de suspensão de cloroplastos, 1,4 mL de água destilada e 50 μL de DCPIP. NOTA: envolver previamente a cuvette com papel de alumínio.
Medir espectrofotometricamente a 600 nm a velocidade de redução do DCPIP expondo a cuvette a periodos sucessivos de 5 s ou 10 s de iluminação.
Pode ser usada para medir a actividade fotoquímica, quer do PS I e PS II actuando em série, quer só do PS I. A actividade fotoquímica do PS I pode ser medida se a actividade do PS II 89
for bloqueada pelo DCMU e se o fluxo de electrões for fornecido por um dador electrónico artificial. Enquanto no eléctrodo de oxigénio, 1 molécula de O 2 libertada leva à redução de 2 moléculas de reagente de Hill, no caso do espectrofotómetro, 1 molécula de DCPIP reduzida leva a meia molécula de O 2 libertada.
5. Determinação do conteúdo de clorofila dos cloroplastos
Adicionar 0,2 mL da suspensão de cloroplastos a 10 mL da solução de acetona contida num tubo de ensaio.
Agitar vigorosamente e filtrar através de papel de filtro Whatman nº1 para um balão volumétrico de 25 mL.
Lavar o tubo com mais 5 mL de acetona aquosa e use os mesmos 5 mL para lavar o papel de filtro.
Ler a absorvência a 652 nm usando como branco a solução de acetona (ε = 34,5 mg-1 mL.cm-1).
Repetir a lavagem e perfazer os 25 mL com o solvente.
3. Resultados
Reacção de Hill Hill fez a descoberta da existência das duas fases da fotossíntese. Iluminando extractos de cloroplastos na presença de aceitadores artificiais de electrões como o ferricianeto ou o corante reduzível 2,6- diclorofenolindofenol (DCPIP), verificou que os cloroplastos libertavam oxigénio e reduziam o receptor de electrões, o que se traduz nesta recção designada reacção de Hill: , sendo A o receptor de electrões e a H2O o dador de electrões. Verifica-se assim que o CO 2 não é necessário à reacção. Nos sistemas biológicos o aceitador de electrões é o NADP. 90
O processo descrito permite assim medir a actividade fotoquímica de ambos os fotossistemas ou só do PSI. No caso de ambos os sistemas, os electrões ao fluírem do PS II para o PS I ou da ferredoxina para o NADP +, podem ser interceptados por aceitadores electrónicos artificiais. Para se seguir o fluxo de electrões apenas do PSI bloqueia-se a actividade do PSII (pelo herbicida 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilureia ou DCMU) e o fluxo de electrões é fornecido por um dador electrónico artificial, sendo que o DCMU compete com a plastoquinona pelo local onde esta se liga no PSII.
Libertação de dioxigénio pelos cloroplastos isolados usando oxidantes de Hill
Calibração do eléctrodo de O2
∆[O ] = 51 quadriculas 2
[O2]solução saturada = 0,253 µmol/mL (a 25ºC) Vtotal = 2mL n (O2) = 0,506 µmol
1 quadrícula
0,00992 μmol de O
2
Ensaios 91
Ensaio 1 (DCPIP)
Ensaio 2 (ferricianato de potássio)
Estes são os nossos resultados. O sistema de eixos funciona para localizar no espaço os nossos resultados, obtendo assim uma espécie de gráfico. Após c ada adição o aumento da [O 2] 92
foi quantificado. Os triângulos azuis ajudam a fazer uma estimativa do declive enquanto que dentro das linhas verdes se encontra a zona de linearidade (zona de interesse).
Velocidade de libertação do dioxigénio
∆ ∆ 1 quadrícula 0,00992 μmol de O velocidade papel 1 cm/min Assim, para o ensaio 1-A temos que
2
∆ é 8 quadrículas e ∆ é 0,4 cm.
μ
Ou seja, a velocidade de libertação de O 2 aquando da adição de 20 L de DCPIP é
μ
0,19825 mol/min. Para os restantes ensaios o raciocínio é análogo, sendo que os valores registados e calculados se encontram numa tabela apresentada mais à frente. Na última coluna, velocidade por mg de clorofila equivale à medição do número de moles de O2 por tempo por quantidade de clorofila. A quantidade de clorofila pode ser medida através de um ensaio espectrofotométrico da seguinte forma.
Determinação do conteúdo de clorofila dos cloroplastos
Usamos 0,2 mL de extracto com cloroplastos para um volume de 25 mL de acetona. Assim
93
Esta massa equivale a um extracto com cloroplastos de 0,2 mL. Assim a nossa concentração de clorofila será
Para estes ensaios utilizamos um volume de cloroplastos de 100
μL o que
equivale a uma massa de clorofila de 0,16875 mg. Assim para o ensaio 1-A temos por exemplo
∆∆
Ensaio
Reagente de Hill
1 – C 1 – A 1 – B 2 – A 2 – C 2 – B
DCPIP DCPIP DCPIP FeCN FeCN FeCN
Volume ( L)
∆
∆
μ
(quadriculas)
∆ (μmol)
(cm/min)
Velocidade ( mol/min)
10 20 40 20 30 40
2 7 8 4,5 9,5 21
0,0198 0,0694 0,0794 0,0446 0,0942 0,208
0,43 0,41 0,5 0,8 3,925 4,6
0,046 0,17 0,159 0,056 0,024 0,045
μ
Velocidade por mg de clorofila ( mol/min.mg) 0,273 1 0,94 0,33 0,14 0,26
μ
Pela análise do quadro resumo, verifica-se que quanto maior é a quantidade de reagente de Hill adicionada, maior é a quantidade de O 2 libertado. No entanto verifica-se que tanto o DCPIP como o ferricianeto de potássio funcionam como aceitadores de electrões artificiais. Verificámos ainda que o ferricianeto de potássio não funciona no escuro, porque é um aceitador final de electrões na fase luminosa da fotossíntese; deste modo, sem iluminação não ocorre excitação da clorofila nem fluxo de electrões gerado a partir daí, pelo que não existem electrões que o ferricianeto de potássio possa aceitar. As nossas velocidades não fazem sentido pois não apresentam nenhuma relação aparente com o volume. Comparativamente a outros grupos com o mesmo eléctrodo e melhores resultados verificamos que as zonas de lineariedade foram diferentes, podendo advir dai os nossos erros.
94
Efeito da adição de um inibidor do PSII (DCMU) Reagente
Volume
∆
de Hill
( L)
μ
(quadriculas)
1 – C
DCPIP
10
2
1 – A
DCPIP
20
1 – B
DCPIP
Ensaio
DCMU +
1 – D
DCPIP
Velocidade por
∆
Velocidade
(cm/min)
( mol/min)
0,0198
0,43
0,046
0,273
7
0,0694
0,41
0,17
1
40
8
0,0794
0,5
0,159
0,94
50 + 40
3,5
0,0496
0,18
0,248
1,47
∆ (μmol)
μ
mg de clorofila
μ
( mol/min.mg)
De novo, os nossos resultados não fazem sentido, tendo-se registado para outros grupos uma inibição por parte do DCMU, embora apenas parcial pois continuou a existir livertação de O2. No nosso caso a velocidade de libertação de oxigénio aumentou em vez de diminuir, o que nos leva de novo a concluir que os nossos resultados estão errados.
Quanto ao seguimento desta reacção espectrofotometricamente, usa-se o aceitador DCPIP visto que é um composto corado. À medida que vai sendo reduzido, isto é, quando os electrões estão a fluir entre fotossistemas ou apenas no PSI, torna-se um composto incolor, absorvendo menos. No caso do eléctrodo de oxigénio, por cada molécula de O 2 libertada, 2 moléculas do reagente de Hill são reduzidas. Portanto, no espectrofotómetro, uma molécula de DCPIP reduzida significa que metade de uma molécula de O 2 foi libertada.
Libertação de dioxigénio pelos cloroplastos isolados através de ensaios espectrofotométricos Ensaio espectrofotométrico da reacção de Hill Foram feitas medições espectrofotométricas da redução do DCPIP a 600 nm. Tempo (s)
Abs ensaio 1
Abs ensaio 2
Abs ensaio 3
Média Abs
0
1.92
1.84
1.895
1.885
5
1.69
1.69
1.738
1.706
10
1.495
1.495
1.53
1.506667
15
1.327
1.345
1.36
1.344 95
20
1.17
1.2
1.208
1.192667
25
1.04
1.078
1.046
1.054667
30
0.95
0.975
0.938
0.954333
35
0.845
0.88
0.838
0.854333
40
0.85
0.814
0.807
0.823667
0.79
45
0.79
Dos três ensaios representados graficamente em baixo calculámos uma média dos declives, que será a nossa variação de absorvência por segundo. Numa aplicação directa da lei de Lambert-Beer, uma divisão deste valor pelo ε dar-nos-á a concentração de DCPIP em função do tempo, a partir da qual podemos calcular a quantidade de DCPIP em função do tempo. Após este passo queremos transformar esta quantidade na de O 2 libertado, para comparar
Ensaio 1 2.5 2
y = -0.035x + 1.878 R² = 0.9905
a i c 1.5 n ê v r o s b 1 A
0.5 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (s)
posteriormente com os resultados obtidos através do eléctrodo de oxigénio.
96
Ensaio 2 2
y = -0.031x + 1.8292 R² = 0.9953
1.5 a i c n ê v r o s b A
1
0.5
0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tempo (s)
Ensaio 3 2
y = -0.0343x + 1.8918 R² = 0.9978
1.5 a i c n ê v r o s b A
1
0.5 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (s)
97
Variação de absorvência em função do tempo (média dos declives) = 0,03343
ε DCPIP=16000 M
-1
cm-1.
[DCPIP]/s = Vcuvette = 3 mL
H2O + DCPIP → DCPIP reduzido + ½ O2 1 mol DCPIP - ½ O 2
mol – x x = 3,15
mol velocidade de formação de O é 3,15 mol/s 2
Comparação da velocidade de formação de O 2 Para efectuarmos esta comparação, os resultados obtidos em ambos os métodos vão
μ
ser convertidos em mol/min.mg, e o volume de DCPIP será 50 L.
Eléctrodo de oxigénio Como não foi efectuada nenhuma medição com 50
L
de DCPIP foi necessário criar
uma recta com a velocidade de formação do O 2 em função do volume de DCPIP e extrapolar
μ
este valor. Assim, de acordo com a nossa equação da recta a velocidade em mol/min.mg de formação de O2 é 0,2115. No entanto temos de ter em conta que esta recta não possui muita significância estatística pelo que este resultado é algo duvidoso. 0.2 0.18 2 0.16 O e d 0.14 o ã ç 0.12 a m r o 0.1 f e d e 0.08 d a d i 0.06 c o l e v 0.04
y = 0.0032x + 0.0515 R² = 0.4915
0.02 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
volume (μL)
98
45
v = 0,2215 μ mol/min
μ
A quantidade de cloroplastos adicionados foi 20 L e a concentração de clorofila (já determinada) é
. Assim a quantidade de clorofila terá sido 0,03375
mg. Assim a velocidade de formação de O 2 por mg de clorofila será 6,56
μmol/min.mg Espectrofotometria velocidade de formação de O 2 = 3,15
mol/s = 0,189 μmol/min
Aplicando a quantidade de clorofila calculada acima, a velocidade de formação de O 2 por mg de clorofila será 5,6 mol/min.mg.
μ
μ
Eléctrodo de oxigénio 6,56 mol min-1 mg-1
μ
Ensaio espectrofotométrico 5,6 mol min-1 mg-1 Embora o eléctrodo de oxigénio seja um método mais sensível e preciso que o espectrofotómetro os valores obtidos pelos dois métodos não registam uma grande diferença. A pequena diferença pode ainda assim dever-se à nossa extrapolação da recta (como já referimos a nossa recta não era muito fiável) ou a erros experimentais.
Reacções com o viologénio de metilo Um dos métodos de medir o transporte electrónico fotossintético utiliza a autoxidação de um aceitador terminal de electrões, o viologénio de metilo. Este aceita electrões do PS I ficando reduzido, formando-se O 2 com a estequiometria normal da reacção de Hill (O2/2e-=. ½) No entanto, o O2 é consumido simultaneamente com duas vezes esta estequiometria através da combinação da reacção de autoxidação do viologénio de metilo, com a dismutação do radical superóxido, pelo que a equação geral conta com a soma das três equações: Transporte electrónico
Autoxidação do VM2+
Dismutação do radical superóxido 99
, sendo conhecida por reacção de Mehler, com a estequiometria de consumo de O 2 de (O2/2e- = ½). Assim, 0,5 mol de O2 são consumidas por par de electrões transferidos, sendo que esta estequiometria pode ser alterada por: - Presença de agentes redutores como o ascorbato e os iões Mn 2+, que irão interferir com a dismutação do radical superóxido - Adição do enzima superóxido dismutase. - Actividade endógena de catálase presente na preparação de cloroplastos; para evitar isto pode inibir-se a catalase usando azeto de sódio para impedir a libertação de O2 a partir do H2O2 através da reacção: 2 H2O2 → H2O + O2 Para medir apenas o PS I é necessário medir o consumo de O2 ou a redução do aceitador terminal, uma vez que não ocorre libertação de O2 e é necessário adicionar um dador artificial de electrões em vez de se usar água. Deve-se também eliminar qualquer actividade do PS II, para não afectar os resultados. Assim, um meio de ensaio simples para o transporte electrónico através do PS I contém viologénio de metilo, azeto de sódio, DCMU para inibir o PS II e DCPIP e ascorbato como par dador de electrões. Um bloqueamento do PS II irá dar uma menor velocidade inicial de consumo de O2 (PS I + PS II), mas não de consumo de O2 devida apenas ao PS I.
Viologénio de Metilo como aceitador terminal de electrões Consumo de dioxigénio com viologénio de metilo como aceitador de electrões
Ensaio 1
100
Ensaio 2
101
Ensaio 3
102
O raciocínio seguido para esta parte do trabalho foi o mesmo da anterior, exceptuando que em vez da velocidade de libertação do O 2 calculamos a velocidade de consumo. Relembrar que
∆ ∆ 1 quadrícula 0,00992 μmol de O velocidade papel 1 cm/min
2
Assim na tabela seguinte encontram-se resumidos os nossos resultados.
Ensaio
Reagentes
Volume VM ( L)
1 – A 2 – A
VM VM
100 50
μ
∆
∆
(quadriculas)
∆ (μmol)
(cm/min)
Velocidade ( mol/min)
17 17
0,169 0,169
1,37 1,36
0,123 0,124
μ
Velocidade por mg de clorofila ( mol/min.mg) 0,729 0,735
μ
103
3 – A 1 – B 2 – B 3 – B
VM VM + NaN3 VM + NaN3 VM + NaN3
25 100 + 50 50 + 50 25 + 50
14 18 23 4
0,139 0,179 0,228 0,04
4,29 3,04 2,6 4,09
0,0324 0,059 0,088 0,01
Note-se que o volume de cloroplastos aplicado nestes ensaios foi 100
0,192 0,35 0,52 0,059
μL pelo que a
quantidade de clorofila será a mesma que já foi calculada anteriormente para os ensaios do eléctrodo de oxigénio com os oxidantes de Hill – 0,16875 mg. Teoricamente com o aumento do volume de VM 2+ sem NaN3, deve diminuir a velocidade de consumo de O 2, já que existe uma maior formação deste. Com a adição de NaN 3 e com o aumento de volume de VM 2+ é normal que aumente o consumo já que existe cada vez mais VM2+ que origina o radical superóxido através da autoxidação deste.
Os nossos resultados nada permitem concluir, pois não existe um padrão de aumento ou diminuição da velocidade de consumo de O 2 ou do número de moles consumidos relativamente ao volume adicionado.
Actividades do PSI medida com viologénio de metilo
104
Ensaio
Reagentes
C D
VM DCMU Ascorbato + DCPIP
E
Volume VM ( L)
μ
50 50 25 + 80
∆
∆
(quadriculas)
∆ (μmol)
(cm/min)
Velocidade ( mol/min)
23 12
0,23 0,12
1,1 2,75
0,21 0,044
14
0,14
0,82
0,17
μ
Velocidade por mg de clorofila ( mol/min.mg) 1,24 0,261 1
μ
Teoricamente devia verificar-se neste último ensaio algo deste género
Teoricamente devia verificar-se neste último ensaio algo deste género. No entanto tal como se pode verificar o DCMU funcionou como inibidor parcial do PSII, na medida que deveria ter travado o transporte electrónico e apenas diminuiu a velocidade de consumo de O2. Sabemos isto porque continuou a existir consumo de oxigénio mesmo após a adição deste reagente, embora a velocidade tenha diminuído acentuadamente. A inibição do PS II pela acção do DCMU deve dar uma maior velocidade de consumo de oxigénio devida apenas à acção do PS I sobre este, já que uma vez que a cadeia respiratória começa a meio o número de reacções e o tempo despendido nas mesmas é menor, sendo assim a velocidade maior. Na primeira fase da experiência (PS I + PS II) o consumo de O 2 deveria revelar uma velocidade muito menor. É o ascorbato funciona com dador de electrões para o próprio DCPIP, e é este que actua no PSI, 105
repondo o fluxo electrónico. No entanto como já referimos o nosso DCMU não inibiu completamente o PSII, pelo que nunca se verificou a actuação isolada do PSI. Assim isto justifica que a descida acentuada que seria significante do PSI isolado não seja assim tao acentuada de modo a que a taxa de consumo não seja maior do que a correspondente ao viologénio de metilo em comparação.
106
PCR
1. Procedimento
1. Extracção do DNA a partir de carne de vaca [O DNA total (genómico e mitocondrial) vai ser extraído de carne segundo uma variante dos protocolos de Sambrook et al. (1989).]
Pulverizar, reduzindo em pó 500mg de carne bovina picada num almofariz com azoto líquido (juntar mais azoto se precisar).
Extrair mais uma vez com clorofórmio (adicionando o mesmo volume tirado no passo 7, isso é: <10ml).
Misturar, agitar, centrifugar e tirar a fase aquosa como nos pontos 6 e 7.
Dissolver o DNA em 500 μl de TE (10 mM Tris-HCl, (pH 7.4), 0.1 mM EDTA) e transferir para um tubo “Eppendorf” de 1,5ml
para utilização como molde nas reações de PCR.
Transferir para um tubo plástico “Falcon” de
50ml.
Tirar quase toda a fase aquosa (de cima) para um novo tubo (<10ml), deixando intacta a interface entre as fases, desprezar a fase orgânica.
Hidrolisar o RNA presente em solução solução juntando 100 ug/ml de Ribonuclease A (= +/- 1 mg num volume final de 10 ml: ver concentração do stock!).
Tirar o etanol todo sem tocar no pellet e deixar secar o pellet de DNA ao ar durante 5 minutos.
Adicionar 20 vol (aproximadamente 10 ml) tampão de extracção (100 mM Tris-HCl pH 9.0, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA e 1% SDS) ao pó dos 500 mg de carne de vaca, para extrair uma de DNA/RNA .
Misturar bem e deixar incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
Agitar bem, e centrifugar para separar as fases (1600 rpm, 10 min).
Separar os ácidos nucleícos da mistura anterior, através da adição de igual volume (~10ml) da mistura fénol/clorofórmio/alcool -isoamil (25:24:1).
Incubar durante 30min1h a 37ºC.
Desta mistura extrair-se o DNA uma vez com volume igual (<10ml) de fénol/clorofórmio/alcool -isoamil (25:24:1) e uma vez com volume igual de clorofórmio (<10ml), segundo a sequência anterior pontos 5 a 9.
Remover todo o isopropanol e lavar o pellet de DNA com 5 ml etanol (70%), seguido por centrifugação (1600 rpm, 10 min).
O DNA é precipitado da solução final com um volume igual de isopropanol (<10ml) seguido por centrifugação (1600 rpm, 10 min).
2. Quantificação e determinação do grau de pureza do DNA extraído
107
Ligar o espectrofotómetro cerca de 15 minutos antes de iniciar as leituras e regular para comprimento de onda de 260nm.
Fazer as diluição de 1:250, 1:500 e 1:1000 do DNA obtido após extração num mililitro de H2O usando eppendorfs de 1,5 ml. Tenham atenção em agitar bem as diluições de forma a haver uma boa homogeneização do DNA em solução.
Fazer o zero de absorvência com 1ml de água(a mesma que foi usada para ressuspender o DNA usado a cuvette de quartzo.
Repetir as leituras a 280nm e 325nm.
Fazer a leitura de absorvância a 260nm.
Utilizar a mesma cuvette para fazer a medição das duas diluições da amostra de DNA feitas no ponto 1.
Registar todos os valores. Calcular a concentração da solução de DNA obtido após a extração, calcular a quantidade total de DNA extraído e também o seu grau de pureza.
Após os cálculos, faça uma solução com a concentração 100pg/ l do DNA extraído num volume final de 50 l em H2O.
Nota: Tenham muito cuidado com a manipulação das cuvetes pois são muito caras e
partem-se facilmente. Devem limpar bem as superfícies da cuvete por onde o feixe de luz passa com papel higiénico para evitar erros de leitura devido a dedadas ou outras impurezas na superfície da cuvete.
3. Amplificação de fragmentos de DNA por PCR
108
Num microtubo de 1,5 ml em gelo, preparar a seguinte mistura de reacção de PCR (1).
Adiciona 1 μl dos DNAs aos tubos A e B, deixando o tubo C sem DNA (controlo de amplificação negativo, neste tubo em vez do DNA será adicionado 1 μl H2O).
Misturar pipetando várias vezes com a micropipeta suavemente. Deixar os tubos em gelo.
Adaptar as quantidades para o número de reacções a executar, fazendo um “master mix” para n
reacções (n =3 número de amostras de DNA (2) mais um tubo de controlo negativo) para cada par de primers. Um excesso de 10% pode ser adicionado para precaver erros de pipetagem.
Divide para cada tubo 24 μl das respectivas “master mix”.
Ligar o aparelho de PCR, programar com o programa de PCR abaixo indicado (3) e iniciar o programa de amplificação.
Preparar as duas “master mixes” em tubos separados.
Homogenizar as soluções das “master mixes” com a
micropipeta, pipetando várias vezes suavemente.
Preparar e marcar 3 tubos de 200 μl por reacção de PCR no total são 6 tubos e pô-los em gelo. (2)
Transferir os microtubos preparados com a mistura de PCR e DNA do gelo para o bloco de aquecimento do aparelho somente quando a temperatura desde atingir os 94°C. Fechar a tampa e ajustá-la para contactar com a tampa dos microtubos.
Depois da reacção PCR, analisar os produto de PCR através de electroforese em gel de agarose 1,5%.
(1) Componente Quantidade / 1 reacção Tampão de PCR (c/ Mg2+) 10x --------------- 2,5 μl dNTP Mix 100 (25mM cada dNTP)---------- 0,1 μl 109
Primer Foward 10μM -------------------------- 0,5μl Primer Reverse 10μM ------------------------- 0,5μl
Taq DNA Polymerase Promega (5U/μl)- --- 0,1 μl
Água ultra-pura--------------------------------- 20,3 μl Total (por reacção)------------------------------ 24 μl
(2) A marcação deve ser feita da seguinte forma: V (para o PCR com os primers específicos do DNA de vaca) seguido do numero do grupo e depois traço e A para o tubo de PCR que leva o DNA do tubo A, B para o tubo de PCR que leva o DNA do Tubo B e C para tubo de PCR que leva H2O. (Então na tampa do primeiro tubo do grupo 1 estará V1-A; o segundo tubo terá V1-B, e o terceiro V1-C, para o PCR com primers da batata será B1-A; B1-B e B1-C.
(3) Programa de PCR: 1x: 94°C - 5min 35x: (94ºC – 30 seg; 55°C – 30seg; 72°C – 2min) 1x: 72°C – 5min
4. Electroforese em gel de agarose
110
Selar ambas as extremidades do suporte de preparação do gel de agarose com fita adesiva.Colocar o suporte do gel dentro da hotte e inserir o pente na posição conveniente para definir os poços no gel.
Colocar o suporte com o gel na tina de electroforese, de modo a que os poços estejam do lado do eléctrodo negativo (cátodo), e adicionar tampão TBE 1X até cobrir o gel. Verificar que todos os poços estão preenchidos com tampão.
Para cada amostra, misturar num microtubo: (1). Aplicar o conteúdo total de cada tubo de reacção para um poço do gel, usando a respectiva ponta. (2)
Examinar o gel com iluminação ultravioleta (UV) e registar o padrão de bandas em fotografia.
Preparar uma solução de 100 ml agarose com concentração final de 1,5% (p/v) em tampão TBE num frasco erlenmeyer de 250 ml.
Quando o gel se tiver polimerisado (~30 min), retirar o pente com cuidado para não danificar os poços e retirar a fita adesiva de ambas as extremidades.
Colocar a tampa da tina. Verificar que os poços com o DNA estão do lado do polo negativo (cátodo, eléctrodo de cor preta) pois a migração será no sentido do polo positivo (ánodo, eléctrodo de cor vermelha).
Cuidadosamente para não partir, e usando luvas, retirar o gel com o respectivo suporte da câmara de electroforese.
Dissolver a agarose em forno micro-ondas ou em banho de água a ferver com agitação frequente (para que não haja formação de agregados) até dissolução completa da agarose.
Deixar arrefecer para uma temperatura de cerca de 50ºC (temperatura que seja suportada pelas mãos do manipulador).
Verter a agarose para o suporte do gel até uma altura de ~5mm. Eliminar bolhas de ar que se tenham formado, com a ajuda de uma ponta e deixar solidificar à temperatura ambiente.
Na hotte adicionar 5 l de uma solução de brometo de etídio a 10 mg/m (concentra o final de 0,5 g/mL) à solução de agarose.
Fechar a câmara de electroforese e ligar os cabos eléctricos a uma fonte de alimentação eléctrica de modo a que o cátodo da câmara fique ligado ao cátodo da fonte (preto – preto), assim como o ânodo (vermelho – vermelho).
Após migação julgada conveniente (por avaliação da posição do azul de bromofenol a sensivelmente 3/4 do comprimento do gel), desligar a corrente eléctrica na fonte, desligar os cabos e retirar a tampa da tina de electroforese.
Ligar os cabos à fonte de energia de modo a que o cátodo da câmara fique ligado ao cátodo da fonte (preto – preto), assim como o ânodo (vermelho – vermelho).
Ligar a fonte de alimentação e regular a voltagem para 80 Volts. Verificar se há desprendimento de bolhas dos eléctrodos devido à electrólise e se, passados alguns minutos, o azul de bromofenol já começou a migrar no sentido correcto, ou seja, do polo positivo.
Nota: Durante o aquecimento para dissolução da agarose ter cuidado na manipulação
do erlenmeyer pois a solução no seu interior estará muito quente, se possível usar luvas que protejam do calor. 111
Atenção: O brometo de etídeo é um agente mutagénico potente, usar sempre luvas e
colocar em recipiente próprio todo o material que tenha entrado em contacto com este corante.
(1)
2 μl de tampão de deposição de DNA (usar sempre a mesma ponta)
μ
10 L do produto de PCR (deixar a ponta usada para pipetar o produto de PCR no tubo da mistura
(2)
Cuidados a ter: - Estabilizar a pipeta sobre o poço com ambas as mãos - Expelir o ar da ponta antes de carregar o gel - Mergulhar a ponta da pipeta um pouco abaixo da superfície do líquido (não é necessário introduzir a ponta dentro do poço), posicioná-la na direcção do poço e expelir a amostra muito lentamente. Cuidado para não furar o gel com a ponta da pipeta, e não deixar extravasar a amostra do poço para não contaminar os poços vizinhos.
Atenção: As radiações U.V. são extremamente perigosas, particularmente para os olhos,
provocando lesões na retina. Evitar qualquer exposição dos olhos a estas radiações. Usar sempre óculos protectores ou máscaras de material opaco aos U.V.
112
2. Resultados
Quantificação e determinação do grau de pureza do DNA extraído Após a extracção do DNA quantificou-se o mesmo e ainda se analisou a sua pureza com o auxílio de técnicas espectrofotométricas. A 260 nm, uma OD (optical density – densidade óptica) equivale a cerca de 50 μg/mL de DNA. Assim, obteve-se uma absorvência de 1,417 OD, pelo que a concentração de DNA extraído é
μm.
Para determinar o grau de pureza do DNA mediu-se a igualmente a absorvência da amostra a 280 nm (registando-se 0,857) e determinou-se a relação A260/A280. De acordo com os parâmetros, se esta razão se encontrar entre 1,8 e 2,0, a amostra pode ser considerada pura. Para valores abaixo de 1,8 considera-se a amostra contaminada com proteína e fenol. A nossa razão foi 1,65 pelo que se considera que a amostra está contaminada. No entanto, utilizou-se esta amostra para as restantes partes da actividade experimental.
Tamanho de fragmentos ampliados Pode fazer-se uma determinação in silico dos tamanhos dos fragmentos esperados após amplificação com os primers fornecidos, recorrendo a um alinhamento com as databases de DNA usando os programas disponíveis online (Primer-Blast), conhecendo as sequências em que os primers hibridam (os primers “batata” hibridam na sequência existente na base de dados Genebank com o número de acesso DQ185064, e os primers “vaca” hibridam na sequência existente na base de dados Genebank com o número de acesso V00654.). Sabe-se que os primers são: *Primer Forward mtDNA “COX2” batata: 5´ - GCGCATAAACTATGTTCGTC -3´ *Primer Reverse mtDNA “COX2” batata: 5´ - AGATCCTAATTGCCATGGTT -3´ *Primer Forward mtDNA “Mt11” vaca: 5´- TTCTGTAGCCATAGCCGTTGTA -3´ *Primer Reverse mtDNA “Mt11” vaca: 5´ - CCCTTGCGTAGGTAATTCATTC -3´
113
Assim, in silico, para o DNA da batata o tamanho obtido foi 366bp e para o DNA da vaca o tamanho obtido foi 1751bp.
Figura 1 - Primer-Blast para DNA da vaca.
Figura 2 - Primer-Blast para DNA da batata.
114
Pode
também
calcular-se
o
tamanho
dos
fragmentos
amplificados
experimentalmente (in vitro) por PCR para cada reacção com diferentes pares de primers, usando o marcador de pesos moleculares. Os fragmentos lineares de DNA migram a velocidades inversamente proporcionais ao log10 das suas massas moleculares devido a um maior atrito com a matriz com o aumento do tamanho. Para simplificar, substitui-se neste caso a massa molecular dos fragmentos pelo seu tamanho em pares de bases (bp). Tendo em conta esta informação deve medir-se a distância, em mm, para o marcador de pesos moleculares desde o bordo frontal do poço a cada uma das bandas. Ao fazer corresponder a distância a cada banda ao tamanho do respectivo fragmento pode traçar-se uma recta de regressão com a distância migrada no eixo dos xx e o logaritmo de bp no eixo dos yy para os valores do marcador de pesos moleculares usado, que servirá para conhecer os pares de bases que correspondem às nossas amostras.
115
V3A
V3B
V3C
B3A
B3B
M
B3C
Legenda: V3A – DNA de vaca e primers de batata V3B – DNA de vaca e primers de vaca V3C – Controlo B3A – DNA de batata e primers de batata B3B – DNA de batata e primers de vaca B3C – Controlo M – Marcador Generuler 1kb
Distância (mm)
log10 bp
bp
18 22 26 30 35 42
3,3
2000 1500 1000 750 500 250
Figura 3 - Comparação entre o marcador comercial e os resultados obtidos com o nosso marcador.
3,2 3 2,9 2,7 2,4
116
Tabela 2 - Dados relativos ao marcador para traçar a recta de regressão: distância (mm), pares de bases (bp) e log10bp.
Recta de regressão 3.5 3 2.5
y = -0.0376x + 4.0018 R² = 0.9941
p 2 b 0 1 g o 1.5 l
1 0.5 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Distância (mm) Gráfico 1 - Recta de regressão com dados do marcador.
Com a recta de regressão determinada, procede-se então ao cálculo do número de pares de bases dos fragmentos de DNA que se pretendia determinar.
Equação da recta:
, onde y é o log10bp e x a distância percorrida em mm. Ou seja, medindo a distância percorrida pelo DNA das amostras que temos, podemos determinar a sua quantidade de pares de bases. Distância percorrida pelo DNA de V3B = 21 mm
Distância percorrida pelo DNA de B3A = 39 mm
117
Comparando com os valores acima obtidos através dos dados do NCBI, para o tamanho do gene do DNA da batata temos 372 pares de bases obtidos experimentalmente em contraste com 366 pares de bases e para o tamanho do gene DNA da vaca temos 1703 pares de bases em contraste com 1751 pares de bases. Os resultados são relativamente próximos sendo que para a diferença obtida é necessário ter em conta que na construção da recta de regressão existe subjectividade por ser um método comparativo, e ainda que as amostras de DNA estavam contaminadas.
Análise do gel
V3A
V3B
V3C
B3A
B3B
B3C
M
Legenda: V3A – DNA de vaca e primers de batata V3B – DNA de vaca e primers de vaca V3C – Controlo B3A – DNA de batata e primers de batata B3B – DNA de batata e primers de vaca B3C – Controlo M – Marcador Generuler 1kb No tubo V3B verifica-se presença de DNA identificado como DNA da vaca e no tubo B3A verifica-se presença de DNA identificado como DNA da batata. Os nossos tubos contendo DNA não correspondem aos dos restantes grupos da turma devido a erros na ordem de aplicação, sendo que para a maioria da turma o DNA da vaca se encontra no primeiro tubo e o DNA da batata no quinto. Assim pode concluir-se que nestes dois tubos havia DNA e primers 118
