Universidade Universidade Federal do Pará Instituto de Tecnologia Faculdade de Engenharia Química Elementos de Instrumentação Científica Professor: Davi Brasil
ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA/VISÍVEL
Equipe: Daniel Nascimento dos Santos 09025002701 Gilmar Nascimento Neves 09025003001 Raimunda Nonata Consolação e Branco 09025002901
BELÉM/PA 22 de Novembro de 2010
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Universidade Universidade Federal do Pará Instituto de Tecnologia Faculdade de Engenharia Química Elementos de Instrumentação Científica Professor: Davi Brasil
ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA/VISÍVEL
Equipe: Daniel Nascimento dos Santos 09025002701 Gilmar Nascimento Neves 09025003001 Raimunda Nonata Consolação e Branco 09025002901
Trabalho apres resentado à disciplina Elementos de Instrumentação Científica sob orientação do professor Davi Brasil como requ requis isit itoo aval avalia iati tivo vo no 4º seme semest stre re da Universidade Universidade Federal do Pará.
BELÉM/PA 22 de Novembro de 2010 RESUMO 2
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A espectroscopia de radiação na região do ultravioleta e visível é muito utilizada nos meios laboratoriais no que diz respeito às técnicas de análises (qualitativas ou quan quanti tita tati tiva vas) s),, por por sua sua conf confia iabi bili lida dade de e prec precis isão ão.. Logo Logo seu seu estu estudo do se mo most stra ra extremamente extremamente necessário nas mais diversas diversas áreas acadêmicas. acadêmicas. O presente trabalho tem como objetivo objetivo apresenta apresentarr a espectro espectroscop scopia ia de radiaçã radiaçãoo na região região do ult ultravi raviolet oletaa e visível, assim como seus aspectos teóricos e a sua aplicabilidade na vida real.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1.1. A ESPECTROMETRIA ..........................................................................................5 1.2. O ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO...............................................................5 1.4. A RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA .........................................................................6 1.4. 1. 4. AS ASPE PECT CTOS OS TE TEÓR ÓRIC ICOS OS DA ES ESPE PECT CTRO ROSC SCOP OPIA IA DE AB ABSO SORÇ RÇÃO ÃO ULTRAVIOLETA............................................. .................................................................... .............................................. .......................................7 ................7 2. ORI ORIGEM GEM DOS DOS ESPE ESPECTR CTROS OS DE DE ABSOR ABSORÇÃO ÇÃO MOL MOLECU ECULAR LAR UV/ UV/VIS VIS......11 2.1. ABSORÇÃO POR COMPOSTOS ORGÂNICOS ..............................................11 2.2. ABSORÇÃO POR ESPÉCIES INORGÂNICAS................................................11 3
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3. EQUIPAMENTO...................................................................................................13 ................................................................... .........................................13 ..................13 3.1. FONTES DE RADIAÇÃO ............................................ 3.2. DISPOSITIVOS PARA SEPARAR OU RESOLVER RADIAÇÕES ...............13 3.2.1. FILTROS ÓPTICOS .............................................. ..................................................................... .............................................13 ......................13 3.2.2. MONOCROMADORES.....................................................................................14 3.3. RECIPIENTES PARA AMOSTRAS ...................................................................14 3.4. TRANSDUTORES DE RADIAÇÃO ....................................................................14 3.5. INSTRUMENTOS FOTOELÉTRICOS..............................................................15 3.5.1. FOTÔMETRO OU FOTOCOLORÍMETRO..................................................15 3.5.2. ESPECTROFOTÔ ESPECTROFOTÔMETROS METROS .............................................................................15 4. MA MANU NUSE SEIO IO DA AM AMOS OSTR TRA A NO UV UV/V /VIS IS..........................................................18 5. APL APLICA ICAÇÕE ÇÕESS DA ESPE ESPECT CTROS ROSCOP COPIA IA NA REG REGIÃO IÃO DO UV/V UV/VIS IS..............20 5.1. APLICAÇÕES NA ANÁLISE QUALITATIVA.................................................20 5.2. APLICAÇÕES NA ANÁLISE QUANTITATIVA..............................................20 6. EXE EXEMPL MPLOS OS DE APLIC APLICAÇÕ AÇÕES ES DA ESPE ESPECTR CTROSC OSCOPI OPIA A NA REGIÃ REGIÃO O DO .................................................................... .............................................. .............................................. .................................21 ..........21 UV/VIS............................................. 6.1. DESE DESENVOLV NVOLVIMEN IMENTO TO E VALI VALIDAÇÃO DAÇÃO DE UM MÉTOD MÉTODO O ANAL ANALÍTICO ÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO POR ESPECTROSCOPIA UV DE CAPTOPRIL EM COMPRIMIDOS DE LIBERAÇÃO PROLONGADA. ............................................21 6.2 .2.. AV AVAL ALIA IAÇÃ ÇÃO O DA UT UTIL ILIZ IZAÇ AÇÃO ÃO DA ES ESPE PECT CTRO ROSC SCOP OPIA IA UV NA DETERMINAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS EM LEITE DE VACA............................................ ................................................................... .............................................. .............................................. ....................................23 .............23 6.3 .3.. PER ERF FIL DE FÁ FÁRM RMAC ACOS OS POR ES ESPE PECT CTRO ROFO FOTO TOME MET TRI RIA A NO .................................................................... .............................................. .....................................25 ..............25 ULTRAVIOLETA............................................. 7. CONCLUSÃO........................................................................................................28 8. BIB IBLI LIO OGR GRAF AFIIA............................................... ...................................................................... .....................................................29 ..............................29 1. INTRODUÇÃO 1.1. A ESPECTROMETRIA A espectrometria é um conjunto de recursos que nos permite identificar a estrutura das partículas que constituem as substâncias. Atualmente existem tecnologias tão avançadas que se torna possível descrever com precisão a estrutura exata de uma molécu mol écula la.. Os equip equipame ament ntos os modern modernos os permit permitem em detec detectar tar os ti tipos pos de elem element entos os presentes no composto, a quantidade de cada um deles, a posição tridimensional de cada átomo e muito mais. Esses aparelhos funcionam basicamente a partir de feixes de onda eletromagnética eletromagnética incidentes sobre uma amostra do composto, que então, absorve energia em determinados comprimentos de onda (l). Os valores da energia e dos comprimentos 4
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de onda absorvidos são detectados no aparelho e transformados em um gráfico no comput computado ador. r. É então então pela pela análi análise se desse desse gráfi gráfico co que que se deter determi mina na a estrut estrutura ura da molécula.
1.2. O ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO O espectro eletromagnético é o intervalo completo da radiação eletromagnética que vai da região das ondas de rádio até os raios gama. Atualmente são conhecidas radiações com comprimento comprimento de onda que variam desde 10 -6 m até cerca de 10 11 m. As radi radiaações com com ompr prim imeento nto de onda supe uperio rior a 0,7 0,74 m são são dit ditas infravermelhas. Por outro lado, àquelas cujo comprimento de onda é inferior a 0,36m chamam-se ultravioletas. Logo, o espectro eletromagnético é subdividido em três faixas: ultravioleta, visível e infravermelha. Dependen Dependendo do das suas suas freqüênc freqüências ias,, as radiaçõe radiaçõess do espectro espectro são portador portadoras as de quantidades quantidades de energia diferentes. diferentes. Quanto mais curto o comprimento de onda, mais alta é a energia de um fóton.
Figura 1 - Espectro eletromagnético
1.4. A RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA A radiação eletromagnética eletromagnética de comprimento de onda mais curto que a luz visível e mais longo que os raios X é camada de luz ou radiação ultravioleta (UV). Esta luz, invisível para o olho humano, é conhecida também como luz negra. A região UV do
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espec espectro tro foi descob descobert ertaa em 1801 1801 por John John Ritte Ritterr no transc transcurs ursoo de experi experiênc ências ias fotoelétricas. A luz UV é geral geralmen mente te div dividi idida da em regiõ regiões es denom denomin inada adass de ultra ultravi viole oleta ta próximo (400-300 nm), afastado (300-200 nm) e no vácuo (200-4 nm). Estes últimos compri comprimen mentos tos de ondas ondas são parti particul cularm armen ente te preju prejudic diciai iaiss para para a vida, vida, por por serem serem fortemente absorvidos absorvidos pela atmosfera e pela camada de ozônio da Terra. A luz UV é produzida em alguns processos que geram transição da luz visível em átomos, no qual, um elétron de um estado energético de alta energia retorna para um estado energético energético de menor energia. A absorção molecular na região do UV e do visível depende da estrutura eletrônica da molécula. A absorção de energia é quantizada e conduz à passagem dos elétrons de orbitais do estado fundamental para orbitais de maior energia em um estado excitado. Para muitas das estruturas eletrônicas esta absorção ocorre em uma porção pouco acessível do ultravioleta. ultravioleta. Na prática, a espectrometria no UV é limitada, na maior parte, aos sistemas conjugados. A seletividade da absorção no UV é uma vantagem, entretanto, uma vez que se pode pode reconh reconhec ecer er grupo gruposs caract caracterí erísti stico coss em mol moléc écula ulass de compl complexi exidad dadee basta bastante nte variável. Como uma grande porção de uma molécula relativamente complexa pode ser transparente no UV, pode-se obter espectro semelhante ao de moléculas muito mais simp simple les. s. Assi Assim, m, por por exem exempl plo, o, o espe espect ctro ro do horm hormôn ônio io masc mascul ulin inoo test testos oste tero rona na assemelha-se assemelha-se bastante ao do óxido de mesitila. A absorção é produzida pela estrutura de enoma conjugada, que existe em ambos os compostos. Os efeitos efeitos biológicos biológicos da luz UV inclui inclui bronzeado bronzeadoss e queimadu queimaduras ras pelo pelo sol. Exposição excessiva excessiva tem sido ligada ao desenvolvimento desenvolvimento de câncer na pele e catarata. A região da luz ultravioleta afastada tem a capacidade de destruir certas classes de bact bactéri érias. as. Por este este mot motiv ivo, o, é usada usada para para esteri esteriliz lizar ar algun algunss gênero gêneross alime alimentí ntíci cios os e equipamentos médicos.
1.4. ASPECTOS TEÓRICOS ABSORÇÃO ULTRAVIOLETA
DA
ESPECTROSCOPIA
DE
O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração de compostos presentes em solução. A maioria dos métodos utili uti liza zados dos em bioqu bioquím ímic icaa clíni clínica ca envol envolve ve a determ determin inaçã açãoo espect espectrof rofot otomé ométri trica ca de compostos corados (cromóforo) obtidos pela reação entre o composto a ser analisado e 6
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o reagente (reagente cromogênico), originando um produto colorido. Os métodos que se baseiam nesse princípio são denominados métodos colorimétricos, os quais geralmente são específicos e muito sensíveis. A grande vantagem em utilizar compostos coloridos deve deve-s -see ao fato fato de eles eles abso absorv rver erem em luz luz visí visíve vell (reg (regiã iãoo visí visíve vell do espe espect ctro ro eletromagnético). A espectrofotometria espectrofotometria — medida de absorção ou transmissão de luz — é uma das mais valiosas técnicas analíticas amplamente utilizadas em laboratórios de área básica, bem bem como como em análi análises ses clíni clínicas cas.. Po Porr meio meio da espec espectro trofot fotome ometri tria, a, compo componen nente tess desc descon onhe heci cido doss de um umaa solu soluçã çãoo pode podem m ser ser iden identi tifi fica cado doss por por seus seus espe espect ctro ross característicos ao ultravioleta, visível, ou infravermelho. Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com moléculas absorventes, absorventes, parte da luz é absorvida pela solução e o restante é transmitido. transmitido. A absorção de luz depende basicamente da concentração das moléculas absorventes e da espessura da solução – caminho óptico.
Figura 2 - Absorção de luz
Onde: i0 = Feixe de luz incidente; i = Feixe de luz transmitido; l = Espessura da solução ou caminho óptico. A espectroscopia de absorção na região do ultravioleta-visível (UV/VIS) utiliza radiação radiação eletroma eletromagnét gnética ica cujos cujos comprime comprimentos ntos variam variam entre entre 200 a 780 nm. Quando estimulada com esse tipo radiação, a molécula do composto pode sofrer transições eletrônicas por meio de absorção de energia. Nos átomos e nas moléculas os elétrons giram ao redor de seus núcleos em níveis definidos de energia, de acordo com a teoria quântica. Sendo a energia dos elétrons mínima, os elétrons se encontram no menor estado energético, ou seja, no 7
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chamado chamado estado estado fundame fundamental ntal.. Neste Neste estado estado eles podem podem absorver absorver energia energia radiante radiante,, passando então a um estado energético superior ou excitado. Este fenômeno recebe o nome de excitação eletrônica e, para que se produza a radiação, deve pertencer à região UV do espectro eletromagnético. A frequência da radiação se relaciona com a energia através da equação: E = hv
A quantidade de energia necessária para uma transição eletrônica desde o estado fundamental, fundamental, E0, a um estado excitado, E 1, é dado pela equação: (E1-E0) = hv
A absorção de energia UV/VIS modifica a estrutura eletrônica da molécula em conseqüência de transições eletrônicas envolvendo geralmente elétrons π e n (não ligantes) envolvidos em ligações. Isto requer que a molécula contenha pelos menos um grupo grupo funci funciona onall insat insatura urado do (C=C, (C=C, C=O, C=O, por exemp exemplo) lo) para para fornec fornecer er os orbit orbitai aiss moleculares π e n. Tal centro de absorção é chamado cromóforo, sendo responsável principalmente pelas transições π → π * e n → π *. Estas resultam da absorção de rad radiaçõe ções eletroma romagn gnééticas icas que se enqua nquaddram ram em um umaa regi regiãão espe spectra ctrall experimentalmente conveniente, ao contrário das transições n → σ * e σ → σ * que requerem geralmente radiações mais energéticas ( λ < 200 nm). A tabela a seguir mostra uma relação de alguns compostos e o comprimento de onda de máxima absorção. Cromóforos
Sistema
λ máximo
Aldeído
-CHO
210 280-300
Amino
-NH2
195
Brometo
-Br
208
Carbonila
=C=O
195 270-285
Carboxila
-COOH
200-210
Dissulfeto
-S-S
194 255
Éster
-COOR
205 8
9
Éter
-O-
185
Nitro
-NO 2
210
Nitroso
-NO
302
Tiocarbonila
=C=S-
205
Tioeter
-S-
194 215
Tiol
-SH
195
Tabela 1 - Bandas de absorção eletrônica de cromóforos
As band bandas as de abso absorç rção ão pode podem m ser ser cara caract cter eriz izad adas as por por dois dois parâ parâme metr tros os fundamentais: a posição e a intensidade. A posição corresponde normalmente ao “ λ ” da radia radiaçã çãoo eletro eletromag magnét nétic icaa respon responsáv sável el pela pela transi transição ção elet eletrôn rônica ica,, enquan enquanto to a inten int ensid sidad adee depend depende, e, entre entre out outros ros fatore fatores, s, da energi energiaa dos orbit orbitais ais mol molec ecula ulares res e probabilidade de transição. Os espectro espectross de absorção absorção UV/VIS apresent apresentam am geralmen geralmente te bandas bandas largas largas que resu result ltam am da sobr sobrep epos osiç ição ão dos dos sina sinais is prov proven enie ient ntes es de tran transi siçõ ções es vibr vibrac acio iona nais is e rotacionais aos sinais associados às transições eletrônicas. O espectro obtido é registrado r egistrado como comprimento comprimento de onda versus transmitância. Como a absorbância (A) é proporcional a log 1/T , o uso de uma resistência que varia de modo logarítmico com o comprimento de permite a obtenção de espectros lineares com relação à absorvância.
Figura 3 - Espectro de eletrônico de absorção no UV/VIS da acetona
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Figura 4 - Espectro de eletrônico de absorção no UV/VIS do 2,4-dinitrofenciato de potássio
ORI ORIGEM GEM DOS DOS ESPE ESPECT CTRO ROSS DE ABSO ABSORÇ RÇÃO ÃO MOLECULAR UV/VIS 2.
O processo de absorção é essencialmente o mesmo para espécies orgânicas e inorgâ ino rgânic nicas, as, porém porém,, exist existem em algum algumas as pecul peculia iarid ridade adess refere referent ntes es a cada cada class classe. e. Os elétrons que contribuem para a absorção UV/VIS das espécies moleculares orgânicas são: •
Os elétrons que participam das ligações entre os átomos (elétrons π e σ ); );
•
Os elétrons não-ligantes n, ou seja, os elétrons externos dos átomos que não participam participam da formação das ligações.
2.1. ABSORÇÃO POR COMPOSTOS ORGÂNICOS Nos compostos orgânicos, são possíveis quatro tipos de transições eletrônicas. Sendo elas classificadas como:
Transições σ → σ *: ocorrem nos hidrocarbonetos que possuem apenas ligações σ e elétrons ligantes. Ex.: Propano ( λ máx = 135 nm); •
Transições n → σ : ocorrem em compostos saturados contendo átomos com elétrons não-ligantes. Ex.: cloreto de metila ( λ máx = 173 nm); *
•
Transições n → σ *: são observadas em compostos contendo orbitais π e heteroátomo com elétrons não-ligantes; •
•
Transições π → π : compostos contendo grupo funcional insaturado. *
Estas duas últimas são as transições mais importantes para a espectroscopia UV/VIS UV/VIS dos compostos compostos orgânico orgânicos, s, pois o l máx apresenta-se normalmente nessa região, sendo que as transições π → π * apresentam absortividades molares muito maiores em relação às transições n → π *. 10
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2.2. ABSORÇÃO POR ESPÉCIES INORGÂNICAS Os compostos inorgânicos dos elementos dos blocos s e p apresentam bandas de absorção na região UV originadas das transições n → π*. A capacidade de absorção de muitos complexos se deve a um processo de transferência de carga. Nos complexos de transferência de carga, um dos componentes deve ter atuar como doador doador de elétron e o outro como receptor. A absorção relaciona-se relaciona-se com a transição de um elétron do doador para um orbital de maior energia do receptor. Assim, o estado excitado é produto de uma espécie de oxi-redução interna. No comple complexo xo [Fe(SC [Fe(SCN) N)6]3-, por por exem exempl plo, o, a abso absorç rção ão se rela relaci cion onaa com com a transição de um elétron do íon tiocianato a um orbital do íon Fe(III). A maiori maioriaa dos compl complexo exoss que aprese apresenta nta bandas bandas de transf transferê erênci nciaa de carga carga associadas a um íon metálico que atua com aceptor de elétrons. Uma exceção é o complexo de ferro(II) com o-fenantrolina, onde o ligante é o aceptor e íon metálico é o doador.
1. EQUI QUIPAM PAMENT ENTO Os instrume instrumentai ntaiss util utilizad izados os para medidas medidas de absorção absorção de radiaçã radiaçãoo UV/VIS UV/VIS incorporam usualmente os seguintes componentes: 11
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Uma fonte de radiação contínua; • Um dispositivo para separar (“monocromar”) as radiações contínuas; • Um recipiente para a amostra; • Um detector para converter a energia radiante em sinal elétrico; • Um mostrador ou registrador para apresentar o sinal elétrico. •
3.1. FONTES DE RADIAÇÃO As fontes fontes de radiaçã radiaçãoo util utilizad izadas as na espectro espectrofoto fotometr metria ia de absorção absorção UV/VIS UV/VIS podem ser:
Lâmpada com filamento de tungstênio t ungstênio: emite a maior parte da radiação no infravermelho, todavia, ela é usada para a região entre 320 e 2400 nm. A temperatura do filamento varia entre 2000 e 3000K. Para a lâmpada produzir radiação estável, é necess necessári árioo um rigoro rigoroso so contr controle ole da sua fonte fonte de alim aliment entaç ação ão atravé atravéss de circu circuit itos os reguladores. • Lâmpada de Tungstênio-Iodo : é uma lâmpada de tungstênio comum, contendo , em vez de vácuo, o iodo sublimado. Este tipo de fonte possui um vida útil duas vezes maior do que a de uma lâmpada comum devido a uma reação entre o tungstênio e o iodo. Com um invólucro de quartzo esta lâmpada pode operar de 200 a 3000 nm. • Lâmpada de descarga de hidrogênio ou deutério com janelas de quartzo: são as mais utilizadas como fontes de radiação UV. Quando se submete o gás hidrogênio ou deutério a uma descarga elétrica, produz-se um espectro contínuo na região UV, cobrindo a faixa de 180 η m, limite de transmissão do quartzo, até 380 nm. •
3.2. DISPOSITIVOS PARA SEPARAR OU RESOLVER RADIAÇÕES As radiações dentro do espectro contínuo podem ser separadas utilizando: Filtros óticos; • Monocromadores. •
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3.2.1. FILTROS ÓPTICOS São dispositivos que selecionam uma faixa espectral relativamente estreita da radiação contínua. Eles podem ser: filtros que isolam uma certa certa banda banda espectra espectrall Filtro de absorção : são filtros absorvend absorvendoo preferenc preferencialm ialmente ente radiaçõe radiaçõess dos demais demais comprime comprimentos ntos de onda. onda. Eles Eles possuem larguras efetivas de 30 a 50 hm e transmitância máximas que variam de 5 a 30 %; baseiam-s m-see na int interf erferê erênci nciaa constr construti utiva va e • Filtro Fil tro de inter interfer ferênc ência ia: baseia destrutiva que que ocorre durante a passagem passagem de um feixe policromático policromático pelo filtro. filtro. Eles permitem isolar bandas com larguras efetivas de 10 a 20 nm e transmitâncias transmitâncias máximas de 35 a 75%. •
3.2.2. MONOCROMADORES São dispositivos que servem para separar uma radiação policromática em linhas ou bandas espectrais muito estreitas. O sistema monocromador consiste nos seguintes componentes básicos: Uma fenda de entrada, que recebe a radiação contínua da fonte e fornece uma estreita imagem ótica; • Uma lente colimadora, que torna paralelos os raios propagados através da fenda de entrada; • Um elemento de dispersão (prisma ou rede de difração), que desdobra a radiação contínua; • Uma lente de focagem, para focalizar a radiação desdobrada em uma fenda de saída; • Uma fenda de saída, que isola a linha ou banda espectral de interesse. •
3.3. RECIPIENTES PARA AMOSTRAS Os recipientes usados nas medidas espectrofotométricas são denominados de cubetas. cubetas. Os instrumen instrumentos tos mais simples simples (fotômetr (fotômetros os ou coloríme colorímetros) tros) util utiliza izam m cubetas cubetas cilíndricas, que são mais baratas. Os espectrofotômetros utilizam normalmente cubetas retan retangul gulare aress com com percu percurso rso ópt óptic icoo de 1cm. 1cm. Todav Todavia, ia, encont encontra-s ra-se, e, comerc comercia ialme lmente nte,, cubetas com espessuras de 0,1cm até 10 cm. As cubetas são construídas de material transparente que deixa passar livremente a radiação na região espectral interessada.
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As cubetas devem ser alojadas em direções perpendiculares à direção do feixe, a fim de reduzir as perdas por reflexão.
3.4. TRANSDUTORES DE RADIAÇÃO Os dete detect ctor ores es de radi radiaç ação ão UV/V UV/VIS ISív ível el são são tran transd sdut utor ores es de entr entrad adaa que que convertem a energia radiante em sinal elétrico. Os detectores devem apresentar as seguintes características básicas: Responder à energia radiante dentro da faixa espectral; • Ser sensível para baixos níveis de potência radiante; • Ter resposta muito rápida; • Apresentar uma relação linear entre a potência radiante incidente e o sinal elétrico produzido. •
3.5. INSTRUMENTOS FOTOELÉTRICOS Uma classificação classificação dos instrumentos instrumentos fotoelétricos considera o tipo de dispositivo usado para selecionar a radiação eletromagnética para as medidas de transmitância ou absorbância. Assim: Quando o dispositivo é um filtro ótico denomina-se o instrumento de fotômetro, fotocolorímetro ou por operarem apenas no visível, colorímetro . Quando o dispositivo é um monocromador de prisma ou de rede de • difração denomina-se de espectrofotômetro . •
3.5.1. FOTÔMETRO OU FOTOCOLORÍMETRO São instr instrume umento ntoss simpl simples, es, barat baratos os e de fácil fácil manut manutenç enção. ão. Eles Eles são usados usados convenientemente sempre que não se requeiram faixas espectrais muito estreitas. Não cost costum umam am oper operar ar fora fora da regi região ão visí visíve vell e não não alca alcanç nçam am o grau grau de prec precis isão ão dos dos espectrofotômetros.
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Figura 5 - Fotômetro de chamas
3.5.2. ESPECTROFOTÔMETRO ESPECTROFOTÔMETROSS A principal limitação dos fotômetros é a resolução do feixe de radiação usada. Isto faz com que a lei de Lambert-Beer não seja seguida. Em geral, quanto melhor a qualidade de um monocromador mais versátil o espectrofotômetro e mais caros são os instrumentos.
Figura 6 - Espectrofotômetro
Os espectrofotômetros são construídos segundo modelos de feixe simples ou duplo duplo para para operar operar nas regiõ regiões es UV/VIS UV/VIS.. Os aparel aparelhos hos de feixe feixe simpl simples es são são usados usados normalmente para fins de análise quantitativa. Os de feixe duplo são úteis não só para análise quantitativa, mas também permitem traçar os espectros de absorção e ser usado na análise qualitativa. A figura abaixo mostra um esquema de um espectrofotômetro de feixe simples.
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Figura 7 – Esquema óptico de um espectrofotômetro de UV com feixe simples
A seguir encontra-se um esquema de espectrofotômetro de duplo-feixe:
Figura 8 - Esquema óptico de um espectrofotômetro de UV com duplo feixe
1. MANUSE MANUSEIO IO DA AMOSTR AMOSTRA A NO NO UV/V UV/VIS IS O espectro no UV/VIS de um composto é normalmente obtido em solução ou em fase vapor. Encontram-se disponíveis no comércio células de quartzo para determinação de espectros em fase vapor. Estas células são providas com entrada e saída para gás e 16
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possuem caminho óptico variável desde 0,1 mm até 100 mm. Algumas destas células permitem a circulação de um líquido que mantém constante a temperatura da célula. As células utilizadas na determinação de espectros em solução possuem um caminho óptico que varia de 1 cm até 10 cm. São de uso comum as células de quartzo de 1 cm, quadradas. Estas células requerem cerca de 3 mL de solução. Podem-se utilizar tamp tampas as que que redu reduze zem m o volu volume me e cami caminh nhoo ópti óptico co de 1 cm. cm. Po Pode demm-se se util utiliz izar ar microcélulas quando apenas uma quantidade pequena de soluço é disponível e, neste caso, aconselha-se o uso de condensador de feixe, de modo a minimizar a perda de energia. Ao preparar-se uma solução, pesa-se cuidadosamente a amostra e transfere-se para um balão volumétrico; completa-se o volume com solvente adequado. A partir dest destaa solu soluçã çãoo pode pode-s -see reti retira rarr alíq alíquo uota tass e dilu diluíí-la lass suce sucess ssiv ivam amen ente te,, conf confor orme me procedimento recomendado pelo método. É de máxima importância que as células estejam limpas. Costuma-se enxaguá-las várias vezes examiná-las quanto à absorção entre determinações sucessivas. Pode ser necessário limpar as células com detergente ou com ácido nítrico a quente para remoção de traços de amostras anteriores. Muitos solventes são utilizados na região do UV/VIS. Os mais comuns são o cicloexano, o etanol 95% e o 1,4-dioxano. O cicloexano deve ser isento de impurezas de aromátic aromáticos os ou olefinas olefinas,, o que é obti obtido do por percolaç percolação ão através através de silicage silicagell ativada, ativada, devend devendoo ser transp transpare arente nte até 210 nm. Os compo compost stos os aromát aromátic icos, os, em parti particul cular ar os polinucleares, são solúveis nestes solventes. O etanol 95% é geralmente uma boa escolha quando se necessita de um solvente mais polar. O solvente é geralmente usado na forma comercial, comercial, porém o etanol absoluto deve ser purificado, uma vez que contém traços do benzeno usado em sua preparação. Traços de benzeno podem ser removidos por cuidadosa destilação fracionada ou por cromatografia cromatografia de gás preparativa. O limite inferior de transparência transparência para o etanol ocorre próximo a 210 nm. O 1,4-dioxano pode ser purificado por destilação com sódio. A contaminação com benzeno pode ser removida pela adição de metanol, seguindo-se destilação para remover remover o azeótrop azeótropoo benzeno-m benzeno-meta etanol nol que se forma. forma. O 1,4-dioxa 1,4-dioxano no é transpare transparente nte a partir de 220 nm.
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Muitos Muitos solv solvent entes es de purez purezaa espec espectro troscó scópic picaa adequa adequada da para para o ult ultrav ravio iole leta ta encontram-se atualmente no mercado. Estes solventes são classificados como de “grau espectroscópico” e encontram-se livres da absorção devido a interferentes. Quando se planeja a utilização de um solvente deve-se levar em conta sua inércia em relação ao soluto. É possível detectar ocorrência de reações fotoquímicas pela variação da absorbância com o tempo, após exposição ao feixe de radiação UV do instrumento.
2. APLICAÇÕE APLICAÇÕESS DA ESPECTROS ESPECTROSCOPI COPIA A NA REGIÃO REGIÃO DO UV/VIS UV/VIS Como dito anteriormente, a espectrofotometria UV/VIS é um dos métodos analíti analíticos cos mais usados nas determi determinaçõ nações es analíti analíticas cas em diversas diversas áreas, áreas, sendo sendo esta técnica extremamente valiosa para a identificação dos grupos funcionais na molécula. Isso se deve ao fato dessa técnica ser aplicada para determinações de compostos tanto de caráter orgânico quanto de caráter inorgânico. As aplicações da espectroscopia de UV/VIS podem ser tanto em análises qualitativas, quanto em análises quantitativas.
5.1. APLICAÇÕES NA ANÁLISE QUALITATIVA A absorção de radiação UV por muitos compostos ocorre numa faixa muito reduzida de comprimento de onda, o que faz com que suas curvas se sobreponham, quase que impossibiltando sua identificação. A curva de absorção se encontra influenciada não só pelos grupamentos que contém elétrons capazes de absorver energia como também pelo resto da molécula. Em conseqüência, conseqüência, a absorção UV oferece menos possibilidades possibilidades para identificação identificação de grupos funcionais que outros métodos espectroscópicos como o IR e RMN. Mesmo assim, a espectroscopia UV é muito utilizada na identificação dos constituintes de diversas partes das plantas e na determinação de impurezas em amostra orgânica.
5.2. APLICAÇÕES NA ANÁLISE QUANTITATIVA Quanto as aplicações quantitativas, a espectroscopia de absorção UV, como as outras técnicas de absorção é regida pela lei de Lambert-Beer usando-se para cálculo das concentrações os mesmos procedimentos recomendados para o VIS. A maior parte dos equipamentos registra diretamente a leitura em absorbância, na prática, para fins
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quantitativos, quantitativos, empregam-se curvas analíticas. analíticas. Algumas das aplicações características da espectroscopia espectroscopia UV?VIS são as de determinações de: Compostos aromáticos polinucleares. 2. Produtos Produtos natur naturais ais como como ester esteróide óidess e clorof clorofila. ila. 3. Cora Corant ntes es e vita vitami mina nas. s. 4. Estab Estabil iliza izante ntess e antio antioxid xidant antes. es. 1. EXEMPLOS DE APLICAÇÕES ESPECTROSCOPIA ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO UV/VIS
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É bastante importante se ter uma base de toda a teoria por trás do método, assim como é importante saber interpretar seus dados. Também é fato que saber onde o método é aplicado é importante para nossos estudos como cientistas. Além disso ,algo ainda mais importante é saber não apenas onde e sim como o método é utilizado e o porqu porquê. ê. Logo Logo aqui aqui serão serão descri descrito toss algun algunss traba trabalho lhoss já reali realizad zados os para para mostra mostrarr as aplicações aplicações práticas do método de espectroscopia na região do UV/VIS.
6.1. 6.1. DESE DESENV NVOL OLVI VIME MENT NTO O E VALI VALIDA DAÇÃ ÇÃO O DE UM MÉTO MÉTODO DO ANALÍT ANALÍTICO ICO PARA PARA QUANTI QUANTIFIC FICAÇÃ AÇÃO O POR ESPECT ESPECTROS ROSCOP COPIA IA UV DE CAPTOPRIL EM COMPRIMIDOS DE LIBERAÇÃO PROLONGADA. Este Este traba trabalho lho foi reali realiza zado do na Unive Universi rsidad dadee Federa Federall de Santa Santa Catari Catarina na,, no Laboratório de Controle e Qualidade do Departamento de Ciências Farmacêuticas teve como foco verificar se o método do UV seria útil para tal fim. O Captopril é um fármaco de primeira escolha em casos de hipertensão arterial. Sua ação é eficiente (por isso sua escolha) porém de curto prazo. O medicamento se libera totalmente das capsulas em torno de 6 a 8 horas, fazendo com que o tratamento exija de 3 a 4 capsulas diariamente. A pesquisa maior na verdade é desenvolver uma formulação para uma liberação mais prolongada do fármaco ,porém este não é o foco deste trabalho.
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Figura 9 - Estrutura do Captopril (D-2-metil-3mercaptopropanol-L-prolina)
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Para a verificação do método foram feitas algumas formulações do comprimido como é mostrado na tabela abaixo. A partir desses comprimidos já feitos é que foram realizadas todas as medidas para a validação do método.
As medidas realizadas foram para determinar os parâmetros necessários para a validaçã validaçãoo de um método método analítico. analítico. São eles: robustez, robustez, especif especificid icidade, ade, linearida linearidade de e intervalo, exatidão e precisão. Destes ,o que mais será útil à primeira vista no espectro será a especificidade. Espe Especi cifi fici cida dade de de um méto método do é a capa capaci cida dade de que que este este poss possui ui de medi medir r exatamente um composto em presença de outros componentes. E isso foi verificado como mostra a figura abaixo.
É nitidamente visível que o método foi capaz de quantificar o fármaco mesmo na presença dos excipientes. Ainda pode-se verificar que por menor que fosse a diferença, ainda assim em 212nm ,onde é o pico de absorção máxima do Captopril, os excipientes não iriam interferir na leitura do espectro. 20
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Todos Todos os out outros ros parâm parâmetr etros os necess necessári ários os para para a vali validaç dação ão també também m foram foram validados, com isso é possível concluir que o método proposto para a quantificação do fármaco é muito útil, por sem simples ,rápido e barato.
6.2. AVALIAÇÃO DA UTILIZAÇÃO DA ESPECTROSCOPIA UV NA DETERMINAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS EM LEITE DE VACA Este Este trabal trabalho ho foi foi desen desenvol volvid vidoo na Unive Universi rsidad dadee Fernan Fernando do Pessoa Pessoa e visa visa determinar se o método é útil para tal fim sendo que a literatura aponta o HPLC como o melhor. É fato que a grande maioria dos alimentos que consumimos são industrializados e passam por complexos sistemas para que cheguem de uma forma segura em nossas casas. A com omeercia rcialliza ização da maior part partee dos aliment mentoos é pre precedid dida de um monitoramento monitoramento complexo para o controle e eliminação eliminação de substâncias substâncias nocivas. Estas Estas substân substâncias cias , designad designadas as antibió antibiótico ticoss , são necessária necessáriass para o combate combate a diversas diversas patologias que o animal pode passar ao homem. É fato a importância do leite no desenvolvimento dos seres mamíferos, como o homem. Porém o leite industrializado, mesmo passando por processos de esterilização necessários à nossa saúde, ainda trás substâncias em pequenas quantidades que podem ter um efeito não desejado em nosso organismo como estabilizantes,corantes, estabilizantes,corantes, fármacos, etc. Os medic medicame ament ntos os anti-i anti-infe nfecc ccios iosos os mais mais uti utili lizad zados os pelos pelos produt produtore oress são os antibiót antibióticos icos beta-lac beta-lactâmi tâmicos, cos, os aminoglu aminoglucosí cosídeos, deos, os macróli macrólidos dos e aparenta aparentados, dos, as tetr tetrac acic icli lina nas, s, o clor cloran anfe feni nico col, l, as quin quinol olon onas as,, as sulf sulfon onam amid idas, as, as asso associ ciaç açõe õess de antibióticos e associações com outros fármacos. Nesse estudo foram submetidos ao processo analítico os antibióticos Oxitetraciclina, Sulfamerazina e Cloranfenicol. A tabela abaixo mostra os medicamentos mais comuns de uso veterinário.
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Existe para cada medicamento desses um limite de segurança. Os antibióticos são administrados no animal para seu próprio bem e também para que não haja transmissão de doenças ao homem. Uma utilização incorreta dessas substâncias pode gerar resíduos potencialmente nocivos à saúde do animal e do homem que consome seus derivados. Vários métodos são utilizados na quantificação de antibióticos no leite de vaca, como CG, HPLC, CL, CL, ELISA, BIA, CG/EM, TLC TLC etc. A literatura literatura diz que o método método HPLC já tem sido utilizado com sucesso para tal fim há mais tempo. O método de espectroscopia de UV se mostrou rápido e sensível nas análises. Porém os dados obtidos para o índice de recuperação e o coeficiente de variação mostram que o método não é muito útil na determinação dos antibióticos sendo ainda melhor a utilização do HPLC.
6.3. PERFIL DE FÁRMACOS FÁRMACOS POR ESPECTROFOTO ESPECTROFOTOMETRI METRIA A NO ULTRAVIOLETA Os dois trabalhos anteriores foram escolhidos por terem uma relação muito útil no entendimento deste. Ambos tratam de determinação e quantificação de fármacos. Por isso são precedentes. Este trabalho realizado na Universidade Estadual de Maringá é de excepcional importância importância para a área da saúde pública. Intoxica Intoxicações ções por medicame medicamentos ntos alcançam alcançam o primeiro primeiro lugar lugar entre entre os agentes agentes tóxicos envolvidos em atendimento médico em serviços de urgência e emergência no Brasil, sendo muitos dos casos relacionados às tentativas de suicídio ou envolvendo crian crianças ças idoso idososs que se expus expusera eram m a doses doses acima acima da terap terapêut êutica ica,, result resultand andoo em concentrações tóxicas na corrente sangüínea. O diagnóstico pode ser realizado com o auxílio de exames complementares e análises específicas para determinação do agente tóxico. A triagem de fármacos é a mais freqüente dos testes toxicológicos solicitados, sendo o objetivo deste trabalho, analisar a utilização da espectrofotometria espectrofotometria de varredura na faixa ultravioleta para identificação de fármacos. Foram analisados os espectros de absorção ultravioleta de 4 fármacos de diferentes classes químicas. Os fármacos foram submetidos à varredura na faixa do ultravioleta e identificados os comprimentos de onda 22
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nos quais quais aprese apresent ntava avam m picos picos de absorb absorbânc ância ia máxim máxima. a. O proced procedime iment ntoo util utiliza izado do expl explor oraa a baix baixaa sele seleti tivi vida dade de do ultr ultrav avio iole leta ta,, perm permit itin indo do iden identi tifi fica carr grup grupos os de medicamentos medicamentos da mesma classe, que frequentemente apresentam o mesmo padrão de absorção, e que podem estar presentes no material biológico de forma rápida e simples, diminuindo o tempo de resposta do laboratório à solicitação médica. Estes fármacos tem um limite de detecção para sua análise no equipamento na faixa do ultra violeta. Estes limites estão na tabela abaixo.
A partir dos espectros obtidos no equipamento é feito o reconhecimento do fármaco por uma biblioteca já com os picos de absorbância conhecidos. Assim, já conhecendo a substância fica mais simples o tratamento. A seguinte tabela mostra como se identifica o fármaco através de seu pico máximo de absorbância.
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As análi análises ses espec espectro trofot fotomé ométri tricas cas fornec fornecera eram m o perfi perfill de 40 fármac fármacos. os. Fo Foii possível identificar identificar os picos de absorbância máxima nos seus respectivos respectivos comprimentos de onda na faixa do ultravioleta, bem como o limite de detecção para cada fármaco. Uma das maiore maioress vanta vantage gens ns da baixa baixa selet seletivi ivi-- dade dade da espec espectro trosco scopia pia UV é que compostos da mesma classe frequentemente apresentam o mesmo padrão de absorção; assim, substâncias não identificadas podem ser relacionadas a uma determinada classe com base em suas características características espectrais. A metodologia proposta é simples e rápida, requer instrumentação simples, evitando gastos ou consumo de tempo na análise e permite a identificação de grupos de medicamentos. Isso pode fornecer ao clínico um resultado positivo ou negativo em menor tempo facilitando assim a tomada de decisão clínica e contribuindo para o pronto restabelecimento do paciente. Após estes estudos pode-se estabelecer uma base de dados dos espectros de absorção de cada fármaco, formada por uma coletânea de dados das principais e mais relevantes substâncias, para que substâncias desconhecidas possam ser comparadas com propriedades de referência presentes na base de dados estabelecida. Com estes estes 3 exempl exemplos os foi possí possível vel verif verific icar ar a imp import ortânc ância ia do métod métodoo em algumas áreas. Por ser simples e barato, e também por apresentar uma excelente 24
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precisão em alguns casos, a Espectroscopia no Ultra Violeta é um método bastante utilizado na prática de análises.
1. CONCLUSÃO O dese desenv nvol olvi vime ment ntoo de um inst instru rume ment ntal al prec precis isoo e adeq adequa uado do para para um umaa determinada análise é uma questão de grande relevância no cenário atual, sendo esta uma das principais ocupações de pesquisadores que estão engajados na tarefa de isolar peque pequenas nas quant quantida idades des de compos composto toss orgân orgânico icoss e ino inorgâ rgânic nicos os a parti partirr de mi mistu sturas ras complexas e fazer sua identificação espectrofotométrica. Com base nisso, a espectroscopia na região do UV/VIS constitui um dos mais amplos amplos caminhos caminhos usados usados pelos pelos químicos químicos analític analíticos os para determi determinaçã naçãoo de espécie espéciess moleculares em solução. Apesar do espectro ultravioleta e visível nos fornecer informações limitadas sobre as estruturas químicas de uma substância, esta técnica é muito utilizada por possuir uma alta da sensibilidade de análise e do alto grau de precisão e exatidão em suas medidas, logo ela é empregada extensivamente em determinações quantitativas.
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