2. Pretreatment dan Ekstraksi 2.1. Penanganan Sampel dan Pretreatment Untuk mengetahui jumlah dan komposisi lignans perlu untuk memisahkannya dari matriks tanaman tersebut . Langkah-langkah kerja masing-masing melibatkan risiko kontaminasi, kehilangan sampel, dan reaksi tak terduga dari lignan. Meskipun demikian, metode metode preparat preparati, i, analiti analitis, s, dan peralat peralatan an yang tersedia tersedia,, telah telah bere!olu bere!olusi si saat ini, kemungk kemungkinan inan menerap menerapkan kan metode metode ekstraks ekstraksii dan pretrea pretreatmen tmentt yang lebih lebih aman aman dari dari sampel tanaman. Skema umum yang berlaku untuk lignan analisis bahan tanaman ditunjukkan pada gambar 2.
Gambar 2. Skema analisis umum untuk analisis dan isolasi lignans tanaman.
"nal "nalisi isiss bahan bahan tanam tanaman an ditun ditunjuk jukkan kan pada pada gamba gambarr 2. #ala #alam m prakte praktekny knya, a, peneliti biasanya harus memilih metode dan alat yang tersed tersedia ia di labor laborato atori riumn umnya. ya. Prose Prosedur dur sampli sampling, ng, penyi penyimp mpana anan n sampe sampel, l, dan prapra pera$atan sampel sangat penting untuk hasil analisis lignan. Misalnya, mendapatkan sampel kayu yang representati representati dari spesies pohon tertentu yang melibatkan melibatkan pertanyaan seperti tempat pertumbuhan, umur, karakteristik, dan kondisi isik pohon sampel, dan tinggi tinggi sampel. sampel. Sampel Sampel sebaiknya sebaiknya diletak diletakkan kan di ree%er ree%er segera setelah setelah pengambila pengambilan n sampel untuk menghindari reaksi yang tidak diinginkan seperti oksidasi, polimerisasi, dan reaksi en%imatik. &'i-dasi ekstraksi lipoilik juga dapat menyebabkan masalah di kemudian hari dalam analisis lignan. Pret Pretrea reatm tmen ents ts diper diperluk lukan an untuk untuk seba sebagia gian n besar besar sampel sampel tanam tanaman an sebel sebelum um ekstr ekstraks aksii penger pengering ingan, an, dan penggi penggili linga ngan n atau atau pengha penghan( n(ura uran. n. Untu Untuk k menghi menghinda ndari ri
oksidasi atau polimerisasi senya$a sensiti, disarankan menggunakan teknik pengeringan ringan seperti pengeringan beku atau, jika tidak tersedia, pengeringan pada suhu kamar. Penggilingan juga bisa menyebabkan reaksi yang tidak diinginkan karena suhu pada sumber lignan mungkin naik terlalu tinggi, peenambahan beberapa es kering murni bisa menghilangkan masalah ini. Sampel tanah atau serbuk lebih rentan terhadap oksidasi dan degradasi dan karenanya harus disimpan di tempat yang dingin, gelap, dan kering. 2.2. Pelarut dan Ekstraksi )ase Padat Ekstraksi so'hlet atau perkolasi dengan pelarut polar adalah metode tradisional untuk mengekstraksi lignans dari tanaman. *amun, ada ekstraksi yang kurang polar dalam sebagian besar jaringan tanaman dan mungkin mengganggu analisis lignan berikutnya, jika ekstraksi langsung dengan pelarut polar digunakan. &leh karena itu, dianjurkan untuk melakukan ekstraksi sekuensial dan pertama-tama lepaskan ikatan lipoilik senya$a dengan pelarut organik non-polar seperti heksana, pentana, petroleum eter, atau diklorometana. Ekstraksi hidroilik, termasuk lignan, selanjutnya dapat diekstraksi dengan pelarut polar seperti aseton, metanol, atau etanol dengan menambahkan +-1 air ke pelarut akan memudahkan penetrasi pelarut dan mempromosikan ekstraksi senya$a polar lebih banyak seperti lignan glikosida. Ekstraksi polienol, termasuk lignans dan lignan gly(o-sides, dari biji-bijian tertentu mungkin memerlukan (ampuran pelarut dengan jumlah air besar, seperti aseton berair , baru-baru ini digunakan untuk ekstraksi polienol dari sorgum. *amun, beberapa lignans memiliki polaritas rendah dan menengah dan akan diekstraksi dengan pelarut ekstraksi non-polar. /ampuran (om-ple', atau sejumlah besar lignan, atau, misalnya resin asam, juga bisa mempengaruhi kelarutan dan selektiitas senya$a terhadap pelarut non-polar. Ekstraksi langsung dengan solar !entilasi suhu panas atau ruang-suhu juga telah digunakan untuk ekstraksi lignans tanaman. 0al ini mungkin juga pendekatan yang tepat untuk lignans dengan polaritas rendah, tidak hanya mengandung satu gugus hidroksil bebas, karena ekstraksi selekti dari ekstraksi non-lignan lipoilik tidak mungkin terjadi. Metode yang sangat baik untuk ekstraksi pelarut lignans tanaman adalah per(epatan ekstraksi pelarut "SE, yang dilakukan pada suhu tinggi dan tekanan dan di ba$ah nitrogen atmoser inert. Metode ini memungkinkan (epat, otomatis, dan ekstraksi berurutan menggunakan !olume pelarut yang relati ke(il. Ekstraksi "SE baru-baru ini diterapkan untuk ekstraksi lignan dari berbagai spesies pohon. 3erutama, ekstrak yang kaya lignan. Lignan di beberapa bahan tanaman mungkin memerlukan pretreatment khusus sebelum ekstraksi dan analisis. Se(o diglu(oside S#4 di 5ndonesia biji rami Linumusitatissimum adalah (ontohnya, karena S#4 sebagai oligomer yang terkait dengan ester, atau bahkan polimer, yang terdiri dari S#4 dan asam hidroksimetil glutarat 0M4". 3urunan lignan oligomerik 6 polimerik ini mudah larut dalam metanol atau etanol berair, tapi basa hidrolisis selanjutnya diperlukan untuk melepaskan S#4 bebas. Selanjutnya, langkah hidrolisis asam tambahan harus ditambahkan jika "gly(one Se(o gratis diminati. 7eberapa analitis prosedur, termasuk berbagai langkah dan kombinasi hidrolisis en%y-mati(, a(idi(, dan alkaline, sebelum atau sesudah ekstraksi, telah dikembangkan untuk menganalisis S#4 dan Se(o dalam makanan dan
pakan. 0idrolisis sering juga dilakukan untuk mempermudah analisis kromatograi subsekuen dari ekstrak yang mengandung lignan glikosida terutama dalam proses teknis, seperti pulping dan pembuatan kertas, tapi juga sampel lingkungan dan untuk beberapa makanan. "plikasi, lignans dilarutkan ke dalam air, menurut Ekman dan 0olmbom ekstraksi lipoilik dari sampel air serat disaring jauh dari sumber pulp pertama kali diekstraksi dengan dietil eter, dan kemudian sebagian dari asa air yang mengandung lignan dikeringkan dan dianalisis dengan 4/. 8ekurangan metode ini yaitu, membutuhkan iltrasi untuk menghilangkan serat, yang mana bisa menjebak beberapa lignans dengan ainitas tinggi ke serat atau lainnya. 8emudian &rs9 dan 0olmbom menerbitkan metode sampling yang lebih baik ekstraksi dalam sampel air, yang men(akup sentriugasi, mengeluarkan serat dan partikel, mengatur p0 sampai ,+ dengan asam sulat en(er, dan ekstraksi dengan M37E sebanyak tiga kali sebelum analisis akhir dari gabungan M37E-ekstrak oleh 4/. Metode ini memungkinkan ekstraksi: ;+ lignans hadir dalam air sam-ples, namun kurang eekti untuk sesku dan dilignans. Penggunaan ekstraksi ase padat SPE telah diterapkan untuk analisis lignan dalam biji rami atau (airan biologis, dimana telah digunakan sebagai langkah pemurnian setelah hidrolisis alkali atau en%imatik dari ekstrak mentah atau untuk raksinasi oligomer dari ekstrak mentah yang tidak dihidrolisis. SPE juga telah digunakan untuk ekstraksi phe-nols dan polienol sederhana dari tanaman dan makanan. Ekstraksi (airan superkritis S)E adalah teknik ekstraksi yang menarik yang bisa memiliki beberapa kelebihan juga pada analisis lignan. Ekstraksi S)E dengan karbon dioksida bekerja dengan baik untuk lignans polaritas rendah sampai sedang seperti yang diperoleh dari S(hi%andra(hinensis, namun hanya untuk ekstraksi dari biji dan bukan dari daun. Meskipun demikian, penambahan dari metanol ke karbon dioksida dapat sangat meningkatkan eisiensi ekstraksi lignans tertentu. *amun, S)E adalah metode yang mudah digunakan untuk menghilangkan ekstraksi lipoilik misalnya dari biji rami sebelum ekstraksi lignan berikutnya.
2.. Persiapan Pemisahan dan 5solasi Lignan Murni Pengayaan dan pemisahan alami masing-masing lignan dalam bentuk murni sering dikehendaki untuk tujuan analisis. 7aru-baru ini penemuan bah$a pohon simpul dari beberapa jenis pohon mengandung sejumlah besar lignans agly(one bebas telah memberikan kesempatan untuk mengisolasi lignan murni, terutama dalam isolasi skala besar 0M< dari spesies (emara yang berbeda, karena 0M< bisa digunakan sebagai bahan a$al pembuatan lignans lainnya misalnya M<, =-hydro'y-Se(o, Lari, (Lari, E*L, E*#, =-o'o-M<, dan iso-0M<. Lignans murni yang diperoleh tidak hanya sebagai senya$a standar baru untuk tujuan analitik, tapi juga untuk biotesting. Prinsip dasar untuk mengisolasi lignans knot$ood yang berbeda adalah sebagai berikut> 8not$ood adalah terpe(ah, beku-kering, dan tanah. Setelah ekstraksi lipoilik menggunakan ekstraksi pelarut heksana, ekstraksi hidroilik diekstraksi dengan air, (ampuran aseton atau dengan etanol. Lignan murni kemudian bisa diperoleh kromatograi kilat pada kolom silika ase normal dan 6 atau oleh kristalisasi dari pelarut yang sesuai misalnya men(airkan 2-propanol, metanol, atau sikloheksana 6 etanol.
0M< juga dapat diendapkan dari larutan etanol dengan penambahan potasium asetat, hingga men(apai kemurnian ;-;+. 8romatograi kilat adalah metode yang mudah digunakan untuk isolasi prepigni dari lignan terpilih dari ekstrak kasar, berat sampel bisa jauh lebih besar dibandingkan dengan 0PL/. *amun, kondisi pemisahan dan pemurnian perlu diikutsertakan. #i(hloromethane dan etanol dalam rasio yang berbeda mis. #/M 6 Et&0 ;?> 2@ ;+> + telah bekerja dengan baik untuk lig-nans aglikon seperti 0M< dan juga untuk sesAuilignans. /ampuran pelarut yang sesuai dapat ditemukan dari per(obaan dengan kromatograi kolom dan 8L3, berbagai kombinasi dan aplikasi open-(olumn kromatograi, kromatograi (air kinerja sedang MPL/, semi preparati 0PL/, dan preparati 3L/ juga sudah terbiasa mengisolasi lignan. Sebagai (ontoh, &$en et al. lignans terisolasi dari minyak %aitun dengan preparati 3L/ diikuti dengan 0PL/ semi preparati. BillC atau dkk. 8ombinasi yang digunakan dari kromatograi lash kolom silika ase normal, MPL/ ase normal, dan ase terbalik kutub eter-linked enil dengan penutup akhir polar 0PL/ semi preparati ke mengisolasi beberapa sesAuilignans dan lignans dari pohon (emara simpul-kayu.lignans terrain dan sesAuilignans dari kayu hemlo(k barat dengan preparati 3L/ dan 0PL/ semi preparati pada ase normal dan ase terbalik kolom silika mengisolasi beberapa lignan dari tunas dan daun (emara hinoki menggunakan kolom kromatog-raphy dengan (ampuran pelarut yang berbeda> #/M 6 metanol, etil asetat 6 n-heksana, dan aseton 6 #/M, diikuti oleh 3L/ sama pelarut dan ase terbalik 0PL/ menggunakan elusi isokratik dengan asetonitril 6 air =>D, dipisahkan dan isomer 0M< terisolasi dari ekstrak 0M< kasar dengan 0PL/ ase terbalik prepara-ti!e menggunakan etanol atau metanol dan air. (ampuran.S#4 terisolasi dari ekstrak dari tepung biji rami yang dihilangkan dengan menggunakan kolom ase terbalik pertama metanol dan kemudian kolom silika ase normal (hloroorm 6 methanol 6 $ater 1> +> 1, sedangkan Pihla!a dkk menyarankan penggunaan langsung kolom ase balik dan elusi dengan alkohol seperti yang terlihat dari (ontoh di atas, pilihan bahan (ol-umn atau 8L3 untuk pemisahan lignan se(ara preparati tampaknya ase normal-ase atau ase terbalik
transormasi menjad -/oni" karena penumpukan alkalinitas selama pengeringan sampel. 0al ini juga diperkuat oleh Eklund dkk., menunjukkan bah$a 0M< mengalami beberapa transormasi di ba$ah dasar dan kondisi asam. Produk yang mungkin termasuk-/oni, /oni", 0M< a(id, dan isomer iso-0M<. 0M< juga bereaksi dengan berbagai nukleoil dalam kondisi asam dan dasar, menghasilkan produk seperti M<, dan =-metho'y-dan =-etho'y-M<, antara lain. Sebenarnya, 0M< sangat tidak stabil dalam larutan dan akan hilang hampir seluruhnya selama hidrolisis asam dan alkaline. Selanjutnya, transormasi ke /oni mungkin tanpa disadari karena kelarutannya -/oni dalam air rendah oleh karena itu mungkin akan mengendap dan menghilang untuk analisis berikutnya. 0M< juga mengalami transormasi oksidati paparan (ahaya. 8edua isomer 0M< dapat disamakan dan keduanya dioksidasi menjadi =-o'o-M< dan selanjutnya ber$arna, oligomer saat terkena iradiasi oleh (ahaya. "danya radikal bebas dalam larutan yang mengandung lig-nans dapat menyebabkan transormasi kimia yang tidak diinginkan, karena kebanyakan lignan dikenal sebagai penangkap radikal yang eekti. Lig-nans tidak bisa hanya membentuk aduk yang berbeda, tapi juga bisa menjalani dimerisasi dan reaksi radikal mungkin tidak diketahui. Meskipun kinetika reaksi relati lambat, risiko ini harus dijaga selama pengolahan sampel dan analisis. Se(o sebagian dapat berubah menjadi Se(o-a(etonide selama kromatograi kol-umn dengan aseton pada silika sedikit asam. "rteak serupa, yaitu a(etonides dari Se(o, (Lari, dan isota'iresinol juga dilaporkan oleh Fang et al.setelah isolasi senya$a enolik dari3a'usmairei. 8ondisi asam juga bisa memba$a arteak seperti anhydro-Se(o dan anhydro-(Lari dengan menghilangkan molekul air dari struktur diol, seperti yang ditunjukkan pada eter guaia(ylgly(eryl lignan ini. "nhydro-Se(o juga merupakan arteak yang diproduksi pada hidrolisis asam S#4, sejauh ini dilaporkan terjadi se(ara alami hanya disimpul kayu abies amabilis, bisa ditransormasikan ke Lari dan (Lari oleh reaksi siklisasi intramolekuler yang dikatalisis asam. Lari juga akan mengatur lebih lanjut ke (Lari kondisi asam yang lebih kuat. "njaeyulu dkk membahas apaka lignan metil dan etil arboreal adalah produk alami dari "rteak 4melina arboreaor terbentuk selama proses ekstraksi. Mereka menyimpulkan bah$a lignan ini pasti terjadi se(ara alami. Sililasi sebelum analisis dengan 4/ biasanya (ukup lurus untuk lingkungan, namun hidroksil yang terhambat se(ara sterik, seperti gugus ?-&0 dalam - - *34, dapat menghasilkan hanya sebagian senya$a sililasi, yang bisa menyebabkan kebingungan. "rteak sililasi lain yang mungkin adalah (y(lisation dari Lari ke (Lari oleh $aktu, yang mungkin jatuh tempo untuk pembentukan asam hidroklorida dalam sampel sililasi #ianjurkan sampel sililasi harus dianalisis di dalam 12 h untuk menghindari degradasi senya$a sililasi.
#apus> G.M. "$ika, L.B.
