Recuento en placa de microorganismos que NO requieren confirmación de colonias Obtención y Expresión de Resultados A. Introducción Este ejercicio tiene como finalidad conocer la expresión de resultados de los análisis de alimentos según la Norma ISO7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes microbiológicos. Esta norma ISO define como debe hacerse el cálculo y expresión de resultados: - cuando el método de análisis utilizado es un método de recuento en placa en el que no se requiere confirmación de colonias. Por ejemplo: Recuento de aerobios mesófilos totales, Recuento de hongos filamentosos y levaduras, etc. - cuando el método de análisis utilizado es un método de recuento en placa en el que si se requiere confirmación de colonias. Por ejemplo: Recuento de Enterobacteriaceae totales A continuación tratamos el primer caso, es decir, cálculo y expresión de resultados en los métodos de recuento en placa en el que no se requiere confirmación de colonias. B. Cálculo y expresión de los resultados obtenidos en los métodos de recuento en placa sin identificación posterior. En este apartado se explica cómo deben hacerse los cálculos en los métodos de recuento en placa en los casos generales los que no debemos hacer identificación/comprobación de las colonias sospechosas. Cálculo de resultados Seleccionar las placas de dos diluciones sucesivas donde al menos, una placa de las seleccionadas, contenga un mínimo de 15 colonias. Ejemplo: tenemos los siguientes resultados.
Seleccionaremos dos diluciones consecutivas, en este caso las diluciones 10-2 y 10-3 Contar las colonias de las placas seleccionadas.
1
Calcular el número de Unidades Formadoras de Colonias por gramo o mililitro, según la siguiente expresión:
Donde:
Sumar todas las colonias contadas en todas las placas seleccionadas para el recuento:
En este ejemplo, se seleccionó para el recuento las diluciones 10-2 y 10-3 El C, será: 235 + 220 + 25 + 28 = 508 El volumen del inoculo aplicado a cada placa depende del método de siembra utilizado:
Siembra mediante homogenización en masa: 1mL
Siembra mediante extensión en superficie: 0,1mL
El número de placas seleccionado, siguiendo con el ejemplo, será n1 = 2 y n2 = 2, porque he seleccionado dos placas de cada dilución. El nivel de dilución depende de las diluciones que hayamos seleccionado para contar y será: 2
d=1, cuando la dilución menor seleccionada para el recuento se trata de muestra sin diluir (sólo para productos líquidos) d=10-1, cuando la dilución menor seleccionada para el recuento sea la primera dilución, dilución 1/10 ó 10-1 d=10-2, cuando la dilución menor seleccionada para el recuento sea la segunda dilución, dilución 1/100 ó 10-2
Y así sucesivamente. Redondeo a dos cifras significativas Los resultados obtenidos mediante la fórmula se han de redondear a dos cifras significativas: - Si la última cifra es inferior a 5, la cifra precedente no se modifica. - Si la última cifra es superior o igual a 5, la cifra precedente será aumentada una unidad. Proceder de esta forma secuencialmente con todas las cifras del número obtenido hasta que se obtengan dos cifras significativas. Por ejemplo, si el número obtenido es: 123.756 Redondeo: 123.760 123.800 124.000 120.000 Expresión de resultados Expresar el número de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) por mililitro (en productos líquidos) o por gramo (en el resto de productos), expresado como un número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada, es decir un entero y un decimal multiplicado por la potencia de 10. Por ejemplo, si el redondeo obtenido es: 120.000 Expresión de resultados: 1,2 x 105 Recuento en placa de microorganismos que NO requieren confirmación de colonias Obtención y Expresión de Resultados Ejercicios de aplicación 3
Ejercicio 1: Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante siembra por homogenización en masa de microorganismos en una muestra de carne picada. El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
Preguntas 1. En este caso, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g: a) Dilución 10-2 y 10-3 b) Dilución 10-3 y 10-4 2. Utilizando la siguiente expresión, el resultado obtenido es:
c) 18.636,3 UFC/g d) 190.000 UFC/g 3. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/g como: a) 1,9 x 104 UFC/g b) 1,9 x 105 UFC/g Ejercicio 2: Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante siembra por extensión en superficie de microorganismos en una muestra de queso fresco. El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
Preguntas 1. En este caso, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g: a) Dilución 10-1 y 10-2 4
b) Dilución 10-2 y 10-3 2.
Utilizando
la
siguiente
expresión,
el
resultado
obtenido
es:
a) 26.323 UFC/g b) 24.636 UFC/g 3. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/g como: a) 2,5 x 104 UFC/g b) 2,4 x 104 UFC/g
Ejercicio 3: Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante siembra por homogenización en masa de microorganismos en una muestra de agua embotellada. El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
Preguntas 1. En este caso, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g: a) Dilución 10-1 y 10-2 b) Dilución 10-2 y 10-3 2. Utilizando la siguiente expresión, el resultado obtenido es:
a) 1500 UFC/g b) 1427 UFC/g 3. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/g como:
5
a) 1,4 x 103 UFC/g b) 1,4 x 102 UFC/g Ejercicio 4: Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante siembra por extensión en superficie de microorganismos en una muestra de agua embotellada. El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
Preguntas 1. En este caso, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g: a) Muestra sin diluir y dilución 10-1 b) Dilución 10-2 y 10-3 2. Utilizando la siguiente expresión, el resultado obtenido es:
a) 445,4 UFC/g b) 445,8 UFC/g 3. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/g como: a) 4,5 x 102 UFC/g b) 5,5 x 102 UFC/g
Ejercicio 5: Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante siembra por extensión en superficie de microorganismos en una muestra de queso fresco. El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es: Pregunt as 1.
En 6
este caso, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g: a) Dilución 10-1 y 10-2 b) Dilución 10-2 y 10-3 2. Utilizando el cálculo adecuado, el resultado obtenido es: a) 4772,7 UFC/g b) 477,2 UFC/g 3. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/g como: a) 4,8 x 103 UFC/g b) 4,8 x 102 UFC/g Ejercicio 6: Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante siembra por extensión en superficie de microorganismos en una muestra agua embotellada. El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
Preguntas 4. En este caso, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g: a) Dilución 10-1 y 10-2 b) Dilución 10-2 y 10-3 5. Utilizando la siguiente expresión, el resultado obtenido es: a) 15.923 UFC/g b) 15.727 UFC/g 6. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/g como: a) 1,6 x 104 UFC/g b) 2 x 105 UFC/g
7
Recuentos en placa de microorganismos que requieren identificación Obtención y expresión de resultados A. Introducción El presente ejercicio tiene como finalidad conocer la expresión de resultados de los análisis de alimentos según la Norma ISO7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes microbiológicos. El ejercicio está formado por unos ejemplos que muestran la manera de realizar la expresión de resultados, según las Normas ISO, en los métodos de recuento en placa en los que se requiere confirmación/identificación de colonias. Por ejemplo: Recuento de Staphylococcus coagulasa positiva, Listeria monocytogenes, etc. B. Cálculo y expresión de los resultados obtenidos, en los métodos de recuento en placa con identificación. En este apartado se explica cómo deben hacerse los cálculos en los métodos de recuento en placa en los casos en los que debemos hacer identificación/comprobación de las colonias sospechosas. Cálculo de resultados Seleccionar las placas de dos diluciones sucesivas donde al menos, una placa de las seleccionadas, contenga un mínimo de 15 colonias características o sospechosas. Ejemplo, tenemos los siguientes resultados:
Seleccionaremos dos diluciones consecutivas, en este caso las diluciones 10-2 y 10-3. Contar las colonias sospechosas de las placas seleccionadas. A partir de los resultados de la identificación, calcular el número de colonias identificadas, según la siguiente expresión:
8
Donde: b: número de colonias que responden a los criterios de identificación. C: número total de colonias por placa (antes de identificación). A: número de colonias características que se re siembran (en general A = 5 en método de referencia y A = 3 en método de rutina). El número de colonias características que se re siembran o se confirman, generalmente es 5 (A = 5). El número de colonias que responden a los criterios de identificación es, por ejemplo: Si para confirmar las Enterobacterias deben realizarse la prueba de la oxidasa y el resultado característico de este tipo de microorganismos es que son oxidasa negativo. El número de colonias que responden a los criterios de identificación serán el número de colonias resembradas que dan como resultado oxidasa negativo. Sumar todas las colonias contadas en todas las placas seleccionadas para el recuento,
En este ejemplo, se seleccionó para el recuento las diluciones 10-2 y 10-3 El C, será: 235 + 220 + 25 + 28 = 508 Siguiendo con el ejemplo, Confirmo 5 colonias; A=5 Solamente 4 son oxidasa negativas; b=4 a = 508 Aplicando la expresión citada, El a= (4/5) x 508 = 406,4 El resultado de las colonias calculadas después de la identificación, a = 406,4
9
Calcular el número de Unidades Formadoras de Colonias por gramo o mililitro, según la siguiente expresión:
Esta fórmula es similar a la de la expresión de resultados del ejercicio anterior sustituyendo la suma de colonias contadas en todas las placas por la suma de colonias calculadas después de la identificación. Recordamos: El volumen del inoculo aplicado a cada placa depende del método de siembra utilizado:
Siembra mediante homogenización en masa: 1mL Siembra mediante extensión en superficie: 0,1mL
El número de placas seleccionado, siguiendo con el ejemplo, será n1 = 2 y n2 = 2, porque he seleccionado dos placas de cada dilución. El nivel de dilución depende de las diluciones que hayamos seleccionado para contar y será:
d=1, cuando la dilución menor seleccionada para el recuento se trata de muestra sin diluir (sólo para productos líquidos) d=10-1, cuando la dilución menor seleccionada para el recuento sea la primera dilución, dilución 1/10 ó 10-1 d=10-2, cuando la dilución menor seleccionada para el recuento sea la segunda dilución, dilución 1/100 ó 10-2
Y así sucesivamente. Redondeo a dos cifras significativas Los resultados obtenidos mediante la fórmula se han de redondear a dos cifras significativas: - Si la última cifra es inferior a 5, la cifra precedente no se modifica. - Si la última cifra es superior o igual a 5, la cifra precedente será aumentada una unidad. Proceder de esta forma secuencialmente con todas las cifras del número obtenido hasta que se obtengan dos cifras significativas.
10
Por ejemplo, si el número obtenido es: 123.756 Redondeo: 123.760 123.800 124.000 120.000 Expresión de resultados Expresar el número de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) por mililitro (en productos líquidos) o por gramo (en el resto de productos), expresado como un número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada, es decir un entero y un decimal multiplicado por la potencia de 10. Por ejemplo, si el redondeo obtenido es: 120.000 Expresión de resultados: 1,2 x 105
11
Recuentos en placa de microorganismos que requieren identificación Obtención y expresión de resultados Ejercicios de aplicación Ejercicio 1: Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante siembra por homogenización en masa de microorganismos en una muestra de carne picada, donde debemos confirmar si las colonias son glucosa positivas. El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
1. En este caso, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g: a) Dilución 10-2 y 10-3 b) Dilución 10-3 y 10-4 2. La suma de todas las colonias contadas en todas las placas seleccionadas para el recuento es: a) 353 b) 34 3. Utilizando la siguiente expresión:
El resultado de las colonias calculadas después de la identificación, si resembramos 5 colonias y sólo 3 son glucosa positivas es: a) 211,8 b) 588,3 4. Utilizando la expresión adecuada, El resultado de las UFC/g es: a) 9627,2 b) 2578,9 12
5. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/g como: a) 2,6 x 105 UFC/g b) 9,6 x 103 UFC/g Ejercicio 2: Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante siembra por extensión en superficie de microorganismos en una muestra de queso fresco , donde debemos confirmar si las colonias sospechosas son catalasa positivas. El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
Conteste las siguientes preguntas: 1. En este caso, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g: c) Dilución 10-1 y 10-2 d) Dilución 10-2 y 10-3 2. La suma de todas las colonias contadas en todas las placas seleccionadas para el recuento es: a) 98 b) 87 3. El resultado de las colonias calculadas después de la identificación, si resembramos 5 colonias y sólo 2 son catalasa positivas: a) 39,2 b) 34,8 4. Utilizando la expresión adecuada, El resultado de las UFC/g es: a) 1781,8 UFC/g b) 1581,8 UFC/g 5. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/g como: a) 1,8 x 103 UFC/g b) 1,6 x 103 UFC/g 13
Ejercicio 3: Cálculo y expresión de resultados en un recuento en placa mediante siembra por homogenización en masa de microorganismos en una muestra de agua embotellada , donde debemos confirmar si las colonias son lactosa positivas. El número de colonias contadas en cada una de las diluciones sembradas es:
Conteste las siguientes preguntas: 6. En este caso, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g: a) Dilución 10-1 y 10-2 b) Dilución 10-2 y 10-3 7. La suma de todas las colonias contadas en todas las placas seleccionadas para el recuento es: a) 112 b) 125 8. El resultado de las colonias calculadas después de la identificación, si resembramos 5 colonias y las 5 son catalasa positivas: a) 125 b) 120 9. Utilizando la expresión adecuada, El resultado de las UFC/g es: a) 568,1 UFC/g b) 509 UFC/g 10. Después de redondear, expresaremos el número de UFC/g como: a) 5,7 x 102 UFC/g b) 5,1 x 103 UFC/g
14
