PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES EXTRACCIÓN DE VITAMINA E: 1. EXTRACCIÓN DE ACEITES DE LAS ALMENDRAS: 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.
Materiales y Reactivos: 1. Almendras dulces; 2. Hexano 3. Agua destilada; 4. Acetona 5. Ácido acético 6. Vaso Precipitado 200 mL, 100 mL 7. Espátula 8. Escobilla 9. Mortero y pistilo 1.1 Molienda de las Almendras:
Vidrio reloj Pipeta aforada de 10 mL, 5 mL Pipeta Graduada de10 mL, 5 mL Balón fondo plano Pinzas para Balón Erlenmeyer 250 mL Equipo destilación simple Equipo Soxleth Bomba de vacio Capsula de porcelana
Vaso Precipitado
Adicionar Almendras + 100 mL de H2O a 80°C Dejar en remojo durante 15 min. Secar y pelar Moler y obtener extracto.
Tomado de: Hernández, S.; Zacconi, F. 2009.
1.2 Extracción del aceite de almendras a temperatura ambiente: Erlenmeyer Masar 15 g de Almendras molidas + 20 mL Hexano
Agitación magnética. 15 min Filtrar al vacío
Lavar sólido con 10 mL hexano
Extracto- Trasvasar a un Balón previamente masado
Tomado de: Hernández, S.; Zacconi, F. 2009 Realizar destilación Masar aceite obtenido ɗ: 0,92 g/cm3
1.3 Extracción del aceite de almendras a reflujo: Balón Plano Balón Fondo Fondo Plano
Masar 15 g de Almendras molidas + 20 mL Hexano
Conectar Refrigerante
Calentar Baño María
Reflujo disolventeHexano P.ebll: 69 °CDurante 15 min.
Suspender agitación y calentamiento
Dejar enfriar
Filtrar almendras
Lavar sólido con 10 mL hexano
Extracto- Trasvasar a un Balón previamente masado
Realizar destilación
Masar aceite obtenido ɗ: 0,92 g/cm3
Tomado de: Hernández, S.; Zacconi, F. 2009
2. MATERIALES Y MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE VITAMINA E: Materiales y reactivos (+) δ-tocoferol (90%) (+) γ-tocoferol (99%) (+) α-tocoferol (67%) Estigmasterol (95%) β-sitosterol (90%)
Disolventes: hexano metanol acetona 2-propanol)
Las soluciones de trabajo para la cuantificación de vitamina E son de 1000 ppm para TOCOFEROL Y FITOSTEROL, estas se preparan en hexano grado HPLC. Posteriormente se hacen soluciones más diluidas para ser utilizadas durante los ensayos experimentales en el mismo disolvente. 2.1 Preparación de la muestra: extracción en fase sólida (SPE) La materia insaponificable del aceite se separa de la fracción total de lípidos por un cartucho 2-OH de 3 cc, que fue previamente acondicionado con cinco ml de hexano. A 400 mg de aceite de almendras crudas de la muestra, ya sea enriquecida con los analitos, se disolvió en cinco ml de hexano, pasado a través del cartucho y, a continuación, se eluyó a sequedad. La fracción de hexano se pierde. La elución de los analitos retenidos en el cartucho son llevados con 3 ml de metanol seguido de una evaporación total del disolvente bajo corriente de nitrógeno. Por último, el residuo se reconstituyó a un volumen de 1 ml con 2-propanol. Esta muestra se encapsula en virtud corriente de nitrógeno y protegido de la luz para su posterior análisis cromatográfico. 2.2 Análisis cromatográfico HPLC (Correa, S.; Busto, O.; Guasch, J.) Los tocoferoles y fitoesteroles se separaron en una columna de HPLC C18 Luna, 250mm x 4.60mm i.d., 5 μm tamaño partícula, utilizando una fase móvil de 85% de metanol y 15% de acetona en condiciones isocráticas con una velocidad de flujo de 1 ml min-1. La determinación se realiza con 20 μl de la muestra a 20 ºC y se detectan los analitos a una longitud de onda de 208 nm. Todos los analitos se eluyeron en menos de 20 minutos. Se realizaron inyecciones por triplicado para cada muestra. 2.2.1
Validación del Método:
Las curvas de calibración
Las curvas de calibración se construyeron utilizando cinco concentraciones y tres repeticiones por cada uno. El nivel de las concentraciones utilizadas fue: 0 a 40 ppm en 2-propanol para α-tocoferol, δ-tocoferol y γ-tocoferol 0-200 ppm en 2-propanol para estigmasterol y sitosterol.
Método de adición estándar
El procedimiento de adición estándar se utilizó para la cuantificación de tocoferol y contenido de fitosteroles en aceite de almendras. Cinco niveles de concentraciones se dispararon a una solución compuesta de 400 mg de aceite de almendras se disolvió en 5 ml de hexano. Los niveles de concentración de la adición de esta solución fueron 1-10 ppm para la α-tocoferol δtocoferol y γ-tocoferol, y de, 10 a 50 ppm y para estigmasterol y β-sitosterol. Con el fin de trazar las líneas de calibración, tres repeticiones de cada nivel de concentración fueron preparadas. Efecto Matrix Efecto de la matriz se determinó mediante la comparación de la pendiente de las curvas representa con método del estándar externo y el método de adición de patrón con el ULC Software (univariante lineal de calibración), al nivel de significación 0,05% por cada compuesto a analizar La Curva de calibración estándar externa, así como las curvas de adición de patrón se trazan para cada analito estudiado. La pendiente y la intersección de cada curva se calculan por regresión lineal de mínimos cuadrados, con el coeficiente de determinación (R2) Y el error estándar de los coeficientes se determinó.
Recuperación del proceso de extracción
Debido a la falta de tocoferol libre y aceites de fitosterol y la evidencia de efecto de la matriz, la recuperación del proceso de extracción se calculó utilizando una comparación de las áreas de los picos en lugar de concentraciones, como se describe a continuación. El estudio de la recuperación fue desarrollado en cuatro niveles de concentración y tres réplicas cada uno, siguiendo el método de adición estándar con una menor modificación. Los niveles de concentración de la adición de unos 400 mg de aceite de almendras en cinco ml de solución de hexano fueron 3-10 ppm para el α-tocoferol, δ-tocoferol y γ-tocoferol, y, 10 a 50 ppm para el estigmasterol y β-sitosterol. En primer lugar, cada conjunto de réplicas se añadieron a cada nivel de concentración después de que se habían sometido a una técnica de extracción en fase sólida. Las áreas del pico obtenido para cada analito se llama A1. Luego, fue otro conjunto de réplicas enriquecida para cada nivel de concentración antes de que se sometió a la extracción proceso. Las áreas del pico obtenido para cada analito, en este caso, eran denominado A2. Por último, la tasa de recuperación (%) para el proceso de extracción para cada nivel de concentración se calculó usando la siguiente fórmula: % Recuperación de SPE = (A2 / A1) x 100
de la concentraciones preparadas
Límites de detección y cuantificación
La detección instrumental y límites de cuantificación se calcularon a partir de la cantidad de cada analito requerida para proporcionar una relación señal-ruido de 3 y 10, respectivamente. Estos límites se calcularon utilizando soluciones de trabajo diluidas en 2 - propanol de cada tocoferol y fitosterol analizados.
2.3 Análisis Cromatográfico de Gases (GC): Reactivos
Solución derivantizante: Disolver 1 ml de la solución comercial de N-metil-bis trifluoroacetamida (BSTFA) con Trimetil clorosilano (TMCS) (99:1) en un 1 ml de pyridina anhidra. Agitar en un vórtex.
Solución de pyrogallol al 3% en etanol absoluto (grado HPLC)
Solución etanólica de dihidrocolesterol (DHC), que es el patrón interno, aproximadamente a 250 ppm.
Solución Hexano/Acetato de etilo (90:10, v/v)
Solución acuosa de KOH saturada.
Hexano HPLC
Solución Etanol/Eter (50:25:25 v/v/v)
Agua milliQ
Metodología para Fitoesteroles libres por GC: 300 mg Aceite Almendras Adicionar 50 μl de sln etanólica de DHC-250 ppm + 8 ml de una sln etanólica de Pyrogallol al 3% y 0.5 ml de una sln acuosa de
KOH saturada. Agitar vortéx Baño maría a 80°C30 min
Enfriar a T- ambiente
etílico/Hexano
4. Se extrae totalmente la fracción insaponificable (fase orgánica) lavando con 12 ml de agua milliQ, y 10 ml de hexano. Se agita por 5 minutos y se espera a que se separen las fases. Se repite el lavado con hexano dos veces más. 5. El extracto que contiene la fracción insaponificable se lleva a sequedad con una corriente con nitrógeno. 6. Se derivatizan los analitos con 250 μl de la solución derivatizante. Se agitan por 30 segundos en el vórtex y se colocan en un baño de agua a 70ºC por 30 min. 7. Se analiza 1μl de la solución derivatizada por GC-FID a las siguientes condiciones: Rampa de temperatura: 40ºC/min Temperatura final: 270ºC por 40 minutos Temperatura del inyector: 250 ºC
Flujo de helio: 1 ml/min Presión de la columna: 7 psi o 50 kPa
Temperatura del detector: 300 ºC Metodología para Fitoesteroles libres por GC (Cunha et al) 1. Se pesan en balanza analítica aproximadamente 300 mg de aceite de frutos secos y se disuelven en 1 ml de una solución de Hexano /Acetato de etilo (90:10, v/v). 2. La solución se carga en un cartucho de SPE de silica de 6 mg que previamente fue acondicionado con 5 ml de Hexano. 3. Una vez cargada la muestra, se agregan 2.5 ml de la solución de Hexano/Acetato de etilo (90:10, v/v) y se guarda la fracción (fracción de fitoesteroles esterificados). 4. A continuación se lava el cartucho con 5 ml de la solución de Hexano/Acetato de etilo (90:10, v/v) seguido de 3 lavados de 5ml de una solución de Etanol/Eter etílico/Hexano (50:25:25 v/v/v). Todos los eluyentes se recogen. (fracción de fitoesteroles libres) BIBLIOGRAFIA:
Correa, S.; Busto, O.;. Guasch, J. (2007) Simultaneous quantification of phytosterols and tocopherols in almond oil by reversed-phase high-performance liquid chromatograpy. Grupo de Química Analítica y Alimentos (Unitat d’Enologia del CeRTA), Universitat Rovira i Virgili. Tarragona España. C.M. López-Ortiz et al. (2008). Comparative study of tocopherol homologue content in four almond oil cultivars during two consecutive years . Journal of Food Composition and Analysis N°21, 144– 151. Hernández, S.; Zacconi,F. (2009). Aceite de almendras dulces: extracción, caracterización y aplicación. Instituto de Investigaciones en Química, Universidad Nacional del Sur- Revista Nova vol.32 N°5.
