Prinsip PCR adalah penggunaan penggunaan polimerase termostabil termostabil (Taq polymerase) selama beberapa siklus. Dimana ada 3 langkah langkah utama yang dilakukan pada setiap siklus tersebut. Adapun langkah tersebut adalah sebagai berikut : 1. Dena Denatu tura rasi si
Dengan Dengan terjadi terjadinya nya denatura denaturasi si yang yang dilakuka dilakukan n pada pada tempera temperatur tur 94°C selama selama 30-60 30-60 detik detik dari dari untaian untaian ganda ganda DNA ( double double – stranded DNA) sehingga sequence target akan muncul. 1. Anne Anneal alin ing g
Pending Pendinginan inan yang yang dilakuka dilakukan n pada pada tempera temperatur tur 45-60°C 45-60°C selama selama 60-120 60-120 detik detik pada pada setiap setiap siklus siklus memungki memungkinka nkan n primer primer untuk untuk melekat pada target. 1. Exte Extens nsio ion n
Sintesis DNA komplementer baru oleh enzim polimerase dilakukan pada temperatur 72°C selama 60-120 detik sehingga terbentuk kembali DNA rantai ganda .
Dimana Dimana setiap setiap siklus siklus tersebut tersebut memperb memperbanya anyak k dua kali jumlah jumlah DNA dan siklus tersebut tersebut diulang 20-35 kali. kali. Sehingga Sehingga pada akhir PCR akan diperoleh amplifikasi sebanyak 106 –109 kali dari jumlah DNA target target awal. Kemudian produk produk amplifikasi tersebut dibaca pada gel elektroferesis. Reaksi amplifikasi ini demikian sensitif sehingga kurang dari 10 molekul DNA target dapat memberi memberi sinyal positif. Untuk mencegah kontaminasi kontaminasi aerosol dari hasil amplifikasi spesimen lain yang dapat menyebabkan menyebabkan hasil positif palsu maka di dalam disertakan enzim Uracil N-Glycosylate (UNG) yang mengenali dan mengkatalisa destruksi DNA yang mengandung urasil tidak terdapat dalam DNA kuman tetapi ada dalam amplikon karena reagen PCR menggunakan urasil. Amplikon yang mugkin terbawa akan dihancurkan dihancurkan terlebih dahulu oleh UNG sehingga tidak ikut proses amplifikasi, dengan demikian mengurangi salah satu kemungkinan kemungkinan hasil positif palsu. Adanya kontrol negatif pada pemeriksaan pemeriksaan mengurangi mengurangi kemungkinan kemungkinan kontaminasi, maka semua peralatan dan perlengkapan laboratorium harus dibersihkan secara teratur dan menggunakan perlengkapan habis pakai. Pada hasil biakan negatif, PCR dapat memberikan memberikan hasil positif. Hal ini kemungkinan karena kuman specimen terlalu sedikit untuk dapat tumbuh dalam biakan atau respon imun penderita yang menyebabkan kuman tak dapat tumbuh. Sedangkan hasil negatif palsu dapat diakibatkan diakibatkan karena specimen tidak mengandung DNA kuman M. tuberkulosis. walaupun berasal dari penderita TB atau kemungkinan dapat disebabkan disebabkan karena kesalahan teknis. Untuk menghindari kemungkinan ini, maka pada setiap pemeriksaan disertakan kontrol positif yang mengand mengandung ung DNA kuman kuman M. tuberku tuberkulosis. losis. Upaya Upaya lain adalah adalah menghila menghilangka ngkan n inhibito inhibitorr yang yang berpoten berpotensi si dapat dapat menurunk menurunkan an sensitivitas PCR.
Pemeriksaan PCR telah dilakukan di beberapa laboratorium dengan target IS 6110. Dimana waktu yang diperlukan antara 24-36 jam. Sensitivitas PCR di dalam penegakan diagnosis efusi pleura tuberkulosis tuberkulosis sekitar 20-81%. PCR positif 100% pada kultur positif efusi pleura tuberkulosis dan sekitar 30-60% PCR positif pada kultur negatif cairan pleura. Pada sampel apusan BTA sputum positif dijumpai dijumpai sensitivitas sensitivitas PCR berkisar
73,6–100%. Sedangkan Sedangkan sampel sampel apusan apusan BTA sputum sputum negatif dijumpai dijumpai sensitivitas sensitivitas PCR
70% dan spesitifitasnya spesitifitasnya 98,6 %. Selain itu pada apusan apusan BTA positif positif dengan pemeriksaan pemeriksaan PCR dapat dapat dijumpai hasil yang negatif. negatif. Yang mana hal ini dapat terjadi terjadi karena adanya infeksi M. atipikal dan inhibitor dalam proses amplifikasi.
PCR (Era Uji Diagnoistik Molekuler Terkini) UJI DIAGNOSTIK MOLEKULER
Dalam bidang kedokteran (manusia maupun hewan), uji-uji diagnostik merupakan salah satu metode untuk menangani kasus penyakit. Berbagai uji diagnostik telah dikembangkan, baik yang didasarkan pada teknik kultur agen penyakit, reraksi kimia/biokimia maupun reaksi imunologik. Dengan berkembangnya teknologi dalam bidang biologi molekuler, maka pengembangan uji-uji diagnostik mulai diarahkan kepada teknologi tersebut yang menggunakan materi genetik sebagai dasar pengujiannya. Materi genetik yang berupa asam nukleat baik DNA (Deoxy-ribose Nucleic Acid) maupun RNA (Ribo Nucleic Acid) mengandung tiga komponen, yaitu: 1) basa (purin dan pirimidin); 2) gula (deoksiribosa untuk DNA dan ribosa untuk RNA); dan 3) fosfat. Basa purin yang terdapat pada DNA maupun RNA adalah sama, yaitu Adenine [A] dan Guanine [G] sedangkan basa pirimidin berbeda, untuk DNA adalah Cytocine [C] dan Thymine [T] dan untuk RNA kedudukan Thymine digantikan oleh Uracil [U] Kedua unsur basa tersebut (purin dan pirimidin) akan berpasangan membentuk kode-kode genetik pada DNA maupun RNA melalui ikatan hidrogen (A akan berpasangan dengan T [pada DNA] atau A dengan U [pada RNA]; dan G dengan C). Unsur gula dan fosfat akan membentuk struktur DNA dan RNA. DNA memiliki struktur rantai ganda sedangkan RNA memiliki rantai tunggal. Struktur DNA lebih stabil bila dibandingkan dengan RNA. Berdasarkan materi genetik tersebut, uji-uji diagnostik dikembangkan melalui teknik-teknik molekuler seperti hibridisasi dengan probe asam nukleat; polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan sekuensing asam nukleat.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Salah satu perkembangan teknik biologi molekuler yang sangat membantu dalam pengembangan uji-uji diagnostik adalah PCR. PCR dapat mengamplifikasi DNA dan jumlah yang sedikit menjadi jumlah yang dapat dideteksi/banyak. Adanya penemuan DNA polymerase (Taq polymerase) yang stabil pada temperatur tinggi dan pengembangan alat yang mengatur temperatur proses PCR secara otornatis, telah membuat PCR dapat digunakan untuk uji-uji diagnostik secara praktis. DNA polymerase adalah enzim yang dapat mensintesis rantai DNA yang baru dan DNA yang sudah ada. Penemuan enzim yang tahan panas sangat membantu untuk mensintesis DNA baru, karena tahap awal proses PCR dilakukan dengan cara pemanasan rantai DNA yang sudah ada pada temperatur 90°C. Reaksi Rantai Polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik sintesis untuk mengamplifikasi atau melipatgandakan fragmen DNA target secara invitro dengan eksponensial yang menggunakan primer atau pemula DNA yang tepat. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA in vivo. Berbeda dengan proses replikasi yang berlangsung secara diskrit untuk sepanjang rantai DNA,
maka pada proses PCR reaksi ini berjalan kontinu, tetapi hanya untuk satu segmen tertentu saja dari suatu DNA. Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary, B. Mullis pada tahun 1985. Impian Mullis dimulai ketika di bulan April, malam Jumat, 1983, saat membawa kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke Negara bagian utara California dimana Mullis mendapatkan inpirasi yang bermakna dengan menemukan cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang spesifik dari DNA. Penemuan yang mempesonakan itu dipublikasi pada American Scientific, 1990, yang memberiny peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah Nobel dalam kimia atas penemuan PCR. Semula Mullis menggunakan enzim Klenow fragmen E.coli DNA Polymerase I untuk memicu perpanjangan potongan DNA yang spesifik. Namun, enzim ini tidak dapat bertahan pada saat tahapan denaturasi dari PCR, sehingga mengharuskan penambahan enzim yang baru lagi pada setiap siklus PCR. Kondisi ini merupakan suatu hambatan yang kritis, khususnya pada teknik yang diharapkan berlangsung secara automatis. Klenow enzim dapat bekerja baik pada potongan DNA yang pendek (<200bp), tetapi tetapi tidak bis bekerja pada potongan DNA yang lebih besar, karena hasilnya yang memberikan sensitifitas yang rendah dan memperlihatkan hasil yang heterogen. Hal ini disebabkan karena tahapan annealing yang rendah dan perubahan temperatur (37’C) yang harus disesuaikan untuk mengaktifkan enzim Klenow. Situasi yang sangat memperihatinkan pada awal dimulainya PCR ini ialah bahwa teknik ini dilakukan secara manual dari satu waterbath ke waterbath lainnya sesuai tahapan dari PCR. Setelah beberapa tahun berikutnya didapatkan enzim thermostable DNA Polymerase yaitu Taq DNA Polymerase, PCR menjadi sangat populer dalam penelitian. Penemuan enzim ini juga memberi peluang untuk dilakukannya setiap tahapan PCR secara automatis, sehingga PCR sekarang telah dapat dikerjakan dengan mesin. Untuk mendeteksi potongan DNA yang spesifik dengan PCR diperlukan informasi dari tiap mikroorganisme yang memiliki potongan DNA yang spesifik untuk golongannya. Dengan merancang komplementer potongan DNA yang spesifik dari mikroorganisme tersebut, maka dapat dihasilkan pemula DNA atau disebut juga primer. Potongan DNA yang spesifik ini akan berikatan dengan pasangan yang komplementer dengannya, dan inilah yang dilipatgandakan atau diamplifikasi sampai jutaan dalam waktu sekitar 4 jam pada mesin PCR. Untuk mendukung amplifikasi tersebut diperlukan berbagai zat lainnya, kemudian divisualisasikan melalui elektroforesis dan proses hibridisasi. Keseluruhan proses PCR membutuhkan waktu hanya 2 hari. Pada perkembangan penggunaan PCR dilakukan pemurnian terhadap sampel yang akan di tes. Permunian sampel DNA dilakukan dengan memakai metode Boom (1990). Metode ini menggunakan Chaotropic agent guanidium thiocyanate (GuSCN) dan diatom. GuSCN dan diatom menghilangkan hambatan secara efisien terhadap berbagai macam sampel dari rumah sakit. GuSCN berfungsi untuk lisis dan menginaktifkan asam nukleat, sedangkan partikel silica ataupun diatom berfungsi mengikat asam nukleat. Untuk mengamplifikasi DNA dilakukan 30-40 kali siklus proses PCR. Satu siklus terdiri dari 3 tahap, yaitu tahap denaturasi pada temperatur 95°C, tahap hibridisasi primer pada temperatur 37° sampai 56°C dan tahap polimerisasi pada temperatur 72°C.
Secara umum, DNA yang akan diamplifikasi diapit oleh sepasang primer sintetik yang merupakan potongan pendek dari DNA yang spesifik/komplementer yang berfungsi sebagai template dari DNA yang akan diamplifikasi. DNA target yang akan diamplifikasi didenaturasi terlebih dahulu dengan pemanasan, kemudian primer ditambahkan pada DNA target dan temperatur diturunkan agan terjadi proses hibridisasi. Bila tahap polimerisasi dimulai, maka rantai DNA target yang terdapat di antara primer akan diperbanyak menjadi dua rantai dengan panjang yang sama seperti DNA target. Dengan adanya pengulangan tahap-tahap denaturasi, hibridisasi dan polimerisasi beberapa kali, maka DNA target akan diperbanyak secana efektif. Bila enzim reverse transcriptase yang mensintesis DNA dan template RNA, digunakan pada tahap awal proses PCR, maka RNA ribosom dan genomik dan virus RNAjuga dapat diamplifikasi. Prinsip dasar suatu PCR adalah : pasangan primer menghibridisasi sekuens komplemen terget pada rantai DNA yang sebelumnya telah terdenaturasi. Sintesis DNA kemudian berlangsung dengan bantuan enzim polimerase di sepanjang daerah diantara primer. PCR dilaksanakan dengan cara menginkubasi sample pada temperatur yang berbeda pada tahap, dalam suatu siklus PCR, yaitu tahap : 1. Denaturasi Dengan pemanasan 95 oC rantai DNA akan berpisah, karena panas dapat merusak ikatan hidroksi antara basa-basa yang komplementar. 2. Annealing ( penempatan / pemasangan primer ) Primer dipasangakan pada tempat yang sesuai ( berkomplementer dengan rantai tunggal DNA ) melalui proses pembentukan iktan hidroksi.Untuk proses pemasangan primer ini dibutuhkan temperature yang berbeda dari setiap primer. 3. Extension ( Perpanjangan) Setelah primer ditempatkan pada posisi yang tepat, dimulailah proses pemanjangan rantai baru DNA yang berkomplementar, dengan bantuan enzim DNA polymerase sehingga terbentuk suatu fragmen rantai ganda DNA yang spesifik. Enzim yang stabil pada temperatur tinggi ini akan membantu proses penempaan nukleotida yang dibutuhkan sampai terbentuknya suatu rantai ganda DNA, temperatur optimal yang dibutuhkan untuk proses ini adalah 72o C. PCR dapat digunakan dalam uji-uji diagnostik untuk mengamplifikasi asam nukleat dan agen-agen penyakit yang ada dalam jumlah sedikit sehingga sensitifitas uji dapat ditingkatkan. DNA yang telah diamplifikasi selanjutnya diidentifikasi dengan teknik hibridisasi yang rnenggunakan probe asam nukleat yang spesifik, atau dengan analisis restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan elektroforesis pada gel agarose atau dengan cara sekuensing. Perkembangan selanjutnya terhadap pemanfaatan mesin PCR, dibedakan antara PCR unipleks dan PCR multipleks. Bila digunakan hanya satu pasang primer disebut PCR unipleks, sedangkan PCR yang menggunakan lebih dari satu pasang disebut PCR multipleks tak ada perbedaan pada tahapan denaturasi, annealing dan elongation, terkecuali pada kandungan PCR-miks, waktu tahapan dan jumlah sikling temperatur. PCR Unipleks dapat dipakai untuk diagnosis terhadap penyebab penyakit infeksi, termasuk M. tuberkulosis dan mikobakterium lain, sedangkan PCR multipleks selain digunakan untuk diagnosis, juga untuk tes resistensi terhadap OAT.
ELISA adalah suatu metoda immunokimia yang berdasarkan reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikatornya. Dengan memiliki satu dari komponen tersebut (antigen atau antibodi) yang dilabel dengan enzim dan diikatkan dengan pendukung immunosorbent, maka akan terbentuk antigen-antibodi kompleks. Pada metoda ELISA dengan antigen kompetitif, antibodi dilapiskan pada immunosorbent (substrat padat). Kemudian antigen sampel dan antigen yang berlabel enzim dimasukan kedalam immunosorbent sehingga terjadi kompetisi antara antigen sampel dengan antigen berlabel enzim untuk berikatan dengan antibodi dan terbentuk kompleks antibodi-antigen. Dengan tambahan substrat yang spesifik terhadap kerja enzim, akan dihasilkan reaksi yang menghasilkan warna. Hasil warna tersebut dapat dilihat secara visual atau diukur dengan menggunakan kolorimeter atau spektrofotometer. Ciri utama metoda ini adalah menggunakan suatu indikator enzim untuk reaksi immunologi (Burgess, 1995). Teknik pengujian dengan metoda ELISA dapat dilakukan dengan beberapa konfigurasi, pemilihan konfigurasi tergantung dari besar molekul yang akan dideteksi, serta tingkat sensitifitas dan spesifitas yang dikehendaki. Beberapa konfigurasi tersebut adalah: A. ELISA Kompetitif ELISA Kompetitif dapat dibedakan menjadi dua, yaitu: 1. ELISA kompetitif langsung Konfigurasi ELISA langsung merupakan konfigurasi paling sederhana. Antibodi spesifik dilapiskan pada mikroplat yang kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Analat yang akan dideteksi bersama dengan enzim-hapten konjugat ditambahkan pada mikroplat yang telah dilapisi dengan antibodi. Analat dan enzim-hapten konjugat akan saling berkompetisi untuk mengikat antibodi yang dilekatkan pada permukaan mikroplat. Banyaknya enzim-hapten konjugat yang dapat mengikat antibodi dapat ditentukan dengan penambahan substrat senyawa pembentuk warna. Warna yang terbentuk akan berbanding terbalik dengan jumlah analat yang terdeteksi dalam contoh. Semakin banyak analat dalam contoh maka analat mempunyai kesempatan yang lebih besar untuk mengikat antibodi, sehingga akan lebih sedikit enzim-hapten konjugat yang mengikat antibodi. Akibatnya intensitas warna yang terbentuk berkurang karena enzim yang bereaksi dengan substrat juga lebih sedikit. 2. ELISA kompetitif tak langsung Pada metoda ini menunjukan bahwa warna yang ditimbulkan tidak langsung disebabkan oleh antigen dan antibodi yang bereaksi. Dibutuhkan suatu antibodi antispesies yang dilabel dengan enzim. Antigen dalam hal ini hapten protein konjugat dilekatkan pada permukaan mikroplat dan kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Analit bersama dengan antibodi ditambahkan kedalam mikroplat. Antigen
dan analat akan berkompetisi untuk mengikat antibodi yang ada. Makin banyak analat dalam contoh yang diuji maka semakin sedikit antigen yang dapat mengikat antibodi. Sehingga antibodi kedua yang berlabel enzim (antibodi antispesies) yang ditambahkan jumlahnya akan semakin sedikit, akibatnya intensitas warna yang ditimbulkan juga semakin rendah. Kompetitif ELISA merupakan konfigurasi yang banyak digunakan untuk pengujian cemaran, toksin serta senyawa dengan berat molekul kecil.
B. ELISA on-kompetitive sandwich Antibodi dilekatkan pada permukaan sumur-sumur mikroplat, kemudian antigen dan contoh uji ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Kemudian ditambahkan antibodi kedua yang diberi label enzim. Intensitas warna yang ditimbulkan setelah penambahan substrat berbanding lurus dengan antigen yang terdeteksi. Konfigurasi ini digunakan untuk mendeteksi makromolekul atau senyawa dengan molekul besar seperti protein dan mikroorganisme. Akan tetapi kurang sensitif untuk mendeteksi senyawa dengan berat molekul kecil seperti toksin dan cemar
