PCR e Eletroforese de Nucleotídeos Dalvania Pinho Domingues Fralini dos Santos Marcilio Gabriel Machado Carvalho Leonardo Teles Faber Patricia de Sá Almeida Almeida Rita de Cássia Costa de Carvalho
Kary Banks Mullis
PCR
PCR=Polymerase Chain Reaction Reação em Cadeia da Polimerase –técnica que utiliza a enzima DNA polimerase ,responsável pela síntese de DNA ,para amplificar in vitro,qualquer segmento de DNA utilizado como molde através de ciclos .
PCR amplifica uma sequência alvo:
Sequência alvo
Histórico
1983 – Kary Banks Mullis. Reação em cadeia da polimerase. Conceito de primer 1987– Primeira publicação:Science. 1989 – Automação do processo pelo uso do primeiro termociclador automático. 1983 – Prêmio Nobel de Química:Kary Banks Mullis
Princípios
Consiste de três etapas: Denaturação– 95 ºC por 30 segundos Anelamento-ligação dos primers(64ºC) Polimerização-síntese de cadeia complementar de DNA
Princípios Requer: DNA molde DNA polimerase termoestável 2 primers Deoxinucleotídeos trifosfato(dNTPs) Cátion divalente(MgCl2) Tampão Termociclador
Ciclos:são repetidos de 30 a 45 vezes v ezes.
Limitações
Contaminação por DNA estranho Incorporação errônea de bases Difícil aplicação a sequências maiores que 500 Daltons
Inibidores:
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Fenol Proteinase K Agentes quelantes em excesso(EDTA) Hemoglobinas e outras proteínas das hemácias SDS(dodecil sulfato de sódio) Elevadas concentrações de sal
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Aplicações 1.Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros) 2.Seleção de clones recombinantes, com primers complementares a seqüências do vetor. 3.Sequenciamento direto de produtos amplificados
Aplicações
4.Detecção de mutações em genes específicos (diagnóstico precoce em estudos de câncer e doenças genéticas, estudos terapêuticos para a determinação do mecanismo de ação de substâncias mutagênicas)
5.Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitos
6.Diagnóstico pré-natal em caso de risco
Aplicações
7.Elucidar relações evolutivas entre espécies, utilizando material arqueológico
8.Na Medicina Forense,análises em cenas de crimes (impressão digital de DNA- Fingerprint )
9.Teste de paternidade
Avanços
Utilização de DNA polimerase termoestável( Taq polimerase)
Novas DNA polimerases(Pfu DNA polimerase,Tli DNA polimerase,Vent DNA polimerase)
Novas estratégias de análise(Nested PCR,Touchdown PCR,Inverse PCR,PCRELISA,Multiplex PCR,HotStart PCR,RT-PCR,PCRCompetitiva.)
Eletroforese
Eletroforese de Nucleotídeos Método padrão para análise,identificação e purificação de fragmentos de DNA ou RNA que diferenciam-se em tamanho ou conformação.
Histórico 1933-Tiselius:eletroforese para separar proteínas em solução 1955-Smithies:géis de amido para separar proteínas do soro Frederick Sanger:análise completa da insulina bovina 1956-Ingran:primeiro mapa peptídico 1959-Raymond:géis de poliacrilamida 1966-Maizel:uso de SDS 1975-O´Farrel:gel 1975-O´Farrel:g el bidimensional 1981-Jorgenson e Lukacs :Eletroforese Capilar(EC)
Princípios
Aplicação de uma diferença de potencial Migração de partículas em um determinado gel Separação molecular na amostra Visualização das “bandas”
Princípios
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Requer: Amostra(livre de contaminação) Gel (agarose ou poliacrilamida) Tampão(TBE:Tris-Borato EDTA e TAE:Tris Acetato EDTA) Equipamento para Eletroforese Corantes:Prata,Ponceau,Azul Corantes:Prata,Po nceau,Azul de Bromofenol,Xileno-Cianol. Ladders(marcadores de tamanho)
Visualização Eletroforese Capilar
Limitações
Taxa de migração do DNA nos géis de agarose 1.Tamanho molecular do DNA 2.Concentração da agarose 3.Conformação do DNA 4.Presença de Brometo de Etídio 5.Voltagem aplicada 6.Tipo de agarose 7.Tampão
Limitações
Não é adequada para determinação de compostos voláteis,não-polares e de massa molar baixa(menores que 200 Daltons)
Não é adequada para polímeros nãoiônicos com massa molar alta(maiores que 500 Daltons)
Aplicações
Sequenciamento de DNA(eletroforese capilar)
Separação de misturas complexas de macromoléculas
Avanços
Western blotting
Eletroforese Capilar em Solução Livre(ECSL) Eletroforese Capilar em Gel(ECG) Eletrocromatografia Capilar Micelar(ECCM) Eletroforese Capilar com Focalização Isoelétrica(ECFI) Isotacoforese Capilar(IC)
Vídeos
PCR Teste de paternidade
Referências Alberts B, Jonhson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula. 4 ed. Porto Alegre: Artmed; 2004. http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf (Acesso em 08 de agosto de 2008) http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm (Acesso em:18 de agosto de 2008 http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html (Acesso em 18 de agosto de 2008) http://www.etall.hpg.com.br (Acesso em 18 de agosto de 2008)
Discussão
Porque foi tão importante o desenvolvimento da PCR? É possível extrair-se DNA de um fio de cabelo,uma célula do epitélio oral ou de uma gota de sangue? A eletroforese de nucleotídeos é mais simples do que a de proteínas?
