LABORATORIO 03. TURBIDIMETRÍA

BIOTECNOLOGÍA DE LOS PAI

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

LABORATORIO 03. DETERMINACIÓN DE BIOMASA POR MÉTODOS DE TURBIDIMETRÍA Y POR MÉTODO DE AZÚCARES REDUCTORES (MÉTODO DNS) I. 







II.

OBJETIVOS 1.1.Objetivo 1.1. Objetivo General Mediante el método de turbidimetría, construir una Curva Patrón y hallar la ecuación para determinar la cantidad de biomasa en una solución de levadura. Mediante el Método de colorimetría DNS, determinar la cantidad de Azúcares Reductores de una solución de levadura. 1.2.Objetivos 1.2. Objetivos Específicos Conocer el uso del espectrofotómetro para determinar los valores de absorbancia de distintas muestras. Conocer las diferencias entre transmitancia tr ansmitancia y absorbancia.

FUNDAMENTO TEÓRICO

2.1. Biomasa Se refiere de manera general a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez también se puede referir como la cantidad de células, de personas, o masa de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproducción de las células. La determinación de la biomasa es una de las variedades más importantes de un bioproceso ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clave para establecer las tasas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances de masa de cualquier proceso biológico. Los métodos clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que se basan en el número de células o en el peso celular. celular. Para determinar la biomasa es necesario calcular el número de células en una determinada muestra. 2.2. Turbidimetria La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se mide Absorbancia o Transmitancia). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida). La turbidimetría tiene una gran variedad de aplicaciones y permite trabajar con muestras gaseosas, liquidas e incluso con sólidos transparentes. La formación de precipitados difíciles de filtrar, como por ejemplo los gelatinosos o los de tamaño de partícula muy pequeño, suelen proporcionar suspensiones ideales para la aplicación de técnicas basadas en la dispersión de la luz que sustituye a las técnicas gravimétricas. Este tipo de

1 LABORATORIO 03. MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y AZUCARES REDUCTORES



aplicaciones son frecuentes en laboratorios analíticos, laboratorios clínicos y en plantas de procesos. Cuando un haz de luz paralelo golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. A diferencia de la Nefelometría, la cual mide la luz dispersada por una solución de partículas, la Turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. 2.3. Transmitancia y Absorbancia La transmitancia se define como la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo. La absorbancia sucede cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz será transmitida por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos aspectos del mismo fenómeno. 2.4. Azúcares Reductores Azúcares reductores son aquellos que, como la glucosa, fructosa, lactosa y maltosa presentan un carbono libre en su estructura y pueden reducir, en determinadas condiciones, a las sales cúpricas. Azúcares reductores: Los monosacáridos y muchos disacáridos, (excepto Sacarosa y Trehalosa). Monosacáridos: Ej. Glucosa, Fructosa Disacáridos reductores Ej.: Lactosa, Maltosa, Isomaltosa, Celobiosa, etc. Azúcares no reductores: Oligosacáridos y Polisacáridos. Oligosacáridos: moléculas formadas por 2 a 10 monosacáridos. Polisacáridos moléculas formadas por más de 10 monosacáridos. Ej. Almidón, Celulosa, Glucógeno, Ac. Hialurònico. Para la determinación de azúcares reductores se aplicó el método de colorimetría DNS (Acido 3,5 dinitrosalisílico) usando el espectrofotómetro, se realizó la cuantificación de los azúcares presentes en cada una de las cuatro muestras, para lo cual se creó una curva de calibración a partir de una solución de glucosa. 2.5. Método DNS Uno de los métodos más acordes y con mejor resultados en la determinación de los azucares con carácter reductor, es el método DNS (Acido 3,5 dinitrosalicílico), método que ha sufrido varias modificaciones a través de los años para adecuarse al análisis de diferentes materiales y




su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico. El procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra. En tubos de ensayo se adicionan 0.5 ml de muestra y 0.5 del reactivo de DNS. Los tubos se colocan en baño de agua a 100°C por 5 minutos, luego agregamos 5 ml de agua destilada. Realizamos por último la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro. El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácidodinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 540nm de los azúcares reductores. Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. Por lo tanto, se aplicará esta técnica para la construcción de una curva patrón de glucosa que será una referencia para próximos experimentos 2.6.Cámara de Neubauer Se trata de una gruesa placa de cristal con forma de portaobjetos, de unos 30 x 70 mm y unos 4 mm de grosor. En una cámara simple, la porción central, que es donde se realiza el conteo, está dividida en 3 partes. En la parte central se encuentra grabada una retícula cuadrangular. En el caso de cámara doble, que son las más comunes, existen 2 zonas de conteo, una superior y otra inferior al eje longitudinal de la cámara. La retícula completa mide 3 mm x 3 mm de lado. Subdividida a su vez en 9 cuadrados de 1mm de lado cada uno. El cuadrado central se divide en 25 cuadrados medianos de 0,2 mm de lado, y cada uno de estos cuadros se subdivide a su vez en 16 cuadrados pequeños. 2.7.Fase Lag Es un período de adaptación, cuando un cultivo de microorganismos es llevado de un ambiente a otro. Los microorganismos sufren una reorganización tanto en su velocidad de crecimiento como en sus constituyentes macromoleculares. Durante esta etapa la masa celular puede cambiar sin cambiar el número de células. III.      

MATERIALES Y EQUIPOS 3.1. Materiales 20 tubos de ensayo 01 Rejilla para tubos de ensayo 01 g de levadura 250 ml de Agua destilada 01 Jeringa estéril 01 Cámara de Neubauer 3

LABORATORIO 03. MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y AZUCARES REDUCTORES


   


02 Laminillas cubreobjetos estériles 01 Pipeta de 5 ml 01 Pipeta de 1 ml 01 Papel toalla.



3.2.Equipos Balanza Analítica modelo Sartorius CPA224S Estufa modelo Memmert Microscopio de luz Computador con programa instalado Motic Images 2.0 Espectrofotómetro SQ-4802



3.3.Reactivos 2 ml de DNS (Acido 3,5 dinitrosalisílico)

   

IV.   







  





 

METODOLOGÍA 4.1. Elaboración de Curva Patrón Tomamos 10 tubos vacíos, los lavamos y colocamos a la estufa a secar. Preparamos una solución de levadura de 1% p/v (1g/100ml) A partir de la solución preparada de levadura, preparamos 9 diluciones de 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005% y 0.001% además de una décima dilución al 0.0% que vendría a ser la muestra en blanco (agua destilada) Tomamos una de éstas diluciones (0.4%) para realizar el Conteo de células en Cámara de Neubauer, y calculamos los restantes 9 conteos por proporcionalidad. Llevamos las 10 diluciones al espectrofotómetro y anotamos el valor de absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 520 nm. Con los valores de las absorbancias y los valores del conteo de células, construimos la Curva Patrón. 4.2. Método DNS para determinación de Azúcares Reductores Tomamos 9 tubos vacíos, los lavamos y colocamos a la estufa a secar. Preparamos una solución de sacarosa a 10°Bx (10 g azúcar/100 ml agua). Tomamos primeramente 5 tubos limpios y secos, y colocamos 10 ml de la solución de sacarosa de 10°Bx en cada tubo. Añadimos en 4 tubos, 1 ml de la solución de levadura 1% p/v preparada anteriormente y el quinto tubo lo dejamos sólo con la solución de sacarosa 10°Bx. Tomamos otros 4 tubos, y en cada uno colocamos 0.5 ml de las muestras que se encuentran en los 4 primeros tubos, y luego añadimos 0.5 ml de DNS. Sumergir los tubos por un periodo de 5 minutos en un baño de agua a ebullición. Diluimos cada uno de estos tubos con 5 ml de agua destilada.








Levamos las 5 diluciones al espectrofotómetro y anotamos el valor de absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 540 nm. Con los valores de las absorbancias, determinamos los g glucosa/L/min/g levadura.

V.

RESULTADOS Y DISCUSIONES 5.1.Elaboración de Curva Patrón Tabla 01. Valores de absorbancia y concentraciones de células/ml para la construcción de la Curva de Calibración. Absorbancia =520 nm

Neubauer (cel./ml)

0.8

2.41

6.52 x107

0.39

0.6

2.369

4.89 x107

0.43

0.4

1.937

3.26 x107

1.16

0.2

1.305

1.63 x107

4.95

0.1

0.916

8.15 x106

12.13

0.05

0.787

4.07 x106

16.33

0.01

0.128

8.15 x105

74.47

0.005

0.172

4.07 x105

67.30

0.001

0.094

8.15 x104

80.54

0

0

0

100.00

Dilución %

Transmitancia (%)

Para este primer paso, habíamos elegido el tubo N°03 que contenía la dilución 0.4% y determinamos la concentración de células/ml en ésta dilución, siendo la cantidad de 3.26x10 7, lo cual es correcto para proceder a tomar valores de absorbancia en el espectrofotómetro. La dispersión es proporcional a la concentración del cultivo y sólo es válido para concentraciones mayores a 107 células/ml, donde la proporcionalidad de la absorbancia y la masa bacteriana se conservan. Así, utilizamos el espectrofotómetro, que mide la absorbancia. (MACU, 1975) Con estos datos tomados durante la práctica se construye la curva de calibración, que relaciona las concentraciones de las diferentes diluciones y la absorbancia medida en cada una de ellas. La Figura 01 muestra a Curva de Calibración para determinar la concentración de células presentes en un mililitro de solución, a partir del valor de la absorbancia.




35000000 30000000 25000000 20000000

l m / 15000000 l e c

y = 2E+07x - 3E+06 R² = 0.9123

10000000 5000000 0 -5000000 0

1

2

3

Absorbancia

Figura 01. Curva de Calibración: Absorbancia vs. [Cel. /ml] Tabla 02. Análisis de Varianza Grados de libertad Regresión Residuos Total

Suma de Promedio de cuadrados cuadrados 8.43 x1014 8.11 x1013 9.24 x1014

1 6 7

8.43 x1014 1.35 x1013

F

Valor crítico de F

62.40

0.000218231

Tabla 03. Valores de los coeficientes de la ecuación de Curva de Calibración. Coeficientes Intercepción absorbancia

-2701875.23 15735547

En la Figura 1, se muestra la Curva de Calibración, la que, considerando los valores de absorbancia a diferentes concentraciones de células/ml, obtenemos una ecuación (Ecuación 1), de la cual podemos registrar la medida de la concentración de células con tan solo tener el valor de la absorbancia de la muestra. Obtuvimos además un valor de correlación no muy alto (91.23%) en la determinación de la Curva de Calibración, quiere decir que un cambio en la medida de la absorbancia se traduce en un cambio aproximadamente proporcional en la concentración de células/ml. Ecuación 1:

cc (cel /ml) = 15735547*Abs – 2701875.23




3 2.5 Absorbancia 2

y = -0.434ln(x) + 2 R² = 1

a i c n 1.5 a b r o 1 s b A

0.5

0 -0.5

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

Transmitancia (%)

Figura 02. Curva Logarítmica de Absorbancia y Transmitancia para muestras diluidas de solución de levadura 1% p/v 5.2.Método DNS para determinación de Azúcares Reductores Cuando buscamos información acerca de cómo realizar la determinación de azúcares reductores, nos encontramos con prácticas ya hechas, en las que se habla de hidrolisis acida, para este laboratorio, utilizamos el Ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS). Además, es muy empleado en la determinación de azucares reductores como una técnica colorimétrica, ya que proporciona un color medionaraja a la muestra, la que cambia de tonalidad según la cantidad de sustrato (azúcar) que se encuentre en la muestra.

Ecuación 2.: cc (g/l) = 1.9211*Abs. – 0.2009 Tabla 04. Valores de concentración de glucosa resultante tomadas cada 5 minutos

tiempo (min)

5 10 15 20

Absorbancia =540 nm 1 ml solución levadura 1.438 1.590 1.678 2.765

0.1 ml solución levadura 0.932 0.829 1.135 1.721

Concentración (g/L)

gglucosa/L/min/glevadura

1 ml solución levadura 2.562 2.854 3.023 5.111

1 ml solución levadura 0.512 0.285 0.202 0.256



En la Tabla 04 notamos el comportamiento de la concentración final de glucosa en muestras de soluciones de levadura a través del tiempo (parámetros de 5 minutos), y vemos cómo estos 7 LABORATORIO 03. MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y AZUCARES REDUCTORES



valores descienden. Esto se traduce en simple explicación, que los azúcares son el sustrato que las levaduras van consumiendo. Los azucares reductores son monosacáridos que poseen grupos carbonilos libres, que se obtienen de la hidrólisis ácida y térmica de los polisacáridos. El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea ácido 3,5 dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra. Determina las absorbancias por medio de un espectrofotómetro a 540nm. Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. (Carrascal, et.al, 2003) El DNS reacciona únicamente con los azúcares reductores. La sacarosa es un disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por métodos espectrofotométricos es proporcional a la concentración de sacarosa. (Carrascal, et.al, 2003)

3 2.5 a i 2 c n a b r 1.5 o s b A 1

1 ml solución levadura

0.5 0 0

5

10

15

20

25

tiempo (min)

Figura 03. Comportamiento de la Absorbancia en el tiempo. La absorbancia es inversamente proporcional a la cantidad de sustrato que queda en el cultivo. La composición química del medio de cultivo está cambiando debido a que los nutrientes se están consumiendo y productos metabólicos son producidos. (Ting, 1956) Observamos en la Figura 03 el comportamiento de los valores de absorbancia en las muestras finales de levadura y DNS, y notamos que los valores de la absorbancia tomados en el espectrofotómetro, en los primeros 15 minutos, varían 1.438 y 1.678 para la muestra de 1 ml de solución de levadura, y a partir de los 15 minutos, éste valor aumenta exponencialmente, y notamos que a los 20 minutos, toma un valor de 2.765. En los primeros 15 minutos, nos encontramos en la Fase Lag, donde existe un aparente reposo en el que las células sintetizan las enzimas necesarias para la actividad metabólica que deben llevar adelante. Cuando se hacen mediciones del número de células en distintos tiempos dentro de esta 8 LABORATORIO 03. MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y AZUCARES REDUCTORES



fase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio, interiormente las células trabajan activamente adaptando el equipo enzimático al medio de cultivo. La levadura se prepara para hacer uso de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase de adaptación al medio, con aumento de la masa celular pero no del número de células. Pasado este período, el cultivo entra en la denominada fase de crecimiento exponencial (Fase Log), donde la velocidad de crecimiento es máxima. La velocidad de crecimiento que alcanza un cultivo, depende de diversos factores ambientales como son la temperatura, el pH, oxigenación, etc. (Bello, et.al, 2006)

6.000 5.000

y = 0.1563x + 1.433 R² = 0.7506

) L / 4.000 a s o c u 3.000 l g g ( c 2.000 c

1 ml solución levadura

y = 0.1027x + 0.7328 R² = 0.7493

1.000

0.1 ml solución levadura

0.000 0

10

20

30

t (min)

Figura 04. Comportamiento de la concentración de glucosa en el tiempo. En los tubos conteniendo las muestras y el DNS, notamos que los resultados de absorbancia a 540 nm van incrementándose desde el tubo 1 al tubo 4 a medida que pasan los minutos, pues, como menciona Ramos y Pérez ( 2004) a mayor tiempo transcurrido habrá mayor hidrólisis de sacarosa y por tanto mayor número de grupos reductores que reaccionan con el DNS y se convierten en 3amino-5-dinitrosalicílico, compuesto anaranjado que tiene su máximo de absorbancia a 540 nm. Este aumento debe ser proporcional, aunque puede perderse en los últimos minutos si ya se ha conseguido hidrolizar prácticamente toda la glucosa de la muestra, estaríamos hablando de las fases de Desaceleración y Estacionario del crecimiento de Levaduras. VI.

CONCLUSIONES 





Aplicando proporcionalidad, determinamos las concentraciones de cel/ml en cada dilución, y con sus respectivos valores de absorbancia, construimos la Curva Patrón, la que, al linealizar, resulta la ecuación: cc (cel /ml) = 15735547 *Abs – 2701875.23 Por el método DNS logramos determinar la cantidad de Azúcares Reductores y la concentración de glucosa en muestras tomadas cada 5 minutos. El grupo de alumnos del IX ciclo, en el curso de Biotecnología de los PAI, asesorados por el Ingeniero, logramos obtener el conocimiento para el uso del espectrofotómetro y poder así determinar los valores de absorbancia para distintas muestras. 9

LABORATORIO 03. MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y AZUCARES REDUCTORES


VII.


RECOMENDACIONES  









VIII.

Asegurarse tener los materiales completos y limpios antes de empezar la práctica. Calibrar bien el microscopio con la finalidad de observar de manera buena las levaduras y así facilitar el conteo. Es mejor usar una jeringa en vez de pipeta, por el tamaño de gota y por la facilidad de manejo. Mediante el programa Motic Images 2.0 tenemos un fácil acceso para contabilizar las células ene l computador, pero es preferible tomar fotos a las cuadrillas para ganar tiempo. Utilizar los tubos estériles, para evitar una contaminación en las muestras, para ellos, se lava, desinfecta y colocamos en la estufa para secar antes de usar. Al momento de hacer las diluciones, hacer un buen cálculo para las medidas exactas en las diluciones, y no tener problemas al pasar las muestras en el espectrofotómetro. BIBLIOGRAFÍA



Ramos, M.; Pérez, M. 2004. Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa. México. Departamento de Biotecnología. 116 p.



Carrascal, A.; Páez, A. y Burbano, M. 2003. Manual de Laboratorio: Microbiología de Alimentos. Pontifica Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiología. Bogotá. 171 p.



Ting, S.V. 1956. Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous Determination of Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. Agric. Food Chem. Vol. 4(3) 263-266.



Bello, D.; Carrera, E. y Díaz, Y. 2006. Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del Ácido 3,5 dinitrosalicílico. Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar. Cuba. pp 45 – 50.



Manual analítico para el Control Unificado (MACU) de alcohol y levadura Sacharomyces. Control analítico Parte 1, Cuba, 1975.




ANEXOS ANEXO 01. Conteo de células en 9 cuadrículas de 0.2 mm x 0.2 mm en la dilución de 0.4% Cuadrantes de 0.05 x 0.05 mm2 2

m m 2 . 0 x 2 . 0 e d s a l u c i r d a u C

1 3 5 11 13 15 21 23 25

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

8 11 5 6 7 2 5 6 12

9 21 6 2 11 8 7 4 8

10 14 5 6 12 17 8 3 11

2 10 8 8 6 5 6 7 2

11 7 14 5 8 13 15 3 14

7 17 12 10 9 18 12 7 15

8 11 14 9 9 5 10 4 8

8 13 10 6 12 8 3 12 9

7 5 4 5 7 10 3 3 8

18 9 14 10 7 11 4 11 9

8 5 8 10 9 7 2 10 17

3 13 3 8 12 7 9 6 10

2 5 2 4 7 3 7 4 8

14 8 5 5 5 10 18 11 6

21 8 8 6 5 4 10 4 6

6 5 2 6 6 3 11 3 9

ANEXO 02. Cálculos estadísticos y conteo de células en las cuadrículas de 0.2 mm x 0.2 mm

Sumatoria Promedio

Cuadriculas de 0.2 mm x 0.2 mm 1 3 5 11 13 15 21 142 162 120 106 132 131 130 130.33/0.4 = 325.8

Concentración de células

cc

254.8células 

(0.2 x0.2 x0.1)mm

Desv. Est. C. V.

3

x

103 mm3 1mL



23 25 98 152

6.4 x10 7 células / mL

51.204 15.71%

ANEXO 03. Curva Patrón de concentración de glucosa/L vs Absorbancia

Curva Patrón g/l Glu vs Abs 2.25 2 1.75 1.5 1.25 1 0.75 0.5 0.25 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

y = 1.9211x - 0.2009 R² = 0.991 1 1.2

Ecuación: C(g/l) = 1.9211*Abs – 0.2009 11 LABORATORIO 03. MÉTODO DE TURBIDIMETRÍA Y AZUCARES REDUCTORES



ANEXO 04. Diluciones de 0.8; 0.6; 0.4; 0.2; 0.1; 0.05; 0.01; 0.005; 0.001 y blanco, para determinación de Curva Patrón.

ANEXO 05. Muestras preparadas con solución de Glucosa a 10°Bx para determinación de azucares reductores.

ANEXO 06. Muestras con DNS para determinación de Azúcares Reductores.




ANEXO 07. Espectrofotómetro.

ANEXO 08. Fotografías tomadas en el computador a las 9 cuadriculas para el conteo de células.


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