Guía Unificada de Laboratorios Fundamentos de Microbiología de alimentos
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1. Titulo: MU!T"#$ %&LUC'! ( "CU'T# M&C"#)&*'# +. #b,eti-os 2.1 Familiariza Familiarizarr al estudiante estudiante en el tratamiento tratamiento adecuado de una muestra muestra para análisis análisis microbiolóico. 2.2 !onocer !onocer las t"cnicas t"cnicas utilizadas utilizadas en la preparaci preparación ón de diluciones. diluciones. 2.3 #denti$ica #denti$icarr la manera correcta correcta de reportar % reistrar reistrar los resultados resultados de los análisis análisis microbiolóicos.
. Marco Teórico &uestreo' (s la operación )ue consiste en separar un determinado numero de muestras de un lote con el $in de obtener resultados anal*ticos con$iables. +,mero de &uestras' ara )ue el muestreo tena utilidad estad*stica se debe realizar sobre un n,mero apreciable de unidades de un lote. (l numero de muestras esta en relación con la precisión )ue se desee obtener de los resultados. (l n,mero de muestras es el iual a la ra*z cuadrada del n,mero total de unidades )ue con$orman el lote o tomando el 1 / del total cuando este es rande % el 10/ cuando el lote lote es pe)ueo pe)ueo.. !uando !uando los produc productos tos se contro controlan lan con reula reularid ridad ad es su$ici su$icient ente e analizar de a 10 muestras de cada lote. arámetros a tener en cuenta en un prorama de &uestreo' -
#nspección amao de del lote + +4 amao ao de de la la mue muesstran ran44 &uestra oma de muestra &uestra de$ectuosa 5ieso del co comprad rador 5ieso del endedor +iel +iel de calidad calidad Acep Aceptabl table e +!A4' +!A4' (s el porcent porcenta7e a7e máimo máimo de unidade unidadess de$ectu de$ectuosa osass n,mer n,mero o máimo máimo de unidad unidades es de$ec de$ectuo tuosas sas por por cada cada 1004 1004 )ue )ue se consi considera dera satis$actorio o )ue se admite en un lote.
!ondiciones para el muestreo' ara obtener una muestra representatia se deben cumplir las siuientes condiciones' -
La person persona a resp respon onsa sable ble del muest muestre reo o debe debe conoce conocerr per$ per$ec ecta tame ment nte e su $inal $inalid idad ad e importancia debe estar bien entrenada. (n lo lo posibl posible e la mues muestra tra se toma tomara ra en en sus sus enase enasess orii oriinal nales. es.
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(l muestr muestreo eo sobre sobre lotes lotes o remesas remesas se puede puede 9acer 9acer usando usando la t"cni t"cnica ca del muest muestreo reo aleatorio aplicando la tabla de n,meros al azar. !uand uando o los los ena enasses son mu% ran rande dess % di$* di$*ci cilles de tran transp spor orta tarr se toma toman n as"pti as"pticam cament ente e muestr muestras as repres represent entati atias as % se pasan pasan a enase enasess est"ri est"riles les más pe)ueos.
(n*o de la muestra al laboratorio' :na ez tomadas las muestras se empa)uetan de $orma adecuada se,n su naturaleza para eitar las roturas % el deterioro; estos recipientes se maraca correctamente as*' -
+ombre +ombre % dire direcci cción ón de de la person persona a )ue )ue 9a tomado tomado la mues muestra tra +ombre +ombre % dire direcci cción ón de la pers persona ona empres empresa a donde donde se 9an toma tomado do las mues muestra trass Fec9 Fec9a a lua luarr % 9or 9ora a de la tom toma a de mues muestr tras as !las !lase e de alim alimen ento toss )ue )ue inte inter ran an las las mue muest stra rass +ombre +ombre del del $abri $abrican cante te impo importa rtador dor ende endedor dor compr comprado ador r 5azón de del mu muestreo +,mero +,mero tama tamao o % marc marca a de las unidade unidadess )ue )ue $orma $orman n el lote lote Forma Forma de tran transpo sporte rte punto punto de ori orien en % luar luar de de dest destino ino &"to &"todo do de mues muestr treo eo util utiliz izad ado o emperat mperatura ura del produc producto to en en el moment momento o del del muest muestreo reo emper mperat atur ura a ambie ambient ntal al de alm almac acen enam amie ient nto o !ondic diciones de de en en*o
ipos de &uestreo' Los muestreos se pueden clasi$icar de acuerdo a los siuientes criterios'
&uestr &uestreo eo +orma +ormal'l' +o eis eiste te eide eidenci ncia a de desia desiació ción n de las cond condici icione oness &uestr &uestreo eo reduci reducido' do' (l mar maren en de calida calidad d es superio superiorr al normal normal % la muest muestra ra se diide diide en dos &uestr &uestreo eo riur riuroso oso'' =a% indici indicios os de cali calidad dad in$e in$erio riorr a lo norma normall
&uestr &uestreo eo Alea Aleator torio' io'
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&uestr &uestreo eo simpl simple' e' oble' >oble'
&uestreo Aleatorio' !onsiste en eleir las unidades al azar utilizando tablas matemáticas calculadas para este $in. (stas tablas se mane7an de la siuiente manera'
arar el el recipi recipient ente e est"ri est"rill )ue se a a a usar para para trit tritura urarr la muest muestra. ra. #ntroducir #ntroducir as"pticamen as"pticamente te la porción porción de un un olumen olumen adecuado adecuado en dic9o recipiente. recipiente. esar esar de de nueo nueo para para deter determin minar ar el el peso peso neto neto del alimen alimento. to. !on !on una una prob probet eta a rad radua uada da est"ri est"rill se aad aadir irá á la canti cantida dad d de dilu%e dilu%ent nte e est" est"ri rill para obtener la dilución deseada.
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!asi todos los análisis se realizan a partir de una suspensión li)uida de concentración conocida )ue se denomina suspensión madre % )ue tiene una dilución 1'10. ara conseuir este $actor de dilución se pesa una cantidad de muestra % la pesada )ue resulte se multiplica por nuee4 este nueo resultado serán los mililitros de dilu%ente )ue se debe aadir a la muestra pesada. A partir de esta dilución se preparan las siuientes 1'1001'1000 as* sucesiamente....4 9asta el $actor re)uerido % establecido por el laboratorio )ue realiza el análisis. :n buen dilu%ente no debe producir modi$icaciones cualitatias ni cuantitatias en la microbiota de los alimentos )ue an a ser analizados sin suprimir ni $aorecer su desarrollo. Los dilu%entes más utilizados en microbiolo*a alimentarla son' Aua de triptona con sal solución 5iner BC %Do Aua de peptona tamponada. riturado % 9omoenizado de la muestra' ara obtener resultados con$iables en un recuento o n,mero mas probable es primordial obtener muestras bien 9omoenizadas para ello eisten diersos e)uipos el más conocido es el entro de sus enta7as se encuentran' -
urante los tiempos normales de $uncionamiento eneralmente dos minutos4 no se produce aumento de calor. Los 9omoeneizados se pueden uardar en re$rieración en las bolsas del
!uando no se cuenta con el ( !55HA+#<&<. M/todo &C#'TC (l presente m"todo esta basado en los lineamientos de la +orma "cnica !olombiana +!-?02 )ue establece directrices enerales para realizar análisis microbiolóicos de con$ormidad con las normas internacionales #< @218 >( 1@4. ara la correcta aplicación de esta norma la preparación de la muestra es $undamental por lo tanto se re)uiere )ue la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutias % por duplicado a demás de #nocular correctamente los ol,menes 0.1 ml para super$icie % ba7o ciertas condiciones 1ml como cuando se sospec9a ba7a cara microbiana % 1ml para análisis en pro$undidad.
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5anos para el 5ecuento' Gacterias' >espu"s del periodo especi$icado de incubación se cuentan las unidades $ormadoras de colonias u$c4 presentes en las ca7as )ue contenan entre 1 % 300 u$c; los análisis )ue aplican para dic9o rano son' Aerobios mesó$ilos !oli$ormes Gacterias termó$ilas proteol*ticas lipol*ticas !lostridium sul$ito reductores <. aureus entre otros ecepto para a)uellas bacterias cu%a norma eie presencia o ausencia o cuando se deban realizar análisis especiales )ue re)uieren de una identi$icación posterior como la con$irmación de <. aureus coaulasa positio. =onos' >espu"s del periodo especi$icado de incubación se cuentan las u$c presentes en las ca7as )ue contenan entre 1 % 10 u$c para &o9os % leaduras % leaduras osmó$ilas. 5ecuento % epresión de los resultados' e esta $orma se prosiue 9asta obtener dos ci$ras sini$icatias. Los resultados se epresan en u$c por ramo o mililitro del producto se,n la naturaleza del mismo sólido o l*)uido4 epresado como un numero entre 1.0 % . dos ci$ras sini$icatias un entero % un decimal4 multiplicado por lu donde es la potencia apropiada de 10.
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(7emplo' A partir de un análisis de Aerobios mesó$ilos para un 7uo de papa%a se obtuieron los siuientes resultados' rimera dilución retenida 10 -2' 168 % 21
Conteo stimado de ufc 0g o ml$ e2resado con las dos cifras significati-as 2or la 2otencia adecuada de 13. ,em2lo: A partir de un análisis de Aerobios mesó$ilos en una muestra de aua se obtuo este resultado' rimera dilución retenida' 10 -1' ? % 10
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!A< 2' Ausencia de crecimiento si las dos ca7as correspondientes a la primera dilución no presentan crecimiento se in$orma el resultado como siue reportando el $actor de dilución de la más concentrada 4 1 13 ufc 0g o ml$ seg5n corres2onda.
,em2lo: A partir de un análisis de aerobios mesó$ilos en una muestra de 7uo se obtuo este resultado' rimera dilución retenida 10 -2' 0 % 0 u$c
'ota: !uando el conteo de colonias ecede al máimo rano se recomienda repetir el análisis empleando diluciones ma%ores con el $in de obtener resultados más con$iables. 5(!:(+ (+ LA!A >( !55HA+#<&< (+ AL#&(+< &M> &inisterio de espu"s del periodo especi$icado de incubación se cuentan las unidades $ormadoras de colonias presentes en las ca7as )ue contenan entre 30 a 300 u$c; los análisis )ue aplican a dic9o rano son' Aerobios mesó$ilos !oli$ormes Gacterias termó$ilas % en eneral para el análisis de microoranismos donde no se obseran reacciones enzimáticos ni de crecimiento sobre la super$icie del Aar. Gacterias patóenos o identi$icación enzimático posterior al recuento4' ara el recuento de estos ,ltimos microoranismos se emplea el rano 20 a 200 u$c como para el análisis de <. aureus G. cereus. &o9os % Leaduras' ara el recuento de mo9os % leaduras % leaduras osmó$ilas se debe utilizar el rano comprendido entre 10 % 100 u$c. 5(!:(+ B (5(<#N+ >( L< 5(<:LA><'
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!aso Heneral'
!i el cociente de esta di-isión es ma6or a +$ se re2orta el resultado obtenido en la dilución más concentrada$ 2ero$ si el cociente es menor o igual a +$ se re2orta la media aritm/tica de los recuentos de las dos diluciones utili7adas 2ara el cálculo. (l resultado obtenido se redondea a dos ci$ras sini$icatias. ara esto si la ,ltima ci$ra es in$erior a la ci$ra anterior no se modi$ica pero si la ultima ci$ra es ma%or o iual a la ci$ra anterior se incrementa en una unidad % se prosiue as* 9asta obtener las dos ci$ras sini$icatias. Los resultados se epresan en u$cD o ml de producto se,n la naturaleza del mismo % epresado como un n,mero entre 10 % dos ci$ras sini$icatias enteras4 multiplicado por 10 donde es la potencia apropiada de 10.
,em2lo' A partir de un análisis de aerobios mesó$ilos para un aua embotellada se obtuieron los siuientes resultados' rimera dilución retenida 10 -2 168 % 21 u$c
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las colonias presentes en las dos ca7as de la menor dilución multiplicándose por el inerso de la dilución e in$ormando el resultado as*'
Conteo stimado de ufc0g o ml$ e2resado con las dos cifras significati-as enteras. !A< 2' Ausencia de crecimiento si las dos ca7as correspondientes a la primera dilución no presentan crecimiento se reporta como neatio % se in$orma el resultado como siue utilizando para el reporte el $actor de dilución mas concentrado. !onteo (stimado P 1 10 u$c D o ml se,n corresponda !A< 3' !recimiento abundante; si las dos ca7as correspondientes a la primera dilución presentan crecimiento ma%or de 300 200 o 100 se,n sea el análisis se diide la ca7a en ?6 u 8 cuadrantes se cuenta el numero de colonias presentes en un cuadrante % se multiplica por el total de cuadrantes 9ec9os en la ca7a.
10-2 ca7a 24 10 ?4 10044 10-3 caia24 120 ?4 100044
10-2 J @20I600 100D2 J 66000 10-3 J ?00I?80 1000 12 J ??0000 ??0000D66000J 666 O 2 !omo el cociente es O a 2 se reporta el resultado de la menor dilución 10Q10 2 '66000u$cDml. Al redondear la ci$ra a dos enteros como se especi$icó anteriormente se obtiene 66000 )ue epresado con dos ci$ras sini$icatias es iual al !onteo (stimado de 66 103 u$cDml. +A' !uando el conteo de colonias eceda de 200 en 1D8 de la ca7a se reportará como Conteo stimado 8 1933 ufc0g o ml multi2licado 2or el in-erso de la ma6or dilución.
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. Materiales$ ;ui2os e &nsumos -
Aar HB $undido ?0 ml Aar <! $undido ?0 ml 1 Frasco de dilución o Fiola con capacidad de 20 ml con 0 ml de aua peptonada 0.1/ 3 tubos taparrosca con ml de aua peptonada cada uno 3 ipetas de 1 ml est"riles 1 ipeta de 10 ml est"ril 2 Asas de =ocRe% est"riles 1 Vaso de licuadora con cuc9illas est"riles % su correspondiente motor. 1 Galanza de precisión 0.1. ? !a7as de petri est"riles.
9. Procedimiento (l traba7o de las muestras debe iniciarse lo antes posible despu"s de su recolección si no se puede se debe mantener en re$rieración sin eceder las 2? 9oras.
rans$erir un mililitro de la dilución 10-1 a un tubo )ue contena ml de dilu%ente para obtener la dilución 10 -2 9omoenizar cuidadosamente la dilución % trans$erir un mililitro a otro tubo )ue contena ml del dilu%ente para obtener la dilución 10 -3. 5epetir estos
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pasos 9asta obtener el n,mero de diluciones deseadas cada dilución sucesia disminuirá 10 eces la concentración. e etri est"riles. Vierta el Aar <! $undido % mantenido a ?T !.1 a 20 ml4 &ezcle inmediatamente las ca7as con el medio moiendo estas a la derec9a iz)uierda arriba % aba7o m*nimo eces. >e7e solidi$icar e incube las ca7as inertidas a 3@T ! U 2T !. asadas 2? 9oras de incubación reise las ca7as % realice el recuento de colonias isibles incube nueamente % reise a las ?8 9oras realice el recuento. !riterio de selección' !uando se a a realizar el recuento debe seleccionar las diluciones para bacterias mesó$ilas aerobias en el rano de 30 a 300 colonias. ara el recuento de mo9os % leaduras inocule 0.1 ml de la dilución correspondiente sobre la super$icie de una ca7a de Aar HB de7e absorber e incube inertidas las ca7as a 2T ! por 3 a d*as.
=. 'i-el de "iesgo 2. bata de laboratorio mana lara uantes co$ia zapato cerrado tacón ba7o pantalón laro4
>. )ibliografía -
Albarracin F. B.; =errera F. !. eto de Laboratorio de &icrobiolo*a de Alimentos.1 Alaert !. (scola. &. &"todos de Análisis &icrobiolóicos de Alimentos .&adrid' (ditorial >*az de o%le &. . Geuc9at L 5. &icrobiolo*a de Alimentos. Fundamentos % Fronteras. araoza' (ditorial Acribia 2001. ascual &.5. &icrobiolo*a Alimentar*a' &etodolo*a Anal*tica para Alimentos % Gebidas. *az de
?. *neos
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Titulo: "CU'T# % )*CT"&*! M!@F&L*! *"#)&*!
+. #b,eti-os: 2.1 !onocer las t"cnicas empleadas para el recuento de bacterias &esó$ilas Aerobias en alimentos. 2.2 #nterpretar los resultados obtenidos % repórtanos correctamente. 2.3 >eterminar las implicaciones )ue para los alimentos tiene un recuento alto de este tipo de bacterias.
. Marco teórico: La ma%or*a de los alimentos industrializados ecepto los productos $ermentados4 deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un ran n,mero de microoranismos aun cuando estos microoranismos no sean conocidos como patóenos % no 9a%an alterado de $orma inapreciable las caracter*sticas oranol"pticas del alimento. Las bacterias mesó$ilas aerobias son un rupo 9etero"neo de bacterias capaces de crecer entre 1 % ? T! con un rano óptimo de 3 T! en la industria de alimentos es considerado como el rupo indicador más rande )ue eiste. (n productos terminados es utilizado como indicador de ida ,til. ara su recuento se utilizan medios de cultio )ue no tenan in9ibidores para permitir el crecimiento de los microoranismos. (ste recuento no se 9ace en productos enlatados ni $ermentados %a )ue por la naturaleza de estos alimentos el recuento no ser*a representatio. 5ecuentos altos en alimentos estables indican materias primas contaminadas o tratamiento no satis$actorio en productos perecederos pueden indicar condiciones inadecuadas de tiempo % temperatura durante su almacenamiento. La presencia de un n,mero eleado de bacterias aerobias mesó$ilas )ue crecen bien a temperatura corporal o próima a ella sini$ica )ue puede 9aberse dado condiciones $aorables a la multiplicación de microoranismos patóenos de orien 9umano o animal. (n alimentos des9idratados % en los conelados siempre se obtienen recuentos de bacterias iables más ba7os. As* un recuento en placa no puede re$le7ar la calidad microbiolóica de la materia prima antes de los procesos o tratamientos correspondientes % por ello es necesario llear un eamen microscópico directo para comprobar si e$ectiamente en un principio e ist*an o no abundantes microoranismos. Los recuentos de bacterias mesó$ilas son de poco alor a la 9ora de predecir la ida ,til de un alimento conserado en re$rieración %a )ue muc9os microoranismos mesó$ilos no crecen a temperaturas por deba7o de los T!.
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Los recuentos eleados de bacterias mesó$ilas en productos crudos o no tratados a menudo están constituidos por micro$lora normal o pueden indicar alteraciones incipientes del alimento % no un peliro potencial para la salud del consumidor.
. Materiales$ ;ui2os e &nsumos 1 Frasco de dilución o (rlenme%er capacidad de 20 ml con 0 de aua peptonada 0.1/. - 3 ubos taparrosca )ue contenan ml de aua peptonada cada uno - 6 !a7as de petri est"riles. - 1 ipetas de 10 ml est"ril - 3 ipetas de 1 ml est"riles. - 120 ml Aar late !ount $undido - 1 Vaso de licuadora con cuc9illas est"riles % su correspondiente motor. - Galanza - #ncubadora a 3Y! -
<. "eacti-os 9. Procedimiento -
repare las diluciones 10-110-2 % 10-3 en aua de peptona al 0.1 / a partir de las muestras de alimentos. e7e solidi$icar % adicione una capa sellante sobre la ca7a de7e solidi$icar nueamente. #ncube a 3 T! durante ?8 9oras.
=. 'i-el de "iesgo -