LAPORAN PRAKTIKUM MODUL SEL DAN GENETIKA
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS TANJUNGPURA 2009
DISUSUN OLEH : R. SEPTIANI WINDYASARI
(I11108002)
FRANSISKA ANGGRAENI UTAMI
(I11108008)
ANNISA FIRDAUSIA
(I11108009)
DEWI PERMATASARI
(I11108010)
LISA KUSUMAWATI
(I11108012)
AYU INDRIA PARAMITHA
(I11108013)
WORO ASRIATI N
(I11108014)
RIZKA RAHMANITA
(I11108017)
URAY MUTTIA WULANDARI
(I11108018)
ORI APRISIA PUTRI
(I11108023)
CORNELIUS LUTIONO
(I11108025)
IBNU RAHMAN
(I11108065)
JAMALLUDIN
(I11108071)
NURMALA
(I11108076)
HARIS
(I11108078)
RISNAWATI WAHAB
(I11108080)
PRAKTIKUM BIOLOGI I : FRAKSINASI SEL
I. Tujuan 1. Memisahkan komponen sel 2. Mengamati komponen sel dengan menggunakan mikroskop cahaya
II Tinjauan Pustaka A. Sel Sel adalah tingkatan struktural terendah di mana semua sifat kehidupan, termasuk reproduksi, dapat muncul1. Telah diakui sejak lama adanya dua jenis sel yang berbeda secara fundamenntal, sekurang-kurangnya dari sudut pandang struktural dan fungsional. Sel tersebut ialah sel prokariotik dan sel eukariotik. Sel prokariotik (Yn. pro, sebelum, + karyon, nukleus) hanya ditemukan dalam bakteri. Sel-sel ini kecil, mungkn dengan dinding sel diluar membran pembatas dan tidak dilengkapi dengan selaput inti yang memisahkan materi genetik dari unsur-unsur lainnya. Selain itu, prokariot tidak mempunyai histon terikat pada DNA dan umumnya tidak terdapat organel bermembran. Sebaliknya, sel eukariotik (Yn. eu, baik + karyon) lebih besar, dengan inti jelas yang diliputi oleh selaput inti. Histon berhubungan dengan materi genetik, dan terdapat banyak organel berlapis membran di dalam sitoplasma2. 1. Komponen sel Sel terdiri atas dua bagian utama : sitoplasma dan nukleus. a). Sitoplasma Komponen sel paling luar yang memisahkan sitoplasma dari lingkungan ekstrasel ialah membran plasma. Sitoplasmanya sendiri terdiri atas matriks yang didalamnya terendam beberapa komponen yang sering disebut organel. Membran sel membagi sel eukariotik dalam kompartemenkompartemen tegas yang mengatur jalur intraseluler dan perubahan yang terjadi diantara sel dan lingkungan.
b). Nukleus Nukleus merupakan organel terbesar dari sel, terlettak dipusat dan umumnya berbentuk bulat atau lonjong, tetapi dalam sel tertentu nukleus mungkin berlipid-lipid dalam atau berlobus. Nukleus mengandung satu atau dua nukleolus yang terutama terdiri atas sitonukleoprotein dan nukleolus ini tidak terpulas oleh reaksi feulgen. Nukleus tempat menyimpan materi genetik sel. Pada nukleotida dari molekul DNA yang panjang itu tersandi informasi yang diperlukan untuk sintesis semua protein integral dan sekresi sel3. 2. Organel sel Organel sebagai substansi hidup dalam sitoplasma mempunyai fungsi sendirisendiri dan berdasarkan fungsinya yang berkaitan dengan metabolisme sel2. 1) Mitokondria Mitokondria berasal dari kata mitos yang berarti benang dan chondrion yang berarti butir. Organel ini pertamakali diamati oleh Altman Podi tahun 1894 dan pada waktu itu dinamakan bioblas dan kemudian oleh Brenda pada tahun 1897 dinamakan mitokondria. Dengan menggunakan mikroskop cahaya, mitokondria tidak tampak dengan jelas kecuali kalau digunakan zat pewarna khusus yaitu janus green yang akan memberi warna biru hijau pada mitokondria karena adanya enzim sitokhrom oksidase. Jumlah mitokondria yang terbesar dijumpai pada sel oosit. Mitokondria merupakan organel yang sangat penting dalam proses pembentukan energi sehingga mitokondria mempunyai banyak jenis enzim4. Mitokondria adalah organel energi atau pembangkit tenaga sel, organel ini mengambil energi dari zat-zat gizi dalam makanan dan mengubahnya menjadi suatu bentuk yang dapat digunakan untuk menjalankan aktivitas sel5. 2) Ribosom Ribosom merupakan partikel kecil padat elekron, berukuran sekitar 20x30 nm. Terdapat 2 golongan ribosom, yaitu; golongan pertama terdapat dalam prokariot, kloroplas, mitokondria, dan yang lain terdapat dalam sel eukariotik. Kedua golongan ribosom itu terdiri atas dua subunit yang berbeda ukuran. Ribosom sangat basofilik karena banyaknya gugus
fosfat sebagai unsur rRNA yang bertindak sebagai polianion. Jadi termpat-tempat dalam sitoplasma yang banyak mengandung biru toluidin. Daerah basofilik ini juga terpulas dengan hematoksilin6. 3) Lisosom Lisosom adalah badan padat elektron, bulat, lonjong, atau sangat tidak teratur. Berdiameter 0,75 sampai 0,8 µm. Isinya tampak homogen atau terdiri atas granul padat dari berbagai ukuran. Lisosom dapat mengandung kristal atau sistem konsentaris, dikatakan sebagai fosfolipid bentuk mielin. Empat puluh atau lebih enzim hidrolitik terdapat dalam lisosom. Enzim ini mencakup protease, glikoase, nuklease fosfatase, fosfolifase, dan sulfafase. Lisosom berfungsi sebagai pencerna intrasel yang sanggup menghancurkan semua unsur kimiawi dalam sel3.
4) Retikulum Endoplasma Retikulum Endoplasma kasar dijumpai dalam sel yang dikhususkan untuk sekresi protein, seperti sel asini pankreas, fibroblas dan sel plasma. RE kasar dari tumpukan sisterna gepeng yang menyerupai kantung dan dibatasi oleh membran yang berhubungan langsung dengan membran luar dari selaput inti. Fungsi utama RE kasar adalah memisahkan protein yang tidak diperuntukan disitosol. Fungsi lainnya meliputi glikolisis awal glikoprotein, sintesis fosfolipid, perakitan protein dengan banyak rantai. Retikulum endoplasma halus berupa jalinan bermembran didalam sel. RE halus terlihat tidak bergranula dan halus, sisternanya lebih tubular dan lebih cenderung tampak seperti tumpukan saluran saling berhubungan menyerupai tumpukan sisterna gepeng. Fungsinya adalah mensintesis fosfolipid untuk semua membran sel. 5) Mikrotubula Mikrotubula ditemukan dalam sitoplasma semua sel eukariaotik. Mikrotubula itu berupa batang lurus dan berongga yang berdiameter sekitar 25 nm dan mempunyai panjang dari 200 nm hingga 25 µm. Dinding tabung berongga dibangun dari protein globular yang disebut tubulin. Setiap molekul tubulin terdiri atas dua subunit polipeptida yang
serupa, α-tubulin dan β-tubulin. Mikrotubula memanjang dengan menambah molekul tubulin diujung-ujungnya. Mikrotubula dapat dibongkar dan tubulinnya digunakan untuk membnagun mikrotubula di mana saja di dalam sel. Mikrotubula memberi bentuk dan mendukung sel, dan juga berfungsi sebagai jalur yang dapat digunakan organel dilengkapi dengan molekul motor untuk dapat bergerak1. 6) Mikrofilamen Mikrofilamen merupakan batang padat yang berdiameter sekitar 7 nm. Mikrofilamen ini disebut juga filamen aktin, karena filamen ini tersusun dari molekul aktin, suatru protein globular. Mikrofilamen adalah rantai ganda subunit aktin yang terlilit. Peran strukturalnya ialah untuk menahan tegangan1. 7) Vakuola Vakuola merupakan kantung terikat membran dalam sel. Vakuola mempunyai bermacam-macam fungsi. Vakuola terbagi menjadi dua, yaitu vakuola makanan untuk menyimpan cadangan makanan dan vakuola kontraktil yang memompa air berlebih keluar sel1 . B. Fraksinasi Sel Fraksinasi sel adalah proses fisik yang menggunakan tenaga sentrifugal untuk memisahkan organel dan komponen sel berdasarkan koefisien sedimentasinya. Koefisien sedimentasi sebuah partikel bergantung pada ukuran, bentuk, dan densitas serta viskositas mediumnya 6. Tujuan fraksinasi sel ialah untuk memisahkan sel menjadi bagian-bagian, memisahkan organel-organel utama sehingga fungsinya masing-masing dapat dipelajari1. Organel yang diperoleh dengan teknik ini dapat dianalisis kemurniannya dan komposisi kimiawi serta fungsinya dapat dipelajari secara in vitro6. Alat yang digunakan untuk memfraksinasi sel ini ialah sentrifuge, sejenis komedi putar untuk tabung reaksi yang mampu berputar pada berbagai kecepatan. Mesin yang paling canggih, yang disebut ultrasentrifuge, dapat berputar secepat 80.000 putaran (revolution) per menit (rpm) dan memberikan gaya pada partikel-partikel hingga 500.000 kali gaya gravitasi (500.000 g).
Fraksinasi diawali dengan homogenasi, pengacauan jaringan dan selnya dengan bantuan peralatan seperti blender dapur atau peralatan ultrasuara. Maksudnya ialah untuk memecahkan sel tanpa merusak organelnya. Sel yang dikacaukan disentrifugasi pada berbagai kecepatan dan jangka waktu yang berbeda-beda untuk mengisolasi komponen-komponen yang ukurannya berbeda. Pemutaran homogenat, campuran organel-organel yang mirip sup dalam sentrifuge akan memisahkan bagian-bagian sel menjadi dua fraksi yaitu pelet yang terdiri atas struktur-struktur yang lebih besar yang mengumpul dibagain bawah tabung reaksi dan suupernatan yang terdiri atas bagian-bagian sel yang lebih kecil yang tersuspensi dalam cairan diatas pelet tadi. Kemudian supernatan yang telah diperoleh ini dituang ke dalam tabung lain yang disentrifugasi kembali. Proses ini terus diulangi dengan kecepatan yang semakin meningkat pada setiap tahapan, sehingga mengumpulkan komponen yang semakin lama semakin kecil dalam pelet yang berurutan. Fraksinasi sel membuat peneliti dapat mempersiapkan komponen spesifik sel dalam jumlah besar untuk mengkaji komposisi dan fungsinya. Dengan mengikuti pendekatan ini, para ahli biologi telah dapat mengaitkan berbagai fungsi sel ke organel-organel yang berbeda, satu tugas yang akan lebih jauh lebih sulit jika menggunakan sel utuh. Misalnya, satu fraksi seluler yang dikumpulkan dengan proses sentrifugasi memiliki enzim yang berfungsi dalam proses metabolisme yang dikenal sebagai respirasi seluler. Mikroskop elektron mengungkapkan bahwa fraksi ini mengandung banyak oraganel yang disebut mitokondria. Bukti ini membantu ahli biologi sel untuk menentukan bahwa mitokondria meupakan tempat respirasi seluler. Sitologi dan biokimia saling melengkapi dalam mengkolerasikan struktur dan fungsi seluler1. Dengan menggunakan fraksinasi sel, bagian-bagian dari sel dapat dilihat bentuk dan diketahui fungsinya. Hal ini dikarenakan dengan menggunakan sentrifuge pada kecepatan dan jangka waktu yang berbeda dapat mengisolasi komponen yang ukurannya berbeda. Setelah dilakukan tahap sentrifugasi, bagain yang tidak membentuk pelet (supernatan) dituang dan disentrifugasi lagi, dengan kecepatan yang lebih tinggi. Apabila homogenat disentrifugasi pada 800 g selama 10 menit, maka pelet yang mengandung banyak nukleus dan pecahan seluler akan mengendap. Supernatan disentrifugasi pada 20.000 g selama 15 menit, maka mitokondria dan lisosom mengendap. Supernatann disentrifugasi pada 100.000 g selama 60 menit, maka mikrosom atau potongan membran plasma dan membran internal sel akan
mengendap. Jika supernatan diberi natrium deoksikolat terlebih dulu dan kemudian disentrifugasi pada 105.000 g selama 120 menit, mikrosom akan terdisosiasi dan mengendap secara terpisah sebagai membran retikulum endoplasma dan ribosom6.
III. Metode A. Alat dan Bahan 1. Alat
Sentrifuge
Pipet Transfer
Tabung Mikrofuge
Mikroskop Cahaya
Pipet 100µl, 1000 µl
Kaca Objek dan Gelas Penutup
2. Bahan
Homogenat Hepar Tikus Besar/Rat
PBS (Phospat Bufer Saline)
Metylen Biru
Janus Green
Pada waktu praktikum, telah disediakan homogenate hepar tikus yang dibuat dengan menghancurkan hepar tikus menggunakan homogenizer dan sebelumnya telah diberi larutan sukrosa 2%. B. Cara Kerja Tahap I : 1. Homogenat diambil 1,5 ml pada tabung mikrofuge dan diputar menggunakan sentrifugasi dengan kecepatan 4000 g selama 15 menit. Namun sebelum dilakukan sentrifugasi, perlu dilakukan penimbangan berat antara tabung yang yang letaknya berseberangan agar mendapat keseimbangan saat perputaran. 2. Supernatan dipisahkan dan dipindahkan ke tabung mikrofuge yang baru 3. Endapan/pellet
diencerkan
dengan
menambahkan
200
µl
kemudian
ditambahkan metylen blue dengan perbandingan 1:1. Hasil pengenceran tersebut diteteskan pada kaca objek dan diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 40×10. Komponen sel yang didapatdiperhatikan dan diamati. Lalu dibuat cacatan maupun gambarnya. Tahap II : 1. Supernatan yang didapat sebelumnya diputar kembali dengan kecepatan 12.000 g selama 10 menit lalu dibiarkan sejenak dan diputar kembali dengan kecepatan yang sama selama 5 menit. Sebelum dilakukan sentrifugasi, perlu dilakukan penimbangan berat antara tabung yang yang letaknya berseberangan agar mendapat keseimbangan saat perputaran. 2. Endapan yang terjadi dipisahkan dan supernatant yang terbentuk dibuang. 3. Endapan/pellet diencerkan kembali dengan menambahkan 100 µl PBS dan ditambahkan Janus Green dengan perbandingan 1:1. Hasil pengenceran tersebut diteteskan pada kaca objek dan diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 100×10. Organel sel yang didapat diperhatikan dan diamati. Lalu dibuat cacatan maupun gambarnya.
IV. Hasil I. Sediaan / Pewarnaan : Homogenat hepar tikus besar / Methylen Blue
Perbesaran
: 40×10
Keterangan
: 1. Nukleolous 2. Nukleus
II. Sedian / Pewarnaan : Homogenat hepar tikus besar / Janus Green Perbesaran
: 100×10
Keterangan
: 1. Mitokondria
V. Pembahasan
Sebelum melakukan pengamatan terhadap komponen dan organel-organel sel , maka dilakukan proses fraksinasi sel terlebih dahulu. Saat praktikum, telah disediakan homogenat hepar tikus yang dibuat dengan menghancurkan hepar tikus menggunakan homogenizer dan sebelumnya telah diberi larutan sukrosa 2%. Setelah itu dilakukan proses sentrifugasi yang dibagi menjadi dua tahap, tahap pertama pertama dilakukan untuk melihat fraksi nukleus sedangkan tahap kedua untuk melihat fraksi mitokondria. Setiap tahap sentrifugasi akan dihasilkan supernatan dan pelet. Supernatan yang dihasilkan pada tahap pertama akan digunakan untuk disentrifugasi kembali agar diperoleh fraksi yang berat jenisnya lebih kecil dari nukleus.Sedangkan pelet yang dihasilkan pada sentrifugasi pertama merupakan nukleus. Untuk memperoleh hasil yang baik maka saat sentrifugasi, tabung-tabung mikrofuge sebaiknya ditimbang terlebih dahulu, usahakan tabung yang akan diletakkan berseberangan memiliki berat yang sama agar mendapatkan keseimbangan gravitasi saat dilakukan perputaran. Pada pelet pertama dilakukan proses pewarnaan dengan PBS dan Metylen Blue. Larutan PBS merupakan larutan garam yang mengandung Sodium Klorida, Sodium Fosfat, Potasium klorida, dan Potasium Fosfat (dalam campuran tertentu). PBS sering digunakan sebagai substansi pengencer, bersifat isotonik dan non-toksik terhadap sel. Penambahan PBS bertujuan untuk membentuk lapisan cair pada biomolekul (nukleus). Pembentukan lapisan cair ini untuk mencegah denaturasi, sedangkan Metylen Blue yang bersifat heterosiklik aromatik dengan rumus molekul C16H18ClN3S. Metylen Blue berwujud padat pada suhu kamar berwarna hijau dan tidak berbau, dan jika dilarutkan dalam air maka akan berwarna biru. Metylen Blue digunakan dalam proses pemulasan inti sel sebab bersifat non-toksik sehingga tidak mengganggu komposisi DNA yang terdapat dalam nukleus. Metylen Blue akan berinteraksi dengan inti sel dan menimbulkan warna biru, ini dikarenakan nukleus mengandung asam nukleat dan protein basa (histon) sehingga bersifat basofilik dan dijelaskan dalam penggunaan PBS dan Metylen Blue adalah untuk melepaskan ikatan dan gumpalan sel sehingga sel dengan mudah dapat diamati. Selanjutnya supernatan yang dihasilkan pada sentrifugasi pertama yang terdiri atas bagian-bagian sel yang lebih kecil yang tersuspensi dalam cairan ditas pelet, disentrifugasi kembali dengan kecepatan yang semakin meningkat, sehingga menggumpulkan komponen yang semakin lama semakin kecil. Disini dapat ditemukan fraksi mitokondria, selanjutnya diberi pewarnaan dengan PBS dan Janus
Green. Janus Green memiliki rumus kimia C3OH31N6Cl. Senyawa ini dapat dijadikan sebagai indikator untuk mengubah warna berdasarkan keberadaan oksigen terlarut. Janus Green juga digunakan karena mengandung enzim sitokrom oksidase. Dalam proses ini Janus Green akan berinteraksi dengan mitokondria, sehingga akan tampak mitokondria berwarna kehijauan. Dalam praktikum ini kelompok kami sedikit kesulitan melihat nukleus diakibatkan homogenisasi hepar yang kurang baik atau halus. Selain homogenisasi hepar yang kurang baik atau halus ada beberapa faktor yang dapat mengurangi hasil pengamatan, yaitu kepekaan pengamat dan keadaan mikroskop yang dipergunakan.
VI. Kesimpulan Sel adalah tingkatan struktural terendah di mana semua sifat kehidupan, termasuk reproduksi, dapat muncul1. Sel terbagi atas komponen dan organel-organel yang memiliki bentuk dan fungsi yang berbeda satu sama lainnya namun saling mendukung. Dengan menggunakan proses fraksinasi sel kita dapat memisahkan sel menjadi bagian-bagian, memisahkan organel-organel utama sehingga fungsinya masing-masing dapat dipelajari1. Organel yang diperoleh dengan teknik ini dapat dianalisis kemurniannya dan komposisi kimiawi serta fungsinya dapat dipelajari secara in vitro6. Pewarnaan terhadap organel sel yang akan diamati sangat diperlukan untuk mempermudah dalam pengamatan organel sel.
VII. Daftar Pustaka 1. Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2002. Biologi, Ed 5. Jilid 1. Jakarta: Erlangga. 2. Junquiera LC, Carneiro J, Kelley RO. 1998. Histologi Dasar, Ed 8. Jakarta: EGC 3. Bloom dan DW Fawcett . 2002. Buku Ajar Histologi, Ed 12. Jakarta: EGC 4. Juwono dan Achmad Zulfa J. 2002. Biologi Sel. Jakarta: EGC 5. Sherwood, Lauralee. 2001. Fisiologi Manusia dari Sel ke Sistem, Ed 2. Jakarta: EGC 6. Junquiera LC dan J Carneiro . 2007. Hitologi Dasar:Teks dan Atlas, Ed 10 Jakarta:EGC
