fraksinasi

FITOKIM (Fraksinasi)

FRAKSINASI Landasan Teori

Fraksinasi adalah suatu proses pemisahan senyawa  –   senyawa berdasarkan tingkat kepolaran. Jumlah dan senyawa yang dapat dipisahkan menjadi fraksi berbeda –  berbeda –  beda   beda tergantung pada jenis tumbuhan. Pada prakteknya dalam melakukan fraksinasi digunakan dua metode yaitu dengan menggunakan corong pisah dan kromatografi kolom. Corong

pemisah atau corong

pisah adalah

peralatan

laboratorium

yang

digunakan

dalam ekstraksi dalam ekstraksi cair-cair untuk memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran antara dua fase pelarut dengan densitas dengan densitas berbeda  berbeda yang takcampur. Umumnya

salah

satu

fase

berupa

larutan

air

dan

yang

lainnya

berupa pelarut berupa pelarut

organik  lipofilik  lipofilik seperti eter, seperti eter, MTBE,  MTBE, diklorometana,  diklorometana, kloroform,  kloroform, atau  atau pun etil pun etil asetat. Kebanyakan asetat. Kebanyakan  pelarut organik berada di atas fase air keculai pelarut yang memiliki atom dari unsur  halogen. Corong pemisah berbentuk kerucut yang ditutupi setengah bola. Ia mempunyai penyumbat di atasnya dan keran dan keran di bawahnya. Corong pemisah yang digunakan dalam laboratorium terbuat dari kaca borosilikat dan kerannya dan kerannya terbuat dari kaca dari kaca ataupun Teflon. ataupun Teflon.   Ukuran corong pemisah  bervariasi antara 50 mL sampai 3 L. Dalam skala industri, corong pemisah bisa berukuran san gat  besar dan dipasang sentrifuge. dipasang sentrifuge. Untuk memakai corong ini, campuran dan dua fase pelarut dimasukkan ke dalam corong dari atas dengan corong keran ditutup. Corong ini kemudian ditutup dan digoyang dengan kuat untuk membuat dua fase larutan tercampur. Corong ini kemudian dibalik dan keran dibuka untuk melepaskan tekanan uap yang berlebihan. Corong ini kemudian didiamkan agar pemisahan antara dua fase berlangsung. Penyumbat dan keran corong kemudian dibuka dan dua fase larutan ini dipisahkan dengan mengontrol keran corong. Destilasi bertingkat atau fraksinasi adalah proses pemisahan destilasi ke dalam bagian-bagian dengan titik didih makin lama makin tinggi yang selanjutnya pemisahan bagian-bagian ini dimaksudkan untuk destilasi ulang. Destilasi bertingkat merupakan proses pemurnian zat/senyawa cair dimana zat pencampurnya berupa senyawa cair yang titik didihnya rendah dan

tidak berbeda jauh dengan titik didih senyawa yang akan dimurnikan. Dengan perkataan lain, destilasi ini bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa dari suatu campuran yang komponen-komponennya memiliki perbedaan titik didih relatif kecil. Destilasi ini digunakan untuk memisahkan campuran aseton-metanol, karbon tetra klorida-toluen, dll. Pada proses destilasi bertingkat digunakan kolom fraksinasi yang dipasang pada labu destilasi. Tujuan dari  penggunaan kolom ini adalah untuk memisahkan uap campuran sen yawa cair yang titik didihnya didihn ya hampir sama/tidak begitu berbeda. Sebab dengan adanya penghalang dalam kolom fraksinasi menyebabkan uap yang titik didihnya sama akan sama-sama menguap atau senyawa yang titik didihnya rendah akan naik terus hingga akhirnya mengembun dan turun sebagai destilat, sedangkan senyawa yang titik didihnya lebih tinggi, jika belum mencapai harga titik didihnya maka senyawa tersebut akan menetes kembali ke dalam labu destilasi, yang akhirnya jika  pemanasan dilanjutkan terus akan mencapai harga titik didihnya. Senyawa tersebut akan menguap, mengembun dan turun/menetes sebagai destilat. Macam –  Macam –  macam  macam proses fraksinasi: a) Proses Fraksinasi Kering (Winterization)

Fraksinasi kering adalah suatu proses fraksinasi yang didasarkan pada berat molekul dan komposisi dari suatu material. Proses ini lebih murah dibandingkan dengan proses yang lain, namun hasil kemurnian fraksinasinya rendah. b) Proses Fraksinasi Basah ( Wet ) Wet F ractination 

Fraksinasi basah adalah suatu proses fraksinasi dengan menggunakan zat pembasah (Wetting (Wetting  Agent ) atau disebut juga proses Hydrophilization proses  Hydrophilization atau detergent proses. detergent  proses. Hasil fraksi dari proses ini sama dengan proses fraksinasi kering. c) Proses Fraksinasi dengan menggunakan Solvent (pelarut)/ Solvent olvent F ractionation

Ini adalah suatu proses fraksinasi dengan menggunakan pelarut. Dimana pelarut yang digunakan adalah aseton. Proses fraksinasi ini lebih mahal dibandingkan dengan proses fraksinasi lainnya karena menggunakan bahan pelarut. Condentation  d) Proses Fraksinasi dengan Pengembunan ( F ractional Condentation  )

Proses fraksinasi ini merupakan suatu proses fraksinasi yang didasarkan pada titik didih dari suatu zat / bahan sehingga dihasilkan suatu produk dengan kemurnian yang tinggi. Fraksinasi  pengembunan ini membutuhkan biaya bia ya yang cukup cuk up tinggi namun proses produksi p roduksi lebih cepat dan kemurniannya lebih tinggi.

Pembahasan

Pada praktikum kali ini kami melakukan fraksinasi terhadap maserat. Fraksinasi sendiri adalah merupakan suatu metode pemisahan senyawa –  senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya. Pada  praktikum kali ini kami melakukan fraksinasi menggunakan corong pisah. Corong pemisah atau corong pisah adalah peralatan laboratorium yang digunakan dalam ekstraksi cair –   cair untuk memisahkan komponen  –   komponen dalam suatu campuran antara dua fase pelarut dengan densitas berbeda yang tak campur. Metodologi

Alat

:

1) Corong pisah. 2) Gelas ukur. 3) Erlenmeyer. 4) Botol vial. Bahan : 1) H2SO4 5 ml. 2) n - heksan 5 ml dan 15 ml. 3) Etil asetat 5 ml. 4) Kertas pH. 5)  NH4OH untuk membasahi kertas pH secukupnya. 6) Metanol 5 ml.

Cara Pemakaian corong pisah: 1)

Campuran dan dua fase pelarut dimasukkan ke dalam corong dari atas dengan corong keran ditutup.

2)

Corong ini kemudian ditutup dan digoyang dengan kuat untuk membuat dua fase larutan tercampur.

3) Corong ini kemudian dibalik dan keran dibuka untuk melepaskan tekanan uap yang berlebihan. 4) Corong ini kemudian didiamkan agar pemisahan antara dua fase berlangsung. 5)

Penyumbat dan keran corong kemudian dibuka dan dua fase larutan ini dipisahkan dengan mengontrol keran corong. Prosedur kerja dengan corong pisah:



Cara kerja seperti biasa, dilihat dalam bagan.



Semua proses dilakukan dalam corong pisah.



Setelah didapat beberapa fraksi, fraksi –  fraksi tersebut disimpan dalam botol vial.



Simpan. Daftar Pustaka

» http://www.wikipedia.com/corongpisah.  Diakses pada tanggal 07 November 2011, pukul 21.55 WIB. »

http://hidupituind4h.blogspot.com/2011/01/destilasi.html.  Diakses pada tanggal 07 November 2011, pukul 23.13 WIB.

Praktikum Fraksinasi  Ilmu Farmasi : praktikum, bahan makalah fraksinasi, prosedur fraksinasi dll 

1. Tujuan 

Praktikan diharapkan mampu menguasai prinsip fraksinasi



Praktikan diharapkan mampu melakukan proses fraksinasi

2. Teori dasar

Sebagian besar senyawa kimia ditemukan di alam dalam keadaan tidak murni. Biasanya, suatu senyawa kimia berada dalam keadaan tercampur dengan senyawa lain. Karena itu, diperlukan proses pemisahan untuk mendapatkan senyawa murni atau untuk menghilangkan  pengotor yang dapat mengganggu dalam proses analisis. Tahapan fraksinasi, pemisahan, dan pemurnian dapat dilakukan dengan macam-macam teknik yang diantaranya adalah dengan metode kromatografi ataupun kombinasi kromatografi dengan metode lain. Kadang-kadang dengan satu kali saja dilakukan fraksinasi, misalnya dengan fraksinasi, misalnya dengan fraksinasi menggunakan teknik ekstraksi cair-cair, dapat diperoleh suatu senyawa dengan jumlah yang cukup besar yang selanjutnya tinggal dilakukan tahap  pemurniaan, misalnya dengan rekristalisasi yang sederhana. Tapi dalam kenyataannya, sering kali diperlukan fraksinasi yang berulang-ulang, baik dengan teknik yang sama ataupun kombinasi dengan teknik fraksinasi lainnya. Metode pemisahan yang banyak digunakan adalah : 1. Ekstraksi cair-cair 2. Kromatografi, teknik kromatografi yang sering digunakan adalah kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas-cair (KGC), dan kromatografi cair kerja tinggi (KCKT). Tapi pada modul penuntun praktikum ini hanya akan dibahas kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom (KK), dan kromatografi cair vakum (KCV). 3. Alat dan Bahan

a) Alat : 

Corong pisah



Cawan penguap



Gelas kimia



Tabung reaksi



Water bath



Gelas ukur



Pipa kapiler



Sinar UV



Silica gel



Kertas saring



Alumunium foil

 b) Bahan : 





Ekstrak pekat  N-butanol Asam asetat



 N-heksan



 N-etil asetat



Metanol



Kloroform



Aquadest

4. Prosedur percobaan 

Fraksinasi I

Ekstrak pekat + aquadest + N-heksan + Etanol ↓ Dimasukkan kedalam corong pisah, kemudian kocok perlahan-lahan ↓ Selang beberapa saat buang gas dari corong pisah ↓ Didiamkan hingga terjadi pemisahan ↓ Pisahkan komponen-komponen beda fasanya (fraksi N-heksan dan fraksi residu ekstrak)



Fraksinasi II

Fraksi residu ekstrak + etil asetat ↓ Dimasukkan kedalam corong pisah, kemudian kocok perlahan-lahan ↓ Selang beberapa saat buang gas dari corong pisah ↓ Didiamkan hingga terjadi pemisahan ↓ Pisahkan komponen-komponen beda fasanya (Fraksi etil asetat dan fraksi residu ekstrak) 

Fraksinasi III

Fraksi residu ekstrak + N-butanol ↓ Dimasukkan kedalam corong pisah, kemudian kocok perlahan-lahan ↓ Selang beberapa saat buang gas dari corong pisah ↓ Didiamkan hingga terjadi pemisahan ↓ Pisahkan komponen-komponen beda fasanya (Fraksi N-butanol dan fraksi residu ekstrak)





Profil KLT

Penjenuhan chamber Eluen dimasukkan kedalam gelas kimia ± 1cm dari permukaan ↓

Dimasukkan kertas saring yang telah ditotol ekstrak ↓ Ditutup dengan alumunium foil ↓ Ditunggu hingga eluen meresap keseluruh kertas 

KLT

Fraksi yang sudah dipekatkan, masing-masing : fraksi N-heksan, fraksi etil asetat,fraksi N butanol dan fraksi air ekstrak ↓ Fraksi yang telah pekat ditotol pada silica gel ↓ Silica gel ditaruh secara tegak lurus di chamber yang telah dijenuhkan ↓ Setelah bercak terbentuk ↓ Keringkan silica gelnya ↓ Diamati bercak yang terbentuk (diamati dibawah s inar UV)

[Oleh Mahasiswa Farmasi Unisba]

Baca Lagi Artikel Lain, Sedot Ilmunya : Laporan Praktikum dan Makalah       

Laporan Praktikum Tablet Kempa Langsung Laporan Praktikum Isolasi Hespiridin Dari Kulit Buah Jeruk (Citrus aurantufolia) Laporan Praktikum Kristalisasi, Sublimasi Dan Penentuan Titik Leleh Laporan Praktikum Supositoria Laporan Praktikum Emulsi Laporan Praktikum Isolasi, Identifikasi Dan Konfirmasi Mikroba Praktikum Pembuatan Sediaan Infus Glukosa

      

Praktikum Metode Ekstraksi Laporan Praktikum Sediaan Larutan Isolasi Fitosterol dari Kedawung Laporan Praktikum Penentuan Spektrum Kerja Antibiotik  Laporan Kombinasi Antibiotik Tetrasiklin, Ampisilin, dan Kloramfenikol Teori Praktikum Skrining Fitokimia Sintesis Aspirin

Oleh: Fauzi Bt

KCV (kromatografi cair vakum) 1.

Fraksinasi

Fraksinasi merupakan proses pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak berdasarkan  perbedaan tingkat kepolarannya. Salah satu metode yang dapat digunakan dalam fraksinasi adalah Kromatografi Cair Vakum (KCV) (Gambar 2). Prinsip dasar KCV i ni adalah pemisahan secara adsorpsi dan partisi yang dipercepat dengan bantuan pompa vakum (Hostettmann dkk, 1997). Keuntungan KCV dibandingkan dengan kromatografi konvensional terletak pada jumlah fase gerak yang digunakan. Pada KCV, konsumsi fase gerak hanya 80% atau lebih sedikit dibandingkan dengan kromatografi konvensional, sedangkan kekurangan metode ini adalah membutuhkan waktu yang cukup lama (Hostettmann dkk, 1997).

Kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kemasan rapat yang maksimal, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penyerap lalu divakum kembali. Kolom dihisap sampai kering dan siap d ipakai. Cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, mulai pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan (Hostettmann dkk, 1997).

KROMATOGRAFI CAIR VAKUM (KCV) Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan memisahkan crude extract    menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida (Ghisalberti, 2008). Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu: a.

Cara Basah Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata. Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al ., 2006).

b. Cara kering

Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan (Sarker et al ., 2006). Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai metode seperti preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara kering (Canell, 1998). Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama (Canell, 1998; Sarker et al ., 2006).

Kromatografi Cair-Vakum dalam Skrining Fitokimia Jun 8 Posted by admin

1 Votes

Kromatografi Cair Vakum (KCV)

Merupakan kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan maksimum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. Walaupun KCV memerlukan jumlah sampel yang lebih banyak dari  pada kromatografi lapis tipis (KLT), KCV tetap ekonomis dalam sisi biaya.  )  Tumbuhan sambiloto (Andr ographi s pani culata Ness.

Sambiloto tumbuh liar di tempat terbuka seperti kebun, tepi sungai tanah kosong yang agak lembap atau dipekarangan. Daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan bersilang, bentuk laset, pangkal runcing, ujung meruncing, tepi rata, permukaan atas hijau tua, bagian bawah hijau muda, panjang 2-8 cm, lebar 1-3 cm. Bunga berbibir berbentuk tabung, kecil-kecil, warnanya  putih bernoda ungu,. Buah kapsul berbentuk jorong. Perbanyak den gan biji atau stek batang. Klasifikasi tanaman:

Kingdom

: Plantae (tumbuhan)

Subkingdom

: Tracheobionta (berpembuluh)

Superdivisio

: Spermatophyta (menghasilkan biji)

Divisio

: Magnoliophyta (berbunga)

Kelas

: Magnoliopsida (berkeping dua/dikotil)

Subkelas

: Asteridae

Ordo

: Scrophulariales

Familia : Acanthaceae Genus

: Andrographis

Spesies : Andrographis paniculata Nees Sifat-sifat kimia yang dimiliki tanaman sambiloto (Andrographis paniculata Nees ) antara lain rasa pahit, dingin, masuk meridian paru, lambung, usus besar dan usus kecil. Daun dan  percabangannya mengandung laktone yang terdiri dari deoksiandrografolid, andrografolid (zat  pahit), neoandrgrafolid, 14-deoksi-11-12-didehidroandrografolid, dan homoandrografolid, flavonoid, alkene, keton, aldehid, mineral (kalium,kalsium, natrium). Asam kersik, damar. Flavonoid terbanyak diisolasi dari akar yaitu polimetatoksivaflavon, andrografin, pan, ikkulin. Mono-0-metilwhitin dan apigenin-7,4 dimetileter. Zak aktif andrografoid terbukti berkhasiat sebagai hepatoprotektor (melindungi sel hati dari zat toksin). Efek farmakologis yang dimiliki Andrographis paniculata Nees antara lain sebagai bakteriostatik  pada Staphylococcus Aurcus, Pseudomonas aeruginosa. Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae dan Escherichia Coli. Sambiloto juga efektif untuk pengobatan infeksi in vitro. Andrografoid menurunkan demam yang ditimbulkan oleh pemberian vaksin yang menyebabkan panas pada kelinci. Sedangkan andrografolid dapat mengakhiri kehamilan dan menghambat pertumbuhan trofosit plasenta. Dari segi farmakologi, sambiloto mempunyai efek muskarinik pada p embuluh darah, efek pada jantung iskenik, efek pada respirasi sel. Sifat kholeretik, anti inflamasi dan anti  bakteri. Komponen aktifnya seperti coandrografolid, deoksiandrografolid dan 14-deoksi-11, 12didehidroandrografolid berkhasiat anti radang dan antipiretik.

Khasiat herba Andrographis paniculata Nees antara lain pada penyakit hepatitis, infeksi saluran empedu, disentri basiler, tifoid, diare, influenza, radang amandel (tonsilitis), abses paru, malaria, radang paru (pneumonia), radang saluran nafas (bronchitis), radang ginjal (pielonefritis), radang telingah tengah (OMA), radang usus buntu, sakit gigi, demam, kencing nanah (gonore), kencing manis (diabetes melitus), TB paru, skrofulderma, batuk rejan (pertusis) sesak nafas, leptospirosis, darah tinggi, kusta, keracunan jamur, keracunan singking, keracunan tempe bongkrek, keracunan makanan laut. Kanker, penyakit trofoblas, kehamilan anggur (mola hidatidosa) tumor paru. Metodologi

Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan  pompa vakum serta wadah penampung fraksi. Kolom G-3 diisi adsorben sampai setinggi 5 cm, kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk bersalut dilarutkan dalam pelarut organik yang cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak tersebut ditambahkan adsorben dengan bobot sama dengan bobot ekstrak. Campuran ini digerus sampai homogen, dikeringkan dan dimasukkan ke dalam kolom G-3 kemudian diratakan. Permukaan lapisan adsorben ditutup dengan kapas. Elusi diawali dengan pelarut non polar dilarutkan dengan kombinasi pelarut dengan polaritas meningkat. Sebanyak 50 gram sampel  Andrographis paniculata Nees yang telah berupa serbuk diekstraksi secara maserasi menggunakan 200 ml metanol di dalam labu Erlenmeyer 250 ml. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi karena ditinjau dari segi teksturnya yang lunak, selain itu juga untuk mencegah terjadinya kerusakan komponen kimia yang tidak tahan terhadap pemanasan. Penyari yang digunakan untuk mengekstraksi adalah metanol, karena metanol merupakan pelarut yang bersifat semi polar, dengan demikian methanol dapat menyari komponen-komponen kimia yang sifatnya polar maupun yang sifatnya non polar. Campuran tersebut lalu digojog kuat setiap 10 menit selama 1 jam setelah itu disaring menggunakan kertas saring. Filtrat yang didapatkan ditampung, dan ditambah 150 ml metanol kembali. Replikasi ini dilakukan sebanyak 2 kali. Filtrat yang diperoleh diuapkan diatas cawan porselen di atas penangas air, hingga didapatkan volume filtrat 10 ml. Kemudian ambil sedikit cuplikan untuk dilakukan uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan disimpan. Sisa dari cuplikan tersebut lalu ditambahkan 2 gram serbuk silika gel (adsorben) lalu diuapkan hingga kering. Dalam hal ini, bobot silika gel yang digunakan harus mempunyai bobot yang sama dengan ekstrak. Dengan demikian, silika gel tersebut akan tersalut ekstrak. Silica gel yang telah tersalut ekstrak harus diuapkan hingga benar-benar kering, karena  jika tidak kering maka akan merusak proses pemisahannya. Silika gel yang telah tersalut ekstrak tersebut digerus sampai homogen, dikeringkan dan dimasukkan ke dalam kolom G-3 sampai setinggi 5 cm kemudian diratakan dan dipadatkan dengan bantuan vakum. Kemudian di lapisan  paling atas ditutup dengan kapas. Sebelum vakum dijalankan, pelarut yang kepolarannya paling rendah dituangkan ke permukaan adsorben kemudian vakum dijalankan. Elusi diawali dengan pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan (polaritas meningkat) dengan harapan bahwa komponen kimianya terelusi secara berurutan berdasarkan tingkat kepolarannya.. Oleh karena itu, Kromatografi Cair Vakum menggunakan tekanan yang rendah untuk meningkatkan lajua

aliran fase gerak. Kolom dihisap perlahan-lahan ke dalam wadah penampung fraksi sampai kering dengan cara memvakumkannya. Urutan pelarut yang digunakan adalah sebagai berikut: Fraksi

Pelarut

Komposisi

Volume (ml)

1

Heksana

100

100

2

Heksana-etil asetat

50:50

100

3

Etil asetat

100

100

4

Etil asetat-metanol

75:25

100

5

Etil asetat-metanol

50:50

100

6

Etil asetat-metanol

25:75

100

7

Metanol

100

100

Variasi fase gerak ini digunakan untuk mendeteksi polaritas sampel. Karena dengan adanya variasi fase gerak maka akan menyebabkan perbedaan interaksi sampel yang terjerap dan hal ini akan menyebabkan perbedaan hasil dalam uji kualitatif dengan KLT nanti. Apabila senyawa sampel tersebut memilliki polaritas yang mendekati bahkan mirip dengan polaritas fase gerak, maka hal ini akan menyebabkan senyawa sampel banyak yang akan ikut teradsorpsi oleh fase gerak dan fase gerak yang ditampung tersebut akan banyak mengandung kandungan aktif sampel dan fase gerak tersebut cocok untuk melarutkan senyawa sampel tersebut ( hal inilah yang menyebabkan perbedaan variasi sampel saat dilakukan KLT ). Pelarut yang digunakan oleh kelompok kami adalah no.5 yaitu etil asetat-metanol (50:50). Setiap fraksi hasil KCV ditampung kemudian dipekatkan untuk selanjutnya dianalisis dengan menggunakan KLT. Analisis KLT dilakukan dengan menggunakan fase diam lempeng silica gel GF254 berukuran 7×10 cm untuk setiap fraksi dan fase gerak. Pada analisis KLT ini untuk setiap fraksi dibuat 6 spot yang akan dideteksi dengan menggunakan 6 macam pereaksi semprot. Deteksi hasil bercak hasil elusi dilakukan dengan dilihat dibawah sinar UV 254 nm, UV 366 nm, dan dengan 6 macam pereaksi semprot yaitu reagen FeCl3; 2,4-DNPH, Dragendorf, vanillinasam sulfat, antimony (III) klorida, dan sitroborat. Fase gerak yang digunakan pada sistem KLT adalah sebagai berikut: Fraksi

Fase gerak

Komposisi

1-4

Heksana-Etil asetat

3:2

5-8

Kloroform-Metanol

7:3

9-10

BAW

3:1:1

Elusi dilakukan dengan fase gerak yang berbeda tiap fraksinya sampai mencapai batas akhir. Deteksi pertama adalah dengan sinar UV 366 nm dan 254 nm. Kemudian lempeng dibagi menjadi 6 bagian, dan tiap bagian disemprot dengan reagen : FeCl3, 2,4-DNPH, dragendorf, vanilin-asam sulfat dengan pemanasan 105°C selama 5 menit, antimon (III) klorida ( sebelum dan sesudah pemanasan 105°C selama 5 menit), dan sitroborat ( dideteksi pada sinar tampak dan sinar UV 366 nm. Fungsi dari digunakannya pereaksi semprot ini ad alah untuk uji kualitatif senyawa aktif sambiloto. Fungsi dari pereaksi semprot FeCl3 adalah untuk mendeteksi adanya gugus fenol pada tanin atau polifenolat, reaksi positif adanya senyawa ini adalah dengan terbentuknya kompleks  berwarna biru, merah ungu, hijau, atau hitam kuat; pereaksi semprot dragendorf digunakan untuk mendeteksi komponen alkaloid, reaksi positif dari uji ini adalah dengan ditunjukkan warna coklat atau jingga-coklat dan merah-jingga dengan latar belakang kuning sampai kelabu;  pereaksi semprot sitroborat digunakan untuk mendeteksi keberadaan senyawa golongan flavonoid dari glikosida saponin reaksi positif ditunjukkan dengan berpendar di bawah sinar UV 366nm. Pereaksi semprot Antimon (III) klorida digunakan untuk mendeteksi turunan terpen dari mono terpen sampai politerpen dan steroid, selain itu da pat juga digunakan untuk mendeteksi glikosida  jantung, saponin, lisnogin. Reaksi positif dari uji ini ditunjukkan dengan bercak berwarna ungu atau coklat pada sinar tampak, apabila dibawah sinar UV 366 nm umumnya bercak berpendar ungu merah, biru, dan hijau. Vanilin-asam sulfat dapat digunakan untuk mend eteksi senyawa atsiri (terpenoid, fenol dan + turunannya serta fenilpropan) dengan mekanisme abstraksi H  sehingga terbentuk senyawa ikatan rangkap terkonjugasi, peristiwa ini tidak terjadi sekaligus tetapi satu persatu secara  berurutan yang menyebabkan warnanya semakin lama semakin tidak stabil, dapat juga untuk mendeteksi senyawa saponin yang ditunjukkan dengan adanya bercak berwarna biru, violet biru atau terkadang berwarna kekuningn bila diamati pada sinar biasa. Pereaksi semprot 2,4-DNPH dapat digunakan untuk mendeteksi secara kualitatif gugus karbonil dari keton atau aldehid, hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning. 2,4-NDPH tidak bereaksi dengan gugus karbonil pada asam karboksilat, amida, dan ester. Hasil

Hasil analisis dengan KLT fraksi dari KCV untuk masing-masing fraksi adalah seba gai berikut. 1. Fraksi 1

Pada praktikum ini, kelompok kami mendapatkan bagian fraksi pertama yaitu fraksi heksana:etil asetat (60:40). Fraksi ini bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang bersifat nonpolar. Serbuk yang di KCV berwarna hijau sehingga cairan atau fraksi yang didapatkan juga berwarna hijau tua. Sitroborat adalah pereaksi untuk mengidentifikasi secara kualitatif adanya flavono id. Jika positif maka akan berwarna kuning di sinar tampak dan berpendar di UV 366. Pada plat, tidak ada  bercak yang berwarna kuning, tetapi terdapat bercak yang berpendar di UV 366 setelah di semprot sitroborat. Hal ini menunjukkan bahwa dimungkinkan adanya kandungan flavonoid  pada fraksi ini. Fraksi yang terdapat pada fraksi ini diduga merupakan flavonoid dalam bentuk  bebas dan bukan dalam bentuk glikosidanya karena tersari oleh fase gerak dari KCV yang relatif nonpolar yaitu heksana-etil asetat (60:40). Jika dalam b entuk glikosida akan bersifat polar dan akan tersari dengan pelarut polar (like dissolve like). Sedangkan pada sinar tampak, tidak terlihat warna kuning karena mungkin konsentrasi flavonoidnya sedikit sehingga bercaknya sangat tipis. 2. Fraksi 2

Dengan hasil ini diketahui bahwa ada satu bercak dimungkinkan mengandung tannin atau senyawa fenolik lainnya karena berwarna orange dibawah UV 366. Selain itu juga positif terhadap pereaksi semprot dragendroff, 2,4-DNPH, SbCl3, Vanilin H2SO4, dan sitroborat. Dengan demikian fraksi kedua mengandung alkaloid, senyawa nitrogen heterosiklik, atau amina kuartener, gugus keto atau aldehid, turunan terpena (monoterpen hingga politerpen, steroid), senyawa minyak atsiri (terpenoid, turunan fenilpropana, dan fenol), sen yawa 3’,4’-dihidroksi flavon dan 3’,4’-dihidroksi flavonol. 3. Fraksi 3

Hasil KLT: Warna Bercak Pereaksi

Rf 

Hasil Tampak

254

366

0.13

-

-

Biru

-

0.5

-

-

Biru

-

0.13

-

Pemadaman

Biru

-

0.23

-

-

Orange

-

0.5

-

Pemadaman

Biru

-

0.96

-

-

Orange

-

0.13

-

Pemadaman

Biru

-

FeCl3

Dragendorf 

2,4-DNPH

0.23

-

-

Orange

-

0.5

-

Pemadaman

Biru

-

0.96

-

-

Orange

-

0.13

-

Pemadaman

Biru

+

0.23

-

-

Orange

-

0.5

-

Pemadaman

Biru

+

0.96

-

-

Orange

-

0.13

-

Pemadaman

Biru

-

0.23

-

-

Orange

-

0.5

-

Pemadaman

Biru

-

0.96

-

-

Orange

-

0.13

-

Pemadaman

Biru

+

0.23

-

Hitam

Orange

+

0.5

-

Pemadaman

Biru

+

0.96

-

-

Orange

+

SbCl3

Vanilin-H2SO4

Sitroborat

Dari data di atas dapat disimpulkan bahwa pada fraksi dua memberikan reaksi positif pada senyawa flavonoid dan glikosida saponin serta turunan terpen dari monoterpen sampai politerpen dan steroid. 4. Fraksi 4

Fraksi 4 dielusi dengan fase gerak kloroform-metanol (7:3) dan pelarut etil asetat-metanol (75:25). Setelah elusi, terlihat spot berwarna hijau tua dengan Rf 0.9615. Spot ini menyebabkan  peredaman berwarna hijau di bawah UV 254 dan berflouresensi ungu di bawah UV 366 dengan Rf yang sama. Fraksi 4 bereaksi positif dengan pereaksi FeCl3 karena munculnya bercak hijau. Artinya fraksi 4 mengandung gugus fenol dari tanin atau polifenat. Namun fraksi 4 ini bereaksi n egatif dengan  pereaksi lain. Sebenarnya fraksi 4 berfluoresensi merah di bawah UV 366 dengan pereaksi SbCl3 (reaksi positif) tetapi tidak berwarna coklat atau ungu pada sinar tampak seperti yang seharusnya terjadi jika reaksi SbCl3 positif. Jadi kemungkinan fraksi 4 mengandung terpen dan turunannya

(monoterpen hingga politerpen dan streroid) tapi hal ini tidak dapat dipastikan karena seharusnya muncul warna ungu atau coklat pada sinar tampak. Kemungkinan memang ada kandungan terpen atau turunannya dalam fraksi 4 tetapi jumlahnya sangat kecil sehingga tidak ada warna ungu atau hijau pada sinar tampak, atau pada fraksi 4 terdapat senyawa yang berfluoresensi merah seperti terpen dan turunannya tetapi sebenarnya senyawa tersebut bukan terpen, hanya saja sama-sama  berfluoresensi merah setelah disemprot dengan SbCl3 seperti terpen. Karena pelarut yang digunakan tidak terlalu polar, maka senyawa nonpolar masih bisa ditemukan dalam fraksi 4 tetapi jumlahnya tidak banyak karena sudah terlarut dalam fraksi-fraksi sebelumnya yang lebih nonpolar. 5. Fraksi 5

Pada percobaan ini, kelompok kami mendapat fraksi kelima yang menggunakan pelarut pada KCV etil asetat-metanol (25:75). Pelarut tersebut relatif bersifat polar dibandingkan pelarut pelarut sebelumnya, sehingga senyawa yang tersari dari sampel sambiloto adalah senyawasenyawa yang bersifat polar. Fraksi yang diperoleh kemudian dipekatkan dan dilakukan KLT dengan fase gerak Kloroform-Metanol (7:3). Fase gerak ini bersifat nonpolar, sehingga senyawa yang bersifat polar akan tertahan dalam fase gerak silika gel yang bersifat polar, sedangkan senyawa nonpolar akan terelusi bersama fase gerak. Dari hasil KLT hanya diperoleh satu bercak saja dengan nilai Rf 1. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung dalam fraksi kelima ini kemungkinan adalah senyawa yang nonpolar. Akan tetapi bercak yang dihasilkan hanya satu, jadi kemungkinan senyawa yang terkandung dalam sambiloto telah tersari pada fraksi-fraksi sebelumnya yang menggunakan pelarut yang lebih nonpolar. Bercak tersebut terlihat berfluorosensi hijau dibawah UV 366 dan mengalami peredaman fluorosensi di bawah UV 254. Setelah disemprot dengan pereaksi semprot FeCl3, 2,4-DNPH, dragendorf, vanilin-asam sulfat dengan pemanasan 105°C selama 5 menit, SbCl3, dan sitroborat sama sekali tidak menunjukkan perubahan. Dalam hal ini bercak mengalami pemadaman pada UV 254 dan berfluorosensi hijau pada UV 366. Reaksi dengan pereaksi semprot FeCl3 adalah positif, terbukti dengan terbentuknya kompleks  berwarna hijau ketika dilihat dibawah UV 366. Hal ini menunjukkan adanya gugus fenol pada tanin atau polifenolat. Reaksi dengan pereaksi semprot dragendorf menunjukkan hasil negatif dengan tidak terbentuknya warna coklat atau jingga-coklat. Hal ini menunjukkan tidak adanya senyawa alkaloid dalam fraksi kelima ini. Reaksi dengan pereaksi semprot sitroborat positif ditunjukkan dengan berpendar hijau di bawah sinar UV 366 yang menunjukkan keberadaan senyawa golongan flavonoid. Dengan pereaksi semprot SbCl3 reaksi positif dibawah sinar UV 366, bercak berpendar hijau yang menunjukkan adanya senyawa terpen dan turunannya. Sedangkan dengan pereaski semprot Vanilin H2SO4 bereaksi negatif yang menunjukkan tidak adanya senyawa minyak atsiri (terpenoid, turunan fenilpropana, dan fenol). Sedangkan dengan  pereaksi semprot 2,4-DNPH bereaksi negatif, yang menunjukkan tidak adanya gugus karbonil dari keton atau aldehid. Dari hasil KLT tersebut dapat disimpulkan bahwa kemungkinan dalam fraksi kelima dari ekstrak sambiloto ini mengandung senyawa fenolat atau polifenol, flavonoid, turunan terpen, akan tetapi tidak mengandung senyawa alkaloid, senyawa atsiri (terpenoid, turunan fenilpropana, dan fenol), dan gugus karbonil dari keton atau aldehid.

6. Fraksi 6

Pada filtrat fraksi 6 yang didapatkan, kemungkinan tinggal sedikit senyawa fenolik yang ada. Jika terdapat senyawa fenolik, maka akan terjadi tailing  saat dielusi dan dapat dilihat di bawah sinar UV. Apalagi, pada percobaan, penguapan dilakukan dengan panas dengan dialiri udara dengan kipas angin. Maka, fenolik akan teroksidasi dan membentuk mulai dari difenol samapi  polifenol dan menyebabkan tailing . Dari semua pereaksi semprot yang digunakan, hanya didapati bercak pada penyemprotan dengan reagen sitroborat, yaitu bercak fluoresensi ungu muda, baik pada UV 254 nm maupun 366 nm dengan Rf 0.0641. Warna ini tidak menunjukkan hasil positif untuk reagen sitroborat, maka tidak terdapat sen yawa metabolit yang dapat terdeteksi oleh sistem yang digunakan pada fraksi 6. Tidak didapatkannya bercak yang pasti nyata mungkin terjadi karena senyawa metabolit telah banyak larut di fase nonpolar. Sedangkan untuk metabolit polar, fase gerak yang digunakan masih kurang polar (kuat) untuk mengelusi. Dimungkinkan, metabolit polar akan larut di metanol murni pada fraksinasi kelompok terakhir (fraksi 7). Kemungkinan lain adalah didapatkannya hasil negatif palsu akibat kurang pekatnya fraksi yang dielusi pada KLT, sehingga keb eradaan senyawa tersebut secara kualitatif tidak terdeteksi. 7. Fraksi 7

Dari percobaan, didapat data sebelum disemprot pada pengamatan dengan sinar tampak, hasil elusi menghasilkan warna hijau kecoklatan. Pada pengamatan pada UV 254 nm pun tidak tampak adanya bercak di ke enam totolan pada plat KLT. Sedangkan pada pengamatan di bawah sinar UV 366 nm, tampak adanya peredaman bercak yang berjarak 2 cm dari totolan awal. Semua totolan (6 totolan) memiliki bercak dengan Rf yang sama yaitu 0,25. Setelah disemprot, pada sinar tampak tidak tampak bercak di sepanjang plat KLT. Dari ke enam totolan tidak ada bercak yang dihasilkan. Pada pengamatan pada UV 254 nm pun tidak tampak adanya bercak di ke enam totolan pada plat KLT baik sebelum atau sesudah dilakukan  pemanasan pada pereaksi semprot yang membutuhkan pemanasan. Sedangkan pada pengamatan di bawah sinar UV 366 nm, tampak adanya peredaman bercak yang berjarak 2 cm dari totolan awal pada bagian yang disemprot dengan pereaksi semprot sitroborat. Rf dari bercak tersebut adalah 0,25. Adanya peredaman ini, menunjukkan tidak adanya kandungan flavonoid dalam sampel uji (ekstrak daun sambiloto). Pada proses fraksinasi, pelarut yang digunakan adalah metanol dengan komposisi 100%. Dari semua komposisi pelarut yang digunakan, komposisi metanol 100% merupakan pelarut yang  paling polar. Fraksi yang didapat merupakan hasil fraksinasi yang paling akhir. Karena pelarut yang digunakan merupakan pelarut yang paling polar, maka senyawa-senyawa yang polar yang akan terfraksinasi. Namun, hasil percobaan yang kurang memuaskan yaitu hanya keberadaan flavonid saja yang teridentifikasi mungkin disebabkan karena fraksi metanol yang di dapat merupakan fraksi terakhir sehingga, senyawa-senyawa polar yang terkandung banyak yang telah terfraksinasi pada pelarut-pelarut sebelumnya. Selain itu, senyawa-senyawa nonpo lar juga tidak atau sedikit sekali yang terfraksinasi karena pelarut yang di gunakan bersifat polar. Dari hasil diatas dapat disimpulkan sebagai berikut :

FRAKSI

FeCl3

Dragendorf 

2,4-DNPH

SbCl3

Vanilin-

Sitroborat

H2SO4 1

-

+

-

+

-

+

2

+

+

+

+

+

+

3

-

-

-

+

-

+

4

+

-

-

-

-

-

5

+

-

-

+

-

+

6

-

-

-

-

-

-

7

-

-

-

-

-

-

Dengan demikian berdasarkan skrinning fitokimia yang telah dilakukan dapat dikatakan bahwa secara umum tanaman sambiloto mengandung tanin atau senyawa polifenolat yang mengandung gugus fenol. Sambiloto juga mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, serta senyawa terpenoid dan turunannya yang bersifat nonpolar karena hanya terlarut pada fraksi awal hasil KCV dimana  pelarut-pelarut yang digunakan relatif bersifat nonpolar. Kesimpulan 1. 2. 3.

4.

5.

Pelarut yang digunakan pada KCV untukm fraksinasi dari fraksi kelima adalah etil asetat-metanol (25:75) yang relatif bersifat polar. Fraksi kelima bereaksi positif terhadap pereaksi semprot FeCl3, SbCl3, dan sitroborat. Akan tetapi bereaksi negatif terhadap pereaksi semprot Dragendorff, 2,4 -DNPH, dan Vanilin-H2SO4 Berdasar hasil KLT pada fraksi kelima terkandung senyawa fenolat atau polifenol, flavonoid, turunan terpen, akan tetapi tidak mengandung senyawa alkaloid, senyawa atsiri (terpenoid, turunan fenilpropana, dan fenol), dan gugus karbonil dari keton atau aldehid. Secara umum hasil KCV daun sambiloto menunjukkan bahwa daun sambiloto mengandung senyawa-senyawa yang sifatnya relatif nonpolar karena senyawa-senyawa tersebut lebih terlarut pada fraksi-fraksi awal dimana pelarut yang digunakan mempunyai sifat nonpolar. Berdasarkan percobaan, daun sambiloto secara umum mengandung senyawa tanin atau senyawa polifenolat yang mengandung gugus fenol, senyawa terpenoid dan turunannya, senyawa flavonoid, serta alkaloid.

Daftar Pustaka http://www.erowid.org/archive/rhodium/chemistry/equipment/drycolumn.vacuum.chromatography.html

Harborne, J.B, 1987, Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, diterjemahkan oleh Dr. Kosasih Patmawinata dan Dr. Iwang Soediro, ITB, Bandung.

Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Penerbit ITB : Bandung. Wagner H.,S. Bladt and EM. Zgainski, 1984, Plant Drugs Analysis., Springer-Verlag., Berlin Oleh: Alwi Isnandar, Tedo Haris Candra, Aditya Wardhana (file nemu di komputer ccrc, terus tak upload deh)