FRAKSINASI SEL Muhammad Zulfikar Mahmudin 1147020042 Kelompok 3, 4B Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Sunan Gunung Djati Bandung E-mail :
[email protected] ABSTRAK Fraksinasi sel adalah teknik untuk memisahkan bagian-bagian sel. Secara umum, teknik ini melibatkan homogenisasi, yaitu pemecahan sel secara halus, dan sentrifugasi, yaitu pemisahan komponen-komponen sel oleh gaya sentrifugal dalam alat sentrifuge. Tujuan dari praktikum kali ini adalah memisahkan komponen sel untuk membedakan komponenkomponen sel tersebut. Prosedur kerja pertama menyiapkan alat dan bahan, kemudian membuat homogenate daun bayam dengan blender yang telah diberi larutan sukrosa 2%, mengambil 1,5 ml homogenate pada tabung mikrofuge, dan memutarnya dengan sentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit, memisahkan supernatan dan memindahkan ke tabung mikrofuge yang baru, mengencerkan endapan atau pellet dengan menambahkan 200µl PBS, menambahkan metylen blue dengan perbandingan 1:1, meneteskan pada kaca objek dan memeriksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 40x10, mengamati komponen sel yang di dapat, memutar kembali supernatant yang di dapat dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit, mendiamkan sejenak kemudian mengulangi dengan kecepatan yang sama selama 5 menit, memisahkan endapan dan membuang supernatan, mengencerkan kembali endapan atau pellet dengan menambahkan 100 µl PBS dan memberi janus green di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100, mengamati organel sel yang di dapat dan membuat catatan maupun gambarnya. Hasil yang didapat adalah densitas inti sel lebih besar dibandingkan dengan densitas mitokondria ditunjukkan dari bobot inti sel yang lebih besar dibandingkan dengan bobot mitokondria. Kata Kunci: Bayam, Fraksinasi, Homogenate, Pellet, Sentrifugasi.
I.
PENDAHULUAN
Perkembangan teknologi yang
bagian bawah tabung sentrifuge, dan
semakin pesat memungkinkan orang
supernatan, yang terdiri atas bagian-
untuk bisa melihat struktur yang paling
bagian sel yang lebih kecil yang
kecil dalam kehidupan kita yaitu sel.
tersuspensi dalam cairan di atas pelet
Pengamatan sel dengan mikroskop terus
tersebut
memperoleh kemajuan seiring dengan
sentrifugasi kembali dengan kecepatan
penemuan
penyempurnaan
yang lebih tinggi untuk mendapatkan
mikroskop itu sendiri. Sebagai bagian
pelet yang lebih ringan atau kecil
dari makhluk hidup juga mengandung
daripada
banyak komponen atau bagian-bagian
sentrifugasi
dari sel yang kemudian dikenal dengan
disentrifugasi dengan kecepatan yang
organel. Untuk bisa mempelajari organel
makin
sel dapat di lakukan dengan teknik
komponen yang makin kecil dalam pelet
fraksionasi sel, sehingga kita dapat
yang berurutan. Pelet tersebut dapat di
memisahkan organel utama sehingga
resuspensi dan dimurnikan lebih lanjut
fungsinya dapat dipelajari (Ningsih,
dengan sentrifugasi densitas gradien
2006). teknik
(Horton , 2006). Fraksionasi sel digunakan untuk
untuk memisahkan bagian-bagian sel.
mempelajari sifat biokimia dan fisiologi
Secara umum, teknik ini melibatkan
organel di luar sel. Prosedur dasar
homogenisasi,
fraksionasi
sel
secara halus, dan sentrifugasi, yaitu
homogenasi
untuk
pemisahan
sel
membran plasma dan dinding sel untuk
gaya sentrifugal dalam alat
mengeluarkan sitoplasma dan kemudian
sentrifuge. Pemutaran homogenat di
dilanjutkan dengan sentrifugasi untuk
dalam
memisahkan organel sel. Kemurnian tiap
dan
Fraksinasi
oleh
sel
yaitu
adalah
pemecahan
komponen-komponen
sentrifuge
akan
sel
memisahkan
.
Supernatan
pelet
pertama,
diferensial,
tinggi
sehingga
dengan
didapatkan
dimulai
komfirmasi
di
supernatan
dengan
menghancurkan
bagian-bagian sel kedalam dua fraksi,
fraksi
yaitu pelet, yang terdiri atas struktur-
mikroskop (Metzler, 2001).
struktur lebih besar yang terkumpul di
di
dapat
menggunakan
Teknik yang digunakan untuk
Alat
yang
digunakan
pada
pemisahan organel sel adalah semata-
praktikum kali ini adalah homogenizer
mata di dasarkan pada sentrifugasi,
(blender), sentrifuge, mikro pipet dan tip
kepadatan
dan
(100µl, 1000µl), tabung mikrofuge,
perbedaan
koefisien
kecepatan
membuat
kepadatan
dan
mikroskop cahaya, kaca objek dan gelas
sedimentasi. Hasil akhir dari proses
penutup. Bahan yang digunakan adalah
sentrifugasi yaitu organel sel dapat
daun bayam, sukrosa 2%, PBS (Phospat
keluar atau lepas dari membran plasma.
Buffer Saline), metylen blue, janus
Pelet yang di hasilkan dari skema atau proses
sentrifugasi
pertama
dapat
mengandung organel namun dengan presentase kecil. Fraksi lebih lanjut pada proses sentrifugasi akan menghasilkan inti,
mitokondria,
serta
mikrosom
masing-masing dengan densitas yang berbeda. Langkah-langkah sentrifugasi di lakukan dalam larutan buffer
agar
struktur protein tetap lestari (Nilsson, 2004). Tujuan dari praktikum kali ini adalah memisahkan komponen sel untuk membedakan komponen-komponen sel
II.3.
green. Langkah Kerja Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan, kemudian membuat homogenate daun bayam dengan cara menghancurkan daun bayam menggunakan blender yang sebelumnya telah diberi larutan sukrosa 2%. Selanjutnya mengambil 1,5 ml homogenate pada tabung mikrofuge, dan memutarnya dengan sentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit, memisahkan supernatant dan memindahkan ke tabung mikrofuge yang baru, lalu mengencerkan endapan
tersebut.
atau
pellet
dengan
menambahkan 200µl PBS, kemudian II.
METODE II.1. Lokasi
menambahkan metylen blue dengan dan
Waktu
Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu I UIN Sunan Gunung Djati Bandung pada pukul 15.30-18.00 WIB. II.2. Alat dan Bahan
perbandingan 1:1, meneteskan pada kaca objek
dan
memeriksa
dibawah
mikroskop dengan perbesaran 40x10, lalu mengamati komponen sel yang di dapat, dan membuat catatan maupun gambarnya.
Selanjutnya
memutar
kembali supernatant yang di dapat
sebelumnya dengan kecepatan 12.000
endapan
rpm selama 10 menit, setelah selesai lalu
menambahkan 100 µl PBS dan memberi
mendiamkan
kemudian
janus green di bawah mikroskp dengan
mengulangi lagi dengan kecepatan yang
perbesaran 10x100, dan yang terakhir
sama selama 5 menit, lalu memisahkan
adalah mengamati organel sel yang di
endapan dan membuang supernatant,
dapat juga membuat catatan maupun
kemudian
gambarnya.
III.
sejenak
mengencerkan
kembali
atau
pellet
dengan
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.
V.
VI.
Foto Pengamatan
Literatur
No.
VIII. IX. XII. 2 2 1
VII. 1.
X.
Perbesaran: 10x10 Sumber: (Dokumentasi Pribadi, 2016). XV. Keterangan: 1. Inti Sel 2. Mitokondria
XI.
XVI.
Percobaan
ini
(Rickwood, 2000). Fraksionasi sel ini
adalah mengenai fraksinasi subseluler.
dapat digunakan untuk mempersiapkan
Prinsip dari percobaan ini adalah partikel
komponen-komponen spesifik sel dalam
yang tersuspensi akan mengendap ke
jumlah besar untuk mengkaji komposisi
dasar karena pengaruh gravitasi, juga
dan
didasarkan atas massa, ukuran, panjang
Komponen spesifik yang ada pada
partikel,
percobaan
dan
densitas
kali
XIII. Perbesaran: 10x10 XIV. Sumber: (Behike, 2010)
partikel
fungsinya ini
(Campbell ialah
inti
2000) sel
dan
mitokondria.
Kedua
organel
ini
negara isotonik. PBS sering digunakan
merupakan perpustakaan genetik yang
sebagai
dimiliki oleh sel eukariot. Hal itu
berbagai
dikarenakan keduanya memiliki struktur
mempertahankan pH protein. Protein
DNA yang mengontrol sistem kerja pada
memerlukan kisaran pH tertentu untuk
sel tersebut. Pada proses fraksinasi
menjaga netralitas pada asam amino
digunakan
yaitu
tertentu, untuk mempertahankan struktur
sukrosa 2%m dan PBS (Phosphat Buffer
protein. Jika tidak, struktur protein akan
Saline),
dua
bahan
menurut
menjelaskan
bahwa
kimia
larutan
penyangga
eksperimen
Artika
(2010)
terdenaturasi.
sukrosa
EDTA
XVII.
dalam untuk
Fraksionasi
sel
berfungsi untuk menjaga struktur bayam
dilakukan dengan menggunakan alat
supaya tidak mati sel-selnya sehingga
sentrifuse yang prosesnya dinamakan
ketika diisolasi masih bisa berfungsi.
sentrifugasi. Sentrifugasi ini dilakukan
Sedangkan fungsi PBS menurut Yuwono
berdasarkan perbedaan densitas molekul
(2008) adalah PBS sering digunakan
sel.
dalam percobaan biologi sel untuk
sentrifugasi untuk pemisahannya. Prinsip
mempertahankan osmolaritas sel. Garam
kerja
mengandung ion, yang menyeimbangkan
substansi
jumlah ion garam di dalam sel. Jika sel
molekul dengan cara memberikan gaya
yang tenggelam ke dalam solusi yang
sentrifugal sehingga substansi yang lebih
memiliki terlalu banyak garam ion, air
berat (pelet) akan berada di dasar
akan bocor keluar dari sel,menyebabkan
sedangkan substansi yang lebih ringan
sel menyusut. Sebaliknya, jika sel
(supernatan) akan terletak di atas. Teknik
terbenam ke dalam solusi yang memiliki
ini dapat digunakan untuk mengisolasi
ion terlalu sedikit garam, air akan masuk
dan mengkarakterisasi molekul biologi
ke dalam sel, menyebabkan sel pecah.
juga komponen subseluler (Underwood,
Oleh karena itu, sangat penting saat
2002).
melakukan percobaan biologi sel untuk
dilakukan sentrifugasi sebanyak dua
menjaga sel-sel di osmolaritas tertentu.
kali. Penyebabnya organel mitokondria
PBS adalah pada osmolaritas yang
yang kecil membutuhkan perbedaan
benaruntuk
kecepatan yang besar dalam sentrifugasi.
menjaga
sel-sel
dalam
Percobaan sentrifus
ini adalah
berdasarkan
Isolasi
fraksi
menggunakan memisahkan berat
jenis
mitokondria
Hal ini dikarenakan semakin kecil
Metylen blue tidak beracun, sehingga
ukuran suatu komponen sel maka akan
aman digunakan. Secara fisik, metylen
semakin
blue memberi warna pada sel, namun
sulit
untuk
mendapatkan
fraksinya dan semakin besar kecepatan
secara
yang
metabolisme
digunakan
untuk
mengisolasi
komponen tersebut (Hendra, 2001). XVIII.
kimia
tidak
dalam
menggangu sel,
sehingga
pengamatan tetap akurat. Selain itu,
Berdasarkan
metylen blue bisa menjadi indikator
perbedaan densitas tersebut, mitokondria
adanya
yang memiliki densitas yang lebih
warnanya berangsur-angsur memudar,
rendah dibandingkan dengan inti sel. Hal
maka sel yang diamati masih hidup dan
itu terbukti dengan praktikum yang telah
menghasilkan enzim yang menguraikan
dilakukan
metilen biru. Jika warnanya tetap biru,
dengan
mensentrifugasi
homogenat pada kecepatan 700 g dalam waktu 10 menit menghasilkan pellet yang di dalamnya terdapat inti sel sedangkan sentrifugasi supernatannya pada kecepatan 5000 g dalam waktu 15 menit menghasilkan pellet yang di dalmnya
terdapat
mitokondria.
Berdasarkan prinsip ketergantungan laju pengendapan terhadap densitas, semakin berat densitas partikel maka semakin banyak diperlukan kecepatan dan waktu untuk
mensentrifugasinya.
Pada
pengamatan dibawah mikroskop pellet yang telah di sentrifugasi diberi metylen blue yang diteteskan pada kaca objek, fungsi metylen blue ini adalah menurut Hendra
(2001)
menjelaskan
bahwa
metylen blue berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang diamati melalui mikroskop.
kehidupan
dalam
sel.
Jika
berarti sel yang diamati sudah mati. XIX. KESIMPULAN XX.
Metode
yang
digunakan untuk fraksinasi subseluler adalah sentrifugasi. Prinsip sentrifugasi pada
percobaan
ini
perbedaan
massa,
partikel,
dan
Sentrifugasi mengisolasi molekul
berdasarkan
ukuran,
panjang
densitas
partikel.
digunakan
untuk
dan
biologi
mengkarakterisasi juga
komponen
subseluler yaitu inti sel dan mitokondria berdasarkan perbedaan densitas yang dimiliknya. Inti sel dan mitokondria memiliki DNA yang sangat penting untuk metabolisme sel terutama sintesis protein. Densitas inti sel lebih besar dibandingkan
dengan
densitas
mitokondria ditunjukkan dari bobot inti
sel yang lebih besar dibandingkan
XXVIII. Ningsih,
Dian
Riana.,
dengan bobot mitokondria. Semakin
Warsinah, dan Suwandri. 2006.
kecil ukuran suatu komponen sel maka
Fraksinasi
Ekstrak
akan semakin sulit untuk mendapatkan
Kulit
BatangRhizophora
fraksinya dan semakin besar kecepatan
mucronatadan
yang
Hambatnya
digunakan
untuk
mengisolasi
komponen tersebut. XXI. XXII.
Escherichia
Metanol
Uji
Daya Terhadap
coli.
Jurnal
Molekul. Vol. 1. No. 1. Hal: 15-
DAFTAR PUSTAKA
Artika, Mega. 2010. Struktur dan Fungsi Subseluler. Bogor: Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.
30. XXIX. Rickwood D. 2000. Centrifugation : a practical approach. Washington DC : IRLPress.
XXIII. Campbell. 2000. Biologi Jilid Kesatu Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.
XXX.
XXIV.
Hendra A. 2001. Teknik Pemisahan dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press.
XXXI. Yuwono, Tribowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.
XXV.
Horton, H. R. et al. 2006.
Biochemistry: The Chemical
XXXII. Behike, Joachim dan Otto Ristau. 2010. Enhanced Resolution of Sedimentation CoefficientDistribution Profiles by Extrapolation to Infinite Time. Journal Biophysics. 2(39): 449-455.
Reactions of Living Cells,2nd
XXXIII. LAMPIRAN
Principles of Biochemistry, 4th ed. Upper Saddle River, NJ: Pearson/Prentice Hall. XXVI. Metzler, D.E.
2001.
ed.San Diego: Academic Press. XXVII. Nilsson, T., et al. 2004. Mass spectrometry
in
high
throughput proteomics: ready forthe big time. Journal of Sitology. 7(9): p. 68-15.
Underwood AL. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta :Erlangga.
XL. XXXIV. XXXV.
XLI.
Gambar 4. Proses Centrifuge
Gambar 1. Proses Homogenizer Pada Bayam
XLII. XLIII.
Gambar 5. Hasil Centrifuge 5000 rpm
XXXVI. XXXVII.
Gambar 2. Proses Pengambilan Supernatan Bayam Menggunakan Mikropipet
XLIV. XLV.
Gambar 6. Endapan di Ambil
XXXVIII. XXXIX.
Gambar 3. Supernatan yang Telah di Homogenizer
XLVI. XLVII.
Gambar 7. Endapan Setelah Diberi Metylen Blue
LI.
Gambar 9. Proses Pemasukan Kedalam Freezer
XLVIII. XLIX.
Gambar 8. Hasil Centifuge ulang 12.000 rpm
LII.
LIII.
Gambar 10. Hasil setelah di Freezer
L.
