PRÁCTICA No. 2 EXTRACCIÓN DE CASEÍNA Y DETERMINACIÓN DE PI PRACTICE No. 2 CASEIN EXTRACTION AND DETERMINATION OF PI Bioquímica Bogotá, Colombia 24/10/2015 Resumen En diversos compuestos conformados por macromoléculas se presentan fenómenos como la precipitación, a partir de la cual se da lugar a diferentes productos. Este es el caso de la caseína, la cual es la proteína que se encuentra en mayor cantidad en la leche y debido a su punto isoeléctrico presenta la característica de precipitación. A partir de la precipitación de la caseína por acción del ácido acético, su tratamiento químico y la preparación de 10 muestras con diferentes ajustes de pH, se pudo medir su absorbancia mediante el método de espectrofotometría UV/Vis y construir la curva de titulación, para luego determinar el punto isoeléctrico, el cual fue de 4,67, presentando un porcentaje de error de 1,52, teniendo como referencia el valor de 4,6. Palabras clave: Espectrofotometría UV/Vis, Caseína, Punto isoeléctrico. Abstract In various compounds formed of macromolecules such as precipitation phenomena occur, from which it gives rise to different products. This is the case of casein, which is the protein found in greater amounts in the milk and due to its isoelectric point has the characteristic of precipitation. From the precipitation of casein by the action of acetic acid, the chemical treatment and preparation of 10 samples with different pH adjustments, absorbance could be measured by the method of UV / Vis spectrophotometry and build the titration curve for then determine the isoelectric point, which was 4.67, showing an error rate of 1.52, with reference to the value of 4.6. Keys words: Spectrophotometry UV/Vis, Casein, Isoelectric point. 1. Introducción En las proteínas, como en los aminoácidos y en cualquier molécula anfotérica, las cargas pueden ser neutralizadas de manera tal que la carga neta sea igual a cero. Este proceso se realiza al modificar el pH del medio en el que se encuentren estas moléculas. Si en una mezcla de proteína se alcanza el punto isoeléctrico de una de ellas, ésta se precipita, mientras que el resto quedan disueltas. La razón es que la composición química de cada proteína es característica y presenta un
número distinto de grupos ionizables que se neutralizan a diferente pH. La caseína es una de las fosfoproteínas de la leche que se precipita a pH de 4.6 (Segal & Ortega, 2005). En la leche, la caseína se encuentra incluida en un complejo salino en estado micelar, que se comporta como sustancia homogénea. La composición de la caseína isoeléctrica varía de una especie a otra. En particular, la caseína humana es más rica en azufre, en cistina y en glúcidos que la caseína de vaca (Lacad Godina, 1985). En la presente
práctica se extrae la caseína mediante la acidificación con ácido acético y se determina su punto isoeléctrico, es decir, el pH en el cual los cuerpos químicos disociados presentan una igualdad de cargas negativas y positivas. 2. Materiales y métodos En un vaso de precipitado de 50mL se adicionaron 10mL de leche, se agregó 1mL de ácido acético para precipitar la caseína, posteriormente se inicia a filtrar. Luego se procede a adicionar 20mL de etanol, agitando durante 5 minutos. Al descartar el etanol, se agregaron 20mL de éter etílico, llevando a agitación. Al filtrar nuevamente la caseína, se pesaron 50mg de muestra, se adicionó agua destilada y KOH, disolviendo totalmente la caseína. Dicha solución se transfirió cuantitativamente a un balón aforado con ácido acético, para preparar una serie de soluciones con distintas relaciones en volúmenes de reactivos. En la Tabla 1. se observan las cantidades necesarias para tener en cuenta en el análisis de precipitado y de obtención del punto isoeléctrico. Dado a que cada condición va a permitir la medición en el espectrofotómetro UV/Vis. Dando como resultado datos que generen una gráfica para la posterior determinación del pI.
Tubo
Acetato de sodio 0,1M
Ác. Acético 0,1M
Ác. Acético 0,01M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,5mL 1,0mL 1,5mL 2,0mL 3,0mL 4,0mL 6,0mL 8,0mL 6,0mL 8,0mL
9,5mL 9,0mL 8,5mL 8,0mL 7,0mL 6,0mL 4,0mL 2,0mL -
4,0mL 2,0mL
Tabla 1. Proporciones de soluciones de análisis
3. Resultados El método que se usó en la práctica para la obtención de la caseína fue mediante acidificación, con ácido acético, a una muestra de leche. A partir de esto, se obtuvo un precipitado blanco, esto debido a que la solubilidad de la caseína disminuye a un valor de pH 4,6 y el pH de la leche se encuentra a un valor de 6.6; al adicionar acido las cargas de la proteína se neutralizaran y su desnaturalización produce la precipitación tal como se observó en la práctica (Gil Hernández, 2010). Lo anterior se logró evidenciar al realizar la adición de proporciones de ácido de ácido y acetato de sodio al tubo 7, dando un pH de valor cercano a 4.6, siendo de 4,67. Este dato se observa en la Gráfica 1, en donde se aprecia que es el punto más alto y se infiere que es el punto isoeléctrico. Este dato se compara con el teórico, para así calcular el porcentaje de error, confirmando si el método fue acertado y que tan alejado esta la parte experimental de los datos reportados en la literatura. %Error = | %Error = |
|*100%
|*100%
%Error = 1,52%
Tubo Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A 0,000 0,027 0,033 0,017 0,000 0,001 0,000 0,034 0,004 0,000 -0,001
pH 3,24 3,68 3,78 3,98 4,20 4,48 4,67 5,10 5,50 6,16
Tabla 2. Datos para la construcción de la gráfica de A vs pH
Punto isoeléctrico experimental de la caseína 0,040 0,035
pI apróx. 4,67
Absorbancia
0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 -0,005 0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
pH Gráfico 1. Determinación de punto isoeléctrico experimental de la caseína presente en leche entera.
Al seguir observando la Gráfica 1. se observan unos picos muy bajos en los puntos de pH entre 3,98 y 4,48. Esto se puede deber a una inadecuada preparación de la muestra en los tubos 4, 5 y 6, en donde tal vez no se contó con las proporciones
correctas de los reactivos, afectando la muestra y de esta forma llevando a una incorrecta lectura de la absorbancia. La absorbancia se ve afectada de manera directa por la turbidez de las muestras, de esta manera, si una muestra presentaba alta turbidez la lectura saldría incorrecta. De igual forma, pueden interferir diversos compuestos en la muestra que absorben en el UV/Vis. Por otro lado, la adición de KOH a la caseína que se encontraba sólida produjo un efecto de solubilización, ya que al ser un compuesto básico, tiene la propiedad de regenerar el medio hasta alcanzar las condiciones iniciales de la muestra. 4. Conclusiones Debido a las propiedades de precipitación que presenta la caseína, es posible realizar una medición de su punto isoeléctrico a partir de una desestabilización por acidificación. El pI experimental, obtenido a partir de la Gráfica 1. fue de 4,67. Mediante la comparación con el pI reportado en la literatura, se obtuvo un % de error de 1,52%. Se infiere que la práctica se realiza con un 98,49% de exactitud, esto se debe a errores comprendidos en el procedimiento de extracción de la caseína. 5. Bibliografía
Gil Hernández, Á. (2010). Tratado de Nutrición: Composición y calidad nutritiva de los alimentos. Madrid: Editorial Médica Panamericana, D.L. Lacad Godina, A. (1985). Ciencia de la leche. Principios de técnica lechera. Barcelona: Editorial Reverté, S.A. Segal, C., & Ortega, G. (2005). Manual de práctivas biología molecular de la célula I. México: UNAM. Vian Otuño, Á. (2006). Introducción a la química industrial. Barcelona: Editorial Reverté.
