11. Extraccion de Adn

UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN MACROPROCESO DE RECURSOS E INFRAESTRUCTURA ACADÉMICA FORMATO PARA PRACTICAS DE LABORATORIO Fecha: Abril 2011

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INFORMACIÓN BÁSICA NOMBRE DE LA PRÁCTICA: EXTRACCIÓN DE ADN

PRACTICA No. 11

ASIGNATURA: Biología TEMA DE LA PRÁCTICA: Extracción sencilla de ADN (ácido desoxirribonucleico) de material vegetal LABORATORIO A UTILIZAR: Biología CONTENIDO DE LA GUÍA

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO.   

Extraer ADN de material vegetal Discutir la diferencia entre la molécula de ADN y ARN Reconocer procesos básicos como claves en el desarrollo de cualquier actividad

INTRODUCCIÓN. Los ácidos nucleídos, ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido desoxirribonucleico) son polímeros especializados en almacenar, transmitir y expresar la información genética en secuencias de aminoácidos, las cuales luego de algunos procesos (Traducción) conforman las proteínas de una célula. MARCO TEORICO Cada molécula de ADN está constituida por dos cadenas o bandas formadas por un numeroso grupo de compuestos químicos llamados nucleótidos. Estas cadenas forman una estructura (de escalera retorcida) que se llama doble hélice. Cada nucleótido está formado por tres unidades: una molécula de azúcar llamada desoxirribosa, un grupo fosfato y uno de cuatro posibles compuestos nitrogenados llamados bases: Adenina (abreviada como A), Guanina (G), estas son Purinas, Timina (T) y Citosina (C), estas son pirimidínicas; La molécula de desoxirribosa ocupa el centro del nucleótido y está rodeada por un grupo fosfato a un lado y una base al otro. El grupo fosfato está a su vez unido a la desoxirribosa del nucleótido contiguo de la cadena. Estas subunidades enlazadas desoxirribosa-fosfato forman los lados de la escalera; las bases están enfrentadas por parejas (Figura 1). Deben considerarse también a la hora de seleccionar una metodología de extracción los diversos y versátiles sistemas comerciales tipo kits para la extracción de DNA y RNA existentes en el mercado. Muchos de ellos se basan en procedimientos cromatográficos para la purificación. Posteriormente a


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la extracción del ácido nucleico de interés es necesario evaluar la cantidad y calidad del mismo. Con una electroforesis en gel de agarosa podemos conocer la calidad de la muestra. Si el DNA no ha sufrido roturas veremos una única banda de alto peso molecular. Para el caso de muestras de RNA la corrida electroforética de preparaciones de buena calidad mostrará claramente los diferentes RNAs ribosomales y de transferencia.

(http://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/TP4-09.pdf) Bioquimica III Figura 1. Estructura molecular del ADN,y enrollamiento molecular / tomado de:http://3.bp.blogspot.com/ylsJX3a4Koc/TWquit5UmnI/AAAAAAAAAIM/8qpqgT4tn3k/s1600/cromosom_ADN01%255B1%255D .jpg


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La estructura del ADN es de doble cadena, lo que probablemente da una mayor protección a la información contenida en la molécula. La estructura del ARN es monocatenaria aunque, puede presentarse en forma lineal como el ARNm o en forma plegada cruciforme como ARNt y ARNr (Figura 2). Figura 2. Representación de las cadena de ARN y ADN, tomado de: http://www.biotecnologica.com/wpcontent/imagenes/2007/06/rna.png

Otra diferencia entre ADN y ARN es su componente de pentosa (azúcar), el ADN cuenta con desoxirribosa y el ARN con ribosa, el ADN está compuesto por Adenina, Timina Guanina y Citosina, el ARN sustituye la Timina por Uracilo (Figura 3).

CONSULTA PREVIA Elabore un Mapa conceptual del tema a tratar en la Práctica de Laboratorio. Apóyate para ello de las ayudas visuales brindadas…Debe responder a la pregunta: ¿Por qué el ADN es la Clave de la diversidad de la Tierra? Elabóralo en Cmaptools. http://www.youtube.com/watch?v=nje9i7CRkt8&feature=related El ADN http://www.youtube.com/watch?v=-EGKrYdQEHQ&feature=related Replicación del ADN


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METODOLOGIA Se desarrollara en grupos de cuatro personas como máximo, en los espacios de los laboratorios de Biología, siguiendo el procedimiento indicado en la guía de trabajo. Esta práctica se realizara para estudiantes del área de salud e ingenierías incluyendo psicología El tiempo de extracción es relativamente corto comparado con procesos de extracción de ADN Animal. Por ello la descripción de cada proceso como se describe a lo largo del procedimiento a seguir, involucra la atención sobre cada uno de los 8 pasos. Los cuáles serán considerados clave en el análisis final. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS A UTILIZAR.

Materiales Y Equipos

Reactivos

Material Estudiante*

Mortero y pistilo (6)

Agua destilada (300 ml.)

Marcador para vidrio y colores (anaranjado, azul, morado, rojo, negro, blanco) entre otros (INDISPENSABLE)

Beaker 200 ml. (3)

Isopropanol (o Alcohol isoamílico) a 0·C. (50 ml.)

Cinta de enmascarar

Azul de metileno. (2 ml.)

Guantes (2 pares por estudiante) Gafas de protección, Gorro y Bata Manga larga de material no inflamable.

Centrífuga. (1) Probeta 25 ml. (5)

Bisturí por grupo

Cubeta con hielo (1)

Cloruro de Sodio (Sal) (5 gr.)

Pipeta 10 ml. (5)

Bicarbonato de Sódio (5 gr.)

Tubos de Ensayo (21) gradillas (6)

Champú (Jabón líquido) (5 ml.) Ojala sin color alguno o blanco. Banano 1 unidad

Agitador de vidrio (5) Balanza digital (1)

L

Bisturí (1 por grupo) 1 cebolla pequeña por grupo Tomate 1 unidad Germen de trigo Arvejas frescas (desgranadas)


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Cada uno de los materiales vegetales solicitados deben ser medidos para que no se genere desperdicio del mismo al momento de terminar con la práctica.  Los estudiantes que no porten sus implementos de Bioseguridad individuales y materiales por equipo no serán admitidos a la sesión de trabajo práctico.  Recuerden traer las cantidades solicitadas en recipientes aislados para no contaminar un contenido mayor al solicitado en el laboratorio. PRECAUCIONES Y MANEJO DE MATERIALES Y EQUIPOS. CONSULTA DE EQUIPO ESPECIALIZADO. Con precaución y cuidado al manipular la balanza digital normal y la balanza de precisión. (Tararla adecuadamente) Al igual que el Bisturí – evitando cortar hacia el interior. Desechar adecuadamente los excedentes de Alcoholes en los recipientes adecuados (Fenoles) Reactivos y Reacción Agua destilada: Agua a la que se le han eliminado iones e impurezas mediante destilación. Isopropanol o acohol isoamílico:H3C-HCOH-CH3.Es un alcohol incoloro, inflamable, de olor intenso, compuesto no polar, en la práctica permite la precipitación del ADN. Azul de metileno (Cloruro de Metilionina):C16H18ClN3S, es un compuesto de variadas aplicaciones, entre estas la capacidad de teñir tejidos viables, en la práctica tiñe las fibras de ADN.

PROCEDIMIENTO: 1. Preparación de la solución tampón. En un beaker de 200 ml mezclar: 120 ml de agua destilada, 4.5 gr de Sal, 5 gr de Bicarbonato de Sodio, 5 ml de Champú.

2. Preparación del material biológico Se corta en cuadritos el material vegetal (cebolla), también realiza el mismo procedimiento con el banano y cualquier otra muestra. Se le añade un poco de agua destilada y a continuación se tritura utilizando el mortero, hasta dejar sin partículas el macerado.


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3. Mezcla del puré con el tampón frío En una probeta de 25 ml se depositan 5 ml del macerado obtenido en el paso anterior y se añaden10 ml de la Solución tampón frío. Se agita fuertemente durante 2 min.

10 l

5 ml

15 ml

4. Centrifugación por 10 minutos a baja velocidad El contenido de la probeta se separa en los dos tubos de ensayo pequeños, de manera que los dos tengan la misma cantidad. A continuación estos tubos se ponen en la centrífuga durante 5 min.

Nota: Los jabones utilizados como la para lavar la vajilla emulsionan los lípidos de las membranas celulares y las rompen. 5. Recoger el sobrenadante Tras la centrifugación se recoge el sobrenadante (con cuidado de no agitar el precipitado) de cada uno de los tubos de ensayo hasta completar 5 ml; para ello nos ayudamos de una pipeta. Este sobrenadante se pone en otro Tubo de ensayo limpio.


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Pipeta

6. Añadir el alcohol isoamilico o isopropanol Se añade 10 ml de alcohol isoamílico o isopropanol frío lentamente al tubo que contiene el sobrenadante, se dejacaer el isopropanol o alcohol isoamílico sobre las paredes de la probeta. Se debe dejar escurrir lentamente el el alcohol por la pared interna del tubo, teniendo este inclinado. El alcohol quedara flotando sobre el tampón.

7. Recoger el ADN con una varilla de vidrio Tras añadir el alcohol (isopropanol o isoamílico) en nuestra muestra han quedado dos fases, una superior (contiene el alcohol) y otra inferior. Se introduce la pipeta en la interface entre el alcohol y el resto de la muestra y se va extrayendo con cuidado, en este material se encuentra el ADN Alcohol ADN Sedimento 8. Añadir una gota de azul de metileno El método que hemos utilizado para extraer al ADN no es del todo eficiente, ya que en la muestra todavía queda ADN sin extraer. Al añadir el azul de metileno, en la interface, se teñirán las fibras de ADN que no hemos conseguido extraer.


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BIBLIOGRAFIA MADER, S. 2008. Biología. 9na Edición. McGraw Hill. México, D.F. MATTA, N; GARCIA, M. 1997. Curso libre juvenil en Biología. Facultad de Ciencias. Departamento de Biología. Universidad Nacional de Colombia. PERSON, 2010.Biologia. México, D.F. Cibergrafía http://www.biol.unlp.edu.ar/bioquimica3/TP4-09.pdf

ELABORÓ

REVISÓ

APROBÓ

Firma: Docentes Laboratorio de Biología

Firma: Equipo Docente Laboratorio de Biología

Firma: Equipo de laboratorio de Biología

Nombre: Equipo Laboratorio de Biología

Nombre: Equipo Docente Laboratorio de Biología

Nombre: Equipo de Laboratorio de Biología y Gerencia de Laboratorios

Fecha Enero 2013 - Rediseño

Fecha: Enero 2013

Fecha:

Enero 2013


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INFORME DE LABORATORIO GRUPO: ESTUDIANTES:   

NOTA:

CARRERA:

Formule tres objetivos que desee cumplir con la Práctica de Laboratorio 1. 2. 3. Elabore un Mapa conceptual del tema a tratar en la Práctica de Laboratorio. Apóyate para ello de las ayudas visuales brindadas…Debe responder a la pregunta: ¿Por qué el ADN es la Clave de la diversidad de la Tierra? Elabóralo en Cmaptools. http://www.youtube.com/watch?v=nje9i7CRkt8&feature=related El ADN http://www.youtube.com/watch?v=-EGKrYdQEHQ&feature=related Replicación del ADN

RESULTADOS: 1. Analiza y describa lo observado en los procedimientos realizados, desde el paso 3 al 8. – deben ser específicos en Cuanto a las pruebas y cada proceso para permitir al final observar la evidencia de la Presencia de ADN Vegetal obtenido.


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2. Explica apoyándote además de un gráfico sobre de la acción del detergente (líquido) sobre las células vegetales. ¿Qué efecto o fenómeno realizan componentes lipídicos de la membrana al adicionarles detergente?.

CUESTIONARIO 1. Realiza un cuadro comparativo entre ADN y ARN


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2. Consulta acerca de la Clonación como mecanismo de mediación en pacientes con cáncer ante la pérdida de algún órgano.

CAUSAS DE ERROR.

CONCLUSIONES


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APLICACIÓN PROFESIONAL DE LA PRÁCTICA REALIZADA

BIBLIOGRAFIA UTILIZADA

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