Extracción de Caseína y determinación de punto isoeléctrico CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ ESTEFANÍA RODRÍGUEZ SÁNCHEZ
COD. 05092031
Resumen Se intenta determinar experimentalmente el punto isoeléctrico de la caseína, haciendo una extracción inicial a partir de la leche, conociendo que este aminoácido está presente en ésta. Abstract Attempts to experimentally determine the point isoelectric casein, making an initial extraction from milk, knowing that this amino acid is present in this. Palabras Clave: Aminoácidos – Absorbancia – punto isoeléctrico
Introducción Caseína Las caseínas son moléculas de gran tamaño que contienen un gran número de aminoácidos, entre los cuales los más importantes son los ácidos glutámico, la leucina y la prolina. Existen algunos subgrupos de las caseínas con distintas propiedades y entre dos y ocho variables genéticas. Las caseínas se agrupan en forma de polímeros constituidos por centenares o miles de moléculas individuales. Estos complejos moleculares se conocen como micelas de caseína. Si se estudia la estructura de las micelas se observa que están constituidas por subunidades micelares o submicelas de 10-20 nm de diámetro que tienen alrededor de 10 moléculas de los cuatro tipos de caseínas
Figura Fi gura 1. Modelo Modelo de d e la estructura de la submicela y la micela de la caseína. cas eína.
La leche es un sistema acuoso donde las diferentes micelas de caseína están en movimiento permanente y constante. Es un movimiento Browniano que provoca que las micelas, al chocar unas con otras se unan para disminuir su superficie. Sin embargo se mantienen separadas en la leche por otras dos fuerzas con efecto opuesto:
(αs1, αs2, β y κ) en proporciones variables,
con presencia de calcio en cada grupo fosfato. La unión de las distintas submicelas por fosfato cálcico da lugar a la micela propiamente dicha, cuya representación gráfica se recoge en la figura 1. Dentro de cada submicela las caseínas α y β, de carácter insoluble en
agua, se sitúan en el centro o núcleo hidrófobo, mientras que las κ -caseínas, de naturaleza hidrófila, se sitúan en la superficie. Debido a esta distribución, la submicela adquiere una forma más o menos esférica y es soluble en forma coloide. Las uniones de fosfato y citrato de calcio, la presencia de magnesio, así como las interacciones hidrófobas entre las distintas submicelas son las responsables de su integración en la micela de caseína.
Las micelas tienen una carga negativa neta que origina la repulsión entre ellas y evita la coalescencia. Existe una fuerte afinidad entre las micelas y el agua debido a la atracción entre los grupos cargado negativamente de las micelas y los grupos polares positivos de las moléculas de agua. Esta capa de hidratación, formada por moléculas de agua orientada corresponde al agua ligada. Alrededor de esta primera capa se superponen varias capas más que constituyen el agua de hidratación. Estas fuerzas de hidratación se oponen a las fuerzas de cohesión y reducen la tención interfacial. (Ángel Gil Hernandez, María Dolores Ruiz López, 2010)
Punto Isoeléctrico Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan
1 Bioquímica- Estefanía Rodríguez Sánchez
Extracción de Caseína y determinación de punto isoeléctrico CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estarían protonados (-NH3+). De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación. Si suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga neta de la proteína dependería exclusivamente de la protonación/desprotonación de los grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están formadas por multitud de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los aminoácidos que la componen y del pH del medio. (Anónimo, 2011)
Metodología
CALENTAR AGREGAR
•
•
en un vaso de precipitado a 38º C 150 mL H 2O+ 50 mL leche. CH3COOH 1M gota a gota hasta formacion de precipitado.
FILTRAR LAVAR
•
TRANSFERIR
•
PESAR
•
ADICIONAR
•
DISOLVER
•
TRANSFERIR
•
COMPLETAR
•
el filtrado con 5 mL de etanol
a un vaso previamente pesado.
500 mg de caseína en un vaso de precipitados
al vaso 40 mL de agua y 5 mL de NaOH 1M
evitando la formacion de espuma.
a un balon de 100 mL y adicionarCH3COOH.
a volumen con agua.
si la solución presenta turbidez filtrar, si no continuar con la segunda parte.
•
ADICIONAR
5 mL de los tampones realizados previamente según tabla, omitiendo el pH más bajo y el más alto a 8 tubos de ensayo.
•
1 mL de solución preparada en el paso anterior.
•
Suavemente los tubos
•
La absorvancia de cada tubo a 640 nm.
•
curva de callibración absorvancia vs. pH.
•
Cualitativamente el resultado.
AÑADIR
AGITAR
MEDIR
REALIZAR
COMPARAR
2 Bioquímica- Estefanía Rodríguez Sánchez
Extracción de Caseína y determinación de punto isoeléctrico CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ Tabla 1. Volúmenes de tampones para determinación de PI Tubo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Acetato de Sodio 0,1M
Ácido acético 0,1M
Ácido acético 0,01M
pH (aprox)
0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 6,0 8,0 6,0 8,0
9,5 9,0 8,5 8,0 7,0 6,0 4,0 2,0 -
4,0 2,0
3,2 3,6 3,8 4,0 4,2 4,5 4,7 5,1 5,5 6,1
GRUPO 1. 0.350 0.300 a i 0.250 c n a 0.200 v r o 0.150 s b A 0.100
0.050 0.000 3.8
3.9
4
4.2
4.5
4.7
5.1
5.5
pH
En el grupo 2 se puede determinar la oscilación de absorbancias entre, 0.227 y 0.313 y no demuestra cambios importantes con respecto al grupo anterior, siendo el punto de declinación de la curva en pH 4.5 al igual que el grupo anterior. GRUPO 2.
0.350
Resultados
0.300
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Tabla2. Resultados por grupos
a i 0.250 c n a0.200 b r o0.150 s b A0.100
0.050 0.000
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
tubo
pH
absorbancia
pH
absorbancia
pH
absorbancia
2
3,8
0,315
3,8
0,313
3,8
0,241
3
3,9
0,276
3,9
0,296
3,9
0,288
4
4,0
0,263
4,0
0,273
4,0
0,288
5
4,2
0,257
4,2
0,275
4,2
0,260
6
4,5
0,236
4,5
0,227
4,5
0,244
7
4,7
0,262
4,7
0,248
4,7
0,225
8
5,1
0,290
5,1
0,305
5,1
0,273
9
5,5
0,299
5,5
0,245
5,5
0,244
Discusión de resultados En el grupo 1 se puede observar que la Absorbancia mínima es de 0.236 y la Absorbancia máxima es de 0.315, esta oscilación no es muy fuerte, por lo que se puede determinar que la caseína no manifiesta cambios excesivos entre los pH´s 3.8 y 5.5.
3.8
3.9
4
4.2
4.5
4.7
5.1
pH
En el grupo número tres las absorbancias no superaron 0.300 a diferencia de los dos grupos anteriores, estas se encuentran entre 0.288 y 0.225 además el punto mínimo no fue en pH 4.5 al igual que en los grupos anteriores sino que fue en 4.7 en el tubo número 7. GRUPO 3.
0.350 0.300 a i 0.250 c n a0.200 v r o0.150 s b0.100 A 0.050 0.000 3.8
3.9
4
4.2
4.5
4.7
5.1
pH
El porcentaje de error según los análisis realizados con respecto al punto isoeléctrico teórico, sería el siguiente.
3 Bioquímica- Estefanía Rodríguez Sánchez
5.5
5.5
Extracción de Caseína y determinación de punto isoeléctrico CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ Organolépticamente los tubos no demuestran un cambio significativo entre sí y subjetivamente a todos se les daría una calificación de 4-6.
experimental es igual al teórico y promediando los resultados de los tres grupos existe un porcentaje error del 2.84%.
Bibliografía Conclusiones El punto Isoeléctrico según el grupo 1 y 2 experimentalmente sería a pH 4.5 y según el grupo 3 coincidiría con la teoría correspondiendo a 4.7. Con una comparación organoléptica no se puede apreciar significativamente el punto isoeléctrico de las soluciones de caseína, debido a que todos los tubos resultaban similares a simple vista. Las diferencias entre los grupos 1 y 2, con respecto al grupo tres pueden corresponder a errores de los analistas, sin embargo en el grupo 3 según los resultados se determina que el punto isoeléctrico
Ángel Gil Hernandez, María Dolores Ruiz López. (2010). Tratado de Nutrición Tomo II Composición y Calidad Nutritiva de los Alimentos. En M. D. Ángel Gil Hernandez, Tratado de Nutrición Tomo II Composición y Calidad Nutritiva de los Alimentos (pág. 784). Madrid, España: Editorial Médica Panamericana S.A. Anónimo. (22 de 09 de 2011). Scribd. Obtenido de Práctica caseina: http://es.scribd.com/doc/65927093/P ractica-caseina
4 Bioquímica- Estefanía Rodríguez Sánchez
