Universidade Federal de Viçosa Viçosa Campus de Rio Paranaíba CBII 240 CB 240 - Ge Gené néti tica ca
Jairo de Carv Carvalho alho Filh Filhoo - 292
Teori eoriaa da Totip otipot oten enci ciaalida lidade de - Schl Schlei eide denn e Schwa chwann nn (183 (1839) 9) - O que postulava essa teoria ???? Fisi Fisiol olog ogis ista ta vege vegeta tall alem alemão ão Habe Haberl rlan andt dt (190 (1902) 2) - Idéia de cultivar celular isoladas - Materializar a teoria de Schleiden e Schwan - Muitos desafios para a época... Descobrir como uma célula madura e diferenciada, voltar ao estági estágioo embrio embrionár nário. io.
Prof Profes esso sorr Stew Stewar ardd e cola colabo bora rado dore ress (195 (1958) 8) - Obtenção de embrião de plantas a partir de células maduras - Embr Embrio iogê gêne nese se Som Somátic áticaa - CCI de raiz de cenoura. - Signi ignifi ficcado ado cient ientíífico fico e po pottenc encial ial prát prátic icoo
Uma das áreas da biotecnologia hoje bastante estudada e aplicada, é o cultivo de tecido vegetal → melhoramento gené genéti tico co e técn técnic icas as de micr microp opro ropa paga gaçã ção. o.
O que é micropropagação ?
- Técnica através da qual se propaga plantas dentro de tubos de ensaios ou similares de vidro, sob condições adequadas de assepsia, nutrição e fatores ambientais, como como luz, luz, tem tempera peratu tura ra,, O2 e CO2 (CID (CID,, 2001) 2001)..
A micr microp opro ropa paga gaçã çãoo in vitro é a aplicação mais prática da cultura de tecido e aquela de maior impacto (GRA (GRATTAP TTAPAGL AGLIA IA e MACHA MACHADO, DO, 1998). 1998). - Por quê ? Como funcionar ? - Form orma de reproduçã ução assexuada - Utiliza explantes do vegetal - Divi Divisõ sões es celu celula lare ress indu induzi zida dass
Padrões morfogené genétticos: Com Como se multiplica ??
A
técnica de clonagem in vitro de plantas tornou-se possível mediante a cult ultura ura de tec tecidos.
Obs.: Poder ser conduzido pela proliferação de gemas axilares ou indução de gemas adventícias
Fatores que influenciam no êxito do cultivo de tecidos → origem
e o tipo de material vegetal: 1) Idade da planta; 2) Tipo Tipo de explante (ápices ( ápices caulinares, segmentos foliares e raízes); 3) posição que este explante ocupa na planta; p lanta;
A lista de fatores é vasta e dificilmente poderão ser controlados
Embriogênese Somática
Consiste na produção de estruturas semelhantes ao embrião zigótico sem a fusão de gametas, que irão se desenvolver até a form formaação ção com ompl plet etaa de um umaa plan planta ta..
Teoricamente é a melhor opção para a propagação
in vitro,
em virtude de suas vantagens:
1) alta taxa de multiplicação comparada a qualquer outro processo de propagação; 2) escalonamento da produção pela manutenção da cultura em meio líquido; 3) plantio direto da muda obtida via ES, sem necessidade de enxertia; 4) possibilidade de transferência de genes; 5) planta geneticamente igual à planta-mãe.
Direta: os embriões se originam diretamente dos tecidos, sem a proliferação do calo. Indireta: o calo é formado, mantido e proliferado antes do dese desenv nvol olvim vimen ento to do doss embr embriõe iões. s. Em ambos os casos, os embriões passam pelo estado globular, cordiforme e torpedo seguindo pela formação da planta (CO (COLLIN LLIN & GROS GROSSE SER, R, 19 1984 84). ).
Rota da ES
Procedimentos para ocorrência do processo de ES: •
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As células diferenciadas devem ser desdiferenciadas depois da divisão celular → Célula embriogênica; Posteriormente serão rediferenciadas.
As
células somáticas adquirem características embriogênicas por meio de uma completa reorganização do estádio celular cel ular
Dividida em dois estádios: •
Indução e Expressão
Depois de uma mudança nas condições de cultura, é que os tecidos ou as células induzidas alcançam o estádio de expressão no qual as células indic dicam as suas competên tências, dife iferenciandose em embr embriõ iões es somá somáti tico cos. s.
A importância da composição do meio nutritivo: - Contém nutrient nutrientes es necessários necessários à sobrevivência sobrevivência da planta - Favorece Favorece o crescimento crescimento e o desenvolvimen desenvolvimento to do material material vegetal Constituição básica: - Macronutrientes inorgânicos (N, (N, K, Ca, Mg, P, P, S, Si) - Micronutrien Micronutrientes tes inorgânicos inorgânicos (Cl, (Cl, Fe, B, Mn, Na, Zn, Cu, Ni, Mo) - Vitaminas (ácido nicotínico, piridoxina e tiamina) - Fontes de nitrogêni nitrogênioo orgânico orgânico (glicina (glicina e inositol) inositol) - Açúcares (sacarose, (sacarose, glucose glucose e monitol, monitol, entre outros) outros) - Reguladores Reguladores de crescimento crescimento (auxina, citocinin citocinina, a, ácido giberélico) giberélico) - Orgânicos Orgânicos opcionais opcionais (hidroliza (hidrolizado do de caseína e extrato extrato de levedura) - Agente gelatinoso gelatinoso opcional opcional (ágar ou phytagel). phytagel).
Composição química natural dos vegetais (Hormônios): - Auxi Auxina nass - Cito Citoci cini nina nass - Gibe Giberi rili linas nas - Eti Etileno leno - Ác. Ác. abs abscí císi sico co Tem o propósito de regular os processos metabólicos envo envolv lvid idos os no cres cresci cime ment ntoo e dese desenv nvol olvi vim mento ento Não Não po poss ssui ui fun unçção nu nutr tric iciion onal al Ativas e com baixas [ ] nos tecidos
Nível de hormônios
potencial embriogênico dos explantes
A auxina é o hormônio mais importante na regulação da ES in vitro
- Estr Estrut utur uras as das das moléc olécul ulaas:
O que é um fitorregulador ? - Substâ Substânci ncias as sintéti sintéticas cas - Atividades Atividades fisiológic fisiológicas as = aos hormônios naturais naturais É necessária a adição para induzir a ES
Auxinas
e citocininas são fatores chaves na determinação da resposta da embriogênese
Participam fortemente na regulação do ciclo e da divisão celular
Auxina Sintética: 2,4-D
Dendezeiro: primeiro projeto no qual plântulas originadas a partir
de embriogênese somática foram cultivadas a campo, (Unilever, Malá Malási sia, a, 1975) 1975)..
Eucaliptos: orga organo nogê gêne nesse, embr embrio iogê gêne nesse som omát átic icaa (EU (EUA, Euro Europa pa). ).
Microestacas (Brasil): aum umeento de 135% na produtivi ividade de polpa a partir de clones selecionados em comparação a população ção base.
Cacau e café: embriogênese somática para a propagação massal de
varie arieda dade dess melho elhora rada dass e resi resist steentes ntes a molés olésti tias as (EU (EUA e Cos Costa Rica Rica))
1) Planta Matriz: • Planta de maior vigor e com característica interesse •
No ca campo: mu multiplicação por es estacas estoque! - Brotos Brotos ortotró ortotrópic picos os - Estacas Estacas com um par de folhas retirar retirar 1/3 do limbo foliar foliar - Casa de Vegetação egetação controle controle da UR - Planta Plantarr em leitos leitos de de areia areia - Transferir ransferir mudas bem enraizadas enraizadas para vasos maiores maiores
Clones Acauã enxertado em conilon aos 30 dias
Clones Acauã para enraizamento aos 30 dias
Clones no canaletão para propagação
2) Coleta de folha, desinfestação e inoculação: Coleta Folhas bem desenvolvidas terceiro par Coletar no inicio da manhã Conduzir p/ laboratório aguardar 30 min. (estômato)
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Desinfestação Capela de fluxo laminar desinsfestação parcial (álcool) Corta folhas em 1/2 tratar c/ hipoclorito de sódio Tríplice lavagem em água destilada
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2) Coleta de folha, desinfestação e inoculação: Inoculação Corta as folha com bisturi pequenos seguimentos (Fig. 1) Transferir para placa de Petri (Fig. 2 e 3) Inoculação meio de cultura gelificada (Fig. 4) Parte adaxial deve ficar em contato com o meio Manter as placas no escuro, sob 24 a 27 ºC
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1
2
3
4
3) Meio de cultura de indução de calos embriogênicos: •
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Indução de calo primário Composição: - Macronutrien Macronutrientes tes inorgânico inorgânicoss - Micronutrien Micronutrientes tes inorgânicos inorgânicos - Vitaminas itaminas (ácido nicotínico, nicotínico, piridoxina piridoxina e tiamina) tiamina) - Fontes de de nitrogênio nitrogênio orgânico orgânico (glicina (glicina e inositol) inositol) - Açúcares Açúcares (sacarose, (sacarose, glucose glucose e monitol, entre outros) outros) - Reguladores Reguladores de crescimento crescimento (auxina, (auxina, citocinina, citocinina, ácido giberélico) giberélico) - Orgânicos Orgânicos opcionais opcionais (hidroliza (hidrolizado do de caseína e extrato de levedura) levedura) - Agente gelatinos gelatinosoo opcional opcional (ágar ou phytagel). phytagel).
4) Formação de calos primários e calos embriogênicos: •
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Após 1 mês de cultivo: - Intensa Intensa proliferação proliferação celular celular - Células Células do câmbio câmbio vascular vascular
bordos dos explantes explantes (Fig. 5 e 6) calos primários primários
100 dias de cultivo: - Formação Formação de calos amarelad amarelados os sobre os primári primários os (Fig. 7) - Inicio da formação formação de setores setores embriogê embriogênicos nicos - Em 4 meses meses é possíve possívell observar observar a olho olho nu
5
6
7
8
5) Multiplicação celular: •
Após 4 a 6 meses: - Isolar setores setores embriogênic embriogênicos os - Subcultivar Subcultivar em meio líquido líquido
Multiplicaçã Multiplicaçãoo
6) Diferenciação, maturação e germinação de embriões:
Diferenciação: •
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Conduzido em meio gelificado Avaliar a capacidade embriogênica Os setores embriogênicos de cada explante isolados (Fig. A) Cada um constitui uma linhagem embriogênica Processo final dos embriões 2 meses (Fig. B)
6) Diferenciação, maturação e germinação de embriões:
Maturação/geminação: Modificação da composição do meio transferir Boa maturação ajusta a densidade dos embriões Após 2 meses embriões na forma de cotilédones Estádio final prontos p/ germinação (Fig. 9) 1ª faze a ser conduzida na presença de luz Inicio do desenvolvimento radicular ( Fig. 10, 11 e 12)
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9
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7) Crescimento: •
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Transferência das plântulas p/ crescimento e enraizamento: - Tubos ubos de ensaio ensaio (Fig. A) - Frasc Frascos os Magen Magenta ta® Melhor resultado (Fig. B) Encaminhar Encaminhar plântulas p/ casa de vegetação aclimatação
8) Aclimatação: •
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Conduzida em tubetes substrato tipo PlantMax ® (peneirado) Pós plantio irrigação diária + solução macro e micro (semanal) Plantas mantidas em casa de vegetação - Som Sombrea breada dass – 40 a 50% da luz solar - UR de 70 a 90 90 % - Temperatura emperatura entre 20 a 30 ºC Após 2 meses e ½ mudas c/ 3 ou mais pares de folhas (Fig. C) 5 meses prontos para plantio em condições de campo (Fig. D)
Multiplic Multiplicação ação massal massal de um genótipo superior em qualquer estágio Genes desejáveis de clones selecionados podem ser mantidos em um banco genético Eficiente na produção em larga escala 20 mil embriões por grama de célula – em média
Vantagens
Custo elevado
Necessidade de laboratório
Fora do alcance do produtores
Dificuldade na aplicação de biofábricas.
Limitações
Obrigado !!
