T.
A. BROWN
Professor of Biomolecular Archaeology,
Department of Biomolecular ScÌences, UMISI Manchester, UK
CLONAGEM /\ GENICA E ANALISE
DE DNA
Uma introdução 4a Edição
Tiadução: Henrique Bunselmeyer Ferreira Biólogo, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Mestre em Genética, UFRGS. Doutor em Genética e Biologia Molecular, UFRGS. Pós-Doutorado no Albert Einstein coltege of Medicine, Nova Iorque, EUA. Professor adjunto IV do Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia, uFRGS.
orientador do Programa de Pós-Graduação em Biologia celular
e
Molecular, UFRGS.
Pesquisador associado do Centro de Biotecnologia, UFRGS.
Luciane Maria Pereira Passaglia Bióloga. UFRGS. Doutora em Genética e Biologia Molecular, UFRGS. Pós-Doutorada na Universidade da Califómia, Berkeley, EUA. Professora adjunta IV do Departamento de Genética, UFRGS. orientadora do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biotogia Molecular, UFRGS. Pesquisadora associada do centro de Biotecnologia, UFRGS, na âreade Fixação Biológica do Nitrogênio, e do Departamento de Genética, UFRGS, nas iíreas de Genética Molecular de Microrganismos e Genética e Biotecnologia vegetal.
2003
Sumário
1a Edição
do DNA recombi-
Parte
1
ias sobre esses as-
Princípios Básicos da Clonagem Gênica e da Análise de DNA...
For parte do leitor de um estudanto A em Biologia. os termos nãoe reforçar o texel.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
r anos de bioquímip'ara alguns pesqui-
número de biólocionagem gênica potexto poderá serrecombinante, para
i , ,I
I
excelentes livrosito considerável pes
livros-texto s. quejá tiveram alesses
fornecer. Minha
o livro de Old e
t
projeto seguisse o \ottingham, e com : todos os effos e a maior parte
s-ì
Por que a Clonagem Gênica e aAnálise de DNA São Importantes............... 13
Veículos pata a Clonagem Gênica: Plasmídeos
e Bacteriófagos ............. ...... 25
Vivas.......... Manipulação de DNA Purificado........... Introdução de DNA em Células Vivas ......... Vetores de Clonagem para E. coli............. Vetores de Clonagem para Eucariotos .............. Como Obter um Clone de um Gene Específico........... A Reação em Cadeia da Polimerase............... Purificação de DNA
a
Partir de Células
.................. 39 .................. 63 ............ 95 ............. 115
.....I3-9 ............. 165 ....... 187
I
I ,,
t devo agradecer avár
.... 11
Parle2
I
Aplicações da Clonagem Gênica e da Análise de DNA na Pesquisa
* 10
certa ou a frase ade-
11 ry
12
.203
Gene Estudando a Expressão e a Função dos Genes.. Estudando Genomas
....205
Estudando aLocalizaçáo e a Estrutura do
.....225
........253
T. A. Brown
:.:f \^-F!
o
t!
t
':ì-r::-.:!ì-':::.:.--i:i::::l::orit:l::Ììtrt:a\ì::-li)iìlia,'::l:i:.',:r:.:::!tt:\' m"uçn mu anb erp m1-3su LìqTuq m : .*'"ro, oç,.rq *qp:q apn,J 1c o :nb eç u:1-eu-orsrq ssou Ep oeienmuo-- e a a:o-r :nb:od ìsfllmç r[T ;ru a5-ç;NJ úuü-ì trF trf 'Lìcmü oË roro r zFruÈ"r r:nu m. ?]lo-r l-ã,.l-aF J Ì:!'w :ná o otrro anb rç "c:1'o-remq m lL ruE:p rc xmìh o *F'dng.süJd:u:[ì ro ? ilLìü-'rìÊq;E oE\ LìIEãF5 ü':(JÉa èuou o zra\ Eol rti(ì Lì':-Èqutu\..-o-\Lì::'{-ni n:s o on:nb \TtÍ" ü:r :qì EWi ;
II
IE
L
G
o rl
*úi
9
10
SuMÁRto
Parte 3
Aplicações da Clonagem Gênica e da Análise de DNA na
13
Produção de Proteínas a partir de Genes
t4 Clonagem 15
Biotecnologia........
Clonados Gênica e Análise de DNA na Medicina
..2ls ..................277
...................2gg
Clonagem Gênica e Análise de DNA naAgricultura................................... 319
I6 Clonagem Gênica e Análise
de DNA na Ciência
Glossrário Índice
Forense
........ 335
....................
.......347
............367
'::::r1nor rrrd ocinri: J^il oru .rl3 :nb ttcl o :.rc1os oqlg o t.ltd :ur:u atur 1i i.:lf:r:J:r:ìirnrlì-ìaruo--1 lrr.ftf,u!-rJsrreieuos::tì:oPL{netlïopu?nÒ,.'ossrnoursuããuuanberolrog'oqlg'?rPoJlnoun::duasualsel4i'oroq: Jp srp g w'â^oq: uau anb rrp uaa'ãtsÌJl oqlfq un e sru'€f,oJ ?Ì opuq rrqll:q apod 1os o anb erp uaa'zr:olsrq rssou tp otSrnurluo: r 9 a:ol anb:o6 opuuãs uJ âf,o,\ 9s'sss: ouor serp ug opunu op roreu r'rpn8e rzalsrr Bun ú1lo^ :J ze;s:p as rapur anb o opnl anb erp uaa'o:unq un eru rr:8ap
a:
anb o opnl atuada: ap g'rr:uasnr ens
e
ef,orl3 op€qes op oÌf,uâFs Õ'âlep
ãuou
o zrp ?JoJ 9Ì Ìos o'ãlâqueurv'of,sriu?f,1 'Ied nas o oes anb stlp
uãL,
t! .ì IE
L
G
n a
*FÍ
c z 9
PARTE
I
PRINCIPIOS BASICOS DA CLONAGEM GÊNICA E DA ANALISE DE DNA
....277
L................ .... zes
L t
... 3re .... 33s
;
i
l--................ .... 367 I i
r..i(a:Ilf
\ì[t-
I
|
'o:srrtrer3 r.reiì
G
t
',r:::qno: r:;r1 ocillã] Ja?t oru :l: :nb rrd o :-r1os oqlg o r;rrC ;ro::sa aru y 'oq[g'?Ìp oJlno un a:duas ual s?W o]oql ; f::orlru I cnuuuo-r ouro: ':rci{r:rrr:d suaSnros::t{ sop urn etPi opuLn} ,.'ossr noursua au uenb a:ol rog âp srp â w'J^oq: uau:nb rrp uea'âtsÌr] oqlrq un â stu'uoJ el opurl Jrqprq apodlos o anb erp uaa'euglsrq essou ep og5rnurluo: r a a:ol anb:o4 'opnuãs uJ aJo os'sss ouof, serp ug'opunu op rowu e'epn8e ezalsrrl Bun Btlo ï zrgsep as rapue anb o opnt anb rrp uãJ'o)€Jnq un erl er:8ap ua anb
1
o opnt aguada: ap g'tr:uasn€ Bns r eJoq3 op?q?s op orJuâlÌs o'âlâp
ãuou
o zrp ef,oJ el Ìos o'âtrãrlueuryo:sr:ue:g'red
nas o ogs anb sap
ue1,,
'õ L G
It a
CnpÍrulo
1
Por Que a Clonagem Gênica e a
Análise de DNA São lmPortantes
O desenvolvimento inicial da genética' I 3 O advento da clonagem gênica e da reação em cadeia da polìmerase, 14 O que é clonagem gênica?. I 5
a clonagem gênica e a PCR são tão importantes, l6 Como encontrar o seu caminho ao longo deste livro,
Pol que
22
OqueéPCR?,16
Em meados do século XIX, Gregor Mendel formulou um conjunto de regras para explicar a herança de características biológicas, as quais assumiam' basicamente, que cada propriedade trerediìrária de um organismo é controlada por um fator, chamado de gene, que é uma partícula física presente em algum local na célula. A redescoberta das leis de Mendel, em 1900, marcou o nascimento da genética, a ciência que busca o entendimento do que são esses genes e de como eles funcionam exatamente.
1.1 O desenvolvimento inicial da genética Em seus primeiros 30 anos de vida, a nova ciência cresceu a uma velocidade espantosa. A idéia de que os genes residem em cromossomos foi proposta porW. Sutton' em i903' e fecebeu suporte experimental de T. H. Morgan, em 1910. Morgan e colaboradores desenvolveram, então, as técnicas paÍa mapeamento gênico, e, até I922,já haviam produzido uma análise abrangente das posições relativas de mais de 2.000 genes nos quatro cromossomos da moscadas-frutas, a Drosophila melanogaster. Apesar do brilhantismo desses estudos genéticos clássicos, não houve um real entendimento da natwezamolecular do gene até a década de 1940. De fato, apenas após os experimentos de Avery, Macleod e Mccarty, em 1944, e de Hershey e chase, em 1952, alguém passou a acreditar que o ácido desoxirribonucléico (DNA) era o material genético: até então, era geralmente aceito que as proteínas constituíam os genes. A descoberta da função do DNA foi um grande estímulo para a pesquisa genética, e muitos biólogos famosos (Delbrück, Chargaff,
IE
.ì 'l::or1uo: uetl or{ru;l
Jr3:Ì oïu álã
:nb ttrì
o a,it1o: oqly o r::rd
malr:: atul
1-
anb erp u:1'âtsrft oqlrrq un â s?u'rloJ eI opurJnql:q apod 1os o anb zrp ruaa'rtrglsrq essou ep ot5tnurluo: t a ::ol enbrod "Ìp .oppuJs aJ JJoÀ gs.sssâ ouoJ srrp ug.opunu op Jorru r'epn8e ezatsrll ?un €tlo^ g'zgsap as reput anb o opnt anb erp uâJ oseJnq un ?JIa el:8ap aa anb o opn1 atuader ap g.er:uasn? €ns € eJorÌf, op?qgs op orJuãÌrs o'âlãp ãuou o zlp tfoJ tl Ios o'âf,âqü€uv'otrsltruerJ'red nes o ots anb selp uaa,, âp
â
w.â.\oq: ueu
IE
L
IE
o a
14
T. A. Bnowr.r
13
Crick e Monod estavam entre os mais influentes) contribuíram para a segunda grande era da genética. Em 14 anos - de 1952 a1966 a estrutura do DNA foi elucidada, o código genético decifrado e os processos de transcrição e de tradução descritos.
O qut !\$
ü$
rlt
1.2 O advento da clonagem gênica e da reação em cadeia da polimerase
Esses anos de atividade e descoberta foram seguidos por um peíodo de calmaria, um anticlímax, no qual parecia, para alguns biólogos moleculares (como a nova geração de geneticistas se autodenominava), que havia poucos aspectos de importância fundamental ainda não-esclarecidos. Na verdade, havia uma frustração em função de as técnicas experimentais disponíveis no final da década de 1960 não serem suficientemente sofisticadas para permitir o estudo dos genes com maiores detalhes.
Depois, nos anos de l91I a 1913, a pesquisa genética foi novamente acelerada por uma revolução na biologia experimental, conforme descrito na época. Uma metodologia completamente nova começou a ser desenvolvida, viabilizando o planejamento e a realizaçãq se não com façilidade, pelo menos com sucesso, de experimentos previamente impossíveis. Tais métodos, chamados de tecnologia de DNA recombinante ou de engenharia genética, com base essencialmente no processo de clonagem gênica, abriram uma nova grande era para a genética, conduzindo a rápidas e eficientes técnicas de seqüenciamento de DNA, as quais permitiram que as estruturas de genes individuais fossem determinadas. Isso culminou, na década de 1990, com os projetos de seqüenciamento massivo de genomas, incluindo o projeto humano, que foi completado em 2000. A partir daí, foram desenvolvidos procedimentos para o estudo da regulação de genes individuais, o que permitiu que os biólogos moleculares entendessem como aberrações na regulação gênica podem resultar em doenças humanas, como o câncer. Essas técnicas geraram a biotecnologia moderna, que coloca os genes em funcionamento para a produção de proteínas e de outros compostos necessários à medicina e aos processos industriais. Durante a década de 1980, quando o entusiasmo gerado pela revolução da clonagem gênica estava no seu auge, parecia quase impossível imaginar que estava prestes a surgir mais um processo igualmente inovador e revolucionário. De acordo com o folclore do DNA, Kary Mullis inventou a reação em cadeia da polimerase (PCR) durante uma viagem de carro aà longo da costa da Califórnia, em uma noite de 1985. A sua idéia genial foi a concepção de uma técnica relativamente simples, que funciona como um complemento perfeito para a clonagem gênica. A PCR tornou mais fáceis muitas das técnicas que antes, apesar de possíveis, eram de difícil execução, quando dependendo apenas da clonagem gênica. Ela estendeu o alcance da análise de DNA e fez com que a biologia molecular encontrasse novas aplicações, inclusive em áreas fora do seu campo tradicional, de medicina, agricultura e biotecnologia. A ecologia molecular, a arqueologia biomolecular e a ciência forense de DNA são apenas três das novas disciplinas que surgiram como uma conseqüência direta da invenção da pCR, e os biólogos moleculares estão buscando novas maneiras de utilizar o DNA para responder questões sobre a evolução humana e o impacto de mudanças ambientais na biosfera. Trinta ãnos após a revolução da clonagem gênica, ainda estamos andando em uma montanha-russa, sem previsão de final para a excitação provocada por ela.
ilro@üÉs
[lsl
i;r'.::fll \-ìf!-
I
'o-rsr:rurr1 r-rciì
Ò
z
r! ',r;:orluor trrti oeìlüi:t J:\:ìl ()ïu .rl3 .rnb rt.l o o:qos oqlq o urd :l:r:s: :rru y ruol\:u : .!ìilnü()-ì r)ruor ':EiìDUr,rd suaSn:osrrtl sop ür1ì rtr,l opurnl; ,.'ossr noursua eu uanb elol roJ 'oql5 '?Ip ôJlno un arduas ual sEW of,oqj ap fip â w:âroq: ueu:nb erp uaa'âtsrJt oqlrlq un ã sru'?]oJ €I opur1:eqp:q apod 1os o anb erp uaa er:gtsrq msou rp oe5rnunuo: r a a:ol anb:od 'oPnuãs uJ 3f,o^ os'sassã ouof, serp ug'opunu op Jorru e'epn8e ezatsrJl ?un ?lÌo ![ ze;sap as raput anb o opnl anb erp uãJ oJ?f,nq un erra err8ap ;
ua anb
o opru atuad:: ep g'er:uasn€ ?ns ? eJor{r op?qgs op oÌJuãÌrs o'elâp
êuou
o zrp rfoJ gl Ios o'âJãqu€ury'otrsrfurJC'Ìrd nas o oes anb serp ruea,,
.ì
t! L G
o a
*ç,: o 6
Ct-onncev GÊNtcA
E Ar'rÁlrse oe
15
DNA
1.3 O que é clonagem gênica?
Erande era da
código genétiAs etapas básicas de um experimento de clonagem gênica são descritas a seguir (Figura 1.1).
(1)
Um fragmento de DNA, contendo o gene a ser clonado, é inserido em uma molécula de DNA, chamada de vetor, para produzir uma quimera ou molécula de DNA recombinante.
um anticlíde geneticistas
Construção de uma molécula de DNA recombinante 1
não-escladisponíveis o estudo dos
p
por uma re-
completase nao
eis. Tais mé-
O
.,,"["* de DNA
comba-
rf:ïï'*i*"o*
+
era para a geas quais per-
na décao projeto hu-
para o lares enten-
Transporte para o interior da célula hospedeira
Bactéria
2
como o em funcionae aos pro-
o
3 Multiplicação da molécula de DNA recombinante
clonagem gêa surgir mais
Bactéria portadora da molécula de
oo
DNA recombinante
_OO
doDNA, Kary
OÔ^
de carro ao r:ncepção de ro
para a clo-
4 Divisão da
de possíveis, estendeu o al-
célula hospedeira
aplicações, apenas três
oì o'
OO
oo
o
6(
5 Numerosas divisões
da PCR, e os
celulares resultando em-7)um clone
)noer ques-
Trinta anos
/ I I
{
sem
Figura
Colônias bacterianas crescendo em meio sólido
1.1
As etapas básicas da clonagem gênica.
ïoriF:J
xìv
'o:st:rUe:; r::ed
IE
t
'-r:::r1uo:
lroilitl I :nuuuo-ì oulol
L:re
d odlü"ìl J^âl o?u Jlã
inb r:d
o :.rqos oqlg o r:r:d
;l.r:ls: erx y
strcirur-r.J su;Snrol:ci :op Lrnr rtlq oputn|.. oss noursuâ âu uanb e:ol rog oqlll'prp oJlno un ::duas ua1 st141.o:oq: anb zrp uaa'âlsrrt oq1rrqun a stu'rro; ?I opuÌl f,eqprq apod 1os o anb erp ual.rrrgtsrq essou ep or5rnuquo: e e atol anb:o4 'opnuâs uJ ef,o 9s'sJss3 ouof, stq) ug opunu op roreu e'epn8t ezalsrJt run Bllo^ :J'ze;sap :s rapue anb o opnl anb etp uãJ'of,?f,nq un eJtl err8ap ua anb o opru atuada: ap g tr:uesn€ Bns E rfoqf, opeqes op orf,uâ[s o 'ãIâp ãuou o zrp BfoJ BI Ios o'âtrâÌ{uúuy'of,srf,u?JJ 'r?d nas o oes anb serp ruaa,, ;f
âp rrp J
w'â^oq: uau
'õ L G t,l
a
M:
o z o õ
16
T. A. Bnowru
(2)
O vetor funciona como um veículo que transporta o gene para o interior de uma célula hospedeira, a qual é, em geral, uma bactéria, embora outros tipos de células vivas possam tambóm ser utilizados. No interior da célula hospedeira, o vetor multiplica-se, produzindo numerosas cópias idênticas não apenas de si próprio, mas também do gene que ele caÍrega. Quando a célula hospedeira se divide, cópias da molécula de DNA recombinante são passadas à progênie, na qual o vetor replica-se novamente. Depois de um grande número de divisões celulares, é produzida uma colônia, ou clone, de células hospedeiras idênticas. Cada célula do clone contém uma ou mais cópias da molécula de DNA recombinante; diz-se, então, que o gene carregado pela molécula de DNA recombinante está clonado.
(3) (4)
(s)
1.4 O que é PCR? A reação em cadeia da polimerase é muito diferente da clonagem gênica. Em vez de utilizar uma série de manipulações envolvendo células vivas, a PCR é executada em um único tubo de ensaio, a partir da mistura de DNA com um conjunto de reagentes e da sua colocação em um termociclador, um equipamento que permite que a mistura seja incubada em uma série de temperaturas que são variadas de uma maneira pré-programada. As etapas básicas de um experimento de PCR são as seguintes (Figura 1.2):
(1) (2)
A mistura é aquecida a94"C, temperatura na qual as pontes de hidrogênio, que mantêm unidas as duas cadeias da molécula de DNA de fita dupla, são rompidas, causando a desnaturação da molécula. A mistura é resfriada a 50 a 60'C. As duas fitas de cada molécula poderiam reunir-se a essa temperatura, mas a maioria não o faz porque a mistura contém um grande excesso
depequenasmoléculasdeDNA,chamadasdeoligonuclffi
(3)
anelam com as moléculas de DNA em posições específicas. A temperaturaé elevada até 74oC,,con_s_ideradg-óqrlq4!a&_4 atividade da DNA-polime.ase mistura. Ãp;"ndo"-;; mais sobré DNÃìõ'timèi;
a"ffiqËËffi-ËË"na
ses na página 67. Neste estágio, tudo o que precisamos para entender o processo é que, durante essa etapa da PCR, a DNA-polimerase de Taqliga-se a uma extremidade de ca-
da iniciador e sintetiza novas fitas de DNA, complementares às moléculas de DNA. molde. Agora, temos quatro fitas de DNA, em vez das duas com as quais iniciamos a
(4)
reação.
A temperatura
é novamente elevada até94"C.As moléculas de DNA de fìta dupla, cada uma das quais consistindo em uma fita da molécula original e uma nova fita de DNA, desnaturam, gerando fitas simples. Isso inicia um segundo ciclo de desnaturação-anelamento-síntese, ao final do qual existem oito fitas de DNA. Com a repetição do ciclo por ,.. | 25 vezes, a molécula de fita dupla com a qual iniciamos é convertida em mais de 50 mii ttrOes de novas moléculas de DNA de fita dupla, cada uma delas uma cópia da região da { molécula inicial delimitada pelos sítios de anelamento dos dois iniciadores.
1.5 Por que a clonagem gênica e a PcR são tão importantes A clonagem gênica
Frguna e a PCR são procedimentos relativamente simples
(Figuras 1.1 e 1.2). Por que, então, elas são consideradas de tanta importância na biologia? Isso se explica principal-
ns eüapas hási
darea@ em
ohe da @inreÍË
1j!ìiTf \ìrt-
'o:sr,rrrelJ
t:ril
o
z
G
t
';;:e rluo: rred odrurl r ?t o?u âlJ ;rb rcd o orqos oqlg o utd .u:::rs: cru: y 'oq[g'erp oJ]no un arduas ual s?W oroqJ i r:f orirl- : rnuuuo-. ouro:'srrrÌr:ur-Ìd suf,aflrosrrd sop uirì rÌif,} opu?n| ,.'ossr noursua au uanb a:ol roJ âp Erp J seutã oq: uau anb erp ua1'âtsÌrt or{lrJq un ã seu'€roJ ?l opuq rrqg:q apod 1os o enb np uaa zt:gtsrq essou tp oeSenunuo: e e elol anbrod 'opuuâszJJro^os'sssâouof,serpug'opunuopf,oreue'epn€trzalsrJl?unBllo gzrgsapasrapueenboopntanbrrpuâJo:?f,nqunef,rlerrSap ua anb o opu aluadar ap g'zr:uasnr sns r rJorlJ op?qgs op oÌJue[s o'ãIãp âuou o zrp aoJ el Ios o'ãJâr{wuy'o:snuerg'rcd nas o oes anb serp u:a,,
'õ L G
It a
*Ë5 a
CLorunoeu GÈrurcn e ANÁLrsE oe DNA
o interior de uma célula s de çélulas vivas pos-
3',
c
5',
3',
3',
5',
5',
3',
17
DNA-molde
indo numerosas cópias
1
e ciuTega.
DNA recombinante são
Desnaturação do DNA-molde - 94'C
uma colônia, ou clone, uma ou mais cópias da pela molécula de
2 Em vez de utilizar em um único tubo ufun
Anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores - 50-60"c
sua colocação em em uma série de hásicas de um ex-
3',
5'.
ttt 5' \'--lniciadores ^\
5'
T--f-ï
5',
3 reunÍ-se
3',
Síntese de novo DNA - 74.C
a
EXCCSSO
3',
foiciadores, que
5',
llllltttttrrrrr 5',
.J
3'
& fita dupla,
5'
5',
3',
3',
5',
cada
fita de DNA, do ciclo por nrais de 50 miia da região da
o
5',
3'
5',
5',
I
Figura 1.2
l.l e 1.2). Por
i
As etapas básicas da reação em cadeia da polimerase.
principal-
?_:.rrli:l
3',
\ìt.
4 Repetição do ciclo 25-30 vezes
'o:struc-r; tred
o
z
G '-r:::tluo:r
wrã^oq: uau
oqlrq un
L::rd
odlsit J
at o?rl 3[3 -]nb rrd o c,rty-rs oq15 o r:r:d :,r::rsa
ual
:rxr ç
errglsrq rssou ep oeóenuquo: e : a:ol anbro4 opeues uJ âtro^ gs'sâssâ ouoJ s€rp ug opunu op Joreu r'epn8e ezalsut eun Btlo !J ze;sap as rapur anb o opnl enb erp uâJ'of,anq un ?f,rl er:8ap ue anb o opnt atu:d:: ap g'er:uasn€ €ns € ?Joqtr op?qgs op ortru?Ìrs o'elâp âuou o zrp eroJ gÌ Ios o'ãJãqueuryoisÌ3ueJ{'r€d nes o oes anb srrp ua1,, ãp eÌp â
anb ap uaa'ãlsrf,l
ê s?u'Bf,oJ ?Ì opuq
r?qyrq apod
1os
o anb erp
,ì
G
L
ItG a
**,ï ô G
18
T. A. Bnowr'r
mente porque elas permitem a obtenção de uma Íìmostra pura de um gene individual, separado de todos os outros genes da célula.
dual- d conjun
gene d
1.5.1 lsolamento de genes por clonagem
e SUaS
i
Na é acap
Para entender exatamente como a clonagem pode produzir uma amostra pura de um gene, considere o experimento básico da Figura 1.1, mas desenhado de maneira um pouco diferente (Figura 1.3). Nesse exemplo, o fragmento de DNA a ser clonado é um dos membros de uma mistura de muitos fragmentos diferentes, cada um dos quais é portador de um gene diferente ou de parte de um gene diferente. Na realidade, essa mistura poderia ser todo o complemento genético de um organismo - de um humano, por exemplo. Cada um desses fragmentos é inserido em uma molécula de vetor distinta, para produzir uma famflia de moléculas de DNA recombinante, uma das quais é portadora do gene de interesse. Geralmente, apenas uma molécula de DNA recombinante é transportada para o interior de uma célula hospedeira indivi-
clones que c0
sanimÍ gura l.
ox7 oo
Frasmentosde DNA
aì
"/
( \---,/ )
\
Vetores
construeão de moléculas
\e
Oru recombinantes
Cada recombinante carrega um fragmento diÍerente
/ lntrodução em bactérias
I
Plaqueamento
ooo Cada colônia contém múltiplas cópias de apenas uma molécula de DNA recombinante
iloriF:l \-H\
Figura 1.3 A clonagem permite que fragmentos de DNA individuais sejam puriÍicados.
Figur O proden
sd(
'o:srruu3 e:rd
..
IE ';;:e :1uo:
r::etì odrüât ãÀ?:ì oNU ala .rnb rtci o :;qos oqlg o t-rtc{ .r,r;r:sa oru:
y
rrlolirq r Enuuuo-. ouro:'scdr:rrr-rd su:6nrosr.rd sop uirÌ tÌir,Ì oplrïnf ,.'ossr noursua au uanb a:ol toJ 'oq1g'elp orlno un a:dues ual s?W of,orlj Jpsrpgw'J oq:tuauanbr4ruaa'âtsÌrtoqlrqrunâs?u'?JoJeiopuq:rqpqapodlosoanberpua;'er:gtsrqrssoutpor5tnurtuo:r9a:olanb:o4 'opuuâs zÍJ ãlo gs'sJssâ ouo: serp ug opunu op f,oreu r'epn€e rzalsrr eun BtloÀ [ zegsap :s rapue enb o opnl anb erp uãJ'otr?Jnq un eJrl tr:8ap :
ua anb
o opnt atuada: ap
g'a:uasnr
Ens E uorlJ
oprqrs op orruãls o'âÌâp ãuou o zrp efoJ elÌos o'ã]ãÌ{u?urv'otrsrf,u?JJ'Ied n:s o
ops anb strp
uaa,,
.ì
IE
L
G Uì
a
:e
E
ffi.5 I
i:g
Ct-orueeeu GÊNtcA E AruÁuse oe DNA
individual, separa-
dual, de modo que cada clone contém múltiplas cópias de apenas uma molécula, embora o conjunto final de clones possa conter muitas moléculas de DNA recombinante diferentes. O gene de interesse está agora separado de todos os outros genes presentes na mistura original e suas características específicas podem ser estudadas detalhadamente. Na prática, a chave para o sucesso ou o fracasso de um experimento de clonagem gênica é a capacidade de identificar um determinado clone de interesse em meio aos muitos outros clones diferentes que são obtidos. Se considerarmos o genoma da bactéria Escherichia coli, que contém pouco mais de 4.000 genes diferentes, poderíamos, em princípio, considerar desanimadora a tarefa de encontrar um determinado gene dentre todos os clones possíveis (Figura 1.4). O problema torna-se ainda mais assustador se lembrarmos que as bactérias são or-
pura de um gene, ira um pouco diferendos membros de uma de um gene diferente todo o complemento fragmentos é inde moléculas de DNA , apenas uma mola hospedeira indivi-
Uma porção muito
ÍrPE pequena do genoma de E. coli
trpD
trN trpB trpA
\ O gene a ser clonado
I 9 k
=t
unav
&--rry!é tpE
gsP
.
A-.
L
trpD
o trpA
Figura 1.4 O problema da seleção.
sejam purificados.
srorlPl
xuv
19
Como podemos selecionar ou identificar apenas um gene?
'orsouug errd
G ra:oquo:
r:.rcil
odul?: a
ãrl
o?u .r13 :nb lzd o o;qos oqqg o
r*d au:sa
arur y s?W'oJor{)
;Erro,rill s?nuuuo: ouro:'srzdr:uxd suaSmos;arÌ sop Mn elpJ opu?n|1.;ossr noursua auruanb elol rog'oqlll'Erp oJìno un::duas uet Jp srp â mb^oq: uau anb erp uaa'âtsrn oqlrJqrun ã s?ru'?JoJ gl opurr reqp:q apod 1os o anb erp ua; er:91srq essou rp oe5rnuquo: e a a:ol anb:o4
'oprluszq;âro^os'sssouoJserpug'opunuopJoreue'epnãrezalsrl?un?llo
ll'ztysapasrapueanboopntenberpueaore:nqunuuer:8ap
era enb o opnl aluadar ep g'er:uasn? ?ns r €ior{f, op?q?s op or:uâIs o'âIâp âruou o zrp BJoJ gI Ios o '3Jâr{rnuv'oJsr:uerJ'r?d
nes o oes anb serp ruaa,,
,ì
IE
L
IE
rt
a
20
T.A.BRowN
ganismos relativamente simples e que o genoma humano contém aproximadamente 10 vezes mais genes. Contudo, conforme explicado no Capítulo 8, vrírias estratégias diferentes podem ser utilizadas para assegurar a obtenção do gene correto ao final de um experimento de clonagem. Algumas dessas estratégias envolvem modificações do procedimento básico de clonagem, de modo a determinar que somente células contendo a molécula de DNA recombinante desejada possam dividir-se, fazendo com que o clone de interesse seja automaticamente selecionado. Outros métodos envolvem técnicas que viabilizam a identificação do clone a paÍir
cleotíden
de uma mistura de muitos clones diferentes. Depois da sua clonagem, praticamente não existem limites pÍÌra as informações que podem ser obtidas a respeito da estrutura ou da expressão de um gene. A disponibilidade de material clonado estimulou o desenvolvimento de métodos analíticos para o estudo de genes, com a introdução constante de novas técnicas. Os métodos para o estudo da estrutura e da ex-
(r)
ofiia
tas
memo&
tmatfoã Umr de
rmg
aindaé
r
nr
EN frN
ft
(F
pressão de um gene clonado são descritos nos Capítulos 10 e 11, respectivamente.
€$Ú
(?JHá
1.5.2 Isolamento de genes Por PCR
FC
A reação em cadeia da polimerase também pode ser utilizada para a obtenção de uma amostra pura de um gene. Isso ocorre porque a região da molécula de DNA de partida que é copiada durante a PCR é o segmento delimitado pelas posições de anelamento dos dois oligonu-
ctÍt sÊÉ
hü
Eo
Ack ca
fran
Frexer .det."n
trpE
q[Ecrdg
fd isoh
trpD
cmobs
trú
E-
AlÉr
de groc
trpB
õ€ryk
mmial
$Qts
é ftÍrrl-
aro'f
1
Inffidos gwllam
Reação em cadeia da polimerase
Lllmr
DIIìIA&
ewe&l ção em gEnl OE
mime ft mnm &{azo dtir,furl I
rmml
Figura 1.5
x vários milhões
lsolamento de genes por PCR.
G
t
'::::rpro:
cd o ::r1os oqlg o r:vd aru:sr aru y ir:JÕì![Ì r Enuuuo,r ouro: 'sr:dr:rrr-rd su:5:losr:d sop [rn E]ieJ opu€n],, ossr noursuo au uanb a:ol ro{ oql5'rrp oJrno un ::duas ua1 s?W'oJorll Jp Brp â sm'â^og: uau anb erp uraa.âlsrrt oqllq un 9 s?u,rroJ gÌ opuqrnlprq apodlos o anb rrp uaa.errgtsrq essou €p o€5enuquo: r a a:ol anb:o4 'opnus zJ ?tro^ 9s'sssã ouof, s?rp uã opunu op roreu r'epn8e zalsrrt ?un etlo !J'zeJsap as rapur anb o opnl enb erp ua;'orernq un r:rl er:8ap ua anb o opru aluadar ep g'a:uasnr ?ns e ?Joqf, op?qes op ortruâ[s o'âlâp ãuou o zÌp ?]oJ EI los o'â3ârlueuryo3sr3u?f,J'Ìed nas o oes anb s€Ip uâL, L:,rrcl
ocirÍit
3Àãt
olu
â[3 Jnb
'õ L
G Uì
a
Clotueev .10
GÊrurcn e ANÁLtsE DÊ
DNA
21
cleotídeos iniciadores. Se os iniciadores anelam de ambos os lados do gene de interesse, muitas cópias do mesmo serão sintetizadas (Figura 1.5). O resultado é o mesmo de um experimento de clonagem gênica, mas o problema de seleção não existe, pois o gene desejado ã automaticamente "selecionado", em conseqüência das posições de anelamento dos iniciadores. Um experimento de PCR pode ser completado em poucas horas, ao passo que a obtenção de um gene por clonagem pode levar semanas ou meses. Por que, entãã, a clonagem gênica ainda é uÍilizada? Isso se deve a duas limitações da pCR:
vezes
diferentes podem de clona-
ml básico de clonaD\A recombìnante :,maticamente seler do clone a partir
(l)
que poilidade de ma!ì estudo de genes, 'J,À estrutura e da exrÊmente.
(2) :ão de uma amosque é copia-
urtida
r dos dois oligonu-
Para que os iniciadores posicionem-se corretamente, em ambos os lados do gene de interesse, as seqüências desses sítios de anelamento devem ser conhecidas. É fácit sintetizar um iniciador com uma seqüência predeterminada (ver p. 1g0), mas se as seqüências dos sítios de anelamento são desconhecidas, é impossível a produção de iniciadores ade-
quados. Isso significa que a PCR só pode ser utilizada para isolar genesjá previamente estudados - o que deve ser feito por clonagem. Há um limite para a extensão de seqüências de DNA, as quais podem ser copiadas por PCR. Cinco quilobases (kb) podem ser copiadas com relativa facitidade e pode-se lidar com segmentos de até 40 kb com atilizaçáo de técnicas especializadas. Entretanto, tais segmentos são mais curtos do que a extensão de muitos genes, especialmente aqueles de humanos ou de outros vertebrados. Se é necessária uma versão intacta de um gene longo, a clonagem deve ser utilizada.
A clonagem gênica é, portanto, a única maneira de isolar genes longos ou genes que nunca foram estudados anteriormente. Mas a PCR ainda possui muitas aplicações impórtantes. Por exempl_o, I4e-g$_o_que_g..qg$êlcia de q,p_ggng seja descoqhecida, ainda pode sei possível adetgrminação de sgqgp.q-gla-s_.g2ropriadas para um par de iniciadóreg, ô9m uãsê no quêãõ nheçld.q99tre,,9.geqtiQry.iggggggeqe eqq!y,91_qtte g{Lqm grgatilgg qlt"rylÈ. um lene que foi isolado e seqüenciado a partir de, digamos, ôaúunaongoì"ããii",'lìõ.tãrto, ser utilizado como base para projetar um par de iniciadores pÍÌra o isolamento do gene humano equivalente.
Além disso, existem muitas aplicações nas quais é necessário o isolamento ou a detecção de genes cujas seqüências já são conhecidas. uma pCR de genes de globina humanos, por exemplo, é úilizada em testes para verificação da presença de mutações que podem causar a anemia hemolítica chamada talassemia. A projeção de iniciadores adequados para essa pCR é fâcil, pois as seqüências dos genes de globina humanos são conhecidui. RpOr a pCR, as cópias dos genes são seqüenciadas ou estudadas de alguma outra maneira para determinar se alguma mutação talassêmica está presente. Uma outra aplicação clínica da PCR envolve a utilização de iniciadores específicos para o DNA de um vírus patogênico. Um resultado positivo indica que uma amostra contém o vírus e que a pessoa que a forneceu deve ser tratada para evitar o estabelecimento da doença. A reação em cadeia da polimerase é exrremamente se-nsívrel: png_g_Ìg{Ì-tgg-e1q-_cui$-4$_o-p.g de C.e,eç4q
seia -qs4.+!!-*de-.s-d-""tççfues_de*_D']jÃËss'_q_qúgõ-bí;pêÃ".-,]-ã-ãolécuta de DNA na mt"q191a rniqlll. rltq.pig{t"ifi-q"-a"que t|í.c"!ig? é -c-gpaz dedetectar vírus nôs estágios mais iniciais de uma infecção, arlm.qllan$o.as ôtranceJaè r"Càtro no t utu-ónto. Èsu gãno. sensibilidade faz com que a PCR taúbèm possa ser utilizada com DNA proveniente de amostras de medicina legal, como cabelo ou manchas de sangue secas, ou até mesmo de ossos de pessoas mortas há bastante tempo (Capítulo 16).
Figura 1.5 lsolamento de genes por PCR.
r.':::f \ì{Y
'r)-ì:tlu?-i:l ì'lr(l
o
IE '.r;r;r1tlr: rrerï ocìtt-ìJ 3af,1oÌu il3 Jnb ird o:;qos oqlg ãp Erp ã w:à\oq:
o
ur:d:,r.r:rsr::ri y
uau anb erp uaa'âlsrrt oqluq un e seu'uoJ gl opuq:rqp:q apod 1os o :nb rrp ue1'euotsrq rssou rp oe5enurluo: r e a:ol anb:od 'oPuues uJ âJo^ os'sâssã ouoJ sEIp ug'opunu op roreu e'epn8e ezalstJl ?un €lÌo iJ'zrgsap as rapur anb o opnt anb erp uaa.o:r:nq un r:n eu8ap ua anb o opru aluad:r ap E-rr:uasnB ens ? ef,oqtr op€q€s op orJuãIrs o 'âlap âuou o zÌp eloJ ?l los o.âJârlueuv.of sÌJuef,J,rrd nes o ots anb s"p *".1^,
.ì
G
L
IE
o a
*ú:
z o @
20
22
T. A. Bnowlr
1.6 como encontrar o seu caminho ao rongo deste Iivro
gamsr
mais
T. A. Bnowrrr
uti gem.. gem' ser
A rea
Este livro explica como a clonagem gênica, a pcR e outras técnicas de análise de executadas e descreve as aplicações dessas técnicas na biologia moderna. As apli cobertas nas segunda e terceira partes do livro. A Parte2 descreve como genes e ge estudados, enquanto a Parte 3 considera as diversas aplicações da clonagem gênica e na biotecnologia, na medicina, na agricultura e na ciência forense. Na Parte 1, abordamos os princípios básicos. A maioria dos nove capítulos é clonagem gênica, pois essa técnica é mais complicada que a pcR. euando você ti dido como é realizadauma clonagem, játeráentendido muitos dos princípios básicos todologia de análise do DNA. No capítulo 2, tratamos do componente central de um mento de clonagem - o veículo - que transporta o.gene para o interior de uma célula deira e é responsável pela sua replicação. Para funcionar como um veículo de c molécula de DNA deve ser capaz de entrar em uma célula hospedeira e, uma vez no da mesma, deve replicar-se para produzir múltiplas cópias de si mesma. Dois tipos culas de DNA que ocoÍïem naturalmente satisfazem essas exigências:
tra pu da du
(1)
Plasmídeos, que são pequenos círculos de DNA encontrados em bactérias e em
(2)
outros organismos. os plasmídeos podem replicar-se independentemente do mo da célula hospedeira. cromossomos virais, em especial os cromossomos de bacteriófagos, que são infectam especificamente bactérias. Durante a infecção, a molécula de DNA riófago é injetada na céluÌa hospedeira, onde irá replicar-se.
I
desejr
ciona de un s
terial com
a
pressí
1.5.2 lsolar
o capítulo 3 descreve como o DNA é purificado a partir de células vivas - tanto que será clonado quanto o DNA do vetor - e o capítulo 4 cobre as várias técnicas nipulação em laboratório de moléculas de DNA purificadas. Existem muitas técnicas so, mas duas são particularmente importantes para a clonagem gênica. A primeira é gem de um vetor em um ponto específico e a segunda, a sua reparação, de modo a i gene no veículo previamente clivado (Figura 1.1). Essas e outras técnicas de manipu DNA foram desenvolvidas como subprodutos de pesquisa básica sobre a síntese e a ção de DNA em células vivas, sendo que a maioria delas faz uso de enzimas puri jas propriedades e modo como são utilizadas em estudos envolvendo DNA são Capítulo 4. Depois de uma molécula de DNA recombinante ter sido construída, ela deve ser célula hospedeira, de modo que a replicação possa acontecer. o transporte para o inter lula hospedeira faz uso de processos naturais para a incorporação de moléculas de D midial ou viral, os quais, assim como o modo como eles são utilizados na clonagem g, descritos no capítulo 5. Nos capítulos 6 e 7, são apresentados os tipos mais importan tores de clonagem e discutidas as suas utilizações. Para concluir a cobertura da clon nica, tratamos, no Capítulo 8, do problema da seleção (Figura 1.4), antes de Capítulo 9, a uma descrição mais detalhada da PCR e das técnicas relacionadas a ela
:-j
I
'\ >: ri
:ì'.lJ
i,Ìl'!j
':;:rrlrro:
r;rr1 oc{ur:t f,,\31 otu
f,13
Jrrb trrl
l lrlor
or11rq
o
t.ttcl:,r:::s: ettrt y
ftu'ê-\oq: uau anb erp u:1 âlsrtrt oq[]q un e s?ru'eroJ el opuq reql:q epod yos o enb erp uaa trrglsrq essou tp ot5tnurluo: t a acol anbro6 opuuâs z,J âro-\ os'sãssã ouof, srrp ug'opumu op rorru r'rpn8r rz:tsrrt ?un ttlo :J'ze3sap as rapur enb o opnt anb trp uãI ofernq [Ín €f,Il er:8ap a: :nb o opn: :ru:d:: ap E tr:uasnE Èns È eroqf, opeqgs op oÌf,uêIs o'âlâp auoü o zrp €loJ €l Ios o ':lâqu?uv otrsllutrJ 'Ied nas o oes anb s?IP uãJ!, ap rrp ã
llnmrlllt, llllhÌru
i$nnuurrn:, LrulilltliltüÌi
ïllllrruurLrdurn lLtì1ffiÌltilíiilrÍrrL
<
Dr
dem
tc*i
1
t! t 'õ L
G UI
a
*t:
o 2 9
iililìtlúillliliïj
'ltlìrurmnrunr ihttut
Cnpírurc 2 Veículos para a Clonagem Gênica: Plasm ídeos e Bacteriófagos
Plasmídeos. 25
Bacteriófagos, 30
Para ser capaz de afuar como um veículo para a clonagem gênica é necessário que uma molécula de DNA apresente viírias características. Ainda mais importante é que tenúa capacidade de replicar-se no
interior da célula hospedeira, de modo que numerosas cópias da moiécula de e passadas às células-filhas. Um veículo de clonagem também deve ser relativameàte pequeno, preferencialmente com um tamanho inferior a 10 kb, pois grandes moléculas tendem a quebrar-se durante a purificação e são mais dificeis de ser manipuladas. Dois tipos de moléculas de DNA que satisfazem esses critérios podem ser
DNA recombinante pobsam-se*qroduzidas
encontrados em células bacterianas: plasmídeos e cromossomos bacterianos. Embora os plasmídeos sejam utilizados com mais freqüência como vetores de clonagem, dois dos mais importantes tipos de vetor em uso atualmente são derivados de bacteriófagos.
1
Plasmídeos Garacterísticas básicas dos plasmídeos Plasmídeos são moléculas de DNA circulares que têm uma existência independente na célula bacteriana (Figura 2.1). Os plasmídeos quase sempre são portadores de um ou mais genes, que, com freqüência, são responsáveis por características úteis apresentadas pela bactériã hospedeira. Por exemplo, a capacidade de sobreviver em concentrações normalmente tóxicas de antibióticos, como cloranfenicol ou ampicilina, é muitas vezes devida à presença na bactéria de um plasmídeo portador de genes de resistência a antibiótico. Em laboratório, a resistência a antibiótico é freqüentemente utilizada como um marcador selecionável paÍa assegurar que as bactérias em cultura contêm um determinado plasmídeo (Figura2.2).
urotrF:[
ruv
'o:srrurr;
ert;d
G ::::quo:r
r::ecl oc{rüât
J ;t orÌr :13 êab
rtd o arqos oqlg o txd a,r:r:s:
:ru y
rtrosÍq p Enunuo: ouro: 'srcdnur-rd suaisrros::d sop urn elïE_l opu:n|1.,.ossr nounua aur uanb ero,t rog .oq1g."rp orraà *.lld*", -.r ,"ry.-oq, âPZIP â sru'ã^oq: uau enb erp uaa'ãlsrll oqlrJq un g s€u'Er.lt opurr:eqprq apodlos o anb rrp uea'euorsrq essou ep otSenuDuo: r a a:ol anb:o4 'opqus zçâJo^ os'sas ourotr seÌp ug.opunu op Joreur e,rpn8e9l ezelsrJl Eun ?lÌo^ A.zJsap es rapue anb o opnr enb rlp uaJ.orerrq *o ,r^ ,rÉr[ aa enb o opru elueda: ap g'er:uasn€ ens ? BJoqf, op?qrs op orJuãlrs o'ãlãp âuou o zrP ?rcJ o'arrqr"rry.o:sr:uag,rud i
911o,
nas o oes anb wrp uraa,,
,ì
G
L r!
rt
a
26
T.
A. Bnowru
frtuo
ÍsrDlI
nr-ËEfiü
Plasmídeos
@ì
nepüçi
roçcooü
Plasmídeos
nfunr1
rt4õmcr
Figura 2.1 Cromossomo bacteriano
Plasm ídeos: elementos genéti-
@ffir
cos independentes encontrados em células bacterianas.
CUECNÍrc
E&NmlÍI EisdcÍe$r
Tlgúor -
Otmanlnr
Ftuàdm mhoid (TftlaLl)
Resistência à ampicilina
Resistência à tetraciclina
o o oox O \-i O
Células de E. coli,
6., algumas contendo RP4 @Cétutas com o plasmídeo
\
OCétutas sem o ptasmídeo
\
/
\
Figura2.2
-_,,.7t, Meio de multiplicação normal sem antibiótico
Meio de multiplicação + 50 pg/ml
-
tetraciclina I I
I
V
V
Todas as células capazes de
Somente células contendo RP4 podem multiplicar-se
multiplicar-se
erorrp:l
O uso de resistência a antibiótico como um marcador selecionável para um plasmídeo. O plasmídeo RP4 (no topo) é portador de genes de resistência à ampicilina, à tetraciclina e à canamicina. Somente as células de E coli que contêm RP4 (ou um plasmídeo aparentado) são capazes de sobreviver e multiplicar-se em um meio com quantidades tóxicas de um ou mais desses antibióticos.
nln23 EffiS ttslrm ffio úGüíbil
) Xuv | 'o:sr:uer3 e.rrcl G
jEriotìtÌ Ë Enuuuo: orro:'srzdr:ur,rd
suaËerros-rar{ sop rtrÌÌ r:t.ir-}
':c:cquo:r urtl odu!ât 3Àat o!ü âlã .nb nd o ::cps oqlg o ur:d u:::s: :rru y opu?n},.'ossr noursua au uanb a:ol rog'oq[g'erp o]lno m a:dures ural s€W.oroq3
uaa'ãlsrrl oÌIprq un e sru'BroJ ?l opuq reqprq apod 1os o anb rrp uaa'errgrrrg ogì".rrrro, . .ro rràrod "rror "p ouotr srD ugopunü op Jorcu e'epnBe ezalsrt Eún w)o g'zglsap as.rtpue anb o opnl anb grp sal'otetng "un u.u euãelt aa anb o opnl aluada: ap g'enuasne ens ? eroqJ opeqús op ortruâIs o 'êlãp âruou o zrp eJoJ 9l Ios o 'âlâquBuy'o:sr:uerg 'red nas o oes anb serp ruaa,, .p
9-*'*oqr
"gp 'orj'ilB zg eJo
uau
gs'sâssâ
anb rrp
.ì
IE
L
$ ttt
a
Croruaeeu GÊNlcA
E
AuÁrtse oe
DNA
27
o ra a produção de suas cópias, enquanto alguns dos plasmídeos maiores são portadores de genes que codificam enzimas especiais, as quais são específicas para a replicação plasmidial. Alguns poucos tipos de plasmídeos são também capazes de replicar-se a partir da ry3 in serção no cromossomo bacteriano (Figura 2.3b). Tais plasmídeoíìãtegratFõíouffisoirios
aol@
porí R
elementos genétiencontracélulas bacterianas.
ïndepénilãntêíã ïméghção támbéú ïõrnossornõí'dè baciêriófago3, que serão descritos
mais detalhadamente quando forem considerados (p. 31 ).
2;Nz Tamanho e número de cóPias O tamanho e o número de cópias de um plasmídeo são importantes sobretudo no que diz respeito à clonagem. Já foi mencionada a relevância do tamanho do plasmídeo e afirmado ser um tamanho inferior a l0 kb desejável para um vetor de clonagem. O tamanho dos plasmídeos (Iabela 2.1) vana entre aproximadamente 1,0 kb, para os menores, até mais de 250 kb, para
(a)Plasmídeonão-integrativosmídeos
m
ffilW oâ
o-
, Cromossomo bacteriano
(b) Epissomo Cromossomo bacteriano
a antibiótiselecioplasrnídeo. O {no topo) é porde resistência à
nrmarcador
eacaas células RP4 (ou
sao e multicom de um ou
)-O @@ Cromossomo Portador do plasmídeo integrado
PlasmÍdeo
Á,u,"^o""rrr\
/\
Figura 2.3 Estratégias de replicação de (a) um plasmídeo não-integrativo e de (b) um epissomo.
o
.- z
IE
,ì r:rd rrsllsf, JtÌll V
G
oqlrq un 3 sru'eroJ ?Ì opurT rtqprq apod 1os o anb rrp uaa er:91srq tssou ep og5tnurluo: t a a:ol anb:od .opouãs zJ âf,o gs,sãsse ouof, serp uã opunu op rowu e'epn8t ezatsrrt Eun ?tlo :J'zegsap :s reput anb o opnl anb ap uâI'of,?f,nq un ?rn er:8ap aa anb o ãpnr aruadar ap g a:uasne Ens e eJoqtr oprqrs op orJuâ[Is o'ãlâp âuou o zrp ?troJ 9l los o 'â]equeuv oJsrf,utrg 'Ied nes o ots enb sEIp ueJ,,
rt
'-r-rf,3rìtror
,p rrn t
o-.1-q: uau
anb erp uaa'ãtsrJl
l:rd ocitur.l il:l oru
r1o
:nb ltrl
o o;qos ot115 o
L
G
a
*g'i
o
6
28 ï
A. Bnowlr
Tabela 2.1 Tamanhos de plasmídeos representativos
Plasmídeo
Tamanho Extensão de nucleotídeos (kb)
Massa molecular
(MDa)
Organismo
lilffirglci odhnkh
pUCS
2,1
1,8
ColEl RP4
6,4 54
4,2 36
Pseudomonas e outros
F
95
63
E. coli
TOL
rt7
78
Pseudomonas putida
pTiAch5
213
142
A g ro b ac t e rium
E. coli E. coli
fim.ttl
A$cÉf
lürafË
ummmfi"rrt
tumefac
Mrlegrb n ie
,ffiXra-l
ns
íih@E€ntËi
üllfhmceff
rffitËr ffiria- n
os maiores, de modo que apenas poucos deles são úteis para
autilizaçáo em clonagem. Entretanto, conforme descrito no Capítulo 7, plasmídeos maiores podem, sob alçumas circunstâncias, ser adaptados para a clonagem. a O número de cópias refere-se ao número dè-moléculas de um determinado plasmídeo que são encontradas normalmente em uma célula bacteriana individual. Os fatores que controlam o número de cópias não são bem-compreendidos, mas sabe-se que cada plasmídeo possui um valor característico, que pode ser de apenas um (em especial para as moléculas grandes) ou igual ou maior do que 50. Via de regra, um vetor de clonagem útil deve esta.r presente na célula em múltiplas cópias, para que grandes quanúdades da molécula de DNA recombinante possÍìm ser obtidas.
@mfirmítnd @uffiGWE* ürrlllEnF pe
'ffi@Err
'elí
A classifir
trcrí$[iqa cl
2.1.3 Conjugação e compatibilidade
ffiffiõs
Os plasmídeos são divididos em dois g*po!.onlugativos e não-conjugativos. Os plasmídeos conjugativos são çarccÍeizados pela capacidade de promover a conilgação sexual entre células bacterianas (Figura 2.4),umprocesso que pode resultar na propagação do plasmídeo conjugativo de uma célula para todas as outras células de uma cultura bacteriana. A conjugação e a transferência do plasmídeo são controladas por um conjunto de genes de transferência, ou tra, que estão presentes em plasmídeos conjugativos, mas ausentes no tipo nãoconjugativo. Um plasmídeo não-conjugativo pode, contudo, sob algumas circunstâncias, ser co-transferido juntamente com um plasmídeo conjugativo, quando ambos estão presentes na mesma célula.
lt
I
íll Ph
üÍn
jus í!) Ph resis
oÍr pÍop tlËtx
Vários tipos difererltes de plasmídeos podem ser encontrados em uma mesma célula ao mesmo tempo, incluúe mais de um plasmídeo conjugativo diferente. De fato, sabe-se que células de E. coli podem conter simultaneamente até sete plasmídeos diferentes. para serem capazes de coexistir na mesma célula, os plasmídeos diferentes devem ser compatíveis. Se
I
l
I
i ii
n4s-
Étfr l{l
dois plasmídeos são incompatíveis, então um ou outro será rapidamente perdido pela célula. Diferentes tipos de plasmídeo podem, portanto, ser classificados dentro de ãiferentes grupos de incompatibilidade, com base na possibilidade ou não de coexistirem na mesma célula. Os plasmídeos de um mesmo grupo de incompatibilidade são freqüentemente similares entre si quanto a vários aspectos. A base da incompatibilidade não é bem-compreendida, mas acredita-se que eventos que ocoffem durante a replicação são os responsáveis pe1o fenômeno.
l Ì
I t I I
I' Ì
l
Classific
l5l
Cotr Plas
tïnu Ptrn
pbfl
tas d
2.15
Plasmídc
O fam de(
','
qrs ela ta 7âÍto é o
t
È_ r.roìrrf y >rv
|
-..,''
',,'., , '.r,'.,
o 2
G '-r:::rluo: rrcd ocftü.r:l ã^Jl olu Jla inb rrd o :;qos
oq13 o r;rrd
:,r.r::sl aru
y
ep eÌp e sstu 'ã oq: uau enb rrp ua; elslr oqIJq un ã s?u'BroJ 9l opu-ÌÌ leqyrq apod 1os o anb erp 'opÊuâs zJ âro^ os'sãssa ouotr srrp ug.opunu op rorrur e,epn8r ezatsrJt ?un €lÌo
ao enb o opnl aluadar
ap
g'tr:uasnt
?ns 3 ?Jorp op€qts op orf,uãÌrs
uaa er:grsrq essou rp oeórnurluo: r a a:o,r anbro4 :[.ze;sap :s repuÃnb o opìl ..b rrp *ea.o:ernq urn r:n er:5ap
o'âlâp ãuou o zÌp rrog
"11o,
o..Dqreurv.o3sÌJw.rJ,red
nas o
on anb selp uâL,
,ì
G
L
G
rt
a
*Ë5
g
6
d
Ct-oruncev GÊurcn e ANÁLtsE oe
Célula doadora
DNA
29
Célula receptora
Íganismo
Figura2.4 coli coli ydomonas e outros
nli
domonas putida
fucreium
tumefaciens
Ìão em clonagem. Entre_ l $ob algumas circunstân_ rnunado pÌasmídeo que tuores que controlam o possui um va-
TransÍerência de plasmídeo entre células bacterianas por conjugação. As células doadora e receptora fixam-se uma à outra por uma Íímbria, um apêndice oco presente na supedície da célula doadora. Uma cópia do plasmÊ deo é, então, passada paraacélula receptora. Acredita-se que a transÍerência ocorra através da fímbria, mas isso ainda não Íoi comprovado. A transÍerência por J outros meios (por exemplo, dire- i tamente pelas paredes celulares ! das bactérias) permanece sendo , uma possibitidade.
Plasmídeo conjugativo
o
o
J
las grandes) ou igual u'esente na célula em binante possÍÌm ser
2,1.4 Classificação dos plasmídeos A classificação mais útil dos plasmídeos de ocorrência natural é baseada na principal característica codificg!3leleqggng!{lasmidiais. os cinco principais ripos de plasmídeo, de acordo com essa classificação, são
_sú"rtlos. Os plasmí_
sexual en-
(l)
ão do plasmí-
:ucteriana. A con_ *genes de trans_ s no tipo não_
re
(2)
iïrürostâncias, ser presentes na ürmsúna ii,uru,r"
célula ao sabe-se que Para serem
') (3)
üe
pela céludiferentes na mesma
slml-
Plasmídebs de fertilidade ou "F' cÍìrregam apenas genes trae não possuem qualquer outra caracteística além da capacidadei€ promoverem a transferência plasmidial conjugativa. Exemplo: plasmídeo F de E. coli. Plasmídeos de resistência ou "R" caÍïegam genes que conferem à bactéria hospedeira resistência a um ou mais agentes antibacterianos, como o cloranfenicol, a ampicilina ou o mercúrio. Plasmídeos R são muito importantes para a microbiologia cÍnìca, pois a propagação dos mesmos em populações naturais pode ter sérias conseqüências no tratamento de infecções bacterianas. Exemplo: Rp4, comumente encontrà do em pseudomo_ ^-ocorre_ndg rambém em muiras oìúãÀ uâòieú; "ry.ryas Plasmïiteós-eol codificam ôôtiõinas. pïoti:inas-qìé mã.ram outras bacrérias. Exemolo Exemplo:
-
ColEl (4) (s)
osiegÍúteì:-
\
de E. coli.
Plasmídeos degradativos permitem que a bactéria hospedeira metabolize moléculas incomuns, como o tolueno e o ácido salicílico. Exemplo: ToL de pseudomonas putida. Plasmídeos de virulência conferem patogenicidade à bactéria hospedeira. Exemplo:
plasmídeos Ti
de
Agrobacterium tumefociens,que induzem
to-or",
tas dicotiledôneas.
de galha em
plan-
nels pe-
2.1-5 Plasmídeos em outros organismos que não bactérias O fato de os plasmídeos serem bastante comuns em bactérias não implica, de maneira alguma, que eles também o sejam em outros organismos. O plasmídeo eucariótico mais bem caracterizado é o círculo de 2 pm, que ocoÍïe em muitas linhagens da levedura Saccharomyces cerevi-
IE
t
if::''r]:-!.:ì:::rLro-ìoliior's.r.r,ur-rtÌs,e.ruos'rlserprunrrr.lopurnf;]ï:i:::lr:l*tff;:'":ï;'iulfïJ;iï:'ji::Í;üïr"r: su:âaoq: uau anb erp uaa âlslr oqll]q un t"*'".ã-1^91 opt.r1*qprq apodlos o anb erp uaa.rr:grsrq essou ep or5rnurruo: t a 9 'oPÌluâs nJ JJo-\ os'sessâ ouof, e:ol anb:od s'rp uA.opunu op ror"g.r"3r.p ., ,.prÃrt á op.r ..b un rru.r8ap ae :nb o opru aluada: ap g'er:uasne Ens t ef,oqtr op"q", "."p.3" "r.lrr, "*. "rio^ "rp,ra1.o:rrnq op oìrr"1* o'ayap aurouo zrp r.áj o,...qr?uv.ofsrJurf,J,red Jp Erp ã
"11o,
nas o ors anb selp uq1 ..
'õ L G
o a
*çi
a
o
30
T. A. Bnowrrr
A descoberta do plasmídeo de 2 1tm teve um impacto bastante positivo, pois permitiu a construção de vetores para a clonagem de genes utilizando esse organismo de grande importância industrial como hospedeiro (p. 140). Contudo, a busca de plasmídeos em outros eucariotos (como, por exemplo, fungos filamentosos, vegetais e animais) mostrou-se infrutífera, suspeitando-se que muitos organismos superiores simplesmente não abrigam plasmídeos no interior de suas células. siae.
2.2
Bacteriófagos
2.2.1 Características básicas dos bacterióÍagos
F
Os dois tipos prit estrutuÍa de Íagos: (i e cauda (por exe
Bacteriófagos ou fagos, como são comumente conhecidos, são vírus que infectam especificamente bactérias. Como todoyos vírus, os fagos possuem uma estrutura bastante simples. Eles consistem meraríente eì-íma molécula de DNA (ou, ocasionalmente, de ácido ribonucléico IRNAI) portadora de alguns genes, inclusive vários para a replicação do fago, envolvida por uma cobertura protetora ou capsídeo, formada por moléculas protéicas (Figura 2.5). O padrão geral de infecção, que é o mesmo para todos os tipos de fago, é um processo de três etapas (Figura 2.6).
(1) (2)
i
I
(3) I
{b) filamentoso (po,r
A partícula do fago fixa-se na superfície externa da bactéria e injeta o seu cromossomo de DNA no interior da célula. A molécula de DNA do fago é replicada, leralmente por enzimas específicas, codificapor genes do seu próprio cromossomo. Outros genes do fago dirigem a síntese dos componentes protéicos do capsídeo partículas virais são montadas e liberadas da bactéria. das
e
novas
Com alguns tipos virais, todo o ciclo de infecção é completado de forma muito rápida, possivelmente em menos de 20 minutos. Esse tipo de infecção rápidaé chamado de ciclo lítico, pois a liberação das novas paqtículas virais está associada à lise da célula bacteriana. O aspecto mais caraóterístico de umficlo de infecção lítico é oÉìo Ua síntese das proteínas do capsídeo ocoÍrer imediatamente após a replicação do DNA do fago, cujas moléculas nunca são maltidas em uma condição estável na célula hospedeira.
I i I
I
2.2.2 Fagos lisogênicos Diferentemente de um ciclo lítico, a infecção lisogênica é caracteizada pela retenção da molécula de DNA do fago na bactéria hospedeira, possivelmente ao longo de muitos milhares de divisões celulares. Com muitos fagos lisogênicos, o DNA viral é inserido no genoma bacteriano, de uma maneira similar à inserção epissômica (Figura 2.3b). Aforma integrada do DNA do fago (chamada de profago) é quiescente e a bactéria portadora (referida como um lisógeno) é, em geral, fisiologicamente indistinguível de uma célula não-infectada. Entretanto, o profago acaba sendo liberado do genoma da bactéria hospedeira e o fago reverte para o modo lítico, lisando a célula. O ciclo de infecção O" l"-Ua. (I),rlq&gg lirgJgqqslpic!, q lqoJg$_qe_ryegra21_ Um número limitado de fagos lisogênicos segue um ciclo de infecção diferente. Quanclo M13 ou um fago aparentado a ele infecta E. coli, novas partículas virais são continuamente montadas e liberadas da célula. O DNA de Ml3 não é integrado no genoma bacteriano e não se torna quiescente. Com esses fagos, a lise celular nunca ocoffe e a bactéria infectada pode continuar a crescer e a dividir-se, embora a uma velocidade menor do que a de células não-infectadas. A Fìgura 2.8 mostra o ciclo de infecção de Ml3.
ri(\rIÊ:l
\ìy
|
'o..r'.'u".t,
Fïgura 2
O padrão geral de i bcçao de uma célu bacteriana por u bacteÍióúag
L'r,'a
IE '-r::oririo:
.ì
ilê .rnb ttd o lqos ot11g o t:r:d :,ur:sr azur tr ; r: joljrrl r ErÌunllo-ì ouio: 'sietl:ur-rd su:5aros;rrì sop urn et1:,y opu:n)., ossÍ noursuâ ãu uanb a:ol rog or{Ig'trp oflno un a:duas uet se141'oroq: âp srp J ffi'â^oq: uau anb erp uaa'ãtsrrt orÌlrJq un ã s?u'?JoJ gl opu{reqp:q apod 1os o anb zrp u:1'er:otsrq tssou ep ot5enuguo: e a a:ol anb:o4 'opnuâs uJ âJo^ os'sossâ ourof, sBrp ug'opunu op Jomu e'rpn-8e ezatsrJt ?un ?lIo g'ze3sep as rapue anb o opnt anb erp uâJ'o3ef,nq un ËJrl er:8ap aa :nb o opru aluadu ap g'rt:uasn? Bns r eJorlf, opeqgs op oÌiualÌs o'alãp ãruou o zlp ef,o; 9l Ios o 'alãqueuv'of,slf,uef,C 'Ed nes o ots anb sap uaa,, rrecl ocirs:rt 3:\a] oïrr
IE
L
G
o a
Cr-orueceu GÊuca e ANÁLtsE oe
DNA
positivo, pois permitiu a de grande importânem outros eucariotos
infrutífera, suspeitanno interior de
Moléculas de proteína (capsídeo)
Figura 2.5
Molécula de DNA
(ls dois tipos principais de
infectam especificabastante simples. Eles de ácido ribonucléico do fago, envolvida por (Figura 2.5). fago, é um processo de
ffrürra
de Íagos: (a) cabeça (por exemplo, l,) e ,ffi flamentoso (por exemplo, M13).
.- ccilrda
(a) Cabeça e
cauda
(b) Fitamentoso
o seu cromossomo específicas, codifica-
Partícula do fago DNA
do capsídeo e novas
1
de forma muito rápida, é chamado de ciclo líti-
O Íago Íixa-se à bactéria e injeta o seu DNA
bacteriana. O astese das proteínas do
cujas moléculas nunca
pela retenção da molé-
muitos milhares de dino genoma bacteriano, do DNA do fa-
componentes do
umlisógeno) é, em
capsÍdeo
3 I
i
Os componentes do capsídeo são sintetizados, novas partículas são montadas e liberadas
o profago acaba
modo lítico, lisando a na
Figura 2.6
2.7.
Opdrão geral de inlhçãode uma célula
diferente.
is são continuamente
bacteriana por um
bacteriano e não se ia infectada pode contide células não-infecta-
ËoriFf
l(ìlv
bacterióÍago.
'o:souer3 r:ecí IE
t
'-rr:;rJuo: ;trfo, rsq
E
?nuuuo: ouro:'stednur-rd suaâuuosr:d soF rrrn e.Ìp; opu?n).,
aP srP â s?rrr'â^oqr tuau anb erp
uaa'ãtslr oq1rrqun â seu'ef,oJ
ossr noursua
ap
g'tnuesne
ocini:t
eÀãt
olu
âlê f,nb rttl o c;qos oq15 o
r:rrJ:,r;::sa
ens ? ?Jor{J op?q?s op onuãTrs
azur
y
au uanb a:ol ro{ oqlg '?rp oJlno urn a:duas ual sBW'oJor{J
a:ol anb:o4 !J'zeJsapasrapuzanboopnlenberpuaa'o:anqunerler:8ap o'ãlâp ãuou o zrp eroJ gl los o 'ãtrâr{ueulr'otrsrtru?J{'red nes o oes enb serp uaa,,
?l opuÌT Jeqp:q epod 1os o enb rrp uea'errgtrsrq essou ep orSenurluoc e 9
'opÌluszqtâtro^c'ssouolseÌpug'opunuoproÌeur'epn8eezalsr:teunello ua enb o optu eluadar
e:ecl
'õ L G
o a
31
32
ï. A. Bnowlt Apesar de haver uma variedade muito grande de bacteriófagos, somente À e M13 chegaram a desempenhar papéis importantes como vetores de clonagem. As propriedades desses dois fagos serão agora consideradas com maiores detalhes.
{
I
I I
.A n,ljr,à ,dirr**:'-
I
\,
Organização gênica na molécula de DNA de
flq
lïÌlbfitulr&.
'cudus
ts f,c F:gu
lrtrTars.lË
?',
I
gf:ïi3ì ;ü'É i
O l, é um exemplo típico de fago de cabeça e cauda (Figura 2.5a). O DNA está contido na estrutura poliédrica da cabeça e a cauda serve para fixar o fago à superfície bacteriana e injetar o DNA na célula (Figura2.1).
Uma partícula do fago À fixa-se a uma célula de E. coli e injeta o seu DNA
-{ï
de ì" circulariza
DNA de
À
Cromossomo bacteriano
/
/
/\
\
Divisão celular
\_ Fr$üe Zg ffiii,iurrMtM
üm
m
nitsaÇe':
Mrnercfu3r rirri'
:?
.
\
lndução: O DNA de À desliga-se do cromossomo bacteriano
A
B
Novas partículas do fago sãd produzidas (ver etapas 2 e 3
da Fig.2.6)
Gs' .
::il \ì\'
I
|
Ftgul
i O ciclo de inÍecção lisogênica do bacterióÍago 1".
ì
Ji3 Jnb
re
d o ::qos or11ll o
urd ;r:::rs.. :rut y
: su'â-\oq: ueu anb erp ual otsrJt or{lrf,q un ê sBu'ero.1 e[ opurT Jeqp:q apod 1os o anb erp ua1'er:glsrq rssou ep oe5enuquo: e a elol enb;o4 oprluas ze_ì JJo-\ os'sâssê ouof, srrp ug'opunu op Jorru e'epn8e ezalsrJl ?un €tIo^ ã zt;sap as repur anb o opnt enb trp uaa o:z:nq un un er:8ap e:e anb o opn: atu:d:: :p E rr:uasn€ €ns € rroqf, op€qgs op oÌJuaps o'âIep ãuou o zrp uoJ rl Ios o'elêquelüV'otrsnueq'rrd nas o ors anb s?lp u{,,
pgr3rri"a.!
acs
ag
r,"enmcs de
o
u:rlcdÌu;t J ìl oru
uEÍ'Ës
nm ftLrr"ncËes
ÍE
ãp Erp
!E..l€tco
rÍíIrÌ0ffir,."arl* as Dí35
@
Êigura2.7
'o...r..rir'.r1 , rlcÌ
',Lr:-.orÌuo:
nnwopr
'õ L IE
o a
*s1
o 6
g
Cronneenit GÊnrcn e AruÁuse oe
somenteÀeMl3chegaram
A molécula
de
DNA
DNA
33
de ì", que tem um tamanho de 49 kb, vem sendo extensivamente es-
ropriedades desses dois fa-
tudãATõiËõììõïEhãËëãfu-dõ'€êÌfi õÕ6sõq*ri-en6iã*;íàa"ïm.Emconseqüência
O DNA está contido na es-
disso, as posições e as identidades da maioria dos genes da molécula de DNA de l, sãoionhecidas (Figura 2.9).Uma característica do mapa genético de À é que os genes relacionados em termos de função estão agrupados em regiões específicas do genoma. Por exemplo, todos os genes que codificam componentes do capsídeo estão agrupados no terço esquerdo da molécu-
perffcie bacteriana e injetar
Fago M13
Fímbria--
DNA de
M1 3
O fago M13 fixa-se a uma fímbria de uma célula de E. coli e injeta o seu DNA
Ml3
Novos fagos são continuamente
do DNA de Mt3
,rã.ffi" \enlicaeão
tt
o o" ìm
f
::iJ#ff":iii"U%
O clclo de inÍecção do bacteriófago M13.
2.7 de infecção lisogênido bacterióÍago ),.
Figura 2.9 O mapa genético de À, mostrando as posições dos genes importantes e as Íunções dos agrupamentos de genes.
o 2 4 6 810
12 14 16
I
M13
\
de M13
o..u,,ll'i.ïl:ï;"."-^
\:ïllïïã,i3crescer
1820222426?83032343638404244464849kb
íü :_iLìtil:J
È"go.
,m# /
ffi
\...Figura 2.8
-
u;
\ìlv
o
IE
t
art;rsr ::ur y
'õ L
âp arp â sru 'a oqr uau anb erp uaa.ãlsrrt orl1uq un 9 s?u,ero; ?l opuq reqp:q apod 1os o anb erp uaa.rr:glsrq essou ep orSenu4uo: r a a:ol anb;o4 'oPDu$ zJ âloÀ os'sâssâ ouof, s?Ip ug opunu op forru r'epn8e rzalsut eun Btlo !J'ze3sap as rapur anb o opnl anb rrp ual'otr€Jnq un ?Jrl er:Sep na :nb o optu aluada: ap g'trtuasm Bns e ?f,oqJ op?q9s op ortruâls o'âlâp ãuou o zÌp eJoJ €Ì Ios o'â]âqueruy'ofsrfu?:{'red nes o ors anb srlp uJL,
UI
'::::r1rro:r
L:,rrci
ociltJl
oÀJt Õïu
ilo .lnb rrii
ottlos or11g o :-lrd
IE
a
#*Ë 'o
34
T. A. Bnowlr
la e os genes que controlam a integração do profago no genoma do hospedeiro estão agrupados na sua região central. O agrupamento de genes relacionados é extremamente importante paÍa o controle da expressão do genoma de À, pois ele permite que os genes sejam ativados ou inativados em grupo, e não individualmente. O agrupamento também é importante pata a construção de vetores de clonagem derivados de ì, (descritos no Capítulo 6).
As Íormas linear e circular do DNA de
?u
Uma segunda característica de À, relevante para a construção de vetores de clonagem, é a conformação da molécula de DNA. A molécula mostrada na Figura 2.9 éltnear, com duas extremidades livres, e representa o DNA presente na estrutura da cabeça do fago. Essa molécula linear consiste em duas fitas de DNA complementares, com bases pareadas de acordo com as regras de \üatson-Crick (isto é, DNA de fita dupla). Entretanto, em.cada extremidade da molécula existe um segmento curto, de 12 nucleotídeos, no qual o DNA é de fita simples (Figura 2.10a). As duas fitas simples são complementaÍes e, portanto, capazes de parear suas bases entre si para formar uma molécula circular totalmente de fita dupla (Figura 2.10b). ttade' Fitas simples complementares são, com freqüência, referidas como extremidades
( I J I I
L
sivastt ou extremidades coesivas, porque o pareamento de bases entre elas pode unir as duas extremidades de uma molécula de DNA (ou as extremidades de duas moléculas de DNA diferentes). As extremidades coesivas de 1" são chamadas de sítios cos e têm duas funções distintas durante o ciclo de infecção de ì,. Primeiramente, elas permitem que a molécula de DNA linear injetada na célula seja circularizada, o que é um pré-requisito para a inserção no genoma bacteriano (Figura 2.7). A segunda função dos sítios cos é um pouco diferente e necessária depois que o profago foi removido do genoma hospedeiro. Nesse estágio, é produzido um grande número de novas moléculas de DNA de l" pelo mecanismo de replicação por círculo rolante (Figura 2.10c), no qual uma fita de DNA contínua é "rolada paraforc" da molécula-molde. O resultado é um catenano, que consiste em uma série de genomas lineares de À unidos pelos seus sítios cos, cuja função é agoraatuar como seqüências de reconhecimento pÍÌra uma endonuclease, que cliva o catenano nos sítios cos, produzindo genomas de l" individuais. Essa endonuclease, que é o produto do gene Á da molécula de DNA de À, cria as extremidades coesivas de fita simples, além de agir em conjunto com outras proteínas pa.ra empacotar cada genoma de À em uma estrutura de cabeça do fago. Como se verá no Capítu\6. os processos de clivagem e empacotamento reconhecem apenas os sítios cos e as seqüênciàs imediatamente adjacentes a eles. A mudança da estrutura das regiões internas degenoma de À, por exemplo, pela inserção de novos genes, não tem efeito sobre esses eventos, desde que o tamanho total do genoma de l, não seja demasiadamente alterado.
M13: um fago filamentoso é um exemplo de fago filamentoso (Figura 2.5b) epossui uma estrutura completamente distinta daquela de À. Ademais, a molécula de DNA de M13 é muito menor do que o genoma de À, com uma extensão de 6.407 nucleotídeos. Ela é circular e tem a característica incomum de consistir inteiramente em DNA de fita simples.
M13
Frgur
Asbr siyas na
br
ÍìorÍÉts
cto
o 2
G
'-n::t1rn:
w'â,\oq: u:u
rrecl ociurJl oaãl ÕÈu â13 ânb r;d o :lqos oqyq o
urd ut:rs: :rrrr y
anb erp uaa.ãlsrrl orlTrrq un ã sru.eJoJ gl opuqrrqprq apod 1os o anb rrp ual.errglsrq rssou rp or5enurluo: e a a:ol anbro4 'opuuas uJ âf,o^ os'Fsse ouof, serp uã opunu op roreu r'epn8r zalsrrt ?un etlo u'ze;sap as rapur anb o opnl snb erp uãI'oJ€fnq un eJrl err8ap u::nb o opru etuadar:p g'rr:uasna ?ns ? uorÌJ oprqts op ortruâlrs o'âlâp ãuou o zrp eloJ €l Ios o'âiâr{ueu\r'o:sriutf,J'red nes o oes anb sBIp uâJ,, Jp BTp â
t 'õ
L G
o a
*ú5o ô
ht
Croneeeu GÊrurcn e ANÁLtsE oe
hospedeiro estão agruPaé extremamente imPortante os genes sejam ativados ou
(a) A Íorma lineaÍ da molécula de DNA de
35
À
Extremidade coesiva esquerda
Extremidade coesiva direita
é importante para a 6).
DNA
CCCGCCGCTGGA
::::-
GGGCGGCGACCT
(b) A Íorma circular da molécula de DNA de l"
declonagem,éacon2.9 élinear, com duas extredo fago. Essa molécula lipareadas de acordo com as
em cada extremidade da o DNA é de fita simPles (Ficapazes de parear suas badupla (Figura 2.10b). ttade' como extremidades entre elas pode unir as duas duas moléculas de DNA dicos e têm duas funções disque a molécula de DNA para a inserção no genodepois que o profago um grande número de novas rolante (Figura 2.10c), no . O resultado é um capelos seus sítios cos, cuuma endonuclease, que cli. Essa endonuclease, que é coesivas de fita simples u-u genoma de l,
"-
"rl
mento reconhecem ape-
A mudança da estrutura das
I
novos genes, não tem efeito não seja demasiadamente al-
(c) Replicação e empacotamento do DNA de
cos
À
O catenano rola para fora da molécula de DNA de l.
cos
qTì l"' I
ççç
A endonuclease codiÍicada pelo gene A cliva o catenano nos
sítios cos
o HH o o' H
Componentes protéicos do capsídeo
Novas partículas de Íagos são montadas
uma estrutura comPletamente
muito menor do que o genoma e tem a caracteística incomum
e"lril-nTrf
xì{!-
Figura 2.10 As Íormas linear e circular do DNA de À. (a) A forma linear, mostrando as extremidades coesivas esquerda e direita. (b) O pareamento de bases entre as extremidades coesivas resulta na forma circular da molécula. (c) A replicação por círculo rolante produz um catenano de novas moléculas de DNA linear de À, que são empacotadas individualmente nas cabeças do fago à medida que novas partículas de À são montadas.
-o-utirr:l er:ii G
t
'-rr:;r1to: ;
trec{ ocÌru.ìl ãÀ?t oxu èla ênb trt{ o :rqos oqlq o r:L:d
:,r:::sl crur y
ruoì!ìI{ E Ènu!u!ì-ì o[ro] 'q€dIf,tIud su:SRros:.rcl sop uin rtle,] opuxn.)., ossr noursua au uanb a:ol roJ or{ig '?rp oJtno un e:duas ua1 sEW.o]oql zp â sw:Nqr uau anb np uaa'elsJl oqprq un ã s?u'BroJ gl opurT Jeql:q apod 1os o anb rrp uaa rr:glsrq essou ep or5enurluo: e a e:ol anb:o4
JP
'oPuuszgJ.fo^c's3ssâouof,ffÌpuA'opunuoptroreue'epn8ezalsr:tBun€llo u: anb o opm eluadu:p E'muasnt ens B ef,oqf op?q?s op orJuâÌrs o'ãIãp âuou
!J'zeJsapasrapuranboopnlanberpuraa'o:unqunerner:8a1t o zrp eJoJ ?l los o'âlâqu?uy'o:sr:ue:g'red nas o ors anb serp uaa,,
'õ L
G Uì
a
36
T.A. BRowN
O tamanho menor da molécula de Ml3 implica possuir espaço paÍa um número menor de genes do que o genoma de À. Isso é possível porque o capsídeo de M13 é construído a partir de múltiplas cópias de apenas três proteínas (requerendo apenas três genes), ao passo que a síntese da estrutura de cabeça e cauda de l, envolve mais de 15 proteínas diferentes. Além disso, Ml3 segue um ciclo de infecção mais simples que o de À e não necessita de genes para a inserção no genoma do hospedeiro. A injeção de uma molécula de DNA de M13 em uma célula de E. coli ocoÍïe através da frmbria, a estrutura que conecta duas células durante a conjugação sexual (Figura2.4).Uma vez no interior da célula, a molécula de fita simples atua como molde para a síntese de uma fita complementar, resultando em uma molécula de fita dupla normal (Figura 2.11a). Essa molécula não é inserida no genoma bacteriano, sendo, emvez disso, replicada até que mais de 100 cópias estejam presentes na célula (Figura 2.1 1b). Quando abacténa se divide, cada célula-filha recebe cópias do genoma do fago, que continua a replicar-se, mantendo, assim, o seu número total por célula. Conforme mostrado na Figura 2.11c, novas partículas do fago são continuamente montadas e liberadas, com aproximadamente 1.000 novos fagos sendo produzidos a cada geração de uma célula infectada.
{ü
As vantagens de Ml3 como um veículo de clonagem
f Jt
V,arios aspectos tornam M13 atraente como base para um veículo de clonagem. Seu genoma é menor do que 10 kb, um tamanho bem dentro da faixa ideal para um vetor em potencial. Alé- do que, a forma replicativa (RF) de fita dupla comporta-se de maneira bastante simi-
lar a um plasmídeo e pode ser tratada como tal para propósitos experimentais. Ela é preparada facilmente a partir de uma cultura de células de E. coli infectadas (p. 59-60) e pode ser
**iiff
iÍï:ï|,ffilï::T tg;t 1ll, gene
s clonado s em
um veror derivado de M 1 3 pode
--
rem ser obtidos na forma de DNA de fita simples. Versões de fita simples de genes clonados j são úteis para viírias técnicas, especialmente para seqüenciamento de DNA e mutagênese ir ,' vitro (p.212 e243). A utilização de um vetor derivado de M13 é uma maneira fácil e confiá- i ) vel para a obtenção de DNA de fita simples para esse tipo de trabalho.
2.2.3 Vírus como veículos de clonagem para outros organismos
(cl
A maioria dos organismos vivos é infectada por vírus e, por isso, é natural que haja um grande interesse na possibilidade de que vírus possam ser utilizados como veículos de clonagem para organismos superiores. Isso é especialmente importante quando lembramos que plasmídeos não são comumente encontrados em oulros organismos. que não bactérias e leveduras (p. 31). De fato, os vírus possuem um potencial considerável como vetores de clonagem para alguns tipos de aplicação com células de animais. Os vírus de mamíferos, como o simian virus 40 (SV40), os adenovírus e os retrovírus, além dos baculovírus, de insetos, são aqueles que receberam mais atenção até agora. Esses vírus são discutidos com maior profundidade no Capítulo 7.
Figura
I
O ciclo r rem. (a)
replicati Molécnl montagí
IE T
NOJECI JJOA V
EI
Jols I q tp elr€d 3nb tuã
,ì
G
L
IE
t,ì
a
*t:
o
z o
Croruncev GÊurcn p AruÁrrse oe
um número menor de
13éconstruídoapartir genes), ao passo que a diferentes. Além disnecessita de genes para a
(a) lnjeção de DNA de Íita simples na célula
DNA
37
A partícula de M13 injeta seu DNA na célula
hospedeira, seguida pela síntese da segunda Íita
DNA de fita simples
E. coli ocorre através da sexual (Figura 2.4). U ma para a síntese de uma (Figura 2.11a). Essa icada até que mais de
ria se divide, cadacé-se, mantendo, assim, o partículas do fago são fagos sendo produ-
DNA de fita dupla: lorma replicativa (RF)
(b) Replicação da RF para produzir novas
clonagem. Seu genoma um vetor em potencial.
moléculas de Íita dupla
7^\
oxo
maneira bastante simiimentais. Ela é prepara-
(p. 59-60) e pode ser derivado de Ml3 pode] ples de genes clonados DNA e mutagênese in /{ maneira fâcil e confrá-)
\\/^/
A RF replica pelo mecanismo de círculo rolante para produzir DNA de Íita simples linear (c) Produção contínua de Íagos M13
maduros é natural que haja um
% -##
DNA circularizado
como veículos de cloquando lembramos que que não bactérias e lede clonagem para alros. como o srmtan vb , de insetos, são aque-
Partículas maduras do fago
com maior profundiFigura 2.11
O ciclo de inÍecção de M13, mostrando os diÍerentes tipos de replicação do DNA que ocorrem. (a) Após a infecção, a molécula de DNA de Íita simples de M13 é convertida na forma replicativa (RF) de fita dupla. (b) A RF replica para produzir múltiplas cópias de si própria. (c) Moléculas de Íita simples são sintetizadas por replicação por círculo rolante e utilizadas na montagem de novas partículas de M13.
::È ::.= IE
€d eroA ztrgrslq €p elred anb r$E
,ì
IE
L
G Uì
a
ë
:.::::':::r:
È
Cnpírulo 3 uma descrição deta-
Dubuque. [Uma boa in-
Purificação de DNA a Partir de Células Vivas
Preparação de DNA celular total, 39
Preparação de DNA de bacteriófagos, 55
Preparação de DNA plasmidial, 47
/ A engenharia genética demanda, em diferentes momentos, a preparação de pelo menos três tiI pos distintos de DNA. Primeiramente, um DNA celular total, muitas vezes necessário como \ ura fonte de material a partir do qual são obtidos os genes a serem clonados. O DNA celular I total pode ser aquele conseguido a partir de uma cultura de células bacterianas, vegetais ou ,l animais ou de qualquer outro tipo
\ I I I \
de organismo em estudo. O segundo tipo é um DNA plasmidial puro, cuja preparação dá-se a partir de uma cultura bacteriana, seguindo as mesmas etapas básicas que a purificação do DNA celular total, com a diferença crucial de que, em algum estágio, o DNA plasmidial deve ser separado do componente principal de DNA cromospômico também presente na célula. Finalmente, PNA de fago é breciso se um veículo de clonagem derivado de bacteriófago for utilizado. DNA de fago é em geral preparado a partir de partículas virais e não a partir de células infectadas, de modo que inexiste problema associado à contaminação com DNA bacteriano. Entretanto, são imprescindíveis técnicas espeliais para a remoção do capsídeo viral. Uma exceção é a forma replicativa de fita dupla Oe Mt:, a qual éprep arada apartir de células de E coli, damesma maneira que um plasmídeo bactenanor/
Preparação de DNA celular total Os fundamentos da preparação de DNA são mais facilmente compreendidos se for considerado primeiramente o tipo mais simples de procedimento de purificação, utilizado quando todo
o complemento de DNA de uma célula bacteriana é necessário. As modificações que se impõem para a preparação de DNA de plasmídeos e de fagos podem, então, ser descritas mais tarde.
e
NOJ€d e30 AE
TJ
ols I q ep 3lr€d 3nb ruã
t! ,ì t! L G
o a
40
T. A. Bnowlr
O procedimento paÍa a preparação de DNA total a partir de uma cultura de células bacterianas pode ser dividido em quatro estágios (Figura 3.1).
(1) (2) (3)
As células bacterianas são cultivadas e depois recuperadas da cultura e concentradas. As células são rompidas para liberar seu conteúdo.
(4)
nitrr
fato
aoì
sad
rl
Este extrato celular é tratado para a remoção de todos os seus componentes, exceto o
i
DNA.
{
A solução
ì indr
) conl \ extr
de DNA resultante é concentrada.
I
lida,
3.1.1 Multiplicação bacteriana em cultura e recuperação das células cultivadas
trat( ade
A maioria
das bactérias pode ser multiplicada sem maiores dificuldades em um meio líquido (caldo de cultura). O meio de cultura deve prover uma mistura eqirilibrada dos nutrientes essenciais, ein concentrações que permitirão o desenvolvimento e a divisão eficiente das bactérias. Os dois meios de cultura típicos são detalhados na Tabela 3.1 . M9 é um exemplo de meio definido, no qual todos os componentes são conhecidos. Esse meio contém uma mistura de nutrientes inorgânicos para prover elementos essenciais, como
com uma
Tab
Mei Mei
1
As bactérias são cultivadas em meio de cultura e recuperadas por centriÍugação
2
As células são recuperadas do meio e rompidas para gerar um extrato celular
-9'íì-
ï-:'t"f
/\fl /\ /--:--
CentriÍugação
\
= --(.-:___:J
\Extrato
Cultura bacteriana
celular
ì diçó send quad
)
uma
-R tt
tos.
tt
L] lt ',tl
\:-r'---DNA
i
Ìas/n
sldac
Dfi
P
puro
lume
ODNAé concentrado
Velor
O DNA é puriÍicado a
paÍtir do extrato celular
do dr téria:
pensi
Figura 3.1 As etapas básicas para a preparação de DNA celular total a partir de uma cultura bacteriana.
IE
in oJSd 330,\
Bï
r9lslq ?p alr€d enb ruã
,ì
IE
L
G
rt
a
Croruncev GÊuce e ANÁLtsE
de células bacte-
e
concentradas. exceto o
:nì um meio líquido dos nutrientes eseficiente das bacté-
çio conhecidos. Esse os essenciais, como
DNA
41
nitrogênio, magnésio e cálcio' além de glicose, como fonte de carbono e energia. Na prática, fatores de crescimento adicionais, como elementos-traço e vitaminas, devem ser adicionados ao M9 para que ele seja capaz de sustentar o desenvolvimento bacteriano. A definição precisa dos elementos necessários depende da espécie a ser cultivada. O segundo meio descrito na Tabela 3.1, o de Luria-Bertani (LB), é um pouco diferente, é ou complexo, o que significa que a identidade e a quuíiaud" precisas .' indefinido dos seus componentes são desconhecidas. Isso ocorre porque dois dos seus ingredientes, a triptona e o . extrato de levedura, são misturas complexas, de compostos químicos desconhecidos. Na realidade, a triptona supre as bactérias com aminoácidoì e pequenos peptídeos, enquanto o ex_ trato de levedura (uma preparação seca de células ae levèdura puúui-.nt. alg".iJury *p." a demanda por iritrogênio, açúcares e nutrientes orgânicos e inorgânicos. Meios complicados como o LB não necessitam de suplementação adiciorial e sustentam o desenvolvimento de uma ampla gama de espécies bacterianas.
Tabela 3.1 A composição de dois meios típicos para o cultivo de células bacterianas
Meio Meio M9
LB (meio de Luria-Bertani)
-(fato
DE
Componente
g/l de meio
NarHPO.
6,0
NH2PO4
3,0
NaCl
0,5
NH4Ct
1,0
MgSO,
0,5
Glicose CaCl., Triptona Extrato de levedura
2,0 0,015 5
NaCl
10
10
celular
Meios definidos devem ser utilizados quando as bactérias têm de ser cultivadas sob condições precisamente controladas. Isso, contudo, não énecessário quando as bactérias estão sendo cultivadas simplesmente como uma fonte de DNA no u- meio completo é ade_ quado. Em meio LB, a 37"c e.coT ", por"uro, proporcionada agiiaçao a 150 a 250 rpm em uma plataforma rotatória. células de çraeão coti dividem-se à*oã" o-u u", a cada 20 minu\ tos, até que a cultura atinja uma densidade máxima de"aproximadam*,"_k_:-^^l-_d*;r"; las/ml. o aumenro do nú-mero de célul-as na culrura. po$g. ^gr
iooõ
I*,Ëffiï;õôi 'i;ÌËiãüã'r.ãi,póiiln"ur" DO corresponde a aproximadamente 0,g x lOe '
10nf-tgr+.g.g p_e. l.p_ lpituta .da den_compripento de onda, uma unidade; de-:' i .
células/ml.
Pâra
'
aprêtriáfãçãõõe"üffiëitiàtõïelïilái;ãfëïffiilffim
esrar concentradas no menor volume possível. Por isso' as células da cultura são sedimentadas por centrif'ugação (Figura 3.3). velocidades de centrifugação moderadas são suficientes para r"di-"nt- as bactérias no fundo de um tubo de centífuga, o que permite que o meio de cultura seja removido. Assim, bactérias oriundas de 1.000 ml de uma cultura càm densidade celular -á*i-u podem ser ressuspensas em um volume de l0 ml ou menos.
cultura bacteriana.
-'r70-red JJOA e{-{ols
,v .,
t
q Yp rlred 3nb urã
*ú,=
ít 8l ( [f*\ I \t \\ ..\ rl
Clorunceu GÊHtca e ANÁLlsE oe
DNA
43
em uma
óptica (DO). (a) passa luz de um da cultura é medi- -log,o (intensidade . em um espectroa partir de uma cr.rlturas com densida-
-
Figura 3.3 Sedimentação de bactérias por centrif ugação.
quais a lise celular é causada pela exposição a agentes químicos que afetam a integridade das baneiras celulares. Os métodos químicos são mais comumente utilizados quando as células bacterianas devem ser liSadas visando à preparação de DNA. A lise química via de regra envolve um agente que ataca a parede celular e um outro que rompe a membrana da célula (Figura 3.4a). Os agentes químicos a serem utilizados dependem da da espécie de bactéria envolvida. PanE. colí e organismos aparentados, o enfraquecimento (EDTA) uma ou etilenodiamina paredì celular é, em geral, feito com lisozima, tetracetato de iombinação de ambos. A lisozima é uma enzima que está presente na clara do ovo e em secre-
por sua vez, é envol-
coli, aprópia parede Todas essas barreiras ididas em métodos fínÉtodos químicos, nos
o
xtulffi
.z
mmmmmrnur4 rruou'd
G :luf,si 3nÍ V
.z IE L
*-"Ï::{:::::"ï:"":Hll:ïnas o ots anb strp ual,,
It a
o.iill:t :-\.al (ìru :1e :tlh itJ o :rqus
ìi
c'q1t1
o t'lr:d
::--:::--:.:,- ::rl ,rosmu:r;r;-:rr'r:Ì:-:::--::f,-ossrnous:auuanbetro^tol'oqllI'?rp""""Ïl-::|ï^t::tÏ:ï^:i::i ;*ì[ -*
-
**atql
p mmm
ffiffiï
Eopourqprqapodlos
rtprrst
u:"r-
o anb
*".ó;'-J*p
;ï;1" ;;õ;J;ã
trpuaa'tr:glqqes ã
ory
;'ârãrru'urv'of, *;l ;r "r";"p'Ã'b
slruerg'nd
IE
*ia,ãa
44
T. A. Bnowlr
poliméricos que conferem ções como alâgnmae a saliva, sendo capaz de digerir os compostos ngidez à parede celular. O EDTA, por sua vez, remove íons de magnésio essenciais à preservação da estrutura global do envoltório celular, além de, também, inibir enzimas celulares capazes de degradar DNA. Sob certas condições, o enfraquecimento da parede celular com lisozima e EDTA é suficiente para romper as células bacterianas, mas, em geral, um detergente, como o dodecilsulfato de sódio (SDS), também é adicionado. Detergentes auxiliam no processo de lise removendo moléculas de lipídeos, o que provoca o rompimento das membranas celula-
A ra de
ácido lentat cas
fi
lada I com l
res.
Depois de as células terem sido lisadas, a etapa final da preparação do extrato é a remoção dos resíduos celulares insolúveis. Componentes como frações da parede celular parcialmente digeridas podem ser sedimentados por centrifugação (Figura 3.4b), deixando o extrato celular como um sobrenadante razoavelmente limpo.
3.1.3 Purificação de DNA a partir de um extrato celular Além do DNA, um extrato celular bacteriano contém'quantidades significativas de proteínas e RNA. Para deixar o DNA em uma forma pura, vários procedimentos podem ser utilizados Figura 3.5 Remoção de contaminantes protéicos por eldração com Íenol.
na remoção desses contaminantes.
(a) Lise das células
Er com Í probk
Rompimento da parede celular Rompimento da membrana celular
mas ir n€Ìs m
_-_
?---l-
ç-- l^
Extrato cel
u
la
moa
r
Polip'r
--\D
AI vidas
A
únir
cleasr
81"4 Conct
(b) CentriÍugação para remoção dos resíduos celulares
Com Í
não nt
ÕÕ I
l :l
5Jilil:1É'
centriÍugação.
-
l---- I '--
ções d ção dc
DNA' RNA' ProteÍnas
Or Na pn
q
Nalr ácidos
tado
Resíduos celulares
sr
celent,
lução Figura 3.4 Preparação de um extrato celular: (a) lise das células e (b) centrifugação do extrato celular para remoção de resíduos insolúveis.
LìüE
Ior-r4E]rorElC
Til[i
. :z
G '::--+:iio: r,rrd odruèt 31rl oru .iã ênb rt.ì o :.tqos oqlg o urd :l::rs: otut y ss;6ffas;ç:'i i:r -:r i:a: : l::r rìì -.'os nomsua au uanb afo^ Ìol 'oq[g'?Ip o:lno un arduas uâ] sBW'oloqtr M @qmFrq r wruJ g[ op,rrrl rtqgrq apod 1os o anb erp u:1'er:91m4 essou ep or5enuuuo: t a a:ol anb:od utpnsr u:rm zun E{o.\ f 'zejsp âs lapw anb o opnt anb erp uea'o:anq un an er:8ap ryrryr rp^
uory
oçGqtr €p o!ru3q-s o'aIãP
:üou
o zrp EoJ El los o
'âleqmuv'of,srJwrJ
'red nas o oes anb seIP
uâL,
,ì IE
L
t!
It a
*rãË .q
i
srrreti
CLoruneetr GÊnrcn e AruÁuse oe
:,:[iméricos que conferem
:
io essenciais à preservaenzimas celulares capa-
celular com lisoztgeral. um detergente, col;es auxiliam no processo : rlas membranas celula:e.arede
DNA
45
A maneira-padrão de desproteinizar um extrato celular é adicionar fenol ou uma mistura de fenol e clorofórmio 1:1. Tais solventes orgânicos precipitam proteínas, mas deixam os ácidos nucléicos (DNA e RNA) em solução aquosa. Assim, se o eitrato celular é misturado lentamente com o solvente e as fases são separadas por centrifugação, as moléculas protéicas ltcam na interface entre as camadas aquosa e orgânica, na forma de uma massa coagulada branca (Figura 3.5). A solução aquosa de ácidos nucléicos pode então ser removida com uma pipeta.
doextratoéaremoção Ftr:de celular parcialmente . Jeirando o extrato celuFase aquosa (DNA + RNA) lnterface (proteínas coaguladas)
-.-------------
slsnificativas de proteínas ros podem ser utilizados Fïgura 3.5 Hernoção de ounüaminan-
hs protéicos por extração corn Íenol.
____\
-_
:-_I
,-+
Extrato celular
Fenol Extrato celular
Mistura com fenol
Separação das Íases por centrifugação
Em alguns extratos celulares, o conteúdo protéico é tão grande que uma única extração com fenol mostra-se insuficiente para purificar completamente os ácidos nucléicos. Esse problema poderia ser resolvido pela realização de várias extrações sucessivas com fenol, mas isso não é desejável, pois cada etapa de mistura e de centrifugação resulta em quebras nas moléculas de DNA. A solução é, então, tratar o extrato celular com uma protease, como a pronase ou a proteinase K, antes da extração com fenol. Essas enzimas quebram os polipeptídeos em unidades menores, as quais são mais facilmente removidas pelo fenol. Algumas moléculas de RNA, especialmente de RNA-mensageiro (mnNÀ), são removidas pelo tratamento com fenol, mas a maioria permanece com o DNA na solução aquosa. A única maneira eficiente de remover o RNA é trataÍ a preparação com a enzima ribonuclease, que degrada rapidamente tais moléculas em suas subunidades ribonucleotídicas.
S.1.4 Concentração de amostras de DNA
ìNA, proteínas
i I
Fes I
lrifugação do extrato celular
com freqüência, uma preparação bem-sucedida resulta em uma solução densa de DNA, que não necessita de qualquer concentração adicional. Entretanto, às vezes, são obtidas soluções diluídas, sendo, então, importante considerar métodos para o aumento da concentração do DNA. O método de concentração utilizado iom mais freqüôncia é a precipitação com etanol. Na presença de sal (estritamente falando, cátions monovalenter, .o-o os íons de sódio [Na-]) e a uma temperatura de -20'C ou menos, o etanol absoluto precipita com eficiência ácidos nucléicos poliméricos. com uma solução densa de DNA, o etanol pode ser deposi_
tado sobre a amostra, provocando a precipitação das moléculas na interfa.ô. U- truqul excelente consiste em empurrar um bastão de vidro pelo etanol para que ele mergulhe na solução de DNA. Quando o bastão é removido, as moléculas de DNA aderem a ele podem e ser retiradas da solução na forma de uma longa fibra (Figura 3.6a). Alternativamenre, sã o eta-
o
*sl
2
G
,: : ìnn:.FJ.r ,i;.ir::*::: rr,::.::-. m mffi upm}.[.::ssr ürrìluq rm: *ütro,l EI opuqnqprq apod los o a.b erp uaa'Àorrril o":".rrtro, e r rro^ ,.brr4 "rror "p LMliãff* mmmJ 5@ì mf ìoçmnIE oP loro e'zpn8e ezarsut Bun rtlo^ ã'ze;sap as rapur anb o opnl anb erp u:a.o:e:nq un an err3afi m'dal:g tr'mmosmm r uog-ì oP"qË op oDuJIs o'JIâp Juou o zrp ero; rl Ios o'ãtrâr{uruv.o:sr:uerg,red nas o ors anb srrp rr"a,, rü
..,,..5,,'";ì'ìïiìi:ï*Ì;ff;:tïï;'.:,ilf.:",i;:ïìï:ïff::.:'1,':ilï,.r:
G
L
IE
o a
o
46
T. A. Bnowlr
A mul sar de as
Bastão de vidro
de DNA
Solução de DNA concentrada
DNA precipitado coletado por centriÍugação
r
Figura 3.6
tes em hir
Coleta do DNA por precipitação com etanol. (a) Etanol absoluto é depositado sobre uma solução concentrada de DNA. As fibras de DNA podem ser recuperadas com um bastão de vidro. (b) Para soluções menos concentradas, o etanol é adicionado (em uma proporção de 2,5 volumes de etanol absolulo para 1 volume de solução de DNA) e o DNA precipitado é coletado por centriÍugação.
rompirner
rianas r-ia ta células de parede do com al rede celul
LÌma
nentq!i!
uma ex.tr8
cõm_-d[õi tëm qúanì não ser su te íìspecto
morìdos
1
u*m dc
(CTABt-r
nado a rrrr boidrarospois- colet
nol é misturado com uma solução de DNA diluída, o precipitado pode ser coletado por centrifugação (Figura 3.6b) e depois novamente dissolvido em um volume adequado de água. A precipitação com etanol tem a vantagem adicional de deixar cadeias curtas e componentes monoméricos de ácidos nucléicos em solução. Assim, nesse estágio, ribonucleotídeos produzidos por tratamento com ribonuclease são perdidos.
complero o RNA po Um se
sui duas p dissolr,e tr
3.1.5 Medição da concentração do DNA É crucial conhecer exatamente quanto do DNA está presente em uma solução quando da execução de um experimento de clonagem gênica. Felizmente, a concentração de uma solução de DNA pode ser precisamente medida pela espectrofotometria de absorbância de ultravioletâ (UV). A quantidade de radiação IfV absorvida por uma solução de DNA é diretamente proporcional à quantidade de DNA na amostra. Via de regra, a absorbância é medida a260 nme, nesse comprimento de onda, uma absorbância (Aruo) de 1,0 corresponde a 50 pg de DNA de fita dupla por ml. A absorbância de ultravioleta também pode ser utilizada para a verificação da pureza de uma preparação de DNA. Com uma amostra pura de DNA, arazão das absorbâncias a 260 nm e a 280 nm (Aruo/Arro) é 1,8. Razões menores que 1,8 indicam que a preparação está contaminada com proteínas ou com fenol.
3.1.6 Preparação de DNA celular total de outros organismos que não bactérias
5er
utilizã
presença ( _ì-8ar.
pen
químiss5
1
lular. mes
carìe na cc lica e é re: \-
rnente por
., Euanirlina
moléculas
t2
Preparaq .+prific'a
Bactérias não são os únicos organismos cujo DNA pdde ser necessrírio. DNA celular total de, por exemplo, plantas ou animais pode ser fundamental se o objetivo do projeto de engenharia genética for a clonagem de genes de tais organismos. Embora as etapas básicas da purificação de DNA sejam as mesmas para qualquer organismo, a introdução de algumas modificações pode ser exigida em decomência das características especiais das células que estão sendo utilizadas.
t! '-r:::tiuo:r trrd ocltrtal J ôl olu Jli ìrtb rcd o ::qos oqltl o urd ;rat:rsl arnt y rrruil: -ir.:flJf,:tr;1i11s'r;.:j;..;rrinr:luopurn|.;os$nou$uãêuuanberolrog'oq[g'?IpoJlnounerduasua]s2141'o:oq: fubrr4, mrn1-ax-n oqlrq tm 9 su'soJ gl opurlr?rilrrq apod 1os o enb ?Ip uâJ'ttf,otslq ?ssou ep otSenurluo: t a a:ol anb:o4 Lmxw Lionmcr-ì súp u:I -opmü op roro r'epn8e ezatsrJl ?un etlo !J'ze;s:p as rapw :nb o opnl anb erp u3l'otrunq un eiln rr:8ep rudm:ry' g-m:uasrc rur EoqJ opeqrs op ortruâIs o'âlâp âuou o zrp ef,oJgÌIos o 'êlâqu?uryorsrf,uttrg'red n:s o oes anb srrp uaa,,
r
p@
.ì
IE
L
t!
o a
lal ilg rrma líquido- x cnraro é d
piÍação c-o
qídeos e a
Cr-oruncev GÊrurcn e ANÁLrsE DE
As Íibras de
IïtA podem ser recu:eradas com um bas-
5o de vidro. (b) Para soluções menos con:entradas, o etanol é :dicionado (em uma :rcporção de 2,5 volu-es de etanol absoluto :ara 1 volume de solu:áo de DNA) e o DNA :recipitado é coletado :,:,r centriÍugação.
:er coletado por cen-
A
:'Jrtas e componentes r :n:,nucleotídeos produ-
i{tú.icão quando da exe-
r de uma solução de de ultravioleé diretamente pro'\Â ;i' s :úedida a 260 nm e, -t 50 pg de DNA de
a:ação da pureza de ubs.rrbâncias a 260 nm ;ão está contami-
47
A multiplicação das células em meio líquido pode, muitas vezes, não ser adequada, apesar de as culturas de células vegetais e animais estarem se tornando cadavez mais importanÌes em biologia. Entretanto, as principais modificações são, em geral, exigidas na etapa de nompimento das células. Os agentes químicos utilizados para o rompimento de células bacte-
3.6 do DNA por precom etanol. absoluto é sobre uma
adequado de água.
DNA
.
rianas via de regra não funcionam com outros organismos: a lisozima, por exemplo, não afeta células vegetais. Há enzimas degradantes específicas disponíveis para a maioria dos tipos de parede celular, mas, muitas vezes, técnicas físicas, como a trituração do material congelado com almofariz e gral, são mais eficientes. Células animais, por sua vez, r,áo possuem parede celular e podem ser lisadas por um simples tratamento com detergente. Uma outra consideração impgrt4nte diz respeito ao conteúdo bioquímico das células a partiidãs qqAiq_q PNe gs!4 $endo _extraído. Na maioria das bactérias, os principais compoq911e9 b-!og{mi,c-g-q p_{e_sgllgq ell,um extrato celular são pqot_9in4q, DNA e RNA, de modo que uma extração com fenol e/ou um tratamento com protease, qe€_ullo pql3,Igfnoç{o_ {o RNA tu*té-.õncom rlbonüõléadõarõãüãïmãmostra d;DNCp*". E tr"t-t"J" ^ "él"l' têm quantidaaeísìÉíìfiiãtliãi-tie õúïioJ"óãmpõtèntãs bioquímicos, esses tratamentos podem não ser suficientes para liberar DNA puro. Tecidos vegetais são particularmente difíceis nesre aspecto, pois mg-ip.9*y9_ze_s_g59it9{q1_g-rqndgs ggantidqdes de carboidratos, que não são redeve ser utilizada. movidos por qx-trgç{g -c_gq.le_19!_P*ol-t!p-o.933*4b-oldggem $jerryti,va Um dos métodos disponíveis usa um detergente chamado brometo de cetiltrimetilamônio {CTAB), que forma um complexo insolúvel com ácidos nucléicos. Quando o CTAB é adicionado a um extrato celular vegetal, o complexo ácido nucléico-CTAB precipita, deixando carboidratos, proteínas e outros contaminantes no sobrenadante (Figura 3.7). O precipitado é,depois. coletado por centrifugação e ressuspenso em NaCl (cloreto de sódio) lM, que desfaz o complexo. Os ácidos nucléicos podem então ser concentrados por precipitação com etanol e o RNA pode ser removido por tratamento com ribonuclease. Um segundo método envolve um composto denominado tiocianato de guanidina, que possui duas propriedades que o tornam útil para a purificação de DNA. Primeiro, ele desnafura e dissolve todos os compostos bioquímicos que não são ácidos nucléicos, podendo, portanto, ser utilizado para liberar DNA de virtualmente qualquer tipo de tecido. Em segundo lugar, na presença de tiocianâto de guanidina, o DNA liga-se fortemente a partículas de sílica (Figura -1.$s). permitindo que o DNA seja facilmente recuperado da mistura de outros compostos bioquímicos desnaturados. Uma das possibilidades é a adição de sílica diretamente ao extrato celular. mas é mais conveniente que seja utilizada uma coluna cromatográfica. A sflica é colocada na coluna e o extrato celular, então, adicionado a ela (Figura 3.8b). O DNA liga-se à sílica e é retido na coluna, enquanto os compostos bioquímicos desnaturados passam diretamente por ela. Depois da lavagem dos últimos contaminantes com a solução de tiocianato de"ì _suanidina, o DNA é recuperado pela adição de água, que desestabiliza as interações entre as moléculas de DNA e a sílica.
3-2 Preparação de DNA plasmidial lN-{
,\ purificação de plasmídeos a partir celular total de,
rrüeto de engenharia da purifi cação FúÍnas modifi caçõe s ,JÌre estão sendo uti-
rr',,usicas "!lLt
de uma cultura bacteriana envolve a mesma estratégia gepreparação DNA ral de uma de total. As células contendo plasmídeos são cultivadas em meio por líquido, sedimentadas centrifugação e rompidas para a preparação do extrato celular. O -rtrato é desproteinizado, o RNA removido e o DNA provavelmente concentrado por precipitação com etanol. Entretanto, existe uma importante distinção entre a purificação de plasmídeos e a de DNA celular total. Em uma preparação de plasmídeos é sempre necessário se-
o
G
,F:
,:
ì
.ì i :j, ,,;:;ì"1ï*:ì;ìj":ïl:#.:1i:,ï:ï':?iJ:::ïï;Ë: opuqrrqÌuqâpodloso:nbrrpueaerf,otsÌrìEssouepoe5enuguo:eea:olanbro4
l:milmhrçr ro-I:rrcrquJ:-::ro-rro-IEI tlq0il, r 'inwt ilru I itrr:r Ef lcLr= L1Ìr lomu t'e1nËr ez:tsrfl run ello^ E ü5üN'Ld:
qF!@ tiluiuI;ru *F
ì EE--lrr
r-5 r
ïlo:-ì opeqõ
op ottruâFs o 'JÌâp ãuou o zrp
r:pur anb o opnl anb erp uãJ oJ?Jnq un ef,rl err8ap rrÕJ tl los o 'âf,equruv'oJsr:ue:g'ftd nas o ors anb serp uea,,
zrJsap as
G
L
ItG a
*ú:
48
T.
A. Bnowlr
CTAB
\Complexo
ácido
Extrato celular Complexo ácido nucléico-CTAB precipitado
DNA
puro
Precipitação
i?[,itli'3;",
<--
ribonuclease
Figura 3.7 O método do CïAB para puriÍicação de DNA de vegetais. parÍÌr o DNA plasmidial da grande quantidade de DNA cromossômico bacteriano que também está presente nas células. ,\ A separação de ambos os tipos de DNA pode ser bastante difícil, embora essencial se os plasmídeos serão utilizados como veículos de clonagem. Mesmo a presença de quantidades t.', .. r: mínimas de DNA bacteriano contaminante em um experimento de clonagem pode levar a resultados indesejáveis. Felizmente, há vários métodos disponíveis para a remoção de DNA ,\" bacteriano durante a purificação de plasmídeos e o uso dos citados métodos, individualmente ou combinados, pode resultar no isolamento de DNA plasmidial bastante puro. "J z "ï:,'\ , Os métodos são báseados nas várias diferenças físicas existentes entre o DNA plasmidial I e o bacteriano, sendo a mais óbvia o tamanho. Os maiores plasmídeos possuem apenas 87o do tamanho do cromossomo de E coli e amaiona deles é muito menor do que isso. Técnicas ca"t pazes de separar moléculas de DNA pequenas de rÌroléculas de DNA grandes deveriam, porl! tanto, ser capazes de purificar plasmídeos eficientemente. Além de diferirem no tamanho, plasmídeos e DNA bacteriano também diferem quanto à sua conformação. Quando aplicado a um polímero, como o DNA, o termo conformação refere-se à configuração espacial total da molécula, com as duas conformações mais simples sendo a linear e a circular. Os plasmídeos e o cromossomo bacteriano são circulares, mas, du-
\ì
o,l.
3'\\':'
r-l
í-ì
\
10'nÌtiE]@Ìf".,jl.j
lir:lfi|qi
flrll:l
..
ÍE
t
'::-.:rilro:
t-rrcl odtuèl â.\)ì o?u JIJ "ìnb
ltd
o o;qos or1lg o
urcl
:l:::s: :tul y
.mdr,n;j .:t!:ru-.:; j i.; .::: i::-l ,ìai:E:ìò. oss nouÌsuã ãuuanb a:ol rog oqlg'Brp ollno um e:duas ual st141'o:oq: rfficry, 1.;qml ory:qm 9 wu'aà-1g oprq *qptq rpod 1os o anb rrp ue.L errolsrq tssou ?p oe5znurluo: t e a:ol anbro4 ronmrffqldÍlltçìunúopro*"'"paã"zãlsreunt1Ìo ã'ze3sâpãsIJpu?anboopruanbtrpuâJ'o3?Jnqunerntrr8ap
'ruir:
JW,lmJuiEmmr mqtr op"q6
op oDualrs o.ãlâp âuoü o zlp €loJ 9l los o'ã3âqu?uvoJsr:uag'rzd nas o ots anb serp ruaa,,
'õ L G
t, a
*Ë:
o z g 6
Figur Purifir tiociar
coluni
Clorunceu GÊNrcA
E ANÁLrsE
oe DNA
49
(a) Ligação do DNA a partículas de sílica
/r-:x @-'t=
Partículas de sílica
-'@ .@' \
\6\y
Moléculas de DNA
@
(b) Purificação de DNA por coluna de cromatograÍia
Extrato celular
ü Partículas de sílica
+ffi
Agua
w
W}
ô
ìul
bacteriano que também
difícil, embora essencial
se os
a presença de quantidades
de clonagem pode levar a reis para a remoção de DNA
Compostos bioquímicos desnaturados
métodos. individualmente bastante puro. entre o DNA plasmidial possuem apenas 87o do do que isso. Técnicas caDNA grandes deveriam, por-
l,l H
H
-_ ti-"i-.-/ \:-7
DNA Descarte i
Figura 3.8 Purificação de DNA pelo método do tiocianato de guanidina e da sílica. (a) Na presença do tiocianato de guanidina, o DNA liga-se a partículas de sílica. (b) O DNA é puriÍicado em uma ooluna crornatográf ica.
também diferem quanto à A, o termo conformação reconformações mais simples no são circulares, mas, du-
IE o?u âla .lnb cd o o:qos oqlg o :;ud lursr orur y rrrd odruèl rm: mihrmld çmiru!çi !{ìl iiÌn r:g,t oprnn}..'os$ noÌnffâ ãru uãnb"^ât a:ol rog oqlg'etp ortno un a:duâs u3l sery'oJoÌ{f ffirpmq:m-ooryqrmâ szu?ro;yloprqnq1uq apod 1os o anb ap uâI'?rrotsrq?ssouep oe5znurtuo: r a a:olanb:o4 -1p-.sq1rs3
rqlnpslmoprow
JÍDg-EJÍryrt lnr r cloqJ
opeqìgs
e?pn8e rzatsut erlm etlo^ A zr;sap es rapue anb o opnl anb ap uaa'orernqun an er:8ap op oouâIs o'âlâp âuou o zrp úroJ el los o râf,Jrlu?uy'o]sr:urtg'rcd nas o ogs anb serp uaa,,
.ì
t! L
G
o a
50
T. A. Bnowrrr
rante a preparação do extrato celular, o cromossomo é sempre quebrado e gera fragmentos lineares. Um método para separação de moléculas circulares de lineares resultará, pãr1anto, em plasmídeos puros.
:Ìe.
Bm
r,l
1rÌ{
FlÌ
^E:1i{
;ttl"'t
3.2.1 Separação com base no tamanho Em geral, o fracionamento por tamanho é executado no estágio de preparação do extrato celular. Se as células são lisadas sob condições cuidadosamente controladìs, ocorre apenas uma quantidade mínima de quebra do DNA cromossômico. Os fragmentos de DNA resultantes são ainda muito grandes - muito maiores que os plasmídeos e podem ser removidos, juntamente com os resíduos celulares, por centrifugação. Esse processo é também facilitado pelo fato de que o cromossomo bacteriano está fisicamente fixado ao envoltório celular, de modo que os fragmentos cromossômicos sedimentam com os resíduos celulares se essa interação nãã é
rompida. O rompimento das células deve, portanto, ser executado de maneira bastante branda para impedir a quebra generalizada do DNA bacteriano. Paru E. coli e espécies aparentadas a ela. a lise controlada é executada conforme mostiado na Figura 3.9. o tratamento com EDTA e lisozima é feito na presença de sacarose, o que impede que as células rompam-se imediatamen-
ilir
,Ufittr
Slll:.
ruLl
-ïii,ufillt
üf
iltfi ültff'lìto:
illlutllf
-.rmmu
ìr
&ú,fuS]!Ì
llJ{l
tÌIuÍxlLijul
;lr
,*,tt!tLf:*ringr,ffro
r,lii!ffiiirf,$ úe
t,e e
SWtç 4rìilfü$ tllf
tiitmliÌ
Ítrüt
Írìrìriïìtú
ihdldurmuln
foruülurrrnur, i&f
,ufu'nmam"dUr uClLir:q,:tliiu
tuCiüuu
Cromossomo bacteriano
EsÍeroplasto
uLlm
'üllhf
;p'lirlt,tu1Nrmrirdurur 11|tiì(rrÌtìElI]jlflEl!1tlü,
Lisozima + EDTA
if,
ìüutÌüt[
'Itrìrìilül,iitlr
-llnnlllürr,lll4n|l, mtnrmmrudii
...........................".............'...*
Sacarose 25%
td
rÜrt;|íltr 4l:
Plasmídeos
Membrana
.'/
celular intacta Parede celular rompida I
I
rriton x-t oo
t Plasmídeos
Lisado
clariÍicado
Grandes fragmentos de DNA
+CentriÍugação
lmìtttittüuttllr,
ìo o2 ab \ ^,.
IV .aa
.^ /'
/-
llüllür
lnffi
rrïfl
ttilttumÌ"ìrìfiMiliüm'
riiilrÌrlllíffiirriiÌìllMll
' i
o-\
uulÍÍÍtlü,fl 1
Extrato celular Resíduos celulares
Preparação de um lisado clarificado.
lütrr
o
:: ::.:.:::i-io:.rirrlop,{rr,,.,r.r"'"1r,,:'.'rìi:.jïj,::ï1ï:ìil::ïïlïrJïiffinï:'i.ï::ï;'j;'l#;:;:
uêr'âlÍll ollluq un r $u'croJ eÌ opuq rrqir:q apod 1os o anb rrp ua1'Ãorrii1"*o., oe5enunuo: e a a:olànb:o4 F-rç : fLì--a qT! uf .opunlu op lornu e,epn-Br ezetsrJt €un ?tlo^ g.zeSsap :s rapur anb o opnl anb "p erp uâJ.of,ernq un ?nl e,rãap -EDuêsn? lw,;: :: I Ens e EloÌ]] op?q€s op orluaÌrs o ,êlâp âruou o zÌp €troj ?Ì Ìos o,ãlãqu?uv.of,st:ue:g,rrd nes o ors :nb srrp rraa,, gr
rrp
.ì
ÍE
L
G
rt
a
uLl
nur| utl[, r||l{ulutü
r::-.1
IE
tttjümr
Figura 3.9
z
r'm; ::i
ilÌllüiillilü
'ütflÌn1Imdirxtrudllui
unmnr
*s1
o
llirrltttluru
Dlrl {trr
:;
-
i$MnülilïlrM
illlntnluttu,,idlffulìir
rrtttrrrrnt{ttttu
\-_
I
*
dim*rnn
CLorunoev GÊNrcA
r quebrado e gera fragmentos li: Lineares resultará, portanto, em
DNA
51
gradadas, que retêm uma membrana citoplasmáticaintacta. A lise celular é, então, induzida pela adição de um detergente não-iônico, como o Triton X-100 (detergentes iônicos, como o SDS, causam quebras cromossômicas). Esse método provoca poucas quebras no DNA bacteriano, de modo que a centrifugação resulta em um lisado clariÍicado, consistindo quase que inteiramente em DNA plasmidial. Contudo, um lisado clarificado ainda conterá, invariavelmente, algum DNA cromossômico. Ademais, se os próprios plasmídeos são moléculas grandes, eles também podem sedimentar juntamente com os resíduos celulares. Assim, o fracionamento por tamanho raramente é suficiente por si só, devendo-se considerar modos alternativos para a remoção dos contaminantes de DNA bacteriano.
\22
b maneira bastante branda para
fr
oe
te. Em vez disso, são formados esferoplastos, células com paredes celulares parcialmente de-
;io de preparação do extrato cecontroladas, ocoÍïe apenas uma lmentos de DNA resultantes são Ddem ser removidos, juntamenn é também facilitado pelo fato rur oÌtório celulaq de modo que clulares se essa interação não é
E ANÁLrsE
Separação com base na conÍormação Antes de se considerar como as diferenças conformacionais entre plasmídeos e DNA bacteriano podem ser utilizadas para separar os dois tipos de DNA, deve ser analisada mais detathadamente a estrutura geral do DNA plasmidial. Não é estritamente correto dizer que plasmídeos têm conformação circular, pois círculos de DNA de fita dupla podem, na realidade, adotar duas configurações alternativas bastante distintas. A maioria dos plasmídeos existe na célula como moléculas superenroladas (Figura 3.10a). O superenrolamento ocoÍre porque a hélice dupla do DNA plasmidial é parcialmente desenrolada durante o processo de replicação plasmidial por enzimas chamadas de topoisomerases (p. 70). A conformação superenrolada somente pode ser mantida se ambas as fitas polinucleotídicas estiverem intactas, daí o nome mais técnico de DNA circular covalentemente fechado (ccc, do inglês covalently closedcircular). Se uma das fitas polinucleotídicas é quebrada, a hélice dupla retorna ao seu estado
e espécies aparentadas a ela,
O tratamento com EDTA e li- a-r rompam-se imediatamen-
normal relaxado e o plasmídeo adota a sua conformação alternativa, denominada de circular
aberta (oc, do inglèsopen-circular) (Figura 3.10b).
- Corte
Figura 3.10 conformações de DNA de Íita dupla circular: lmlt srnerenrolado - ambas as Íitas estão intactas; 'Ìh l roular aberto - uma ou ambas as fitas possuem uma quebra.
lMurms
Figura 3.9 Preparação de um lisado clarificado.
(a)
Superenrolado
(b) Circular aberto
O superenrolamento é importante na preparação de plasmídeos porque moléculas superenroladas podem ser facilmente separadas de DNA não-superenrolado. Dois métodos diferentes são comumente utilizados, os quais têm capacidade de purificar DNA plasmidial a partir de extratos celulares brufos, embora, napráÍica, sejam obtidos resultados melhores quando um lisado clarificado é primeiramente preparado.
Desnaturação alcalina A base dessa técnica é a existência de uma estreita faixa de pH na qual DNA não-superenrolado é desnaturado, enquanto plasmídeos superenrolados não o são. Se, com a adição de hi-
a
IE x.rrrsr orul g ì .- : r ::ì ::: :::.:ri; .ossrnoursuaauuanba:o^roc'oqÌg'rlporlnounarduasuslsBl/^{ oJorlf @ Xumr .rú cr: ür :tsrr rÍc- n: !ãu'Ëro_J pl opurl rsqlrrq apod 1os o anb erp uâI ?rrgtsrÌ{ essou ep oe5rnurluo: r a a:ol anbro4 úrr$r; r im: l flr üJ-rc::---u Õp ronu e 'tpnËr ezâtsl:] Eun ello^ E ZBJsãp âs râpur ênb o opnr anb erp uâJ of,rrnq un ?rrl rr:8ap lndil ;r : m-Es:x ms f, Ei.q-- otlEqe\ op oÍf,uâFs o'JIJp âuou o zrp rloJ gl Ios o 'atêqu€uy oJsrf,ur:g 'rcd nas o oçs anb stlp uaa,, :.---:lJrrl-r r.rril odu:.ìl:atrl ouu.ìlil rnb rrd o:.rr1os
or11r1
o urcì
,ì
G
L
IE
rt
a
#g:
z 9
52
T.A.Bnowru
dróxido de sódio a um extrato celular ou a um lisado clarificado, o pH é ajustado para l2,O a 12,5, aspontes de hidrogênio do DNA não-superenrolado são rompidas, o que causa o desenrolamento da hélice dupla e a separação das duas cadeias polinucleotídicas (Figura 3.1 1). Se,
cula form
depois disso, é adicionado ácido, essas fitas de DNA bacteriano desnaturado reagregam-se em uma massa desorganizada. A rede insolúvel formada pode, então, ser sedimentada por centrifugação, deixando o DNA plasmidial puro no sobrenadante.
de flutuaq forma um
de de flun de a densr
sidade po ao tratâm
Adem
(EtBr)
?
4z-
DNA linear
-+:ffi\ *ïr" / /
pH 12,0
a 12,5
-
PIasmídeos suPerenrolados
pc
O bromet
5V
centes. pr
mento res near. O D de desenr da densid
-t{3
apenas a
DNA linear de fita simples
formam
i
u
pondente A cen método u cado é sul separado
,,0
io,
RNA pru Centrifugação
s9 o tubo plasmidia do dotub
/a
i
ã
Plasmídeos superenrolados
3
-
Sedimento de
sde
q de DNA linear
DNA linear
r
bq \ \ó
Figura 3-í
1
DNApla
PuriÍicação de plasmídeos pelo método de desnaturação alca-
gura 3.14 tá pronto
lina.
Uma vantagem adicional desse procedimento é que, sob certas circunstâncias (especificamente, lise celular por SDS e neutralização com acetato de sódio), a maioria das proteínas e do RNA também se torna insolúvel e pode ser removida pela etapa de centrifugação. A extranecessários se o méção com fenol e o tratamento com ribonuclease podem, portanto, não ser todo de desnaturação alcalina é utilizado.
CentriÍugação em gradiente de densidade de brometo de etídeo-cloreto de césio Essa é uma versão especializada da técnica mais geral de equilíbrio ou centrifugação em gradiente de densidade. Um gradiente de densidade é produzido pela centrifugação de uma solução de cloreto de césio (CsCl) a uma velÒcidade muito elevada (Figura 3.12a). O gradiente é formado porque a força centrífuga elevada puxa os íons de césio e de cloreto em direção ao fundo do tubo. A migração dos íons no tubo é contrabalançada por difusão, de modo a levar ao estabelecimento de um gradiente, com as maiores densidades de CsCl em
direção ao fundo. Macromoléculas presentes na solução de CsCl quando ela é centrifugada formam bandas em pontos distintos do gradiente (Figura 3.12b). O ponto exato onde uma determinada molé-
B
rt Ir t !r II
I z o
=çq
CentriÍugação em, dade de cloreto ú diente de densidac do por centriÍuga@r (b) Separação d RNA em um gradi
"Tèmdiasquesãooseupai,Francisco.Âmanhece,osoliáforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera alegria viraìm buraco.Tem dia que tudo o que andei se desfaz.E volta umâ tristeza aguda, a maior do mundo.Em dias como esses,só você faz sentido, Poique você é a continuação da nossa história.Tem dia que o sol pode brilhar Lindo lá fora,mas é um brilho triste.Tem dia que nem chove,mas é dia de  nrãc esi:reve para r: iìlho sobrc o pai qur' elr'não tele tentpo par;r corirecer'
( o para Francisco,
I AII-X Ediro.a I
Cloruneeu GÊr,rrca
lo. o pH é ajustado para 12,0 a ompidas, o que causa o desen-
ucleotídicas (Figura 3.11). Se, ,
desnaturado reagregam-se em
io. ser sedimentada por centri-
Figura 3.11 PuriÍicação de plasmídeos pelo método de desnaturação alca-
E ANÁLtsE
oe
DNA
cula forma uma banda depende da sua densidade de flutuação; o DNA possui uma densidade de flutuação de aproximadamente r,7 glcm3 e, portanto, migra até o ponto do gradiente onde a densidade do cscl é de l,i g/cm3. As moléculas protéicãs, po, ,uu vez, tê,mdensidades de flutuação muito mais baixas e, por isso, flutuam no topo do gradiente, enquanto o RNA forma um sedimento no fundo do tubo (Figura 312b).4 centrifugação em gradientes de densidade pode, pois, separar DNA, RNA e proteínas e é uma alternativa à extração com fenol e ao tratamento com ribonuclease para a purificação de DNA. Ademais, a centrifugação em gradientes de densidade na presença de brometo de etídeo (EtBr) pode ser utilizadapwa separar DNA superenrolado de moléculas não-superenroladas. O brometo de etídeo liga-se a moléculas de DNA intercalando-se entre pares de bases adjacentes, provocando um desenrolamento parcial da hélice dupla (Figura 3.13). Esse desenrolamento resulta em um decréscimo na densidade de flutuação de até0,125 glcm3 paraDNA linear. O DNA superenrolado, por sua vez, por não ter extremidades livres, tem uma liberdade de desenrolamento muito restrita e liga-se a uma quantidade limitada de EtBr. O decréscimo da densidade de flutuação de uma molécula superenrolada é, assim, muito menor, chegando apenas a aproximadamente 0,085 g/cm3. Em conseqüência disso, moléculas superenroladas formam uma banda em um gradiente de EtBr-CsCl em uma posição diferente daquela coÍïespondente a DNA linear e circular aberto (Figura3.l4a). A centrifugação em um gradiente de densidade de brometo de etídeo-cloreto de césio é um método muito eficiente para a obtenção de DNA plasmidial puro. Quando um lisado clarificado é submetido a esse procedimento, os plasmídeos formam bandas em um ponto distinto, separado do DNA bacteriano linear, com as proteínas flutuando no topo do graãiente e com o RNA precipitado no fundo. A posição das bandas de DNA pode ser visualizada iluminandose o tubo com radiação ultravioleta, que faz com que o EtBr ligado ao DNA fluoresça. o DNA plasmidial puro é removido por aspiração, utilizando-se uma seringa cuja agulha perfura o lado do tubo na altura correspondente à amosúa a ser coletada (Figura :.i+U;. O EtBr ligado ao DNA plasmidial é extraído com n-butanol (Figura 3.14c) e o CsCl, removido por diálise (Figura 3.14d). A preparação plasmidial resultante é praticamente IOOVo pura e o plasmídeo está pronto para ser utilizado como um veículo de clonagem
lina.
Proteína
rtas circunstâncias (especifi ca-
dio). a maioria das proteínas e hpa de centrifugação. A extra-
1,60
o. não ser necessários se o mé-
6c
e brometo de
Aumento da concentração de CsCI
riores densidades de
CsCl em
centrifugada formam bandas r onde uma determinada moléé
B
;t+
z o
$o
1,65
t,zo
o
E Ì,
<_
t.zs
'õ
c
oo
Figura 3.12 Oenhifugação em gradiente de densi@de de cloreto de césio. (a) Um gra,diemte de densidade de CsCl produzi,üu por centrifugação a alta velocidade. rib) Separação de proteínas, DNA e Hfi,lA em um gradiente de densidade.
1,80
RNA (a)
(b)
"Temdiasquesãooseupai,Francisco.Âmanhece,osolláforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera
o lr
alegria vira um buraco.Tem dia que tudo o que andei se desfaz. E voltâ umâ tristeza âguda, a maior do mundo.Em dias como esses, só você lz senrido. Porque você é a continuação da nossa história.Tèm dia que o sol pode brilhar lindo 1á fora,mas é um brilho triste.Tèm dia que nem chove,mas é dia de
o tt (
Â
ll
I
è õ o
uilíbrio ou centrifugação em duzido pela centrifugação de úto elevada (Figura 3.I2a). O s íons de césio e de cloreto em ntrabalançada por difusão, de
:lic
53
escri:r.c p:rn o úlho sohrc o 1::ì qur clr'nào teve lclrrpc
p:rr i:r:lltlcrl.
q,
Francisr:o.
AÌÌX
Editur.,
DNA
54
T.A.Bnowru
Estrutura química do brometo de etídeo
Molécula de EtBr intercalada
)s,+ Â
Figura 3.13 +
EtBr
3,4 A Arcabouço de açúcar-ÍosÍato
>3,4 Â Par de bases
Hélice dupla de DNA normal
Desenrolamento parcial da hélice dupla do DNA por intercalação de EtBr entre pares de bases adjacentes. A molécula de DNA normal, mostrada à esquerda, é parcialmente desenrolada ao incorporar quatro moléculas de EtBr, resultando na estrutura "esticada", à direita.
ftgnl
murnftrna@e0
ffihrmriffilp,or ilümMosnmngnd
ü|uffiffi
ffir.@
3.2.3 Amplificação de plasmídeos A preparação de DNA plasmidial pode
ser dificultada pelo fato de que os plasmídeos representam apenas uma pequena porção do DNA total de uma célula bacteriana. O rendimento de uma preparação de DNA plasmidial a partir de uma cultura bacteriana pode, portanto, ser de-
tI
Plqnr Aüfro
Mu
cepcionantemente baixo. A amplificação plasmidial é uma das maneiras de aumentar esse
rendimento. A amplificação tem por objetivo aumentar o número de cópias de um plasmídeo. Alguns plasmídeos multicópia (aqueles com um número de cópias de 20 ou mais) guardam a propriedade útil de serem capíves de replicar na ausência de sínteseprotéica. Isso contrasta com o cromossomo bacteriano principal, que é incapaz de replicar sob tais condições. Essa propriedade pode ser utilizada durante a multiplicação das bactérias em cultura para purificação de DNA plasmidial. Depois que uma densidade celular satisfatória foi atingida, um inibidor de síntese protéica (por exemplo, cloranfenicol) é acücionado à cultura, que, por sua vez, é então incubada adicionalmente por mais 12 horas. Durante esse período, as moléculas do plasmídeo continuam a replicar, apesar da replicação cromossômica e da divisão celular terem sido bloqueadas (Figura 3.15). O resultado é que um número de cópias de plasmídeo de vários milhares pode ser atingido. A amplificação é, pois, um meio muito eficiente de aumentar o rendimento de preparações de plasmídeos multicópia.
B
tt o rt
ô ê
o -t ( o
"Tèmdiasquesãooseupai,Francisco.Amanhece,osolláforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera alegria vira um buraco.Tem dia que tudo o que andei se desfaz.E voltâ uma trìsteza âguda, a maior do mundo.Em dias como esses, só você faz sentido. Porque você é a continuação da nossa história.Tèm dia que o sol pode brilhar lindo 1á fora,mas é um brilho triste.Tèm dia que nem chove,ms é dia de choro. Mas tem sempre um outro dia, Íìlho. Foi você quem me ensinou isso." Quenclo tiìtr irrl dos pcrsonâgcnr lìriNril3ìs. cono c<>lrinua l hrrrórir: Â rrãe escrer.c p:tra o fìlho sobrc o pai qrie cÌe nâo tcvc terrrpo prrr conhei:er.
ffir(@ t'
ffiem ffi
Cr-ounceu GÊNrcA
E AruÁuse oE
DNA
55
Proteínas
DNA linear
eoc ---_* ---------------{>
DNA superenrolado
._l
Remoção do DNA superenrolado com uma seringa
RNA
Desenrolamento parcial da hélice dupla do DNA por intercalação de EtBr entre pares de bases adjacentes. A molécula de DNA normal, mostrada à esquerda, é parcialmente desenrolada ao incorporar quatro moléculas de EtBr, resultando na estrutura "esticada", à direita.
p de que os plasmídeos repre! bacteriana. O rendimento de p;*u pode. portanto. ser de-
(b) Remoção da banda de DNA
(a) Um gradiente de densidade de EtBr-CsGl
Figura 3.13
, I
V
Mistura com n-butanol e agitação, repouso para separação das Íases
Tampão
Figura 3.14 Furificação de DNA qmrncmidial por centriffiuqação em gradien-
h
til
de densidade de EtBr-CsCl.
Solução de DNA em tubo de diálise Difusão do
-
+
EtBr na Íase orgânica
DNA na Íase aquosa
para o tampão
(c) Extração do EtBr com rFbutanol
(d) Remoção do CsCl
por diálise
Preparação de DNA de bacterióÍagos
maneiras de aumentar esse
A diferença fundamental entre a purificação de DNA de fagos e preparações de DNA celular total ou DNA plasmidial ó que, para fagos, o material de partida normalmente não é um ex-
plasmídeo. Alguns fpias de um
trato celular. Isso ocorre porque as partículas de bacteriófagos podem ser obtidas em grande número a partir do meio extracelular de uma cultura bacteriana infectada. Quando uma des-
las Ì
20 ou mais) guardam a proprotéica. Isso contrasta com rsob tais condições. Essa proem cultura para purificação
lb
p
o (À
íria foi atingida, um inibidor fculrura, que, por sua vez,
íodo,
o oílòì
é en-
o
e da divisão
Íï$Ía
3.15
,ffiffifha@o de
Plasmídeos mulÌicópia (número de cópias de 20+)
%3.3s-
o
?ítt)\t " o
as moléculas do plas-
celular terem sicópias de plasmídeo de viírios muito eficiente de aumentar o
o
----------------
lncubação na presença de cloranÍenicol
DNA bacteriano
ooXo-c ta!-JY
Plasmídeos presentes em um número de cópias de 1.000++
Mbsmídeos.
B
It g rl I
;r*
o z
o
g II ( g
"Tem dias que
/
são o seu pai, Francisco.Amanhece, o sol lá fora diz o nome dele, o silêncio do sábado chora a sua ausência.E de repente tudo o que era alegria vira um buraco.Tèm dia que tudo o que andei se desfaz.E volta uma tristeza aguda, a maior do mundo. Em dias como esses, só você faz sentido. Porque você é a continuâção dâ nossa história.Tèm dia que o sol pode brilharLindo lá fora,mas é um brilho triste.Tèm dia que nem chove,mas é dia de choro.Mas tem sempre um outro dia,fi1ho.Foi você quem me ensinou isso." Quanilo là1ta urrr clos p.'rsonrgcnr príncipais,corro corrinrra: hirr
56
T. A. Bnowrrr
culturas é centrifugada, as bactérias são sedimentadas, deixando as partículas de fago em suspensão (Figura 3.16). As partículas de fago são então coletadas da suspensão e o seu DNA é extraído por uma simples etapa de desproteinização para remoção do capsídeo viral. Esse processo geral é bem mais direto que o procedimento utilizado para preparar DNA
grad(
rer.
P
celular total ou plasmidial. Apesar disso, uma purificação bem-sucedida de quantidades significativas de DNA de fago está sujeita a diversos percalços. A principal difìculdade, especialmente com ì,, é a multiplicaçáo de células infectadas em cultura de uma maneira tal que o título de fagos extracelulares (o número de partículas de fago por ml de cultura) seja suficientemente alto. Em termos práticos, o título máximo que pode ser razoavelmente esperado para l, é de 1010 por ml; ainda assim, 1010 partículas de ), renderão somente 500 ng de DNA. Grandes volumes de cultura, na faixa de 500 a 1.000 ml, são, portanto, necessários se quantidades
de-
er
sas
mudi
N
a pro
substanciais de DNA de l, devem ser obtidas.
3.3.1 Cultivos bacterianos visando à obtenção de altos títulos de l, Não há problemas maiores em cultivar bactérias em grandes volumes (culturas bacterianas de 50 ú ou mais são comuns em biotecnologia), mas a obtenção de um título máximo de fagos requer certas habilidades. O fago l" que ocorre naturalmente é lisogênico (p. 31) e uma cultura infectada consiste principalmente em células portadoras do profago integrado no DNA bacteriano (Figura 2.7). O título de À exffacelular é extremamente baixo sob tais circunstâncias. Para a obtenção de um alto rendimento de l, extracelular, a cultura deve ser induzida, a fim de que todas as bactérias entrem na fase lítica do ciclo de infecção, o que resulta na moÍe celular e na liberação de partículas de 1, no meio. O controle da indução é, normalmente, muito dificil, mas a maioria das linhagens de À de laboratório é portadora de uma mutação termossensível (ts) no gene cI, o qual é um dos responsáveis pela manutenção do fago no seu estado inte-
\-r. a\ ^??
Cultura inÍectada
??O|ç(bactérias+ a^'' fagos extracelulares) q,t
it
-
? ç ç?. ?.trt,?i suspensão de Íagos ,? ? ?
I
lffir@,üu Figura 3.16
-
S
S"Oir"r,to de bactérias
rtffi,düb",Ntr'üt
Preparação de uma suspensão de Íagos a partir de uma cultura de bactérias infectadas.
-
E
o o rl
q.
o
z
g I! ( g
"Temdiasquesãooseupai,Francisco.Amanhece,osolláforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera alegria vira um buraco.Tèn dia que tudo o que andei se desfaz.E voltâ uma tristeza aguda, a maior do mundo.Em dias como esses,só você faz senrido. Porque você é a continuação da nossa história.Tem dia que o sol pode brilhar lindo iá fora,mas é um brilho triste.Tem dia que nem chove,mas é dia de choro.Mas tem sempre um outro dia,frlho. Foi você quemme ensinou isso." Quando iàlta urr r:los persona*ens principais, cor:ro continua; históna7 A ntãc escrcve plrr o filho sobre o pri que eÌe não telc rcrrpo par:r conhecer.
ffiM
Cr-orunoeu GÊt'ttcn
r
ANÁLtsE oe
DNA
grado. Se inativado por uma mutação, o gene cI não funciona mais corretamente, o que leva a mudança para a fase lítica do ciclo de infecção. Na mutação clls, o gene cI é funcional a 30oC, temperatura na qual a lisogenia pode ocorrer. Porém, a 42"C, o produto do gene clls não funciona adequadamente e a lisogenia não pode, então, ser mantida. Uma cultura de E. coli infectada com l, clls pode, assim, ser induzida a produzir fagos extracelulares pela transferência de 30"c para 42"c (Figura3.l1).
rando as partículas de fago em das da suspensão e o seu DNA noção do capsídeo viral. o utilizado para preparar DNA n-sucedida de quantidades sig-
principal dificuldade, especial-
ra de uma maneira tal que o tíor ml de cultura) seja suficien-
r
razoavelmente esperado para Dmente 500 ng de DNA. Grannto. necessários se quantidades Profago ì.
altos títulos de
?r,
30.c
olumes (culturas bacterianas de e um ítulo máximo de fagos rergênico (p. 31) e uma cultura inrgo integrado no DNA bacteriao sob tais circunstâncias.
cultura deve ser induzida,
po,
a
_---------------
Sem indução
fim
o que resulta na morte celu-
ryão é, normalmente, muito
difi-
rde uma mutação termossensínção do fago no seu estado inte-
1",.. lndução
Genoma de À liberado
I
p
r-i."
""tut",
+
( \.-a^,r Figura 3.17
ü
3.16
ffi4ao tu
It g I
qt Io z
o
(
-t qr
\
de um lisógeno
Novas partículas de fago l,
düs por transÍerência
de 30'C Para42'C.
ção de uma suspensão s a partir de uma cultura érias inÍectadas.
B
57
"Têmdiasquesãooseupai,Francìsco.Amanhece,osolláforadizonomedele,osilênciodosábadochoraasuaausência.Ederepentetudooqueera alegria vira um buraco.Tèm dia que tudo o que andei se desfaz.E voltâ umâ tristezâ aguda, a maior do mundo.Em dias como esses, só você faz sentido Porque você é a continuacão da nossa história.Tem dia que o sol pode brilhar lindo 1á fora, mas é um brilho triste.Tem dia que nem chove,mas é dra de A nàe cscrevc pirra o filÌro sobrc
O
paì qLre e1e nãO levc lelnpo
prrr i:onheclr.
58
T. A. Bnowr.r
3.3.2 Preparação de fago
?r,
t,33
não-lisogênico
Embora a maioria das linhagens de À seja lisogênica, muitos vetores de clonagem derivados desse fago são modificados, por deleções de cI e de outros genes, a fim de que a lisogeniajamais ocorra. Tais fagos são incapazes de se integrarem no genoma bacteriano e podem infectar células apenas pelo ciclo lítico (p. 31). Com esses fagos, a chave para a obtenção de um alto título reside na maneira pela qual as células são cultivadas, sendo sobremaneira importante o estágio no qual as células são infectadas pela adição de partículas virais. Se os fagos são adicionados antes de as células estarem se dividindo na velocidade máxima, todas elas são lisadas rapidamente, resultando em um baixo título (Figura 3.18a). Por outro lado, se os fagos são adicionados quando a densidade celular é muito alta, então a cultura jamais será completamente lisada e, novamente, o título de fago será baixo (Figura 3.18b). A situação ideal é quando o estágio da cultura e o tamanho do inóculo do fago são equilibrados de modo que as células continuem a multiplicar-se, mas que todas elas acabem sendo infectadas e lisadas (Figura 3.18c). Como pode ser imaginado, habilidade e experiência são necessárias paÍa ajustar o processo até a perfeição.
Coleta de
Os resnm& intactal por
l,asòfagor
pra5 mlu Aspütí
wlaidadcs
porunc dE
de
sal úiltr
fuup
sotl"idoenr
tg./l nrmcaçE Aespui
DÈ'{Apd rxrtliÍie,E
qlldia&r
studsp slheeq
(a) A densidade da cultura é muito baixa
oo oo
z a
tJ
165r-nl
pfrrg
t'
?i Adicão do
@el;ü
lnóculo de ì"
.a Í
?
Íaoo
r,ri"" o )i -
br[rd
f puffi
?
Todas as células são rapidamente lisadas = baixo título de fago
Bactéria
Amúrirrd
FoüÍt ,eflim&g rouü:d |Nfi,fu
(b) A densidade da cultura é muito alta
aO
'?'
\
"'#í
&'irZ,?" :,2+7ÍzZ" 'oo oe? o o o ??'
A cultura nunca é completamente lisada = baixo título de Íago
(c) A densidade da cultura é correta
Oe
ooo"i" oo
?l
Figura 3.18
i!íí''-'dlï+, A cultura continua a desenvolver-se, mas as células acabam sendb lisadas = alto título de fago
B
o o rl
o I! ( o
Situações que podem ocorrer quando se busca o equilíbrio correto entre o estágio da cultura e o tamanho do inóculo para a preparação de uma amostra de um Íago não-lisogênico.
são o seu pai, Francisco.Amanhece, o sol 1á fora diz o nome dele,o silêncio do sábado chora a sua ausência.E de repente tudo o que era alegria vira um buraco.Tem dia que tudo o que andei se desfaz.E volta umâ tristeza âguda,a maior do mundo.Em dias como esses,só você fz sentido. Porque você é a continuação da nossa história.Têm dia que o so1 pode brilharlindo lá fora,mas é um brilho triste.Tem dia que nem chove,mx é dia de choro.Mas tem sempre um outro dia, âlho. Foi você quem me ensinou isso." Quendo felta unr dol persor:agens priucip:is, corrto continua a história? Â rnãe escreve para o {ìlho sobre o pai que eÌe não tere ten:po parl cor:hecer.
"Tem dias que
p:ira Fr:rncisr:o.
I
ARX Pditor.
En,lt Ífr"dmEn
Cloruneev GÊNrcA
tjtir fim de que
a lisogenia
ja-
bacteriano e podem infecreside na maneira pela qual as no qual as células são infecantes de as células estarem . resultando em um ionados quando a densidade lisada e, novamente, o título estágio da cultura e o tamanho
tiluem r.
a multiplicar-se, mas Como pode ser imaginado,
59
Ar.rÁlrsr oe DNA
Coleta de fagos a partir de uma cultura infectada Os restos das células bacterianas lisadas, juntamente com quaisquer células que perrnaneceriìm intactas, podem ser removidos de uma cultura infectada por centrifugação, deixando as partículas do fago em suspensão (Figura 3.16). O problema agorué a redução do volume da suspensão para 5 ml ou menos, um volume manipulável para a extração de DNA. As partículas do fago são tão pequenas que só podem ser sedimentadas por centrifugação a velocidades muito elevadas. Por isso, a coleta dos fagos é geralmente feita por precipitação com polietileno-glicol (PEG). O PEG é um composto polimérico de cadeia longa que, na presença
de clonagem derivados .a
E
de sal, absorve água e, por isso, faz com que estruturas macromoleculares, como as partículas
precipitem. O material precipitado pode, então, ser coletado por centrifugação e redissolvido em um volume adequadamente pequeno (Figura 3.19).
de fago,
ür"4 Purificação de DNA a partir de partículas
de fago lv
A desproteinizaçáo do precipitado de PEG redissolvido é,
até a perfeição.
DNA puro do fago, mas, em geral, os fagos l"
às vezes,
suficiente para a extração de
são submetidos a uma etapa de purificação
inter-
mediária. Essa etapa é necessária porque o precipitado de PEG pode conter também uma certa quantidade de resíduos bacterianos, possivelmente incluindo o indesejável DNA celular. É possível separar esses contaminantes das partículas de À, por centrifugação em um gradiente de densidade de CsCl. A banda das partículas de l, em um gradiente de CsCl forma-se em uma densidade de 1,45-1,50 g/cm3 6igura 3.20) e pode ser coletada do gradiente como descrito anteriormente para bandas de DNA (p. 54 e Figura 3. 14). A remoção do CsCl por dirílise resulta em uma preparação pura de fagos, a partir da qual o DNA pode ser extraído com fenol ou por tratamento com protease, para a digestão do envoltório protéico do fago.
üLs
A purificação do DNA de Ml3 causa alguns problemas A maioria das diferenças entre os ciclos de infecção de Ml3 e l" representa uma vantagem para o biólogo molecular que deseja preparar DNA de Ml3. Primeiramente, a forma replicativa de fita dupla de M13 (p. 34 e 36), que se comporta como um plasmídeo de alto número de cópias, é facilmente purificada por procedimentos-padrão para a preparação de DNA plasmidial. Um extrato celular é preparado a partir de células infectadas com Ml3,
r?r8U
q& Adição de PEG + NaCl
Figura 3.18 Situações que podem
I
?. a
ocorrer quando se busca o equilíbrio correto entre o estágio da cultura e o tamanho do inóculo para a preparação de uma amostra de um fago não-lisogênico.
lta
Do ata Ç
t'
B
It qt rl
;r+
õ
z o
!, II ( !,
Figura 3.19 Coleta de partículas de fago por precipitaçao com polietileno-
Suspensão de Íagos
tr
+({ w"È
:s) Partículas de fago precipitadas
Sedimento de partículas de Íago + resíduos celulares
glicol(PEG).
"Temdiasquesãooseupai,Francisco.Amanhece,osolláforadizonomedele,osì1ênciodosábadochoraasuaausência.Ederepenterudooqueera alegria vira um buraco.Tem dia que tudo o que andei se desfaz.E voltâ uma tristezâ eguda, a maior do mundo. Em dias como esses,só você faz sentido. Porque você é a concinuação da nossa hìstória.Tèm dia que o sol pode brilhar hndo lá fora,mas é um brilho triste.Tèm dia que nem chove,mas é dia de choro.Mas tem sempre um outro dia,filho. Foi você quem me ensinou isso." Quar,lo ialta rur dos personrecnr priur:íp:ìs.colro cortìnua;r histórie? Â rràe cscrevc pau o iìlho sobrc o pai q*r'c1c nic lcve tdnrpo prrr r:onlte:cr.
r:rrr lirrncisro
Alì X F,ììtorr
60
T.
A. Bnowr.r
1,35 1,40 1,45 Partículas de fago l. 1,50 1,55 1,60 Densidade de CsCl (g/cms)
Figura 3.20 Purificação de partículas de Íago l, por centriÍugação em gradiente de densidade de CsCl.
sendo a forma replicativa separada do DNA bacteriano, por exemplo, por centrifugação em gradiente de densidade de EtBr-CsCl. Entretanto, a forma de fita simples do genoma de M13, contida nas partículas extracelulares do fago, é freqüentemente necessária. Nesse aspecto, a grande vantagem em relação a l, vem do fato de que altos títulos de M13 são mais facilmente obtidos. Como as células infectadas secretam continuamente partículas de Ml3 para o meio (Figura 2.8), sem a ocorrência de lise, um alto título de M13 é obtido simplesmente pela manutenção da cultura infectada até que seja alcançada uma.alta densidade celular. De fato, títulos de 1012 por ml ou maiores são obtidos com facilidade, sem o emprego de qualquer truque especial. Títulos altos como esses implicam que quantidades significativas de DNA de M13 de fita simples podem ser preparadas a partir de volumes pequenos de cultura - 5 ml ou menos. Além disso, como as células infectadas não são lisadas, não há problemas de contaminação da suspensão de fagos com resíduos celulares. Conseqüentemente, a etapa de centrifugação em gradiente de densidade de CsCl, necessária para a preparação de fago 1,, é raramente utilizada com Ml3. Em resumo, a preparação de DNA de M13 de fita simples envolve o cultivo em pequeno volume das bactérias infectadas, centrifugação para sedimentação das células bacterianas, precipitação das partículas de fago com PEG, extração com fenol para remoção do envoltório protéico do fago e precipitação com etanol para concentração do DNA resultante (Figura 3.21).
Figun Prepa
Leit Birnboi iVlrl
Boom-
(19
494
Clewell
fol Marnu cul Radloff
s€d
cr{
Rogers.
mií Yamam .
tati
7y Zì,fu-
tÈú
Ct-onneeu GÊNrcA
(a) Cultura de células
inÍectadas
ü
(b)
CentriÍugação
para remoção das células
E ANÁLrsE oe
DNA
61
(c) Adição de PEG à suspensão de
Íagos, centriÍugação
+w.."u *Ë
Lz,l
w
Células
I
de Íagos
M13
Fag
sedimentadas
nas partículas extracegrande vantagem em relação
obtidos. Como as células (Figura 2.8), sem a ocormanutenção da cultura infato, títulos de 1012 por ml ou truque especial. Títulos alde Ml3 de fita simples po5 ml ou menos. Além disso, de contaminação da suspende centrifugação em grafago 1", é raramente utilizada i
b envolve o cultivo em pequeinentação das células bacteriabm fenol para remoção do enhcentração do DNA resultante
tr
W
por centrifugação em
(g) Ressuspensão do DNA de M13 em um pequeno volume
M1
(Í)
ffi I I
M13D I 3DNA
N-._ [ïï-
p'o Protêína
Wr.not
3DNA
Remoção aquosa,
de para
(e) Adição
da Íase
Íenol
adição de
remoção do capsídeo protéico
etanol, centriÍugação
W
(d) Ressuspensão do Íago em tampão
Figura 3.21 Preparação de DNA de M13 a partir de uma cultura bacteriana inÍectada.
Leituras adicionais Birnboim, H.C. & Doly, J. (1979) A rapid alkaliae extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research, 7 ,1513-23. [Um método para a preparação de DNA plasmidial.] Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L., Wertheim van Dillen, P. M. E. & van der Noordaa, J. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiotogy, 28, 495-503. [O método de tiocianato de guanidina e sílica para a purificação de DNA.] Clewell, D.B. (1972) Nature of ColEl plasmid replicationin Escherichia coli inthe presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology, ll0, 66'1-76. [A base biológica da amplificação de plasmídeos.]
Marmur,J.(1961)Aprocedurefortheisolationofdeoxyribonucleicacidfrommicroorganisms. I
:
I
:
Journalof MoIecular Biology, 3, 208- 1 8. [Preparação de DNÁ celular total.] Radloff, R., Bauer, W. & Vinograd, J. (1967) A dye-buoyant-density method for the detection and isolation of closed-circular duplex DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 57,1514-21. [A descrição original da centrifugação em gradiente de densidade contendo brometo de etídio.l Rogers, S.O. & Bendich, A.J. (1985) Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology, 5,69-76. [O método de CTAB.] Yamamoto, K.R., Alberts, B.M., Benzinger, R., Lawhome, L. & Trieber, G. (1970) Rapid bacteriophage sedimentation in the presence of polyethylene glycol and its application to large scale virus preparation. l4rology, 40, . 734-44.lPrcpração de,pNA de À.1 Zinder, N.D. & Boeke, J.D. (1982) The filamentous phage (Ff) as vectors for recombinant DNA. Gene, 19, l-10. [Métodos para a multiplicação e a preparação de DNA de fagos.]
CnpÍru
to 4
Manipulação de DNA Purificado
A gama de enzimas para a manipulação de DNA, 64 Enzimas para a clivagem de DNA: endonucleases de restrição, 7 I
Ligação: unindo moléculas de DNA, 86
Depois de amostras de DNA puras terem sido preparadas, a etapa seguinte em um experimento de clonagem gênica é a construção da molécula de DNA recombinante (Figura 1.1). para produzir essa molécula recombinante, tanto o vetor como o DNA a ser clonado devem ser clivados em pontos específicos e unidos de uma maneira controlada. A clivagem e a união são dois exemplos de técnicas de manipulação do DNA, uma grande variedade das quais vem sendo desenvolvida nos últimos anos. Além de serem clivadas e reunidas, as moléculas de DNA podem ser encurtadas, estendidas, copiadas em RNA e em novas moléculas de DNA e modificadas pela adição ou remoção de grupos químicos específicos. Essas manipulações, que podem, sem exceção, ser realizadas em tubos de ensaio, constituem a fundação não apenas para a clonagem gênica, mas também para estudos básicos sobre a bioquímica do DNA, a estrutura dos genes e o controle da expressão gênica. Quase todas as técnicas de manipulação do DNA utilizam enzimas purificadas. No interior da célula, tais enzimas paÍicipam de processos essenciais, como a replicação e a transcrição do DNA, a destruição de DNA estranho ou indesejável (por exemplo, o DNA de um vírus invasor), a reparação de DNA mutado e a recombinação entre diferentes moléculas de DNA. Depois da purificação a partir de extratos celulares, muitas dessas enzimas podem ser persuadidas a executar suas reações naturais, ou algo relacionado a elas, sob condições artificiais. Embora essas reações enzimáticas sejam freqüentemente diretas, a maioria dàlas é impossível de executar por métodos químicos tradicionais. As enzimas purificadas são, portanto, cruciais para a engenharia genética, fato que levou ao surgimento de um ramo industrial importante, a partir da preparação, dacaracÍenzação e da comercialização das mesmas. Fornecedores comerciais de enzimas altamente purificadas prestam um serviço essencial ao biólogo molecular.
64
T. A. Bnowru
As manipulações de clivagem e de união que constituem a base da clonagem gênica são executadas por enzimas chamadas endonucleases de restrição (para clivagem) e ligases (para a união). A maior parte deste capítulo tratará dos diferentes modos de utilização desses dois tipos de enzima. Primeiramente, porém, deve ser considerada toda a gama de enzimas para a manipulação do DNA, para ver exatamente quais os tipos de reações que podem ser executadas. Muitas dessas enzimas serão mencionadas em capítulos posteriores, quando da descrição de procedimentos que fazem uso delas.
4.1 A gama de enzimas para a manipulação de DNA As enzimas para a manipulação do DNA podem ser agrupadas em cinco grandes classes, dependendo do tipo de reação que catalisam:
(1)
Nucleases são enzimas que clivam, encurtam e degradam moléculas de ácidos nucléi-
(2) (3) (4) (5)
Ligases unem moléculas de ácidos nucléicos. Polimerases fazem cópias de moléculas. Enzimas modiÍicadoras removem ou adicionam grupos químicos. Topoisomerases introduzem ou removem superenrolamentos de DNA circular covalen-
cos.
temente fechado. Antes de ver detalhadamente cada uma dessas classes de enzima, dois aspectos devem ser salientados. O primeiro é que, embora a maioria das enzimas possa ser designada para uma classe específica, algumas apresentam atividades múltiplas, abrangendo duas ou mais classes. Mais importante ainda é que muitas polimerases combinam suas capacidades de produzir novas moléculas de DNA com uma atividade degradativa (isto é, de nuclease) de DNA associa-
fre
da.
Em segundo lugar, deve ser observado que, assim como existem as enzimas para a manipulação de DNA, há muitas enzimas similares conhecidas que são capazes de agir sobre o RNA. A ribonuclease utilizada paÍa remover RNA contaminante de preparações de DNA (p. 45) é um exemplo desse tipo de enzima. Embora algumas enzimas de manipulação de RNA tenham aplicações na clonagem gênica e sejam mencionadas em capítulos posteriores, o enfoque, em geral, estará restrito àquelas enzimas com atuação sobre DNA.
nugesr
ruüúBfrG ünr,k mÍilrdh4ç,q mrffic üumdÍffid lh&Íblil ü|ffinfuÉ
üm[offesr
4.1.1 Nucleases Nucleases degradam moléculas de DNA quebrando as ligações fosfodiéster que unem nucleotídeos adjacentes em uma fita de DNA. Existem dois tipos diferentes de nuclease (Figura 4.1):
(1) (2)
Exonucleases removem um nucleotídeo de cada vez, a pafiir da extremidade de uma molécula de DNA. Endonucleases são capazes de quebrar ligações fosfodiéster no interior da molécula de
DNA. A principal distinção entre
mfu
grú
puú as diferentes endonucleases reside no
número de htas que são
degradadas quando uma molécula de fita dupla é atacada. A enzima chamada 8a131 (purificada a partir da bactéria Alteromonas espejiana) é um exemplo de exonuclease que remove
L
üdt m
]om'crrÉi
Clotlneev GÊNtcA
E ANÁLtsE
oe
DNA
65
I a base da clonagem gênrca são
b
(para clivagem) e ligases (patmodos de utilização desses dois
(a) Uma exonuclease
I
toda a gama de enzimas para a rreações que podem ser executa-
Clivagem
I
posteriores, quando da descrição
D
+
+
Nucleotídeo Ligação fosfodiéster
Clivagem
de DNA
Ponte de hidrogênio
D' -o-
hs em cinco grandes classes, de-
qog?99999ç9gg99po-o
hur moléculas de ácidos nucléi-
:q-O-@3-O m químicos. rrcntos de DNA circular covalen-
(b) Uma endonuclease
enzima, dois aspectos devem ser as possa ser designada para uma
Srangendo duas ou mais classes. has capacidades de produzir no€, de nuclease) de DNA associabxistem as enzimas para a manifuue são capazes de agir sobre o wrte de preparações de DNA (p. nzimas de manipulação de RNA h em capítulos posteriores, o enb sobre DNA.
ls
Figura 4.1
reações catalisadas dois tipos diferentes de nuclease. (a) Uma mruclease, que remove mdeotídeos a partir da ü€Ínidade de uma moFctila de DNA. (b) Uma iaÉonuclease, que que-
tha fgações ÍosÍodiéster :
+ .@
..É
..@ -@-
internas.
kx fosfodiéster que unem nucleode nuclease {Figura 4. I ): ftrentes r
ia partir da extremidade de uma
nucleotídeos a partir de ambas as fitas de uma molécula de fita dupla (Figura 4.2a). euanto maior for o tempo de ação da Bal31 sobre um grupo de moléculas de DNA, mais curtos serão
péster no interior da molécula de
os fragmentos de DNA resultantes. Já outras enzimas, como a exonuclease III de E coli, degradam apenas uma das fitas da molécula de fita dupla, deixando DNA de fita simples como
:
bside no número de fitas que são Lenzima chamada Bal3l (purifi-
rylo de exonuclease que remove
produto (Figura 4.2b). critério pode ser utilizado para classihcar endonucleases. A endonuclease S I (do fwgo Aspers oryzae) cliva apenas fitas simples (Figura 4.3a), enquanto a desoxirribonuclease I (DNase I), a é preparada a partir de pâncrEas bovino, cliva tanto moléculas de fita simples como de fita dupla (Fi-
66
T. A. Bnowr.r
(a) Bal3l
Ud+o.+O..rcr1c
opo4àóó+q
P
Fi$ âsrca@sca das por dibre pcdeendonu pl ì*dease S
(b) Exonuclease lll
5'
3', rttttt
3',
ftapenas
5',
D
tasimples, in
çebras defit
Ces em mol
FrdoÍÍúnaÍile
üfadr.pla-(b,
Figura4.2
-@
.Cr.
As reações catalisadas pelos diferentes tipos de exonuclease. (a) Bal31 , que remove nucleotídeos a partir de ambas as
+ó
Íitas de uma molécula de Íita dupla. (b) Exonuclease lll, que remove nucleotídeos somente a partir da extremidade 3'(ver p. 91 para a descrição das diÍerenças entre as extremidades 3'e 5'de um polinucleotídeo).
rrlrrl
ìC. +-O-GO+O€+
s
I, que divr
Íl{A
de fita
s
çEbdefita
iffiffmendornr
cËlesüiçãq qu IIiIA de fita
ÌnEapenas(
fiitneíoffirb gura 4.3b). A DNase I é considerada inespecífica porque ataca o DNA em qualquer ligação fosfodiéster interna; o resultado final da ação prolongada da DNase I é, portanto, uma mistura de mononucleotídeos e oligonucleotídeos muito curtos. Por outro lado, o grupo especial de enzimas chamadas de endonucleases de restrição cliva DNA de fita dupla somente em um número limitado de sítios de reconhecimento específicos (Figura 4.3c). Tais enzimas, extremamente importantes, são descritas em detalhe na página
71.
dnris deDI\
tffl.l| Èlim DNA.
4.1.2 Ligases
molde
Na célula, a função das ligases é reparafquebras ("descontinuidades") em fitas individuais, que surgem em moléculas de DNA de fita dupla durante a replicação do DNA, por exemplo. As DNA-ligases da maioria dos organismos podem igualmente unir dois fragmentos indivi-
=
-,-:
:
r---
-
:*+::!:-
.'+-:-i--!!:==.::
-+1
F v
í Ë
I í.
h F F
:
i=%___-
nâÍ s{]
gresp
a
pÍine
Cr-orunceu GÊNrcA E ANÁLrsE DE
DNA
67
(a) Nuclease 31 Uma quebra
(D
(ii)
..@
€...*
-@
óóó<+ó+o-e
I I
V
I I
.@-@
Y
.@
..@
óó+ +J{+
I I
V
àQ
=*
[email protected]
(b) DNase
(D
I
(ii)
."@
9annffi
-@ I
t
Figura 4.3
fficações catalisabpordiÍerentes tiendonuclease. S1, que apenas DNA de inclusive çÉÍas de Íita simpsem moléculas
mÉrninantemente illadupla. (b) DNatipos de exonucleaídeos a partir de ambas as (b) Exonuclease lll, que a partir da extremidade 3'(ver entre as extremidades
c
I I
Y
..@..@
€4
rrtrrrll ..@€...@
I I
o+€..É
V
.*-G-.@..É -FG-.É..@
..F+..F..@
rrt
(c) Uma endonuclease de restrição
l" que cliva tanto
mAde Íita simples mrnb de Íita dupla. endonuclease que cliva llÌ{A de Íita dupla,
msapenas em um
I
limitado de sÊ tios. qualquer ligação fosfodiéster mistura de mononucleotídeos chamadas de endonucleade sítios de reconhecimento itas em detalhe na página
") em fitas individuais, do DNA, por exemplo. unir dois fragmentos indivi-
F F
duais de DNA de fita dupla (Figura 4.4). O papel dessas enzimas na construção de moléculas de DNA recombinantes é descrito na página 84.
Polimerases DNA-polimerases são enzimas que sintetizam uma nova fita de DNA, complementaÍ a um molde de DNA ou RNA preexistente (Figura 4.5a). A maioria das polimerases pode funcionÍÌr somente se o molde possui uma região de fita dupla, que atua com um iniciador (do inglês primer) para reação de polimerização. Quaffo tipos de DNA-polimerase são utilizados rotineiramente na engenharia genética. O primeiro é a DNA-polimerase I, geralmente obtida de E. coli. Essa enzima liga-se a uma re-
68
T.
A. Bnowr'r
(a) Reparo de descontinuidade Uma descontinuidade
I oNn-tig"r"
i
(b) União de duas moléculas
..@.@ rlrrlrrrl
-@O..@
J
o*o-"n"."
Figura 4.4 As duas reações catalisadas pela DNA-ligase. (a) Reparo de uma descontinuidade - uma ligação ÍosÍodiéster Íaltante em uma das Íitas de uma molécula de Íita dupla. (b) União de duas moléculas.
gião curta de fita simples (ou quebra) em uma molécula de DNA de fita dupla e, então, sintetizauma fìta completamente nova, degradando a fita preexistente à medida que prossegue na sua atividade (Figura 4.5b). A DNA-polimerase I é, portanto, um exemplo de enzima com atividade dupla - polimerização e degradação de DNA. De fato, as atividades de polimerase e de nuclease da DNA-polimerase I são controladas por diferentes partes da molécula da enzima. A atividade de nuclease está contida nos primeiros 323 aminoácidos do polipeptídeo, de modo que a remoção desse segmento dá origem a uma enzima modificada, a qual retém a função de polimerase, mas é incapaz de degradar DNA. Essa enzima modificada, chamada de fragmento de Klenow, pode ainda sintetizar uma fita de DNA complementar a um molde de fita simples, mas, como não possui atividade de nuc!959, é incapaz de continuar a síntese depois de a quebra ter sido preenchida (Figura 4.5c). Vrárias outras enzimas - polimerases naturais e versões modificadas possuem propriedades similares às do fragmento de Klenow. A principal aplicação do fragmento de Klenow e
Figura As rea
sintetü bras, n
dessas polimerases relacionadas a ele é no seqüenciamento de DNA (p.2I2). A DNA-polimerase de Taq,utllizada na reação em cadeia da polimerase (PCR) (Figura 1.2), é' a enzima DNA-polimerase I da bactéria Thermus aquaticus. Esse organismo vive em fontes termais e muitas de suas enzimas, inclusive a DNA-polirnerase de Taq, são termoestáveis, o que significa que são resistentes à desnaturação por tratamento térmico. É essa a carac-
teística especial da DNA-polimerase de Taq que a torna adequada para a pCR, pois, se não fosse termoestável, ela seria inativada quando a temperatura da reação é elevada a 94"C para desnaturar o DNA. O tipo final de DNA-polimerase importante para a engenharia genética é a transcriptase reversa, uma enzima envolvida na replicação de viírios tipos de vírus. A transcriptase reversa é única por utilizar RNA como molde, emqez de DNA (Figura 4.5d). A capacidade que essa enzima tem de sintetizar uma fita de DNA complementar a um molde de RNA ó fundamental para a técnica denominada clonagem de DNA complementar (cDNA) (p.112-fi9. 7,
F ; F
: :
t F E
dftJa qr
quebr
tl.tl
Enzim Exister
de gn4
(1) r
n
4
Crorueeeu GÊNrcA
E ANÁLrsE oe
DNA
69
(a) A reação básica
s',
5_
3',
-A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T,/ _- à-ì-^5' Molde lniciador 3'
----ì>
A_T_G_C-A-A_T-G-C_A_T_
3',
- t - a - c - g - t - t - a - c-c-T-A3',
5',
Nova Íita sintetizada
(b) DNA-polimerase
I
- A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-TG-T_A_ -T_A_C-G Uma quebra
-A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-T-
- t - a - c - g - t -t - a- c -G-T-A-
N ucleotídeos preexistentes são substituídos
-/-
-_ catalisadas pela DNA-ligase. de - uma ligação em uma das fitas de uma . (b) União de duas molá
----->
(c) O fragmento de Klenow
-f-T-9-9-A-A-r-G-9-l-T-T-A-C-G
G_T-A-
_____>
-A-T-G-C-A-A-T-G-C-A-Tt - Ì - a - C-G-T-A-T-A-C-G,
nucleotídeos / preexistentes não são substituídos
Os
DNA de fita dupla e, então, istente à medida que um exemplo de enzima
-
\\
Somente a quebra é preenchida
(d) Transcriptase Íeversa
-A-u-c-c-A-A-u-c-g-l-y- -/-l-y-g-g-l-l-y-g-g-f-yt v6-T-A-
-polimerase
I são controlartes está contida nos primeidesse segmento dá origem a
/ /**o\
. mas é incapaz de degrada Klenow, pode ainda sintetiza
Molde de
RNA
l'/-t-a-c-g-t-t-a-c-c-T-A\ Nova Íita
de DNA
aüÌs. como não possui atividade
ter sido preenchida (FiguÍa do fragmento de Klenow e
DNA (p.212). da polimerase (PCR) (Figura . Esse
organismo vive em
de Taq, são termoestá-
Figura 4.5 As reações catalisadas por DNA-polimerases. (a) A reação básica: uma nova Íita de DNA é sintetizada na direção de 5'para 3'. (b) DNA-polimerase l, que inicialmente preenche quebras, mas, depois, continua a sintetizar uma nova Íita, degradando a fita preexistente à medida que prossegue na sua atividade. (c) O fragmento de Klenow, que somente preenche quebras. (d) Transcriptase reversa, que utiliza um molde de RNA.
térmico.Éessaacaracpara a PCR, pois, se não reação é elevada a 94.C para genética é a transcriptase vírus. A transcriptase reversa -1.5d). A capacidade que essa molde de RNA é fundamental
) @. 172-174t.
Ë
o
Enzimas modificadoras de DNA Existem inúmeras enzimas que modificam moléculas de DNA pela adição ou pela remoção de grupos químicos específicos. As mais importantes são as seguintes:
(1)
Fosfatase alcalina (de E. coli, de tecido intestinal de vitelo ou de camarão iártico), que remove o grupo fosfato presente na extremidade 5' de uma molécula de DNA (Figura 4.6a).
70
T. A. Bnowrl
(2)
Polinucleotídeo-quinase (de E. coli infectada com fago T4), que tem o efeito inverso da fosfatase alcalina, adicionando grupos fosfato às extremidades
(3)
5'livres (Figura 4.6b).
Desoxinucleotidil-transferase terminal (de tecido tímico de vitelo), que adiciona um ou mais desoxirribonucleotídeos às extremidades 3'de uma molécula de DNA (Figura 4.6c).
4.2 Enz
den
Ar
pft
4.1.5 Topoisomerases
tru
A
s€I seÍ
moléculas de DNA plasmidial) pela introdução ou remoção de superenrolamentos (p. 50-51). Embora as topoisomerases sejam importantes para o estudo da replicação do DNA, ainda não foi encontrada uma utilidade efetiva para elas na engenharia genética.
rar
classe final de enzimas para a manipulação de DNA é a das topoisomerases, as quais são capazes de modificar a conformação de DNA circular fechado covalentemente (por exemplo,
.cli ten
es[
4.7 qu(
des
(a) FosÍatase alcalina
'-ottì"-o,o,o-o--d OH
HO
OH
HO.
OH
\# ry{@q
rrlr
Poï
(b) Polinucleotídeo-quinase HO
W P+oo-.q.
HO
"w
'-o"P
oH rtttt
P..+o-o44q HO'
OH
Figura 4.6 As reações catalisadas por enzimas modiÍicadoras de DNA. (a) FosÍatase alcalina, que remove gru-
'POï
pos S'-Íosfato. (b) Po-
linucleotídeo-quina-
(c) Desoxinucleotidil-transÍerase terminal (i)
s', ..@\
(ii)
s', ,.?fl999ngç{F.F{F.F.F{>{){F_ J3' 3@tt,* iarrrtll!
s', -€...@{4O-F
3'J 3',JJ
1+
se, que acrescenta grupos S'-ÍosÍaÌo. (c)
5' @
afaAfa9Êo+
s',
DesoxinucleotidiltransÍerase terminal,
que acrescenta desoxirribonucleotídeos às extremidades 3' de polinucleotídeos em moléculas (i) de Íita simples ou (ii) de Íita dupla.
Frgrr
fi,nessilar
ofiiqens pre
mnnnanirulaçÍ IilD{A ern um r
;ümnbdec
seÍn s€
F : ;:
Ë
F
CLoruecev GÊNtcA
go T4), que tem o efeito inverso remidades 5'livres (Figura 4.6b). nico de vitelo), que adiciona um ; uma molécula de DNA (Figura
hs topoisomerases,
E Ar.rÁlrse
oe
DNA
Enimas para a clivagem de DNA: endonucleases
de restrição
A clonagem gênica exige que as moléculas de DNA sejam clivadas de uma maneira muito prwisa e reproduível. Isso é ilustrado pela maneira pela qual o vetor é clivado durante a consrução de uma molécula de DNA recombinante (Figura 4.7a). Cadamolécula do vetor deve ser clivada em uma única posição, para abrir o círculo de modo que novo DNA possa ser inserido: uma molécula clivada mais de uma vez será quebrada em àois ou mais fragmentos se1mn'ados e não será útil como vetor de clonagem. Ademais, cada molécula.de vetor deve ser ulivada exatamente na mesma posição do círculo como ficará claro a partir de capítulos posuÊÍiores. a clivagem aleatória não é adequada. Deve ficar bem-explicitado que um tipo muito
as quais são
b covalentemente (por exemplo, le superenrolamentos (p. 50-51). la replicação do DNA, ainda não genética.
cspecial de nuclease é necessário para executar essa manipulação. Freqüentemente, também é necessário clivar o DNA que está para ser clonado (Figura 4-Tb). Para tanto, há duas razões. Primeira, se o objetivo for a clonàgem de um único gãne, que pode consistir em apenas 2 ou 3 kb de DNA, ele deve ser separado por clivagem das grandes (muitas vezes maiores que 80 kb) moléculas de DNA proãuzidas pelo uso das técnicas
I
I I
I I
(a) Moléculas de vetor
I I
I
aì-ï\cvasem c\J \-/Cs
I
I
11
+ \, ^
risura +.e
I I I i I I I I I s'{osÍato. (c) I Otunos Desoxinucleotidils, I r I transÍerase terminal, acrescenta desoI que xirribonucleotídeos I às extremidades 3' * || de polinucleotídeos motécutas (i)de | Íita "r simptes | fita dupla. ou (ii) de As reações catalisaoas por enzimas moOificaOoras de DNA. (a) FosÍatase atcatin", que remove grupo" S'{osfato. (b) Polinucleotídeo-quinase, que acrescenta
/-ì ()
,,--_,\.
( \-/
u
Cada molécula de vetor deve ser clivada uma as cr ivasens devem
:::??"ïï'"ï::as
(b) A molécula de DNA que contém o gêne a ser clonado Gene
,%
r\_--{ \ ,
.....................*
,lffi,rmressidade de
idlluryens precisas
<.--\
-
A,/
Sítios de clivagem
\<
rnmmranipulação de
[MilAem um expede clonagem gênica.
nmimpnto
\
5-
Figura 4.7
Grande molécula de DNA
Fragmentos pequenos o suficiente para serem
clonados
)
I
72
T.
A. Bnowr.r
preparativas descritas no Capítulo 3. Segunda, grandes moléculas de DNA podem ter de ser quebradas simplesmente visando à produção de fragmentos suficientemente pequenos para serem cilïegados pelo vetor. A maioria dos vetores de clonagem exibe uma preferência por fragmentos de DNA dentro de uma determinada faixa de tamanho; vetores baseados em M13, por exemplo, são muito ineficientes para a clonagem de moléculas de DNA com uma extensão maior que 3 kb. Endonucleases de restrição purificadas permitem que o biólogo molecular clive moléculas de DNA da maneira precisa e reprodutível, necessária para a clonagem gênica. A descoberta dessas enzimas, que deu o Prêmio Nobel para W. Arber, H. Smith e D. Nathans, em 1978, foi um dos marcos fundamentais no desenvolvimento da engenharia genética.
4-2.1 A descoberta e a função das endonucleases de restrição A observação inicial que levou à descoberta das endonucleases de restrição ocorreu no início da década de 1950, quando foi demonstrado que algumas linhagens bacterianas eram imunes à infecção por bacteriófagos, um fenômeno chamado de restrição controlada pelo hospedeiro. O mecanismo de restrição não é muito complicado, embora tenham sido necessiírios 20 anos para que ele fosse completamente compreendido. A restrição ocorre porque abactéria produz uma enzima que degrada o DNA do fago antes que ele tenha tempo de replicar-se e de dirigir a síntese de novas partículas virais (Figura 4.8a). O DNA da própria bactéria, cuja destruição seria obviamente letal, fica protegido do ataque por ser portador de grupos metila adicionais, os quais bloqueiam a ação degradativa da enzima (Figura 4.gb). Essas enzimas degradativas são denominadas endonucleases de restrição e são sintetizadas por muitas, ou talvez por todas, espécies de bactéria; mais de 1.200 enzimas de restrição diferentes já foram caracterizadas alé agora. São reconhecidas três classes diferentes de endonucleases de restrição, cada uma delas distinguida por um modo um pouco diferente de ação. As enzimas dos tipos I e III são bastante complexas e têm aplicação limitada na engenharia genética. As endonucleases de restrição do tipo II, por outro lado, são as enzimas de clivagem de grande importância para a clonagem gênica.
Figur Afurção de umi ünudease de rr
çao em uma c
4-2-2 Endonucleases de restrição do tipo ll clivam o DNA em seqüências n ucleotíd icas especíÍicas
ffiüeriana: (a) o
A caracteística principal
das endonucleases de restrição dô tipo II (que, de agora em di4nte, serão chamadas apenas de endonucleases de restrição) é que cada uma delas reconhece e cli-
va uma seqüência específica em uma molécula de DNA. Uma determinada enzima cliva o DNA apenas na seqüência de reconhecimento, deixando qualquer outra seqüência intocada. Por exemplo, a endonuclease de restrição chamada PvaI (isolada de Proteis vulgaris) cliva DNA apenas no hexanucleotídeo CGATCG. Já uma segunda ettzimada mesma ba ciéna, chamada de PvuII, cliva em um hexanucleotídeo diferente, neste caso CAGCTG. Muitas endonucleases de restrição reconhecem sítios-alvo hexanucleotídicos, mas outras clivam seqüências de quatro, cinco ou até oito nucleotídeos. Sau3A (de Staphytococcus aureus linhagem 3A) reconhece GATC e AluI (de Arthrobacter luteus) cliva em AGCT. Exisrem também exemplos de endonucleases de restrição com seqüências de reconhecimento degeneradas, o que significa que elas clivam o DNA em qualquer membro de uma família de sítios relacionados - Hinfl (de Haemophilus influenzae linhagem R), por exemplo, reconhece GANTC, de modo que cliva em GAATC, GATTC, GAGTC e GACTC. As seqüências de restrição para alguràas das endonucleases de restrição mais freqüentemente utilizadas estão listadas na Tabela 4.1.
do Íago é clir mas (b) o DNA
teriano nãc
42.3 Extrer A natu import clivam sultant exemp
Enr
rauml
tenar fÍìs, est
determ em cad
pois o
t
E
rË
:<
I
Ct-oruncev GÊuca e ANÁLtsE oe
de DNA podem ter de ser nte pequenos para
DNA
73
(a) Restrição do DNA do Íago
uma preferência por
rrtores baseados em M13, de DNA com uma extenmolecular clive molécugênica. A descoSmith e D. Nathans, em
restrição Endonucleases de restrição ligam-se ao DNA do fago
ocoÍïeu no início da eram rmunes a ln-
pelo hospedeiro. tenharn sido necessários 20
(b) O DNA bacteriano não é clivado
ocorre porque a bactéria tempo de replicar-se e de da própria bactéria, cuja desde grupos metila adi-
4.8b). de restrição e são sintetiza-
1.200 enzimas de restrição classes diferentes de endoum pouco diferente de ação. limitada na engenharia são as enzimas de clivagem
DNA em tr (que, de agora em diante,
Figura 4.8
frnção de uma ende restri1ão em uma célula briana: (a) o DNA tb Íago é clivado, ms (b) o DNA bacteriano não o é.
uma delas reconhece e cli-
determinada enzima cliva o ouffa seqüência intocada de Proteus vulgaris) clivaima da mesma bactéria, chaCAGCTG. mas outras A, (de Staphylococcus
au-
) clivaemAGCT. Existem de reconhecimento degenede uma família de sítios
&), po.
exemplo, reconhee
GACTC. de restrição mais freqüente-
F t I
b
I
Extremidades cegas e coesivas A natureza exata da clivagem produzida por uma endonuclegse de restrição
é de considerável
importância no projeto de um experimento de clonagem. Müitas endonucleases de restrição clivam simplesmente as duas fitas no meig da seqüência de reconhecimento (Figura 4.9a), resultando em uma extremidade cega (do inglê,s blunt end ou flush end). PvuII e AluI são
exemplos de enzimas que geram extremidades cegas. Entretanto, um grande número de endonucleases de restrição cliva o DNA de uma maneira um pouco diferente. Com essas enzimas, as duas Íitas de DNA não são clivadas exatamente na mesma posição. Em vez disso, a clivagem ocoÍïe de maneira desencontrada nas duas fitas, estando os sítios de clivagem geralmente separados por dois a quatro nucleotídeos, o que determina que os fragmentos de DNA resultantes possuam pequenas projeções de fita simples em cada extremidade (Figura 4.9b). Tais extremidades são chamadas de adesivas ou coesivas, pois o pareamento de bases entre elas pode reunir os fragmentos da molécula de DNA (lem-
74
T.A.Bnowr
Tabela 4.1 As seqüências de reconhecimento para algumas das endonucleases de restrição mais freqüentemente utilizadas
Enzima
Organismo
EcoR.I
Escherichia coli
BamHI
B ac
BgIII
Bacillus globigii
PvuI PvUII
illus
amy lo liquefac i en s
HindIII
Proteus vulgaris Proteus vulgaris H ae mo p hi lus influe nzae
HinfT
H ae mo p hi lu
Sau3A
NotI
Staphylococcus aureus Arthrobacter luteus Thermus aquaticus Haemophìlus aegyptius N o cardia otitidis - c aviarum
sfr
S t re ptomy c e s
AluI TaqI
HaeIII
Ro
s influe nzae R,
fimb riatus
Seqüência de reconhecimentou
Extremidade
GAATTC GGATCC AGATCT CGATCG CAGCTG AAGCTT GANTC GATC AGCT TCGA GGCC GCGGCCGC
Coesiva Coesiva Coesiva Coesiva Cega Coesiva
GGCCNNNNNGGCC
cega ou coesiva
Coesiva Coesiva Cega Coesiva Cega Coesiva Coesiva
A seqüência mostrada corresponde à de uma das fitas, representada na direção de 5' para 3'. Note que quase todas as seqüências de reconhecimento são palíndromos: quando as duas fitas são consideradas, elas são lidas da mesma maneira em ambas as direções. Por exemplo: "
Er
5'_GAATTC_3' EcoRl
||lt
3'-CTTAAG-5'
bre que extremidades coesivas foram vistas napâgina 33, durante a descrição da replicação do fago l,). Uma característica importante dessas endonucleases de restrição é que enzimas com diferentes seqüências de reconhecimento podem produzir as mesmas extremidades coesivas. BamHI (com a seqüência de reconhecimento GGATCC) e BgIII (AGATCT) são exemplos disso - ambas produzem extremidades coesivas GATC (Figura 4.9c). Amesma extremi-
dade coesiva é também produzida por Sau3A, que reconhece somente o tetranucleotídeo GATC. Fragmentos de DNA produzidos por clivagem com qualquer uma dessas enzimas podein ser ligados uns aos outros, pois cada um deles é portador de uma extremidade coesiva complementar.
4.2.4 A freqüência de seqüências de reconhecimento em uma molécula de DNA O número de seqüências de reconhecimento para uma determinada endonuclease de restrição em uma molécula de DNA de tamanho conhecido pode ser calculado matematicamente. Urm seqüência tetranucleotídica (por exemplo, GATC) deve ocorrer uma vez a cada 4a = 256 nw cleotídeos, e uma seqüência hexanucleotídica (por exemplo, GGATCC) uma vez a cada 46 = 4.096 nucleotídeos. Esses cálculos assumem que os nucleotídeos estão ordenados de maneira aleatória e que os quatro nucleotídeos diferentes estão presentes nas mesmas proporçõee (isto é, um conteúdo de GC = 507o). Na prâtica, nenhuma dessas suposições é completamer te válida. Por exemplo, a molécula de DNA de ),, com 49 kb, deveria conter te 12 sítios prÌra uma endonuclease de restrição com uma seqüência de reconhecimento
F
Ê
iQfiloa
rffi
tffimcl
&,q:r
üm
dËrn
tud
müü( drul frthdl
ü,u
rp mru
Crorunoev GÊntcn e ANÁLlsE oe
DNA
75
(a) Produção de extremidades cegas
-N-N-A-G-C-T-N-N-
AIr^t
-N-N_ T-C_G_A-N-N-
_N-N-A_G
C_T-N_N-
-N-r$-ï-b
c-À-ú-ú-
Extremidades cegas
'N'= A, G, C ou T
(b) Produção de extremidades coesivas
-N-NG-A-A-T-T-C-tÈt$-+ ecoRl -N-N-G A-A-T-T-C-N-N-
-N-N-C-T-T-A-A-G-Ì{--N- -N-N-C-T-T-A-A\
\\
G-N-N-
Extremidades coesivas
(c) As mesmas extÍemidades coesivas produzidas por diÍerentes endonucleases de Íestrição'
de 5'para 3'. Note que fitas são consideradas,
Figura 4.9
filclüernidades
Pro-
rünftlas por clivagem übDilA com diÍeren-
a descrição da rePlicação restrição é que enzimas
Mmrnas extremidades coeffiSm (AGATCT) são exem{.9c). A mesma extremi$iffnente o tetranucleotídeo uma dessas enzimas Po' uma extremidade coesiva
em uma endonuclease de restrição matematicamente. Uma uma vez a cada 4a = 256 nuuma vez a cada 46 = s estão ordenados de maneÈ nas mesmas proporçoes suposições é comPletamen'eria conter aProximadamencia de reconhecimento hexa-
F
t
(a) Uma excega produpÍÁ/ri.(b) Uma rünmilade coesiva por EcoRl. npsmas extrecoesivas pro-
ürudas por Bam{l,
ftillle
_N_N_G
Bam*l
Bgttt
SauSA
-*-ru-c- c-T-A-c
G_A_T_C-C_N_NG-N_N-
-N_N_A
G_A_T-C-T_N-N-
IN_N_N
G_A-T_C_N-N-N_
-ú-ú-i- c-r-A-c
À-ú-ú-
-N-ü-N- c-r-A-c
ú-ú-ú-
SauBA.
nucleotídica. Na realidade, tais sítios de reconhecimento ocorrem com uma freqüência menor (por exemplo, seis para BglII, cinco pata BamHI e apenas dois para SalI), um reflexo do fato de que o conteúdo de GC de À é bem merìor do que 50Vo (Figura4.10a). Além disso, os sítios de restrição em geral não estão distribuídos uniformemente ao longo de uma molécula de DNA. Se eles estivessem, uma digestão com uma determinada endonuclease de restrição geraria fragmentos com tamanhos aproximadamente iguais. A Figura 4.10b nostra os fragmentos produzidos pela clivagem do DNA de l, com BgtII, BamHI e SalI' Em sada caso, existe uma considerável variação nos tamanhos dos fragmentos, indicando que os nucleotídeos não estão ordenados aleatoriamente no DNA de À. A lição a ser tilada da Figura 4.10 é que, embora a matemática possa dar uma idéia de quantos sítios de róstriçao são esperados para uma molécula de DNA, somente uma análise experimental é capazde mostrar o quadro real. Deve-se, portanto, ir adiante para considerarsa como as endonucleases de
restrição são utilizadas em laboratório'
76
T.A.Bnowru
caso deven 4.1 la). São
(a) Sítios de clivagem no DNA de À
Obvian tida de um
antes de se da para pm
das endoru
podem vari
dio [NaCl],
po [I exiger te redutor, damental q
r
I I
egnt- 6 sítios
tas de NaC
eamHl -5sítios
bém poden
À
srn-2sÍtios
ocorTa em
r
A coml estáemum
ção à miso
(b) Tamanhos dos Íragmentos
da reação s
já presente
A endo Bgill
enzima é d modo que
22010 13286
r
qüentemen para a cÏl'z
r------- 2392
-651 n 415
Bgü+ tS Oúltin
r60
ses de resü exigências como aDìti
Bamt'l.l 16841
----.---...-..--7233 r--------------- 677O t-----"---'---- 6527 |_-.....--ì5626
de resriçã da enzima-
|------------ì5505
Depois
DNA prod
Sa/l
32745 1
n
5258
499
destmída d
DNA que'
"matar" es
outrÍìs é ul
(EDTA) (q Figura 4.10 Restrição da molécula de DNA de ì,. (a) As posições das seqüências de reconhecimento para Bgtll, Bamïl e Sa/ì. (b) Os Íragmentos produzidos por clivagem com cada uma dessas endonucleases de restrição; os números correspondem aos tamanhos dos Íragmentos, em pares de bases.
4.1le).
|t!È6 Analisam
Uma diges
das posiçú
4.2.5 Executando uma digestão de restrição no laboratório Por exemplo, será considerado como digerir uma amostra de DNA de l" (em uma concentração de 125 pg/ml) com BglII. Primeiramente, toda a quantidade de DNA necessiíria deve ser pipetada em um tubo de ensaio. A quantidade de DNA que será restringida depende da natureza do experimento; neste
ft
n
F t,'
I -L
i.
gnal (Figu gem gênic: nho dos fra
@e serer
léculas de I nores, de n
Clouncev GÊNrcA caso devem ser ingeridos 2 trtg de DNA de 1,, que estão contidos em 16 4.lla). São, portanto, necessárias micropipetas bastante precisas.
E ANÁLrsE oe
pl
DNA
77
da amostra (Figura
Obviamente, o outro componente principal da reação será a endonuclease de restrição, obtida de um fornecedor comercial como uma solução pura e de concentração conhecida. Mas, antes de se adicionar a endonuclease de restrição, a solução contendo o DNA deve ser ajustada para prover as condições corretas pÍÌra assegurar a atividade máxima da enzima. A maioria das endonucleases de restrição funciona adequadamente em pH 7 ,4, mas diferentes enzimas podem variar nas suas exigências quanto à força iônica (geralmente suprida por cloreto de sódio [NaCl]) e à concentração de magnésio (Mg*2) (todas as endonucleases de restrição de tipo II exigem Mg*z para o seu funcionamento). É também recomendável a adição de um agente redutor, como o ditiotreitol (DTT), que estabiliza a enz;rmae evita a sua inativação. É fundamental que as condições corretas sejam proporcionadas à enzima - concentrações incorretas de NaCl ou Mg*'não somente reduzem a atividade da endonuclease de restrição, mas também podem causar alterações na sua especificidade, fazendo com que a clivagem do DNA ocoÍra em outras seqüências de reconhecimento, não-usuais. A composição de um tampão adequado para BgIII é mostrada na Tabela 4.2. Esse tampão está em uma concentração 10 vezes maior do que a de trabalho e é diluído quando da sua adição à mistura da reação. No exemplo apresentado, um volume final adequado para a mistura da reação seria de 20 pl, se forem adicionados 2 pl de tampão de Bgill l0 x aos 16 pl de DNA já presentes (Figura 4.1 lb). A endonuclease de restrição pode agora ser adicionada. Por convenção, uma unidade de enzima é definida como a quantidade necessária para clivar 1 pg de DNA em uma hora, de modo que serão necessárias 2 unidades de BglII para clivar 21tg de DNA de ìu. BgIII é freqüentemente obtida em uma concentração de 4 unidades/pl, de modo que 0,5 pl é suficiente para a clivagem do DNA. Os ingredientes finais na mistura da reação são, portanto, 0,5 pl de BgIII + 1,5 pl de água, determinando um volume final de 20 p.l (Figura 4.11c). O último fator a ser considerado é a temperatura de incubação. A maioria das endonucleases de restrição, inclusive Bg1II, funciona melhor a3'7"C, mas algumas poucas enzimas têm exigências diferentes. TaqI, por exemplo, é uma enzima de restrição de Thermus aquaticus e, como a DNA-polimerase de Tgq, possui uma temperatura de trabalho mais elevada. Digestões de restrição comTaql devem ser incubadas a 65'C para que seja obtida a atividade máxima da enzima.
Depois de uma hora, a restrição deve ser completa (Figura 4.1 1d). Se os fragmentos de
DNA produzidos pela restrição destinam-se a experimentos de clonagem, a enzima deve ser destruída de alguma maneira, para que não possa digerir acidentalmente outras moléculas de
DNA que venham a ser adicionadas em um estágio posterior. Existem várias maneiras de "matar" essa enzima. Para muitas, uma breve incubação a 70'c é suficiente, enquanto para outras é utilizada uma extração com fenol ou a adição de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (que se liga a íons Mg*2, impedindo a ação da endonuclease de restrição) (Figura 4.1 1e).
de reconhecimento pacom cada uma dessas dos Íragmentos, em
iA de l, (em uma concentrapipetada em um tubo de endo experimento; neste
Analisando o resultado de uma clivagem de restrição Uma digestão de restrição resulta em vários fragmentos de DNA, cujos tamanhos dependem das posições exatas das seqüôncias de reconhecimento para a endonuclease na molécula original (Figura 4.10). Para que as endonucleases de restrição possam ser utilizadas em clonagem gênica, é obviamente necessário um método para a determinação do número e do tamanho dos fragmentos de DNA gerados por elas. A ocorrência ou não da clivagem da molécula pode ser evidenciada com facilidade a partir do teste de viscosidade da solução. Grandes moléculas de DNA resultam em uma solução mais viscosa do que uma contendo moléculas menores, de modo que a clivagem está associada a um decréscimo na viscosidade. A resolução
78
T. A. Bnowr.r
mâea (a)
Adição de 2 pl de tampão de
(b)
\_
u
2 pg de DNA de À (16 rrl)
pl
de Bglll + 1 ,5
trrl
deH2O
Bglll
---------->
Adição de 0,5
tr
de dife
ffi
\
..-.......>
ll
Ent forese de rtm: las de ì
V
DNA
I
L_l I
/
f
Nal
sar scp
37'c pot th
tr
V----.-
DNA de À ctivado W ,/ I I -/ídiçàode renot ou EDTA ou áquecimento a70 C por 15 min I I
V
Tabela 4.2 Um tampão lOx adequado para
a
Concentração (mM)
Tris-HCl, pH7,4
500
MgCl,
100
NaCl Ditiotreitol
500
Figura 4.11 Execução de uma digestão de restrição em laboratório (ver texto para detalhes).
restrição de DNA com BglII
Componente
r
léculas
I /lncubação a (d)
(e)
meflIìa
(c)
10
do número e do tamanho dos produtos de clivagem é, contudo, mais difícil. De fato, por muitos anos esse foi um dos aspectos mais tediosos dos experimentos envolvendo DNA. Tais pru blemas acabaram sendo resolvidos no início da década de 1970, quando foi desenvolvidaa técnica da eletroforese em gel.
Separação de moléculas por eletroforese em gel Moléculas de DNA, assim como proteínas e muitos outros compostos biológicos, são doras de uma carga elétrica, negativa no caso do DNA. Conseqüentemente, quando las de DNA são colocadas em um crìmpo elétrico, elas migram em direção ao pólo posi
(Figura4.l2a). A velocidade de migração de uma molécula depende de dois fatores:
a sua
Croruneeu GÊNrcn e ANÁLrsE oe DNA
79
ma e a sua razão entre carga e massa. Infelizmente, a maioria das moléculas de DNA possui a mesma forma e todas têm razões bastante similares entre carga e massa. Portanto, fragmentos de diferentes tamanhos não podem ser separados por procedimentos-padrão de eletroforese.
Entretanto, o tamanho da molécula de DNA passa a ser um fator considerável se a eletroforese for executada em um gel. Um gel, que é via de regra feito de agarose, de acrilamida ou de uma mistura de ambas, constitui uma rede complexa de poros, através da qual as moléculas de DNA devem passar para atingir o eletrodo positivo. Quanto menor for a molécula de DNA, mais rapidamente ela pode migrar pelo gel. Portanto, a eletroforese em gel separa moléculas de DNA de acordo com seus tamanhos (Figura 4.12b). Na prática, a composição do gel determina os tamanhos das moléculas de DNA que podem ser separadas. Um gel de agarose O,SVo com 0,5 cm de espessura, que possui poros relativa-
(a) EletroÍorese-padrão
Tampão
DNA
r,"uo,o,"."
Figura 4.11
f
Execução de uma digestão de restrição em laboratório (ver texto para detalhes).
O DNA migra em direção
com BglII
ao ânodo, mas a separação por classes de tamanho é incipiente
(b) EletroÍorese em gel
Tampão A amostra de DNA é aplicada em uma çanaleta formada no próprio gel
mais difíciÌ. De fato, por murenvolvendo DNA. Tais pro' quando foi desenvolvida a
postos biológicos, são porta nte, quando molécuem direção ao pólo positivo de dois fatores: a sua for-
Figura 4.12 eleúoÍorese-pad rão não sede DNA de tamanilirediÍerentes, enquanto (b) a eletroÍorese em gel o faz.
O DNA separa-se em bandas correspondentes a fragmentos de diferentes tamanhos MenoÍ
-
80
T.A.Bnowru
Auto-ra
mente grandes, pode ser usado para moléculas na faixa de tamanho qntre 1 e 30 kb, permitindo, por exemplo, a clara distinção entre moléculas de 10 e l2kb. No outro extremo da escala, um gel de poliacrilamida 4OVo muito delgado (0,3 mm), com poros extremamente pequenos, pode ser utilizado paÍa separÍÌr moléculas de DNA muito menores, na faixa de 1 a 300 pb, permitindo a distinção de moléculas cujas extensões diferem em apenas um único nucleotídeo.
Uma da
DNA,
A
lizadas i tecção r
Aar
Visualizando moléculas de DNA em um gel
trofores
Coloração
de ser vi
A maneira mais fácil
O DNA
de visualizar os resultados de um experimento de eletroforese em gel é
já a sua coloração com um composto que torne o DNA visível. O brometo de etídeo (EtBr), descrito na página 53 como um meio para a visualização de DNA em gradientes de cloreto de césio (CsCl), é também rotineiramente utilizado na coloração de DNA em géis de agarose e poliacrilamida (Figura 4.13). Bandas mostrando as posições das diferentes classes de tamanho de fragmentos de DNA são claramente visíveis sob irradiação ultravioleta após coloração
Umi
dores dt essa ma
lation)
<
AT:
A
com EtBr, desde que esteja presente DNA suficiente. Infelizmente, esse procedimento é bastante perigoso, pois o brometo de etídeo é um agente mutagênico potente e a radiação ultravioleta utilizada para visualizar o DNA pode causar queimaduras severas. Por essa razão, corantes não-mutagênicos, que coram o DNA de verde ou azul e não requerem irradiação ultravioleta para visualização dos resultados, são agora utilizados em muitos laboratórios.
maior
quando limerase
Canaletas para as amostras
Gel de agarose Suporte plástico
transparente para UV
lncubação em solução de EtBr 0,5 pg/ml por 15 min
Bandas de DNA fluorescentes,
Figura 4.13 Visualização de bandas de DNA em
UV
um gel de agarose por coloração com brometo de etídeo e irradiação ultravioleta (UV).
Figura
da autr
dfrlgtda para vis
tro
Õ
DÌ,lA rne
umlgd de agar
Cr-oruecrv GÊNrcA
eltre 1 e 30 kb, permitinNo outro extremo da escala, extremamente pequenos, na faixa de 1 a 300 pb, perum único nucleotídeo.
de eletroforese em gel é O brometo de etídeo (EtBr), já A em gradientes de cloreto de de DNA em géis de agarose e diferentes classes de tama-
E ANÁLrsE oe
Uma das desvantagens da coloração é o limite da sua sensibilidade. Se menos de l0 ng de DNA, aproximadamente, estão presentes em cada banda, é improvável que elas sejam visualizadas após a coloração. Para pequenas quantidades de DNA, é necessário um método de detecção mais sensível. A auto-radiografia é a resposta paÍa essa demanda. Se o DNA for marcado antes da eletroforese, pela incorporação de um marcador radioativo nas moléculas individuais, ele pode ser visualizado a partir da colocação de um filme fotográfico sensível a raios X sobre o gel. O DNA radioativo expõe o filme, revelando o padrão de bandas (Figura 4.14). Uma molécula de DNA é via de regra marcada pela incorporação de nucleotídeos portadores de um isótopo radioativo do fósforo, o "P lFigura 4.15a). Existem vários métodos para essa marcação, sendo os dois mais populares a translação de quebras (do inglês nicktrans-
lation) e o preenchimento de extremidades. A translação de quebras (nick translation) refere-se
à
atividade da DNA-polimerase I (p. 68).
A maioria das amostras de DNA purificado contém algumas moléculas quebradas, mesmo quando apreparação foi feita da maneira mais cuidadosa possível. Isso significa que a DNA-polimerase I pode ligar-se ao DNA e catalisar a reação de substituição de fita (Figura 4.5b). Tal rea-
lco potente e a radiação ultraseveras. Por essa razáo, conão requerem irradiação ultraem muitos laboratórios.
Placa de vidro Gel de agarose secado em forno
ru
Colocação de um filme sensível a raios X sobre o gel
Exposição por 12 a 1 00 horas, revelação do Íilme
Figura 4.13 Visualização de bandas de DNA em
* :
t
81
Auto-radiografïa de DNA marcado radioativamente
ultravioleta após coloração te, esse procedimento é bas-
um gel de agarose por coloração com brometo de etídeo e irradiação ultravioleta (UV).
DNA
Figura 4.14 da auto-ra-
rügnfia
para visuali-
de DNA marcaem un gel de agarose.
Auto-radiograÍia
82
T.A.Bnowru
ção requer um suprimento de nucleoídeos: se um deles estiver marcado radioativamente, a molécula de DNA também se tornará marcada (Figura 4.15b).
12.7 Estimath
A translação de quebras pode ser utilizadapara marcaÍ qualquer molécula de DNA, mas, sob certas circunstâncias, ela também pode causar a clivagem do DNA. O preenchimento de extremidades é um método mais brando, que raramente provoca a quebra do DNA, mas que, infelizmente, só pode ser utilizado para marcar molóculas que possuem extremidades coesivas. A enzimautilizada é o fragmento de Klenow (p. 68), que "preenche" uma extremidade coesiva sintetizando a fita complementar (Figura 4.15c). Assim como na translação de quebras, se a reação de preenchimento de extremidades for executada na presença de nucleotídeos marcados, o próprio DNA ficará marcado. Tanto a translação de quebras quanto o preenchimento de extremidades viabili zam a marcação do DNA em um grau tal que mesmo quantidades mínimas podem ser detectadas em gel por auto-radiografia. Até 2 ng de DNA por banda podem ser visualizadas sob condições ideais.
A eletrofo
grando mi de tamanh
trição, pol
nados os ü
O métr gração col
D=a_H. na qual D
r
das condiç Em gel
timativa dr fragmento
é executad cadores de nhos varia dos fragmr gestão exp
(a) [0-3'zP]dATP
NH,
t-
)-c-c\* Hi/ ll tÌ-c--nl"t
o- o- o-
I
.-f--f-o"ì-o-?r, -o t.," \l o o/o c'H
/
-
[il1dns
nas
serexecuta
H-C
,,p,^aio(o lt8;i'
,112."8
Mapeame uma mol( Até agora-
K
mentos de na anáIiee
(b) Marcação portranslação de quebras (nicktranstationl
^é'*
*-Pt 4 1 / Quebras
DNA Pot
I
+"p-dArp
(nicks)
-
sições rela quando rrm colTetÍunetr ra .t.l 7).
Umasé meiramentr
marcadas
Figura 4.15 Marcação radioativa: (a) estrutu ra do cr-32P-triÍos-
\"{\4 Extremidade coesiva de
EcoRl
f \
Extremidade marcada
der"er
jg
tame
de dig€rúõr
(c) Marcação por preenchimento de extremidades
Ã--**jrK,r'
trição 195,
Íato de desoxiadenosina 11a-3'ze1oRre;, (b) marcação do DNA por translação de quebras (nick translation), e (c) marcação do DNA por preenchimento de extremidades.
motempo-. [65 x5 gnzir tirlansnte- i
de rcação q
guneetrzir A cory
restrição. sc te resoll"ida
de um nrirrr qinis são- ri
zima não te
Cr-oruaoEu
radioativamente, a mo-
E ANÁLtsE
oe
DNA
83
4.2.7 Estimativa do tamanho de moléculas de DNA A eletroforese em gel separa moléculas de DNA de diferentes tamanhos, com
r molécula de DNA, mas, DNA. O preenchimento de a quebra do DNA, mas que,
as menores migrando maiores distâncias em direção ao eletrodo positivo. Se diversos fragmentos de DNA de tamanhos variados estiverem presentes (o resultado bem-sucedido de umã digestão de restrição, por exemplo), então uma série de bandas apareceráno gel. Como podem ser determinados os tamanhos desses fragmentos? O método mais preciso ltlliza arelação matemática que correlaciona a velocidade de migração com o peso molecular. A fórmula relevante é:
m extremidades coesiuma extremidade
como na translação de quena presença de nucleotí-
viabilizam
GÊucn
D=a-b(logL/t),
marpodem ser detectadas em gel visualizadas sob condições a
naqualDéadistânciapercorrida,Méopesomolecular eaebsãoconstantesquedependem das condições de eletroforese. Em geral, é utilizada uma maneira muito mais simples, embora menos precisa, para a estimativa dos tamanhos de fragmentos de DNA. Uma digestão de restrição-padrão, [ue inclui fragmentos de tamanhos conhecidos, é usualmente incluída em cada eletroforese em gel que é executada. Produtos de restrição de DNA de l, são muitas vezes assim utilizados, como marcadores de tamanho. Por exemplo, HindIII cliva o DNA de À em oito fragmentos, com tama-
nhos variando entre 125 pb, para o menor, e mais de 23 kb, parco maior. Como os tamanhos dos fragmentos nessa reação de digestão são conhecidos, os tamanhos dos fragmentos na digestão experimental podem ser estimados a partir da comparação das posições relativas
'
das bandas nas duas trilhas do gel (Figura 4.16). Embora de precisão limitada, ósse método pode ser executado com apenas 57o de eno, o que é satisfatório na maioria dos casos.
tuLg Mapeamento das posições de diÍerentes sítios de restrição em uma molécula de DNA
Até agora, consideramos como podem ser determinados o número e os tamanhos dos fragmentos de DNA produzidos por clivagem com endonucleases de restrição. A próxima etafa na análise de restrição é a construção de um mapa mostrando, na molécula oe oNR, as po-
Figura 4.15 Marcação radioativa: (a) estrutu ra do cr-32P-trifosfato de desoxiadenosina ([s-3'zP]dATP), (b) marcação do DNA por translação de quebras (nick translation), e (c) marcação do DNA por preenchimento de extremidades.
sições relativas das seqüências de reconhecimento de diversas enzimas diferentes. Somente quando um mapa de restrição está disponível é que as endonucleases de restrição podem ser corretamente selecionadas para uma determinada manipulação de clivagem a executar (Figura 4.17). Uma série de digestões de restrição deve ser executada para a construção de um mapa. primeiramente, o número e o tamanho dos fragmentos produzidos por uma endonuclease de restrição devem ser determinados por eletroforese em gel seguida de comparação com marcadores de tamanho (Figura 4.18). Essa informação deve, então, ser suplementada por uma série de digestões duplas, nas quais o DNA é clivado por duas endonucÈases de restrição ao mesmo tempo. A execução de uma clivagem dupla pode ser possível em uma única etapa, se ambas as enzimas tiverem exigências similares quanto a pH, concentração de Mg*2, eti.Alternativamente, as duas digestões podem ser executadas uma após a outra, ajustando-se a mistura de reação após a primeira digestão para suprir um conjunto diferente de condições para a segunda enzima. A comparação de resultados de digestões simples e duplas permite que muitos sítios de restrição, se não todos, sejam mapeados (Figura 4. l g). As ambigüidades pàdem ser geralmen_ te resolvidas por digestão parcial, executada sob condições que resultam apenas na clivagem de um número limitado de sítios de restrição em qualquer mãlécula de DNA. Digestões larciais são, via de regra, conseguidas pela redução do período de incubação, de moão qu" u zima não tenha tempo suficiente para clivar todos os sítios de restriçat, ou pela incubação"na
84
T.
A. Bnowr.r
(a) Estimativa grosseiÍa por visualização direta
Hiúlll 1"
(b) Estimativa gráÍica precisa
Amostra desconhecida
10 -o !
7,5 ã z
23130ob---941 6 6557
1r-2---
4361
2322 2027
ô õoc z.s P c
_cerca de 5.000 pb _cerca de 3.200 pb
(ú
Fo 012345
F
_cerca de 2.000 pb
3---
Distância migrada (cm) 564
Figura 4.16 Estimativa dos tamanhos de fragmentos de DNA em um gel de agarose. (a) Uma estimativa grosseira do tamanho dos fragmentos pode ser obtida a partir da vÈualização direta. (b) Uma mediçãJmais precisa do tamanho dos fragmentos é conseguida utilizando-se as mobilidades de Íragmentol de À-Hr'ndlll para a construção de uma curva de calibragem; os tamanhos de Íragmentos desconhecidos podem, então, ser determinados a partir das distâncias que migraram.
geneB geneC
.geneD
Mapa {enético Mapa de restrição
legnr
ò
I san
laamHr
À
Para obtenção do gene B, digerir com
o
P''-
Bgíl
g--_e_ írN; \ _í-
Figura 4.17 Para obtenção do gene D, digerir com BamHl + Sa/l
AAB ---*, ffi
f
ì
: F
I
n.---42.,c, ^
,-il.
,s*Z)
t*--'À
Utilização de um mapa de restrição para deÍinir as endonucleases de restrição que devem ser utilizadas para a obtenção de Íragmentos contendo genes individuais.
Figura 4.1 Uapearne e
l(prttta
Cronnceu GÊNtcA
E ANÁLtsE oe
DNA
85
Digestões simples e duplas Tamanhos (kb)
Número de fragmentos
Enzima Xbal
2
xhd
2
Kpnl
Xbal + Xhd
3 3
Xbal + Kpnl
4
24,O;24,5 15,0; 33,5 1 ,5; 17,0; 30,0 9,0; 15,0; 24,5 1,5; 6,0; '17,O;24,0
Gonclusóes:
012345 Distância migrada (cm)
(1) Como o DNA de ì, é linear, o número de sítios de restrição para cada enzima é Xbal 1, Xhol 1 e KPnl 2. (2) Os sítios de Xbal e Xhol podem ser mapeados:
Xbal
Íragmentos de Xbal Íragmentos de Xhd fragmentos de Xhd
Uma estimativa grosseira (b) Uma medição mais prede fragmentos de l,-Hr'ndlll desconhecidos podem,
A única possibilidade é:
,9,0, , 15,0
Xhol
15,0
15,0
,
,
,
,
24,5
,
33,5
,
,
Xbal 24,5
9,0
(3) Todos os sítios de Kpnl estão no Íragmento de 24,5 kb de Xbal, pois o fragmento de 24,0 kb fica intacto após a digestão dupla com
XbalKpnl.A ordem dos fragmentos de Kpnl somente pode ser determinada por digestão parcial. Digestão paÌcial Tamanhos dos Íragmentos (kb)
Enzima Kpnl
-
condições limitantes
1
,5; 17,O; 18,5; 30,0; 31 ,5; 48,5
Conclusões: (1) Fragmento de 48,5 kb = l, não-clivado. (2) Os fragrnentos de 1 ,5; 17,0 e 30,0 kb são produtos de digestão completa' (3) Os fragmentos de 18,5 e 31 ,5 kb são produtos de digestão parcial' Kpnls O mapa de Kpnl deve ser:
30,0
Figura 4.17 Utilização de um mapa de restrição para deÍinir as endonucleases de restrição que devem ser utilizadas para a obtenção de Íragmentos contendo genes individuais.
Xhol Portanto, o mapa completo é: 15,0
1,5
Xbal
9,0 6,0
17,O
Kpnls 1,5 17,0
Figura 4.18 Mapeamento de restrição. Este exemplo mostra como as posições dos sítios de Xbal, Xhol À podem ser determinadas.
e Kpnl na molécula de DNA de
86
T.A. BRowN
uma temperatura baixa (por exemplo , a 4" C em vez de a 37 " C) , o que limita a atividade da en-
zima. O resultado de uma digestão parcial é um padrão complexo de bandas em um gel de eletroforese. Fragmentos adicionais, com diferentes tamanhos, são visualizados juntamente com os fragmentos-padrão, produzidos por digestão total. Os fragmentos adicionais correspondem a moléculas que incluem dois fragmentos de restrição adjacentes, separados por um sítio que não foi clivado. Os seus tamanhos indicam quais fragmentos de restrição da digestão completa estão próximos um ao outro na molécula não-clivada (Figura 4.18).
4.3 Ligação: unindo moléculas de DNA A etapa final na construção de uma molécula de DNA recombinante é a união da molécula do vetor com o DNA a ser clonado (Figura 4.19). Esse processo é chamado de ligação e a enzima que catalisa a reação é denominada de DNAJigase.
t[ação: a etapa
1
moler
4.3.1 O modo de ação da DNA-ligase Todas as células vivas produzem DNA-ligases, mas aenzimautilizada em engenharia genética é geralmente a purificada de bactérias E. coli que foram infectadas com fago T4. Na célu-
la, essa enzima executa uma função muito importante, reparando quaisquer descontinuidades que venham a surgir em uma das fitas de uma molécula de fita dupla (Figura 4.4a). Uma descontinuidade é simplesmente uma posição na qual uma ligação fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes está faltando (note a diferença em relação a uma quebra fnick],naqual um ou mais nucleotídeos estão ausentes). Embora as descontinuidades possam surgir em decorrência de quebras aleatórias de moléculas de DNA celular, elas também surgem como um resultado natural de processos como a replicação e a recombinação do DNA. Portanto, as ligases desempenham funções vitais na célula. Em tubo de ensaio, DNAìigases purificadas, além de repararem descontinuidades de fitas simples, também podem unir moléculas de DNA individuais ou as duas extremidades de uma mesma molécula. A reação química envolvida na ligação de duas moléculas é exatamente a mesma que ocorre na reparação de descontinuidades, exceto pelo fato de que duas ligações fosfodiéster devem ser estabelecidas, uma para cada fita (Figura 4.20a).
4.3.2 Extremidades coesivas aumentam a eficiência da ligação A reação de ligação da Figura 4.20a mostra
a união de dois fragmentos com extremidades cegas. Embora essa reação possa ser executada em tubo de ensaio, ela não é muito eficiente. Isso ocoffe porque a ligase é incapaz de "segurar" a molécula a ser ligada e, por isso, tem que
esperar que as extremidades sejam posicionadas lado a lado por associação casual. Se possível, ligações de extremidades cegas devem ser executadas cory altas concentrações de DNA, a fim de aumentar as chances de encontro correto entre as extremidades das moléculas. Por outro lado, a ligação de extremidades coesivas complementares é muito mais eficiente. Isso ocolre porque extremidades coesivas compatíveis podem parear suas bases entre si por pontes de hidrogênio (Figura 4.20b), formando uma estrutura relativamente estável, sobre a qual a enzima pode atuar. Se as ligações fosfodiéster não forem sintetizadas rapidamente, as extremidades coesivas separam-se de novo. Tais estruturas com bases pareadas, embora transitórias, realmente aumentam a eficiência de ligação, pois estendem o tempo durante o qual as extremidades estão em contato uma com a outra.
Figur reag ffigação catalisadr
ffifrrentes
ffilA-ligase: (a) |
ümrÍárrlasdee ffiescegase
(l
qpode ÍÍìoléGllas
teínitades
cor
Cronncev GÊrurcn e ANÁLtsE oe
DNA
o que limita a atividade da en-
\
+B L
de bandas em um gel de ele-
visualizados juntamente com adicionais correspondem
cene
separados por um sítio que
restrição da digestão comple-
I
Vetor
I
4.18).
é a união da molécula do chamado de ligação e aenzi-
lLil#o:
DNA-lisase
O--""""
Figura 4.19 a etapa final na construção de uma molécula de DNA recombinante.
em engenharia genéticom fago T4. Na céluquaisquer descontinuidades (Figura 4.4a). Uma des-
DNA a ser clonado
Molécula de DNA recombinante
(a) Ligação de extremidades cegas
-.oF{rcrcl-o I
tr -ffi
fosfodiéster entre nucleotí-
re llr
+
}-+€--a-
quebra fnickl,naqual um ou possÍÌm surgir em decorrênsurgem como um resuldo DNA. Portanto, as ligases (b) Ligação de extremidades coesivas
descontinuidades de fiou as duas extremidades de duas moléculas é exatamenpelo fato de que duas liga4.20a).
-o-o-o lllirtt
#
-.@(H
\
da ligação
.+ Descontinuidades
com extremidades ceeta não é rnuito ef,ciente. Isìigada e, por isso, tem que associação casual. Se possíaltas concentrações de DNA" das moléculas. é muito mais eficienparear suas bases entre si por nte estável, sobre a sintetizadas rapidamente, as bases pareadas, embora trano tempo durante o qual
Estrutura transitória mantida por pareamênto de bapes
Figura 4.20 reações de catalisadas pela : (a) ligação de extremiffis cegas e (b) ligaüfDde moléculas de exüemidades coesivas.
\
A DNA-ligase sela as descontinuidades
87
88
T. A. Bnowlr
4.3.3 colocando extremidades coesivas em uma molécula de extremidades cegas Pelas razões detalhadas na seção anterior, extremidades coesivas compatíveis são desejáveis em moléculas de DNA a serem ligadas em um experimento de clonagem gênica. Muitàs ve-
zes, tais extremidades coesivas podem ser obtidas a partir da digestão tanto do vetor quanto do DNA a ser clonado com a mesma endonuclease de restrição, ou com diferentes enzimas que produzem a mesma extremidade coesiva, embora isso nem sempre seja possível. É co-
mum ocoffer, por exemplo, que
a molécula do vetor tenha extremidades coesivas, mas que os fragmentos de DNA a serem clonados tenham extremidades cegas. Nessas circunstânciai, três métodos alternativos podem ser utilizados para colocar as extremidades coesivas corretas nos fragmentos de DNA.
Oligonucleotídeos de ligação O primeiro desses métodos envolve o uso de oligonucleotídeos de ligação (/izfters). Esses oligonucleotídeos são pequenos pedaços de DNA de fita dupla, de seqüência nucleotídica conhecida, que são sintetizados em tubo de ensaio. Um oligonucleotídeo de ligação típico é mostrado na Figura 4.2la.Ele possui extremidades cegas, mas contém um sítio de restrição, para BamHl no exemplo mostrado. A DNA-ligas e é capaz de ligar tais oligonucleotídeos às extremidades de moléculas de DNA maiores, também cegas. Apesar de ser uma ligação de extremidades cegas, é possível executaÍ essa reação em particular de maneira bastante eficiente, pois oligonucleotídeos sintéticos, como os de ligação, são passíveis de produção em grandes quantidades e adicionados à mistura de ligação em uma concentração elevada. Mais de um oligonucleotídeo irá ligar-se a cada extremidade da molécula de DNA, produzindo a estrutura em cadeia mostrada na Figura4.2lb.Mas a digestão com BamHI cliva as cadeias nas seqüências de reconhecimento, produzindo um grande número de oligonucleotídeos clivados e o fragmento de DNA original, agora portador de extremidades coesivas de BamHI. Esse fragmento modifìcado está pronto para ligação em um vetor de clonagem clivado com BamHL
Figura 4
Cligonucleotídeos fuação (linkers) e t rrrilÊ:açãs; (a) a eStn mfípie de um oligo deotídeo de ligaçã {b) a ligação de oli nucleotídeos a u nnnnlécula de extremi des ceg
Adaptadores Há um problema em potencial na utilização de oligonucleotídeos adaptadores. Considere o que iria acontecer se a molécula de extremidades cegas mostrada na Figura 4.21b contivesse uma ou mais seqüências de reconhecimento de BamHI. Se esse fosse o caso, a etapa de restrição necessiíriapara a clivagem dos oligonucleotídeos de ligação e produção das extremidades coesivas também clivaria a molécula de extremidades cegas (Figura 4.22). Osfragmentos resultantes teriam as extremidades coesivas coffetas, mas isso não compensaria o pioblema gerado pela quebra em dois pedaços do gene contido no fragmento de extremidadãs cegas. O segundo método para ligar extremidades coesivas a uma molécula de extremidades cegas foi idealizado para evitar esse problema. Os adaptadores também são oligonucleotídeos sintéticos curtos. Mas, ao contriírio dos oligonucleotídeos de ligaição, eles são sintetizados de maneira a já possuírem uma extremidade coesiva (Figura 4.23a). Obviamente, a idéia é ligar a extremidade cega do adaptador às extremidades cegas do fragmento para aprodução de , uma nova molécula com extremidades coesivas. O método pode parecer simples, mas, na prâtica, ele leva ao surgimento de novos problemas. As exÍemidades coesivas de moléculas individuais do adaptador podem parear suas bases entre si, formando dímeros (Figura 4.23b), o que faz com que a nova molécula de DNA continue tendo extremidades cegas (Figura 4.23c).As extremidades coesivas poderiam ser recriadas pela digestão com uma endonuclease de restrição, mas isso iria eliminar a vantagem primríria da utilização de adaptadores.
lllm possível probl
uuüIzação de oligont
Compare esüa suÌtado desejad Ba'rrïl, como r
@-
Cr-oruneeu GÊNrcA E ANÁusE oe
(a)
Um oligonucleotídeo de ligação
DNA
típico
c-G -A- T-G-G-A-T- C- C-A-T- C-G
tlttrlllllttlr
compatíveis são desej áveis de clonagem gênica. Muitas vedigestão tanto do vetor quanto ou com diferentes enzimas nem sempre seja possível. É co'
G-C-r- A€--c
{;
A-G -G
{-A-G-c
Sítio de BamHl
(b) A utilização de oligonucleotídeos de ligação Molécula de
coeslvas, mas que os Nessas circunstâncias, três coesivas corretas nos
êê
extremidades cegas
a9"
êê ê
n/
Oligonucleotídeos de ligação
DNA-ligase
de Iigação (finfters). Esses de seqüência nucleotídica code ligação típico é mas contém um sítio de restrição,
de ligar tais oligonucleotídeos às Apesar de ser uma ligação de exde maneira bastante eficiente, passíveis de produção em grandes
damolécula de DNA, produadigestão comBamHI cliva as canúmero de oligonucleoÍdeos extremidades coesivas de BamHL vetor de clonagem clivado com
Figura 4.21
/ "'^r, BamHl
de
(Ínkers) e sua (a) a estrutude um oligonude ligação e fgação de oligo-
/
t*t.
ia^de coesivade BamHl
- ì-ï'ú1\ OligonucleotÍdeos de ligação clivados
de extremidades cegas.
adaptadores. Considere o na Figura 4.21b contivesse esse fosse o caso, a etapa de resrie
produção das extremidades
(Figwa4.22). Os fragmentos renão compensaria o problema gede extremidades cegas. uma molécula de extremidades cetambém são oligonucleotídeos de ligação, eles são sintetizados de 4-23a). Obviamente, aidéia é ligara fragmento, para a produção de uma parecer simples, mas, na práticq coesivas de moléculas individuais dímeros (Figura 4.23b), o que faz idades cegas (Figura 4.23c). As excom uma endonuclease de restrição,
BamHl
--ttt--
Figura4.22 possível problema decorrente da de oligonucleotídeos de ligaGompare esta situação com o regüado desejado da restrição com Berrifll, como mostrado na Figura 4.21b.
-E-
-í-
-Éat--
-í- -í-
-Ê-
Clivagens devidas a sítios de EamHl internos
--E-
89
90
T. A. Bnowlr
(a) Um adaptador típico
G_A-T-C_C-C_G-G
ttlt c-c_c_c
Extremidade coesiva de Bam9l
(b) Adaptadores podem ligar-se uns aos outros
-
-A-T-C-C-C-c-G lttt
G-G-C-C-C-T-A-
Figura 4.23
G-G-C-C
(c) A nova molécula de DNA ainda possui extremidades cegas
E_ \_
6_-í
Adaptadores
oj
\
DNA-risase
Os adaptadores ligam-se uns aos outros
Os adaptadores e o problema potencial decorrente de seu uso. (a) Adaptador típico. (b) Dois adaptadores podem ligar-se um ao outro para produzir uma molécula similar a um oligonucleotídeo de ligação, de modo que (c) após a ligação de adaptadores a moléculas de extremidades cegas, elas ainda apresentam esse tipo de extremidade, necessitando, portanto, de uma etapa de restrição.
A resposta para esse problema está na estrutura química precisa das extremidades da molécula adaptadora. Normalmente, as duas extremidades de uma fita polinucleotídica são quimicamente distintas, um fato que se torna claro a partir do exame da estrutura polimérica do DNA (Figura 4.24a). Uma das extremidades, chamada"uidudoro de 5'-terminal, é portaãora de um grupo fosfato (5'-P); a outra, a 3'-terminal, possui um grupo hidroxila (:'-ou). Na hélice dupla, as duas fitas são antiparalelas (Figura4.24b), de modo que cada extremidade de uma molécula de fita dupla consiste em um terminal 5'-P e um terminal 3'-OH. A ligação normalmente acontece entre as extremidades 5'-p e 3'-OH (Figura 4.24c). As moléculas adaptadoras são sintetizadas de modo que a extremidade cega é a mesma de um DNA "natural", mas a extremidade coesiva é diferente. O terminal 3'-OH da extremidade coesiva é o usual, mas o terminal 5'-P é modificado; ele não possui o grupo fosfato, sendo, na verdade, um terminal 5'-oH (Figura 4.25a).4 DNA-ligase é incapaid" fo.-u. uma ligação fosfodiéster entre extremidades 5'-oH e 3'-oH. o resultado disso é que, embora ,errp.. ocoffa o pareamento de bases entre as extremidades coesivas de moléculas adaptadoras, eisa
associação nunca é estabilizada por ligação (Figura 4.25b). os adaptadores podem, portanto, ser ligados a uma molécula de DNA, mas não uns aos outros. Depois da ligação dos adaptadores, os terminais 5'-OH anormais são convertidos à
forma 5'-P natural por tratamento com a enzimapolinucleotídeo-quinase (p. 70), originando um fragmento de extremidade coesiva que pode ser inserido em um vetor adequado.
Í i
Ftgura
mücürçao enfe c 5e 3'de um nudeoti
Produçã cauda h( Atécnicad
dagem radi
DÌrIA de er as subunid:
Daé 'rn ex
Cloruncev GÊrurcn e AruÁuse oe
o-
mostrando a distinção química entre os terminais 5'-P e 3'-OH
O-P:O
Figura 4.23 Os adaptadores e o problema potencial decorrente de seu uso. (a) Adaptador tÊ pico. (b) Dois adaptadores podem ligar-se um ao outro para produzir uma molécula similar a um oligonucleotídeo de ligação, de modo que (c) após a ligação de adaptadores a moléculas de extremidades cegas, elas ainda apresentam esse tipo de extremidade, necessitando, portanto, de uma etapa de restri-
o
o
o
-o-eço o
(b) Na hélice dupla, as Íitas polinucleotídicas são antiparalelas
s',
ertremidade cega é a mesma de terminal 3'-OH da extremidade possui o grupo fosfato, sendo, na é incapaz de formar uma ligação disso é que, embora semprc de moléculas adaptadoras, essa
de DNA, mas não uns aos {H anormais são convertidos à inase (p. 70), originando em um vetor adequado.
çì
Base
OH 3',
3'
"D K 3',
s',
(c) A ligação acontece entre teÌminais 5'-P e 3'-OH E. r....@e
D'
3'-ôôôo-o-o-o-o- 5'
de S'-terminal, é portado-
a
t"". ",
"'ma fita polinucleotídica são qui€trame cuidadoso da estrutura po-
4.24c).
\ cF.o__._ïa."
V
precisa das extremidades da mo-
terminal 3'-OH. A ligação nor-
\
-O-P:O
ção.
um grupo hidroxila (3'-OH). Na modo que cada extremidade de
91
(a) A estrutura de uma Íita polinucleotídica
?,
Um nucleotídeo
DNA
I
Figura4.24 entre os ter5'e 3'de um polinucleotídeo.
5'
I
-@o-r@ tttttr
^,{rcrCrGr:n}r}:f,iJC
3' o.-tH_ -,
Produção de extremidades coesivas por síntese de cauda homopolimérica A técnica de síntese de cauda homopolimérica (homopolymer tailing) representa uma abordagem radicalmente diferente para a produção de extremidades coesivas em uma molécula de
DNA de extremidades cegas. Um homopolímero é simplesmente um polímero no qual todas as subunidades são iguais. Uma fita de DNA feita inteiramente de, digamos, desoxiguanosina é um exemplo de homopolímero, que é chamado de polidesoxiguanosina ou poli(dG).
vel o sut rimento r combina que com
(a) A estÍutura precisa de um adaptadoÌ
to-o-o-r-c-c-c-c ,/ terminá
-oto'
-é-ò-ò-ò-Poá Ho-
-OH modificado
Figura 4.25 O uso de adaptadores: (a) A estrutura real de um adaptador, mostrando o terminal 5'-OH modiÍicado. (b) Conversão das extremidades cegas em coesivas pela ligação de adaptadores.
A síntese de uma cauda envolve a enzima desoxinucleotidil-transferase terminal (p. 70), que adiciona uma série de nucleotídeos às extremidades 3'-OH de uma molécula de DNA de fita dupla. Se essa reação é executada na presença de apenas um desoxirribonucleotídeo, é produzida uma cauda homopolimérica (Figura 4.26a). É óbvio que, para ser possível a ligação de duas moléculas adicionadas de cauda, os homopolímeros devem ser complementares. Freqüentemente, caudas de polidesoxicitosina (politdcl) são ligadas ao vetor e de poli(dG) são ligadas ao DNA a ser clonado. Quando as moléculas de DNA são misturadas, ocoÍïe o pareamento de bases entre as duas caudas (Figura 4.26b). Na prática, as caudas de poli(dG) e poli(dC) em geral não são exatamente do mesmo tamanho, além de as moléculas recombinantes com bases pareadas resultantes apresentarem quebras e descontinuidades (Figura 4.26c). A reparação dessas moléculas é, portanto, um processo de duas etapas, que utiliza a polimerase de Klenow para preenchimento das quebras, seguida da ação da DNAJigase, para a síntese das ligações fosfodiéster faltantes. Nem sempre é necessário que a reação de reparação seja executada em tubo de ensaio. Se as caudas homopoliméricas complementares forem mais longas do que 20 nucleotídeos, são formadas associações por pareamento de bases bastante estáveis. Uma molécula de DNA recombinante mantida unida por pareamento de base, mas não completamente ligada, é muitas vezes está-
Figura, gi[nlese de caude mmpolimérica (âc
wmertailind,
úÈse
de uma cz llrunopolimérica
onsfução de mdéorla de DNI
mmtÉnnte a part um wtor e de ul
Gbde
DNA, an
dhirnados de ca e {c) reparaçã
mrmmlárlade DN
ourtÍnante. dC
5'-lribsfato de 2 soxicitÍ
Cr-ounoeu GÊNrcA
E ANÁLrsE
oe
DNA
93
vel o suficientepara ser introduzida em uma célula hospedeira, no estágio seguinte do experimento de clonagem (Figura 1.1). Uma vez no interior da hospedeira, a molécula de DNA recombinante poderá ser reparada pela DNA-polimerase e pela DNA-ligase da própria çélula, que completarão a construção iniciada em tubo de ensaio.
(b) Ligação de caudas homopoliméricas Figura 4.25 O uso de adaptadores: (a) A estrutura real de um adaptador, mostrando o
G G
G G
terminal 5'-OH modiÍicado. (b) Conversão das extremidades cegas em coesF vas pela ligação de adaptadores.
-c^ -c:c^ Vetor
-
ï\----.
caudas de poli(dC)
G
lnserto dê DNA
-
)
caudas de poli(dG)
-C6
clc
terminal (p.70), uma molécula de DNA de desoxirribonucleotídeo, é
Molécula de DNA recombinante
Figura 4.26
(c) As etapas de reparação
0uebra
de cauda hoionadas de cauda, os hode polidesoxicitosina (poser clonado. Quando as moas duas caudas (Figura exatamente do mesmo taresultantes apresentarem las é, portanto, um pre das quebras, sefaltantes. Nem sempru ensaio. Se as caudas homoÍdeos, são formadas de DNA
ligada, é muitas vezes está
ilmpdimérica (homa
pfuner
tailing): (a) de uma cauda
lliunopolimérica, (b)
--'---r----r-----T--f-G-G-G-G /
./" Descontinuidade
Ë;-ë-ë-c-c-c "
r---r l-rT-----
II
ustrução de uma rrËqrla de DNA rea partir de
A polimerase de Klenow repara a quebra
umìretor e de um inde DNA, ambos de cauda, e (c) reparação da tmÉrlade DNA reunrnôinante. dCTP = üi.üilosfato de 2'-desoxicitidina.
r-r--r-r--rG-G -G-G -G -G-G rrrrrf_c_c_c_c_c_c
\"""""
Aìgase repaÍa as descontinuidades
94
T.
A. Bnowr.r
Leituras adicionais Brown, T.A. (1998) Molecular Biology Labfar. Volume I: Recombinant DNA, 2nd edn. Academic press, London. [Contém detalhes a respeito de todos os tipos de enzimas utilizadas na manipulação de DNA e RNA.] Jacobsen, H., Klenow, H. & Overgaard-Hansen, K. (1974) The N-terminal amino acid sequences of DNA polymeraselfromEscherichiacoliandofthelargeandsmallfragmentsobtainedbyalimitedproteolysis. EuropeanJournal of Biochemistry, 45, 623-7 . [Produção do fragmento de Klenow da DNA-polimerase I.] Lobban, P. & Kaiser, A.D . (1973) Enzymatic end-to-end joining of DNA molecules. Joumal of Molecular Biology., 79, 453-71. [Ligação.]
McDonell, M.W., Simon, M.N. & Studier, F.W. (1977) Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. Journal of Molecular Biotogy, Il0, 1
19-46. [Um exemplo inicial do uso da eletroforese em gel de agarose na análise dos tamanhos de fragmentos
de restrição.l
REBASE: wwwneb.com/rebase/rebase.html [Uma listagem abrangente de todas
as endonucleases de restrição conhecidas e dos respectivos sítios de reconhecimento.] Roústeìn, R.J., Lau, L.F., Bahl, C.P., Narang, N.A. & Wu, R. (1979) Synthetic adaptors for cloning DNA. Methods
in Enzymology, 68, 98-109. Smith' H.O. & Wilcox, K.W. (1970) A restriction enzyme from Haemophilus influenTae. Journal of Molecular Bioptg;. 51, 379-91. [uma das primeiras descrições completas de uma endonuclease de restrição.]
i
t\s cu} tro(
pan nÍì5
con
der
mitt rre{
süEl
c,op
pôÍr zes
DN.
mili €tap
bink
i nig,
$ar c
hém
DTLJ
CnpÍrulo 5 ;2nd edn. Academic press, London. ipulação de DNA
e
RNA.I
n
acid sequences of DNA polymerar limited proteolysis. European Jour-
lntrodução de DNA em Células Vivas
[-polimerase I.] ales. Journal of Molecular Biotogy, iagments
olTT DNA
and determina-
Iournal of Molecular Biology,
Talir"
ll0,
do, tamanhos de fragmentos
hs as endonucleases de restrição co-
{upto., for
v4te
clo.ning DNA. Methods
Joumal of Molecular Biology,
;de restrição.]
Transformação: a incorporação de DNA por células Identificação de recombinantes,
Introdução de DNA de fagos em células bacterianas, 105
bacterianas, 98
l0l
Identificação de fagos recombinantes, I 09 Transformação de células não-bacterianas, I
l0
As manipulações descritas no Capítulo 4 permitem que o biólogo molecular crie novas moléculas de DNA recombinante. A etapa seguinte em um experimento de clonagem gênica é a introdução dessas moléculas em células vivas, geralmente bactérias, que então multiplicam-se para produzir clones (Figura 1.1). Estritamente falando, a palavra "clonagem" refere-se apenas aos estágios finais do processo e não propriamente à construção da molécula de DNA recombinante. A clonagem serve a dois propósitos principais. Primeiramente, ela permite que um grande número de moléculas de DNA recombinante seja produzido a partir de uma quantidade limitada de material de partida. No início, podem estar disponíveis apenas uns poucos nanogramas de DNA recombinante, mas cada bactéria que incorpora um plasmídeo divide-se subseqüentemente várias vezes para produzir uma colônia, na qual cada célula contém múltiplas cópias da molécula. Viírios microgramas de DNA recombinante podem, via de regra, ser preparados a paÍir de uma única colônia bacteriana, o que representa um aumento de 1.000 vezes sobre a quantidade inicial (Figura 5.1). Se a colônia é uirllizada não como uma fonte de DNA, mas como um inóculo para uma cultura líquida, as células resultantes podem fornecer miligramas de DNA, um aumento de um milhão de vezes no rendimento. Dessa maneira, a etapa de clonagem é capaz de suprir as grandes quantidades de DNA necessárias para estudos biológico-moleculares da estrutura e da expressão gênicas (Capítulos 10 e 11). A segunda função importante da clonagem pode ser descrita como de purificação. As manipulações que resultam em uma molécula de DNA recombinante apenas raramente podem ser controladas ao ponto de não permitirem que qualquer outra molécula de DNA esteja também presente no final do processo. A mistura de ligação pode conter, além da molécula de DNA recombinante, uma quantidade variável dos seguintes componentes (Figura 5.2a):
96
T.A.Bnown
oo
oOO
o-ôo_o
ooE
Uma única célula contendo múltiplas ópias de uma molécula de DNA recombinante
Permite a obtenção de várias pg de DNA
recombinante
lnoculação em 500 ml de meio líquido, incubação
por
1
I
horas
Permite a obtenção de
._.2
várias mg de DNA
Figura 5.1
recombinante
A clonagem é capazde gerar grandes quantidades de DNA recombinante.
(1) (2) (3)
Moléculas de vetor que não foram ligadas. Fragmentos de DNA que não foram ligados. Moléculas do vetor que foram recircularizadas sem a inserção de qualquer DNA (vetor
(4)
Moléculas de DNA recombinante portadoras de fragmentos de DNA inseridos incor-
"autoligado"). retamente.
Moléculas não-ligadas raramente causam algum problema, pois, mesmo que sejam incorporadas por células bacterianas, somente sob circunstâncias excepcionais serão replicadas. É muito mais provável que esses pedaços de DNA sejam degradados por enzimas da bactéria hospedeira. Por outro lado, moléculas de vetor autoligadas e Blasmídeos recombinantes incorretos são replicados de maneira tão eficiente quanto a molécula desejada (Figura 5.2b). Mesmo assim, a purificação da molécula desejada ainda pode ser conseguida por meio da clonagem, pois é extremamente incomum que qualquer célula incorpore mais de uma molécula de DNA. Cada célula dá origem a uma única colônia, de modo que cada um dos clones resultantes consiste em células que contêm a mesma molécula. É claro que colônias diferentes contêm moléculas diferentes: algumas guardam a molécula de DNA recombinante desejada, outras possuem diferentes moléculas recombinantes e outras, ainda, contêm o vetor autoligado. O problema passa a ser, portanto, a identificação das colônias com plasmídeos recombinantes corretos.
Figura
5
A clonaç diÍerents
Cr-orunceu GÊNrcA
E ANÁLrsE DE
DNA
97
(a) Os produtos da ligação
,
Fragmentos de
\ T*o u
í\_-/ /--\ ti \_-_. \_-,
Moléculas de vetor
não-lisados
autoligadas
L Vo""" ,--Gene
Moléculas de vetor
A molécula de DNA
i,r-.-rhÀ^
li::ïï',ï'"Í'"""-^ "incorretas"
recombinante desejada
aìo \í-ì \----i
(b) Todas as moléculas circulares serão clonadas
Figura 5.1 A clonagem é capaz de gerar grandes quantidades de DNA recombinante.
Célula contendo o vetor autoligado
Célula contendo uma molécula de DNA recombinante "inconeta"
Célula contendo a molécula desejada
de qualquer DNA (vetor
de DNA
I I
I pois, mesmo que sejam incorionais serão replicadas. É por enzimas da bactéria recombinantes incordesejada (Figura 5.2b). Mesconseguida por meio da clonamais de uma molécula de cada um dos clones resultanque colônias diferentes conrecombinante desejada, ou, contêm o vetor autoligado. plasmídeos recombinantes
/ Clone do vetor autoligado
\ O clone desejado
\ Clone de uma molécula "incorreta"
Figura 5.2 A clonagem é análoga a um processo de purificação. A partir de uma mistura de moléculas diferentes, podem ser obtidos clones contendo cópias de apenas uma molécula.
98
T.A. Bnowru
Este capítulo trata da maneira pela qual vetores plasmidiais e virais e moléculas recombinantes deles derivadas são introduzidos em células bacterianas. Ao longo do capítulo, ficaní evidente que a seleção de colônias contendo moléculas recombinantes em meio a colônias com o vetor autoligado é relativamente simples. O mais difícil é a distinção entre clones com a molécula de
DNA recombinante correta
e todos os demais clones recombinantes, que será
tratada no Capítulo 8.
Itl2
Prepara Assim co fuadamen do foi obs lada capu
mM de clr
5.1 TrasÍormação: a incorporação de DNA por células bacterianas A maioria das espécies de bactéria é capaz de incorporar moléculas de DNA a partir do meio no qual elas se multiplicam. Muitas vezes, uma molécula de DNA incorporada dessa maneira é degradada, mas, ocasionalmenÍe, ela é capaz de sobreviver e replicar-se na célula hospedeira. Isso acontece sobretudo se a molécula de DNA for um plasmídeo com uma origem de replicação reconhecida pelo hospedeiro. A incorporação e a manutenção estável de um plasmídeo é em geral detectada a partir da análise da expressão de genes nele contidos (p. 25).Por exemplo, células de E. coti'são normalmente sensíveis aos efeitos inibitórios da multiplicação proporcionados pelos antibióticos ampicilina e tetraciclina. Entretanto, células que contêm o plasmídeo pBR322 (p. 116-l l7)" um dos primeiros vetores de clonagem a serem desenvolvidos, ainda na década de 1970, são resistentes a tais antibióticos. Isso ocorrb porque pBR322 é portador de alguns genes especí ficos: um gene que codifica uma p-lactamase, enzima que modifica a ampicilina para forma não-tóxica para abacténa, e um conjunto de genes que codificam enzimas que xificam a tetraciclina. A entrada de pBR322 nas células de E. coli pode ser detectada as bactérias são transformadas de sensíveis à ampicilina e à tetraciclina(amp'tet') em resi tes a esses antibióticos (ampotet*). Em anos mais recentes, o termo transformação foi estendido e passou a incluir a incrporação de qualquer molécula de DNA por qualquer tipo de célula, independentemente de eri sa incorporação resultar ou não em uma alteração detectável na célula e não importando se t célula envolvida é de uma bactéria, de um fungo, de um animal ou de um vegetal.
cloreto de
Ainda
deterrnina responsáv ja qual for
corporaçã exterior ú efetiva mc breve elev que térmi(
Seleção
r
A transfor
cuidadosar Possa gera
de todas as
pe+rcnatr
te. Esse últ
5.1.1 Nem todas as espécies de bactéria incorporam DNA com a mesma eficiência Na natureza, a transformação provavelmente não é um processo importante para a de material genético por paÍte das bactérias. Um reflexo disso é que, em laboratório, somerF. te algumas poucas espécies (especialmente membros dos gêneros Bacillus e podem ser transformadas com facilidade. Um estudo cuidadoso desses organismos que eles possuem mecanismos sofisticados para ligação do DNA às células e para a ì ração do mesmo.
A maioria das espécies de bactéria, inclusive E. coli, incorpora apenas quantidades li tadas de DNA sob circunstâncias normais. Para transformar tais espécies eficientemente, bactérias devem passar por alguma forma de tratamento fisico e/ou químico que aumente suas capacidades de captação de DNA. Células submetidas a esse tratamento são ditas petentes. Figura
5Í
aoDNAei
pot
bacterian€
competente
Croruncev GÊNrcA
e virais e moléculas recombiAo longo do capítulo, ficará em meio a colônias
sl.2
recombinantes, que será
Preparação de células de E. colicompetentes
A transformação
de células competentes é um processo ineficiente, mesmo quando elas são cuidadosamente preparadas. Embora 1 ng do vetor plasmidial chamado puC8 (p. I I 8- I 19) possa gerar de I .000 a I 0.000 transformantes, isso representa a incorporação de apenas 0,0 I 7o de todas as moléculas disponíveis. Ademais, 10.000 transformantes representam apenas uma pequena proporção do número total de células que estão presentes em uma cultura competente. Esse último fato implica a necessidade de encontrar alguma maneira para distinguir-se en-
ificam enzimas que desto-
@e
ser detectada porque (amp' tet') em resisten-
incluir
99
6.1.3 Seleção de células transÍormadas
na década de 1970, são de alguns genes especía ampicilina para uma
e passou a
DNA
cloreto de rubídio, também sejam eficientes. Ainda não se sabe exatamente por que esse tratamento funciona. Possivelmente, o CaCl, determina a precipitação do DNA sobre a superfície externa das células ou, talvez, o sal seja responsável por algum tipo de alteração na parede celular que favoreça a ligação ao DNA. Seja qual for o caso, a incubação em CaCl, afeta apenas a ligação ao DNA e não a sua efetiva incorporação pela célula. Quando DNA é adicionado a células tratadas, perÍnanece ligado ao exterior das mesmas, não sendo transportado para o citoplasma nesse estágio (Figura 5.3). A efetiva movimentação do DNA para o interior das células competentes é estimulada por uma breve elevação da temperatura para 42'C. Mais uma vez, o porquê da efetividade desse choque térmico perïnanece desconhecido
de DNA a partir do meio incorporada dessa maneireplicar-se na célula hospecom uma origem de
mla
oe
Assim como muitos dos avanços na tecnologia de DNA recombinante, o desenvolvimento fundamental em relação à transformação também ocorreu no início da década de 1970, quando foi observado que células de E. coli que haviam sido incubadas em uma solução de sal gelada captavam DNA de forma mais eficiente do que células não-tratadas. Uma solução de 50 mM de cloreto de cálcio (CaClr) é usada tradicionalmente, embora outros sais, em especial o
o distinção entre clones com
leral detectada a partir da cÉlulas de E. coli são norionados pelos antibióticos ídeo pBR322 (p. 116-117),
E ANÁLtsE
a incor-
independentemente de ese não importando se a Plasmídeo ligado ao exterior da célula
DNA
Bactéria normal
mportante para a obtenção . em laboratório, somenBacillus e Streptococcus) ,lesses organismos revelou ìrs células e para a incorpoapenas quantidades limies@ies eficientemente, as
Célula competente
Plasm ídeo transportado para o interior da célula
químico que aumente as tratamento são ditas comFigura 5.3 Aligação ao DNA e a
ua
incorporação por
uuna célula bacteriana
competente.
Célula transÍormada
100
T. A. Bnowlr
tre uma célula que incorporou um plasmídeo dos muitos milhares de células que não foram
as
transformadas.
resistênc
A resposta para o problema é aúilização de um marcador de seleção presente no plasmídeo. Um marcador de seleção é simplesmente um gene que confere uma nova característica à célula transformada, que não ocorre em uma bactéria não-transformada. Um bom exemplo de marcador de seleção é o gene de resistência à ampicilina de pBR322. Após um experimento de transformação com pBR322, somente aquelas células que incorporaÍam o plasmídeo são o*p*t"f e capazes de formar colônias em um meio de ágar que contém ampicilina ou tetraciclina (Figura 5.4); não-transformantes, que ainda sáo ampstets, não produzem colônias no meio seletivo. Células transformantes e não-transformantes são, portanto, facilmente distinguidas umas das outras. A maioria dos vetores de clonagem carrega pelo menos um gene que confere resistência a antibiótico às células hospedeiras, com a seleção de transformantes sendo feita por plaqueamento em meio de ágar que contém o antibiótico relevante. Tenha em mente, contudo, que a resistência ao antibiótico não é devida meramente à presença do plasmídeo nas células transformadas. O gene de resistência no plasmídeo também deve ser expressado para sintetização da enzima que destoxifica o antibiótico. A expressão do gene de resistência começa imediatamente após a transformação, mas leva alguns minutos até que a célula contenha uma quantidade de enzima suficiente para ser capaz de suportar os efeitos tóxicos do antibiótico. Por essa razão, as bactérias transformadas não devem ser plaqueadas em meio seletivo imediatamente após o tratamento por choque térmico. Em primeiro lugar, elas devem ser colocadas em um pequeno volume de meio líquido, na ausência de antibiótico, e incubadas por um cuÍo peíodo. A replicação plasmidial e a expressão podem então ser iniciadas, de modo que, quando
cólula
W ldentifir O plaqut
formant(
tas por cr
tor autol to de DÌr
combin:
inativadr da inatir
pBR322
t21
Seleção
deumg
O pBR3l
tura do r exemplo sistência
adiciona
tetracicl
DNA ins ampicilir
Célula de
Célula de E. coli normal (sem plasmídeos)
Não sobrevive
E. coli
contendo plasmídeos pBR322
Sobrevive e produz uma colônia
Fi,
Epessao Íenotípi
AgaÍ contendo 40 pg/ml de ampicilina, 15 pg/ml de tetraciclina ou uma combinação de ambas
Figura 5.4 Seleção de células que contêm plasmídeos pBR322 por plaqueamento em meio de ágar contendo ampicilina e/ou tetraciclina.
37"C mnailes do plaqu ieürÌmrrta a taxa de
ihrmuôaçao a
1
uÉÍrcia das transfu ümntndoseletirrc, p MÉrias tiveram te nnffiara síntese c mms de resistêrrci
Clorurceu GÊrurcn e AruÁlrse oe DNA de células que não foram
101
as células forem plaqueadas e encontrarem o antibiótico, elas já terão sintetizado enzimas de resistência suficientes para poder sobreviver (Figura 5.5).
seleção presente no plasmí-
uma nova característica à Um bom exemplo de 22. Após um experimento orporaram o plasmídeo são contém ampicilina ou tetraci. não produzem colônias no
portanto, facilmente distinEene que confere resistência a
tes sendo feita por plaquea-
em mente, contudo, que a plasmídeo nas células transerpressado para sintetização resistência começa imediaa célula contenha uma quantóxicos do antibiótico. Por em meio seletivo imediataelas devem ser colocadas em e incubadas por um curto peiadas, de modo que, quando
ü.2 Identificação de recombinantes O plaqueamento em um meio seletivo permite a distinção entre transformantes e não-transformantes. O problema seguinte é determinar quais das colônias transformantes são compostas por células que contêm moléculas de DNA recombinante e quais contêm moléculas de vetor autoligadas (Figura 5.2). Na maioria dos vetores de clonagem, a inserção de um fragmento de DNA no plasmídeo destrói a integridade de um dos genes presentes na molécula. Os recombinantes podem, portanto, ser identificados porque a caracteística codificada pelo gene inativado não é mais apresentada pelas células hospedeiras (Figura 5.6). Os princípios gerais da inativação por inserção são ilustrados por um experimento de clonagem típico usando pBR322 como vetor.
1 Seleção de recombinantes com pBR322: inativação por inserção de um gene de resistência a antibiótico O pBR322 possui vários sítios de restrição únicos, os quais podem ser utilizados para a abertura do vetor antes da inserção de um novo fragmento de DNA (Figura 5.7a). BamHI, por exemplo, cliva pBR322 em apenas uma posição, no agrupamento de genes que codifica a resistência à tetraciclina. Uma molécula de pBR322 recombinante, que carÍega um segmento adicional de DNA no sítio de BamHI (Figura 5.7b), não é mais capaz de conferir resistência à tetraciclina para a célula hospedeira, pois um dos genes necessários foi interrompido pelo DNA inserido. Células com essa molécula de pBR322 recombinante ainda são resistentes à ampicilina, mas são sensíveis à tetraciclina çampRtef).
Proteína de resistência a antibiótico Plasmídeo
lmediatamente após a transÍormação
Figura 5.4 Seleção de células que contêm plasmídeos pBR322 por plaqueamento em meio de ágar contendo ampicilina e/ou tetraciclina.
Figura 5.S Eryressão Íenotípica. U ma hnòação a37'C por t hom antes do plaqueamento
rflrrÌenta a taxa de sobrevir€ncia das transformantes um rneio seletivo, porque as lMérias tiveram tempo pamhiciar a sÍntese das enzimas de resistência a antibiótico.
Após incubação a 37"C por t hora
1O2
T.A.Bnowru
(a) Molécula de vetoÌ normal
--_____-------à
Produto do gene
Gene-alvo para inativação por inserção
(b) Molécula de vetor recombinante Figura 5.6 lnativação por inserção. (a)
A molécula de vetor não-recombinante normal é porta-
______________-,
Gene-alvo interrompido
Sem o produto do gene
dora de um gene cujo produto conÍere uma característica selecionável ou identificável à célula hospedeira. (b) Esse gene é inativado quando novo DNA é inserido no vetor; em conseqüência disso, o hospedeiro recombinante não apresenta a característica relevante.
Oretor de clonagem
llhÍa
normal do vetor
lh recombinante cont€
adicional de DNA i Para um rna de pBR3
fufiI\.
tÍ;,n
2 A inativaçi resistêncii
A seleção de recombinantes de pBR322 é executada da seguinte maneira. Após a transformação; as células são plaqueadas em meio com ampicilina e incubadas até que apareçam âs colônias (Figura 5.8a). Todas essas colônias são transformantes (lembre-se de que células não-transformadas são a^pt e não produzem colônia no meio seletivo), mas somente umas poucas contêm moléculas de pBR322 recombinantes: a maioria tem o plasmídeo normal, autoligado. Para identificação dos recombinantes, as colônias são plaqueadas em réplica em meio de ágar que contém tetraciclina (Figura 5.8b). Após a incubação, algumas das colônias originais desenvolvem-se novamente, enquanto outras, não (Figgra 5.8c). Aquelas que se desenvolvem consistem em células portadoras do pBR322 normal, sem inserção de DNA, e, portanto, de um agrupamento funcional de genes de resistência à tetraciclina (amp*tet*;. As colônias que não se desenvolvem em ágar com tetraciclina são recombinante s (amp*tets); como a posição delas nas placas é conhecida, é possível a recuperação de amostras para estudos adicionais a partir da placa original de ágar com ampicilina.
A inativação
veniente par plasmidiais u tador do gen enzima p-gal
lacZ, coma dase (Figura
A p-galar
mais galactor mo de E. coli um segmento sidase (Figur abrigam um I Um exper com ampicilir lactosidase. C
Croruncev GÊNtcA
E ANÁLtsE
oe
DNA lGl
(a) A molécula normal do vetor Gene de resistência à ampicilina Agrupamento de genes de resistência à tetraciclina
ampRte4 (b) Uma molécula de pBR322 recombinante
,
Novo DNA inserido no sítio de BarnHl
Figura 5.6 lnativação por inserção. (a) A molécula de vetor não-recombinante normal é portadora de um gene cujo produto conÍere uma característica selecionável ou identificável à célula hospedeira. (b) Esse gene é inativado quando novo DNA é inserido no vetor; em conseqüência disso, o hospedeiro recombinante não apresenta a característica relevante.
Figura 5.7 O vetor de clonagem pBR322: (a) a moScr.rla normal do vetor e (b) uma molécuür recombinante contêndo um segmento adicional de DNA inserido no sítio de BarrlÍ{l. Para um mapa mais detalhado de pBR322, ver Figura 6.1.
ampqteF
W22 A inativação por inserção nem sempre envolve resistência a antibiótico inte maneira. Após a transforincubadas até que apareçam as (lembre-se de que células io seletivo.y. mas somente umas ia tem o plasmídeo normal, ausao plaqueadas em réplica em bação, algumas das colônias 5.8c). Aquelas que se desem inserção de DNA, e, a à tetraciclina (amp*tef;. As
recombinante s Tamp* t ett 7 ; code amostras para estudos
A inativação por inserção de uma resistência a antibiótico constitui-se em uma maneira conveniente para a identificação de recombinantes. Apesar disso, vários vetores de clonagem plasmidiais utilizam um sistema diferente. Um dos exemplos é pUCS (Figura 5.9a), que é portador do gene de resistência à ampicilina e de um gene chamado lacZ' , que codihca parte da enzima B-galactosidase. A clonagem com pUC8 envolve a inativação por inserção do gene lacZ' , com os recombinantes sendo identificados pela incapacidade de sintetizar B-galactosidase (Figura 5.9b).
A B-galactosidase é uma das váriap enzimas envolvidas na quebra de lactose em glicose mais galactose. Ela é normalmente codificada pelo gene lacZ, que está situado no cromossomo de E coli. Algtmas linhagens de E. coli possuem um gene lacZmodifiçado, que não tem um segmento denominado lacZ' , que codifica a porção chamada de peptídeo u da B-galactosidase (Figura 5.10a). Esses mutantes são capazes de sintetizar a enzima somente quando abrigam um plasmídeo, como pUC8, que é portador do segmento lacZ'faltante do gene. Um experimento de clonagem com pUCl8 envolve a seleção de transformantes em ágar com ampicilina, seguida pela identificação de recombinantes com base na atividade de p-galactosidase. Células portadoras de um plasmídeo pUCS normal são ampR e cap.ves de sinte-
104
T.A. Bnowr
(a) Colônias em meio com ampicilina
(b) Plaqueamento em réplica
I I Superfície de toque
I
Blocode madeira
I I
1..r.,r.'...1
'
I
/
/
de
WM meio ampicilina
Colônias em com
,/
.l
I
I
I 1r...r..r......1
ï-f-\---
toque I
Cétutasaderidas ao bloco
rncunaçao
Meio com tetraciclina
\
/
ColôÀias tetB
de clonagem de vetor non Ímrécula recombiÍìar I]llll]rÍ| segmento adiciona serido no sítio de |l]lÍÈepas mais detalhad ver Figur @ ueúor
(c) Colônias
amfteF
desenvolvem-se em meio com tetraciclina
Posição de recombinante ampqteÊ
lnrmltÉcrrla
,
Não-recombina nles am pR tef
tem uma cq
Figura 5.8 Seleção de recombinantes de pBR322 por inativação por inserção do gene de resistência à tetraciclina. {a) As células são plaqueadas em ágar com ampicilina: todas as transÍormantes produzem colônias. (b) As colônias são plaqueadas em réplica em meio com tetraciclina. (c) As colônias que se desenvolvem em meio com tetraciclina são amp'tef e, portanto, não-recombinantes. Recombinantes (ampBtef) não se desenvolvem, mas suas posições na placa de ampicilina são conhecidas.
tizar B-galactosidase (Figura 5.9a); recombinantes também
são ampR, mas são incapazes de
produzir B-galactosidase (Figura 5.9b). A identificação da presença ou da ausência da p-galactosidase é de fato bastante fácil. Em vez de realizat um ensaio para a detecção da quebra de lactose em glicose e galactose, é executado um teste para a detecção de uma reação um pouco diferente, também catalisada pela enzima. Essa reação envolve um análogo da lactose, chamado X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-galactopiranosídeo), o qual é degradado pela p-galactosidase em um produto que
b
F
sídeo,IPTG tes, formadr
binantes, cot
cas. Esse sis
E3 lntroduçã
Existem doi: da com um r
ção e empr
["3.1 TransÍecçi Esse process
um fago em
Cr-ounoev GÊNtcA
E ANÁLrsE
oe
DNA
105
(a) pUCB Gene de resistência à ampicilina
amf ftgat' (b) Uma molécula de pUCB recombinante
Figura 5.9 O vetor de clonagem pUCS: (a) a nrm*écula de vetor normal, (b) uma nnolécula recombinante contendo Íun segmento adicional de DNA inserido no sítio de BamHl.Para mapas mais detalhados de pUC8, ver Figuras 6.3 e 6.4.
do gene de resistência à todas as transÍormantes rneio com tetraciclina. (c) t=tef e, portanto, não-resuas posições na placa
, mas são incapazes de fato bastante fácil. Em gÌicose e galactose, é exe. também catalisada pela
é de
(5-bromo-4-cloro-3-inem um produto que
:
ampR
pgaf
tem uma cor azul-escuro. Se X-gal (mais um indutor da enzima, como o isopropiltiogalactosídeo, IPTG) for adicionado ao ágar juntamente com ampicilina, as colônias não-recombinates, formadas por células que sintetizam B-galactosidase, terão cor.azlul, enquanto as recombinantes, com o gene lacZ' intenompido e incapazes de produzir B-galactosidase, serão brancas. Esse sistema, chamado de seleção Lac, está resumido na Figura 5.10b.
5.3 lntrodução de DNA de fagos em células bacterianas Existem dois métodos diferentes pelos quais uma molécula de DNA recombinante construída com um vetor derivado de fago pode ser introduzida em uma célula bacteriana: transfecção e empacotamento in vitro.
5.3.1 TransÍecção Esse processo é equivalente à transformação, com a diferença de que o DNA envolvido é o de um fago em vez do de um plasmídeo. Assim como com um plasmídeo, o DNA de fago puri-
106
T. A. Bnowrl
No segundo sil (a) A Íunção
do gene tacz' E. coli
lacZ'-
mutação em um 91 uma das linhagens linhagens é capaz to do gene mutado tos de todas as ou
+pUC8
oQo
Molêculas
) incompletas pUCS
-
e
c
Fragmento da p-galactosidase codiÍicado pelo gene bacteriano Fragmenlo da B-galactosidase codificado pelo gene plasmidial Molécula de P-galactosidase completa
(b) Seleção de recombinantes de pUCB
'+ X-gal + IPTG Colônia azul = não-recombinante Colônia branca = recombinante
colônias
azuis
mistura de empacc
I
./9oQ
= p-galactosidase sintetizada X-gal-+ produto azul
Colônias brancas = p-galactosidase não-sintetizada X-gal-+ sem produto azul
culturas celulares-
Moléculas
de B-galactosidase completas
Figura 5.10 A base teórica da inativação por inserção do gene lacZ'presente em pUC8. (a) Os genes bacteriano e plasmidial complementam-se um ao outro para produzirem uma molécula de pgalactosidase Íuncional. (b)Os recombinantes são selecionados a partir do plaqueamento em ágar contendo X-gal e IPTG.
ficado ou uma molécula de fago recombinante é misturado com células de E. coli competentes, com a incorporação do DNA induzida por choque térmico.
5.3.2 Empacotamento in vitro A transfecção com moléculas de DNA de l, não é um processo muito eficiente quando comparada com a infecção de uma cultura de células com partículas de fago l, maduras. Seria, portanto, útil se moléculas de l" recombinantes pudessem ser empacotadas na estrutura de cabeça e cauda de l, em um tubo de ensaio.
Isso pode parecer difícil, mas, na realidade. é um processo de execução relativamente simples. O empacotamento exige diversas proteínas codificadas pelo genoma de 1,, mas elas podem ser preparadas em uma alta concentração a partir de células infectadas com linhagens defectivas de fago 1,, com a possibilidade de utilizarem-se dois sistemas diferentes. Com o sistema de linhagem única, o fago l, defectivo é portador de uma mutação nos sítios cos, de modo que eles não são reconhecidos pela nuclease que normalmente çliva os catenanos de À durante a replicação do fago (p. 33-3a). Portanto, o fago defectivo é incapaz de replicar-se, embora ele dirija a síntese de todas as proteínas neçessárias ao empacotamento. As proteínas acumulam-se na bactéria e são purificadas a partir de culturas de E. coli infectadas com o l, mutado, podendo ser utilizadas para o empacotamento in vitro de moléculas de l, recombinantes (Figura 5. I 1a).
l
Figura 5.11 Empacotamento in viÍro. (a) Síntese das proteínas do capsídeo de i, pela linhagem de E coli SMR10, que é portadora de um Íago que possui sítios cos ffictivos. (b) Síntese üconjuntos incompletos de proteínas de capsídeo de l. pelas linhagens de E. coli EflB2688 e 8H82690. (c) Uma mistura de lisados celulares provê ioonjunto completo de poteínas de capsídeo @pode empacotar moléculas de DNA de l" em tubo de ensaio.
Crorunceu GÊwtcn e AruÁlrse oe
DNA
107
No segundo sistema, duas linhagens defectivas de l, são necessiírias, ambas portando uma mutação em um gene que codifica um dos componentes do envoltório protéico do fago: em uma das linhagens, a mutação é no gene D e, na ãut,a, é no gene E (Figura 2.9). Nenhuma das linhagens é capaz de completar um ciclo de infecção em E. cori,pois, na ausência do produ_ to do gene mutado, a estrutura completa do capsídeo não pode ser montada. Assim, os produ_ tos de todas as outras proteínas do envoltórió acumuram-se na célula (Figura 5.1rb). uma mistura de empacotamento pode, portanto, ser preparada pela combinação de lisados de duas culturas celulares, uma infectada com a linhagem ãe o À e a outra infeàtaoa com a linhagem
Figura 5.10 A base teórica da inativação por inserção
(a) Um sistema de êmpacotamento de linhagem única
dogene lacZ'presen-
Proteínas de acumulam-se na célula
DNA de l.
te em pUC8. (a) Os genes bacteriano e plasmidial complementam-se um ao outro para produzirem uma molécula de Bgalactosidase Íuncional. (b) Os recombinantes são selecionados a partir do plaqueamento em ágar contendo X-gal e
À
E coli SMR10 _ o DNA de À possui sítios cos deÍectivos (b) Um sistema de empacotamento de duas linhagens
IPTG.
Figura 5.11 Empacotamenlo in vi-
E. coliBHB26SA deÍectivo para a síntese da proteína E (a)
E. coliBHB2690 defectivo para a síntese da proteína D @
À
À
Íro. (a) Síntese das
eficiente quando comfago À maduras. Seria, na estrutura de ca-
relativamente genoma de 1,, mas elas com linhagens s diferentes. Com o nos sítios cos, de cliva os catenanos de À incapaz de replicar-se, .
As proteínas
coli infectadas com o À las de l, recombi-
Futeínas do capsídeo
ü I pela linhagem
de E ooli SMR10, que é poÍtadora de um Íago gue possui sítios cos Èrbctivos. (b) Síntese üconjuntos incompletos de proteínas de oapsídeo de À pelas linhagens de E. coli E-182688 e 8H82690. {c) Uma mistura de lisados celulares provê omnjunto completo de Foteínas de capsídeo epode empacotar moléculas de DNA de ì. em tubo de ensaio.
(c) Empacotamento in vitro
cos I cos I cos I cos r Oo
o-_t +o +C \+ + c o.-. j * +
Catenanos de DNA de
À
Proteínas de À de SMRIO ou de uma mistura de BHB2688 + BHB2690
"o
oô H
H '
ç
r
Partícutas de fago À contendo moléculas de DNA empacotadas
108
T.A. BRowN -.
A mistura contém, então, todos os componentes necessários para o empacotamento de moléculas de l" recombinantes em partículas de fago maduras (Figura 5.11c). Com qualquer um dos dois sistemas, as moléculas empacotadas são introduzidas em células de E coll simplesmente pela adição dos fagos montados à cultura bacteriana. A partir daí ocorre o processo infectivo normal de 1". E
5.3.3 A inÍecção por fago é visualizada como placas em um meio de ágar O estágio final do ciclo infectivo do fago é a lise celular (p. 3l). Se as células infectadas são espalhadas em um meio de ágar sólido imediatamente após a adição do fago, ou imediatamente após a transfecção com DNA viral, a lise celular pode ser visualizada na forma de placas sobre um tapete de bactérias (Figura 5.12a). Cada placa étmazona de clareamento, produzida à medida que os fagos lisam as células, infectam bactérias vizinhas que acabam sendo lisadas e assim por diante (Figura5.l2b). Tanto l, como M13 formam placas. Com À, tais placas são verdadeiras, eis que produzidas por lise celular. Com M13, por outro lado, elas se apresentam um pouco diferentes, pois esse fago não lisa as células hospedeiras (p.32). Em vez disso, Ml3 causa um decréscimo na velocidade de multiplicação das células infectadas, que é suficiente para produzir uma zona de
clareamento rel zonas mais clan O resultado l, ou de M13 é. é derivada de ru las virais idêntir combinantes.
5.4 IdentiÍicaçã Há diversas ma guintes.
5.4.1 Inativação p utilizado col
Todos os vetorc dos de ì,, são p
inativa a síntesr recombinantes
contendo fagos 5.13a). (a) Placas em um tapete de bactérias
5.4,2 lnativação p
Vários tipos de ne cI (posição !
Tapete formado pela
alteração na mc tes com o gene aparente para u
multiplicação conÍluenté de bactérias
Uma placa - uma zona de clareamento
5.4.3 Seleção utili
O fago l, nornu grada de um fq com o profago que a inserção <
(b) Placas líticas Tapete de bactérias
// .,,',jilt í. t'&,,u"" - todas as bactérias Íoram .Í;on'ij': "ÌÏ''iÈiilir,",iìii'.{kl.i; i-'.r..; i,ï.:1. +.
:"*:',ïï,:ï:ïXï,ïiï"n""
(c) Placas de M13
As placas contêm bactérias de multiplicação lenta + partículas do fago M13
combinantes Figura 5.12 Placas de bacterióÍago. (a) A aparência das placas em um tapete de bactérias. (b) Placas produzidas por um Íago que lisa a célula hospedeira (por exemplo, l. no ciclo de infecção lítico); as placas contêm células lisadas e muitas partículas de Íago. (c) Placas produzidas por M13; essas placas contêm bactérias de multiplicação lenta e muitas partículas de Íago M13.
ir
hospedeiras em formam placas,
r[4.4 Seleção con
O sistema de er de inserir na esl
la menor que 3, deleção de gral de modo que tê partículas virais o tamanho total tores, somente I
Crorunoeu GÊrurcn e ANÁLrsE
DE
DNA
109
clareamento relativo em um tapete bacteriano. Embora não sejam placas verdadeiras, essas zonas mais claras são visualmente idênticas a placas de fago normais (Figura 5.12c). O resultado final de um experimento de clonagem gênica utilizando um vetor derivado de À ou de Ml3 é, portanto, uma placa de âgar coberta com placas de fagos. Cada placa de fago é derivada de uma célula individual transfectada ou infectada, que contém, portanto, partículas virais idênticas. Tais partículas podem ou conter moléculas de vetor autoligadas ou ser re-
paÍa o empacotamento de 5.1 1c).
introduzidas em célubacteriana. A partir daí
são
combinantes.
Se as células infectadas são
do fago. ou imediatamen-
'uadana
5.4 Identificação de Íagos recombinantes
forma de placas produzi-
Há diversas maneiras para distinguir placas recombinantes. As mais importantes são as se-
de clareamento.
que acabam sendo
guintes.
li-
iras, eis que produzidas pouco diferentes, pois esse €ausa um decréscimo na vepara produzir uma zona de
rn4.1 lnativação por inserção de um gene lacZ'presente no fago utilizado como vetor Todos os vetores de clonagem derivados de Ml3 (p. l2l-122), além de vários vetores derivados de i,, são portadores de uma cópia do gene lacZ'. A inserção de novo DNA nesse gene inatiya a síntese de B-galactosidase, exatamente como acontece com o plasmídeo pUCS. Os recombinantes são identificados por plaqueamento das células em ágar com X-gal: placas contendo fagos normais são azuis, enquanto placas recombinantes são incolores (Figura 5. I 3a).
t 4.2 lnativação
por inserção do gene c{ de l,
Viírios tipos de vetores de clonagem derivados de l, possuem sítios de restrição únicos no gene cI (posição 38 no mapa da Figura 2.9). A inativação por inserção desse gene provoca uma alteração na morfologia das placas. As placas normais são "turvas", enquanto as recombinantes com o gene cI interrompido são "claras" (Figura 5.13b). A diferença entre elas é bastante aparente para um olho treinado.
n4.3 Seleção utilizando o fenótipo Spi , 5.12 de bacterióÍago. aparência das placas em tâpete de bactérias. (b) plaproduzidas por um Íago que a célula hospedeira (por l, no ciclo de inÍecção as placas contêm células e muitas partículas de (c) Placas produzidas por ; essas placas contêm bacde multiplicação lenta e partículas de Íago M13.
O fago l" normalmente não pode infectar células de E. coli que já possuem uma forma integrada de um fago aparentado chamado P2.Diz-se, por isso, que l, é Spi- (sensível à inibição com o profago P2). Alguns vetores de clonagem derivados de l, foram projetados de modo que a inserção de um novo DNA cause uma mudança de Spi* para Spi-, permitindo que os recombinantes infectem células portadoras de profagos P2. Tais células são utilizadas como hospedeiras em experimentos de clonagem com esses vetores; assim, somente recombinantes formam placas, pois só eles são Spi (Figura 5.13c).
f.4.4 Seleção com base no tamanho'do genoma de l, O sistema de empacotamento de À, que monta as partículas virais maduras, somente é capaz de inserir na estrutura da cabeça moléculas com tamanho entre 37 e 52kb. Qualquer molécula menor que 37 kb não é empacotada. Muitos vetores derivados de À foram construídos pela deleção de grandes segmentos da molécula de DNA que compõe o genoma do fago (p. 130), de modo que têm um tamanho inferior a 37 kb. Esses vetores só podem ser empacotados em partículas virais maduras depois de o DNA adicional ter sido inserido neles, fazendo com que o tamanho total do genoma seja maior do que 37 kb (Figura 5.13d). Portanto, com esses vetores, somente os fagos recombinantes podem ser replicados.
espécies bi poração de
(a) lnativação por inserção do gene tacZ,
Saccharon,
mais sohst
Ágar+X-gal +IPTG
5.5.1 Transforn
Placa clara = recombinante
Para a mai,
Placa azul = nãorecombinante
celular. Cél te transforn
cio (Figura
de celular. fungos e ve
(b) lnativação por inserção do gene l,cl
gura 5.14b
Placa clara = recombinante
ainda pode células são ria de poror na célula. A gradativas r
Placa turva = nãorecombinante
Em conr
cos para a ir
(c) Seleção utilizando o Íenótipo Spi
pipeta muitr transformac
Profago P2
seqüenteme
volve o bon
Somente um fago À recombinante é capaz de inÍectar a célula
culas de our rados sobre chamada de
l, não-recombinante
5.5.2 Transform
a célula
Para animai
(d) Seleção com base no tamanho do genoma de l.
sim, um org
partir de cél mento de pr
Sítios cos
|#--r-r--rr-t ïamanho correto
-
para empacotamento
'
/t\
tì t
gramíneas.
Catenanodel,
Muito pequeno para ser empacotado
ì
transformad Figura 5.13 Estratégias para a seleção de Íagos recombinantes.
esse DNA cl 7.13b). Anin que a obtenç
lizada com r do oviduto,
r
(p. l6l_162)
5.5 TransÍormação de células não-bacterianas Métodos para a introdução de DNA em leveduras, fungos, animais e vegetais também são necessários, se tais organismos devem ser utilizados como hospedeiros para a clonagem gênica. Em termos gerais, a incubação das células em solução de sal só é eficiente para umas poucas
Croruncev GÊrurcn e AruÁuse oe
DNA
111
espécies bacterianas, embora um tratamento com cloreto ou acetato de lítio aumente a incorporação de DNA por células de levedura e seja freqüentemente utilizado na transformação de
Saccharomyces cerevisiae.Para a maioria dos organismos superiores, entretanto, métodos mais sofìsticados são necessários.
55.1 Transformação de células individuais Para a maioria dos organismos, a principal barreira para a incorporação de DNA é a parede celular. Células animais em cultura, que em geral não possuem parede celular, são facilmente transformadas, sobretudo se o DNA for precipitado na superficie celular com fosfato de cálcio (Figura 5.14a). Para outros tipos de cólulas, a resposta é muitas vezes a remoção da parede celular. Há enzimas disponíveis que degradam paredes celulares de células de leveduras, fungos e vegetais e, sob condições adequadas, podem ser obtidos protoplastos intactos (Figura 5.14b), os quais, via de regra, incorporam DNA com facilidade, mas a transformação ainda pode ser estimulada por técnicas especiais, como a eletroporação. Na eletroporação, as células são submetidas a um pulso elétrico curto, que, acredita-se, induz a formação transitória de poros na membrana celular, pelos quais as moléculas de DNA são capazes de penetrar na célula. Após a transformação, os protoplastos são lavados para a remoção das enzimas degradativas e a parede celular é espontaneamente reconstituída. Em contraste com os sistemas de transformação descritos até agora, há dois métodos físicos irara a introdução de DNA em células. O primeiro deles é a microinjeção, que utiliza uma pipeta muito fina para injetar moléculas de DNA diretamente nos núcleos das células a serem transformadas (Figura 5.15a). A técnica foi inicialmente aplicada a células animais, mas subseqüentemente aplicada também, com sucesso, em células vegetais. Um segundo método envolve o bombardeamento das células com microprojéteis de alta velocidade, em geral paÍículas de ouro ou tungstênio, que foram recobertas com DNA. Esses microprojéteis são disparados sobre as células por uma pistola de partículas (Figura 5.15b). A técnica incomum é chamada de biobalística e já foi utilizada com diversos tipos diferentes de célula.
t5.2
TransÍormação de organismos inteiros Para animais e plantas, o produto final desejado pode não ser uma célula transformada, mas, sim, um organismo transformado. Plantas podem ser regeneradas com relativa facilidade a partir de células em cultura, embora tenham sido encontrados problemas paÍa o desenvolvimento de procedimentos de regeneração para espécies de monocotiledôneas, como cereais e
Figura 5.13 Estratégias para a seleção de Íagos recombinantes.
gramíneas. Uma única célula vegetal transformada pode, portanto, dar origem a uma planta transformada, que será portadora do DNA clonado em cada uma de suas células e transmitirá
DNA clonado a sua progênie, depois da floração e da produção de sementes (ver Figura 7.13b). Animais, é claro, não podem ser regenerados a partir de células em cultura, de modo que a obtenção de animais transformados exige uma abordagem mais sutil. Uma técnica utiesse
lizada com mamíferos, como os camundongos, é baseada na remoção de óvulos fecundados do oviduto, que são microinjetados com DNA e reimplantados no trato reprodutivo da mãe
(p.161-162).
e vegetais também são neiros para a clonagem gênica. é efiçiente para umas poucas
T. A. BRowN
Leituras adici
a) Precipitação de DNA sobÍe células animais
Calvin, N.M.
_ _-__-
of
Solução de fosfato de cálcio
gq.-
ó
Bacteir
Capecchi, M.R cells. Cell, Cohen, S.N., C
DNA precipitado sobre a superfície das células
formation
69,2tt0-1
Monocamada de células animais
Hammer, R.E.,
jection. Na
(b) TransÍormação de protoplastos vêgetais
* Célula
vegetal
# I
da
I
-*y_
da parede celular Protoplasto
Hegeneraçao
planta
Célula vegetal transÍormada
Planta transformada
Figura 5.14
Hohn, B. & Mr dings of th Klein, T.M., W into living Mandel, M. & l 154-62. tT
Estratégias para a introdução de novo DNA em células animais e vegetais.
(a) Microinjeção
(b) TransÍormação com microprojéteis
Microprojéteis Pino de disparo
-n
Células-alvo
^a Carga
.
N
células-alvo bomoarceaoas
n
::Sl
a
:i[$ "ot
microprojéteis
Figura 5.15 Dois métodos Íísicos para a introdução de DNA em células.
-----=:-
Ct-oruacer,a GÊrurcn e ANÁLtsE oe
DNA 1 l3
ras adicionais calvin, N.M. & Hanawalt, PC. (1988) High effrciency transformation of bacterial cells by electrop oration. Journal of B ac t e rio lo gy, 17 0, 27 96-g0l. Capecchi, M.R. (1980) High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. C e I l, 22,47 9 -88. Cohen, S'N., Chang, A.VY', Hsu,L. et al. (1972) Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia cali by R-factor DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the IJSA, 69,2ll0-14. [Transformação de uma bactéria com um plasmídeo.]
Hammer,R.E.,Pursel,V.G.,Rexroad,C.E. etal.(L981)Productionoftransgenicrabbits,sheepandpigsbymicroinjection. N ature, 315, 680-83.
Hohn,B'&Murray,K.(Lg77)PackagingrecombinantDNAmoleculesintobacteriophageparticles invitro.proceedingsoftheNationalAcademyof SciencesoftheUSA,T4,3259-63.[Empacotamento invitro.] Klein' T'M', Wolf, E.D., Wu, R. & Sanford, J.C. (1987) High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature, 327,70-73. [Biobalística.] Mandel, M. & Higa' A. (1970) Calcium-dependent bacteriophage DNA infecÍion. Journal of Molecular Biotogy, 53,
Figura 5.14 Estratégias para a introdução de novo DNA em células animais e vegetais.
Figura 5.15 Dois métodos físicos para a introdução de DNA em células.
I
54-62. [Transfecção.]
Cnpírulo 6 Vetores de Clonagem para E. coli
Vetores de clonagem baseados em plasmídeos de E.
coli.
1
l5
Vetores de clonagem baseados no bacteriófago M I 3,
l, e outros vetores de alta capacidade permitem que bibliotecas genômicas sejam construídas, 136 Vetores para outras bactérias, I 37
122
Vetorés de clonagem baseados no bacteriófago À,
t29
As técnicas experimentais básicas envolvidas na clonagem gênica já foram descritas. Os Capítulos 3,4 e 5 mostraram como o DNA pode ser purificado de extratos celulares, como moléculas de DNA recombinantes podem ser construídas em um tubo de ensaio, como moléculas de DNA podem ser reintroduzidas em células vivas e como clones recombinantes podem ser distinguidos. Agora deve-se olhar mais atentamente paÍa o vetor de clonagem propriamente dito, a fïm de analisar a variedade de vetores disponíveis para o biologista molecular e para entender as propriedades e utilizações de cada tipo individual. A maior variedade de vetores de clonagem que existe é para a utilização de E. coli como organismo hospedeiro. Isso não é surpreendente, tendo em vista o papel central que essa bac-
téria tem exercido na pesquisa básica nos últimos 50 anos. A imensa riqueza de informações existente a respeito da microbiologia, bioquímica e genética de E. coli signihca que, virtualmente, todos os estudos fundamentais de estrutura e função gênica foram realizados tendo essa bactéria como organismo experimental. Recentemente, a clonagem gênica e a pesquisa biológica molecular têm se tornado mutualmente sinergísticas - avanços na clonagem gênica têm atuado como estímulo para a pesquisa, enquanto as necessidades da pesquisa têm acelerado o
desenvolvimento de novos e mais sofisticados vetores de clonagem. Neste capítulo, serão descritos os tipõs mais importantes de vetores de clonagem para E. coli e desÍacadas as utilizações específicas das moléculas representativas. No Capítulo 7, os vetores de clonagem para leveduras, fungos, plantas e animais serão considerados.
t 1 vetores de clonagem
baseados em plasmídeos de E. coti
Os vetores de clonagem mais simples e os mais amplamente utilizados na clonagem gênica são aqueles baseados em plasmídeos bacterianos pequenos. Um grande número de vetores plasmidiais diferentes está disponível para auÍilização em E. coli,muitos obtidos de fornecedores comerciais. Eles combinam a facilidade de purificação com propriedades desejáveis,
116
T.
A. Bnown
tais como alta eficiência de tfansformação, marcadores convenientes para a seleção de transformantes e recombinantes e a capacidade para clonagem de pedaços de DNA razoavelmente grandes (até cerca de 8 kb). A maioria dos experimentos de clonagem gênica de "rotina" faz uso de um ou outro desses vetores plasmidiais. Um dos primeiros vetores a ser desenvolvido - e ainda um dos mais populares hoje em dia - é o pBR322, o qual foi introduzido no Capítulo 5 para ilustrar os princípios gerais da seleção na transformação e a identificação dos recombinantes (p. 98). Este estudo de vetores plasmidiais de E. coli será iniciado a partir de uma visão mais aproximada do pBR322.
6.1.1 A nomenclatura dos vetores de clonagem plasmidiais O nome "pBR322" obedece às regras gerais para a nomenclatura de vetores:
. . c
Um mapa de pB nes de resistên (er1, a origem
"p" indica que ele é realmente um plasmídeo. "BR" identifica o laboratório no qual o vetor foi originalmente construído (BR conesponde a Bolívar e Rodrigues, pesquisadores que desenvolveram o pBR322). "322" distingue esse plasmídeo de outros desenvolvidos no mesmo laboratório (existem tambéni plasmídeos chamados pBR325, pBR327, pBR328, etc.).
6.1.2 As propriedades úteis do pBR322 O mapa genético e físico do pBR322 (Figura 6.1) fornece uma indicação darazão pela qual esse plasmídeo tem se tornado um vetor de clonagem tão popular. A primeira característica útil do pBR322 é o seu tamanho. No Capítulo 2 foi determinado que um vetor de clonagem deve ter um tamanho menor do que 10 kb para evitar problemas, tais como a quebra do DNA durante a purificação. O pBR322 possui 4.363 pb, o que significa que não somente o próprio vetor pode ser purificado com facilidade, mas também o podem as moléculas de DNA recombinantes construídas apartir dele. Mesmo com 6 kb de DNA adicionais, uma molécula de pBR322 recombinante ainda apresenta um tamanho manipulável. A segunda característica do pBR322 é que, conforme descrito no Capítulo 5, ele contém dois grupos de genes para resistência a antibióticos. Tanto resistência à ampicilina quanto à tetraciclina podem ser utilizadas como marcas de seleção para células contendo o plasmídeo, e cada gene marcador contém sítios de restrição únicos, que podem ser utilizados em experimentos de clonagem. A inserção de um DNA novo em um pBR322 que tenha sido clivado com Psfl, PvuIou ScaI inativa o gene que confere resistência à ampicilina (o*po),e inserções utilizando qualquer uma das oito endonucleases (principalmente BamHI e HindIII) inativam a resistência à tetraciclina. Essa grande variedade de sítios de restrição, que pode ser utilizada para a inativação por inserção, confirma que o pBR322 pode ser utilizado para clonar fragmentos de DNA com qualquer um dos viírios tipos de extremidades coesivas. Uma terceira vantagem do pBR322 é que ele apresenta um número de cópias relativamente alto. Geralmente existem cerca de 15 moléculas presentes em uma célula de E. coli Íransformada, mas esse número pode ser aumentado, para até 1 .Õ00 a 3.000, pela amplificação do plasmídeo na presença de um inibidor da síntese protéica, tal como cloranfenicol (p. 54). Uma cultura de E. coli, portanto, fornece um bom rendimento de moléculas de pBR322 recombi-
Flgu
nantes.
6.1.3 O pedigreedo pBR322 A extraordinária conveniência do pBR322 como um vetor de clonagem não apareceu ao acaso' O plasmídeo foi, na verdade, planejado de modo que se possibilita à construção final ter essas propriedades desejáveis.
As linhas gerais do esquema utilizado para construir o pBR322 são mostradas na Figura 6.2a. Conforme pode ser observado, sua construção foi um trabalho
o oeag
@:(a)as q,ações
envo na construç
ffie(b)t
orrn
das orbe p8l
CLoruncrv GÊNrcA
para a seleção de transde DNA razoavelmengênica de "rotina" faz
E ANÁLtsE DE
EcoRl
DNA
117
Hird,lll
dos mais populares hoje em os princípios gerais da se-
98). Este estudo de vetores
proximada do pBR322. Figura 6.1 Lfm mapa de pBR322 mostrando as posições dos gems de resistência à ampicilina (amp\ e à tetraciclina
(eÔ, a origem de replicação (ori) e alguns dos sítios de restrição mais imPortantes.
construído (BR corres'eram o pBR322). mesmo laboratório (existem (a) Construção de pBR322
[ï/v
No Capítulo 2 foi determinado e l0 kb para evitar problemas, possú 4.363 pb, o que signifidrdade, mas também o podem
Fragmento Í recrrcuranzaoo
\ R6_5 ì/ Ecolt* \.--/
(
*'l-<
rnÀ / l/ /=.-<
EcoRt. {PSC101) Fragmento de EcoRl EcoRl.
Áttr,rÀ
u1,\
trlíesmo com 6 kb de DNA adium tamanho manipulável. no Capítulo 5, ele contém istência à ampicilina quanto à ulas contendo o plasmídeo, ser utilizados em experi22 que tenha sido clivado *mpicilina (o*p*), e inserções
dentro do éítio de
Tn33\
t
,'r"/--\'".
\--l-{*t""À
BamHI e HindIII) inativam
de cópias relativamenuma célula de E. coli ïransa 3.000, pela amplificação do
construção foi um trabalho
a -::
a
// ./
w /-\
.\--/
;.- EcoRl\9{ ó'à
@
@ tef
uors ÌragmenÌos ligados
tef
ee, ori
cloranfenicol (p. 54). Uma las de pBR322 recombi-
não apareceu ao acaà construção final ter para construir o pBR322
EcoRl
ampR
restrição, que pode ser utilizaser utilizado para clonar frag-
ibilita
*7--\_
z\
indicação darazão pela qual
(b) As origens de pBR322
Figura 6.2 O pedigree de pBR322: (a) as manipulações envolvidas na construção de pBR322 e (b) um resumo das origens de pBR322.
1
í
I
T. A. Bnowr'r
iírduo que exigiu a utilização hábil e muito bem feita das técnicas de manipulação do DNA descritas no Capítulo 4. Um resumo dos resultados de tais manipulações é fomecido na Figura 6.2b, a partir da qual pode ser observado que o pBR322, de fato, compreende DNA derivado de três plasmídeos naturalmente existentes. O gene ampR estáoriginalmente presente no plasmídeo Rl, um plasmídeo típico de resistência a antibióticos, que é encontrado em populações naturais de E. coli (p.29). O gene tetR é derryado de R6-5, um segundo plasmídeo de resistência a antibióticos. A origem de replicação de pBR322, a qual comanda a multiplicação do vetor nas células hospedeiras, é original de pMB l, que é bastante relacionado ao plasmídeo produtor de
(2) A dele
pBR32 transfe ca, evit nante t
molecr popula
sua m€ so acor te peril
colicilina ColEl (p. 29).
6.1.4 Outros vetores plasmidiais típicos para E. coli O pBR322.foi desenvolvido no final da década de l9lo, e o primeiro trabalho científico descrevendo sua utilização foi publicado em 19'.''...Desde então, muitos outros vetores de clonagem plasmidiais foram construídos, a maioria derivada de pBR322, por meio de manipulações semelhantes àquelas resumidas na Figura 6.2a. Não haveria sentido em tentar descrever todos esses vetores, principalmente porque muitos são variações de um mesmo tema. Três exemplos adicionais serão suficientes para ilustrar as características mais importantes apresentadas pela ampla variedade de vetores de clonagem plasmidiais disponível atualmente para os engenheiros genéticos.
pBR327: um plasmídeo com alto número de cópias O pBR327 (Figura 6.3a) foi construído pela remoção de um segmento de 1.089 pb de pni:ZZ. Essa deleção manteve os genes o*p* e tef intactos, mas alterou as capacidades replicativas e conjugativas do plasmídeo resultante. Como resultado, pBR327 difere de pBR322 de duas maneiras importantes:
na-se importante, pois, com a existência de mais cópias de um gene clonado, maior a probabilidade de que o efeito do gene clonado nas células hospedeiras seja detectado. O pBR327, com seu alto número de cópias, é, portanto, a melhor opção para esse tipo de trabalho do que pBR322.
pUCB
Esse vetor fc da inativaçã<
6.3b) é deriv
neçam. A se contém mais pados em un O pUCS lares vetores na construçã de replicaçã
mesmo anter nado, obtido tes.
A
(1) O pBR327 apresenta um número de cópias superior ao pBR322, estando presente com cerca de 30 a 40 moléculas por célula de E. coli. Isso não é de grande relevância quando a preocupaçáo é o rendimento do plasmídeo, uma vez que ambos os plasmídeos podem (a) pBR327 ser amplificados para um número de cópias superior a 1.000. No entanto, o número de cópias EcoRl Hr'ndlll Scal superior de pBR327 em células normais torna Pvul esse vetor mais adequado. caso o objetivo do experimento seja o estudo das função do gene clonado. Nesses casos, a dosagem gênica tor-
(b)
pUCS: um
segund
um processo
lina
e
X-gal
cedimento el para o outro na metade ú A terceiri o qual permi mos, EcoRl pulações adi, ra 6.4a). Out cem uma fle nados (Figru mo que os a!
um membro
corresponder de DNA ou i
procediment
pGEM3Z:
/"*A t 2.t5'r pD
O pGEM3Z
lacZ',
, ))
ori /acz7ÁAgrupamento de sítios \ \€7(ver Figura 6.4a)
este
íi
mente do me
Figura 6.3 Dois vetores de clonagem plasmidiais de E coli.
CroNeoeM GÊr.rrcr e AnÁuse
manipulação do DNA desé fomecido na Figura 6.2b, DNA derivado de três presente no plasmídeo em populações nafuplasmídeo de resistência a a multiplicação do vetor nas ao plasmídeo produtor de
trabalho científico des[os outros vetores de clona312. por meio de manipularentido em tentar descrever de um mesmo tema. Três cas mals rmportantes apredisponível atualmente pa-
segmento de 1.089 pb de alterou as capacidades re-
pBR327 difere de pBR322
or
DNA
1
19
(2) A deleção também
eliminou a capacidade conjugativa de pBR322, transformando pBR327 em um plasmídeo não-conjugativo, que náo é capaz de comandar a sua própria transferência para outras células de E. coli. Isso é importante para a contenção biotógica, evitando a possibilidade de que uma molécula de um plasmídeo pBR327 recombinante escape de um tubo de ensaio e colonize bactérias do intestino de um biologista molecular descuidado. Em contraste, pBR322 poderia, teoricamente, ser passado para populações naturais de E. coli por conjugação, embora, de fato, pBR322 também possua meios de proteção (apesar de menos sofisticados) para minimizar as chances de isso acontecer. O pBR327 é, portanto, preferível, caso o gene clonado seja potencialmente perigoso na ocorrência de um acidente.
pUGS: um plasmídeo de seleção Lac Esse vetor foi mencionado no Capítulo 5, quando a identificação de recombinantes por meio da inativação por inserção do gene da B-galactosidase foi descrira (p. 10a). O pUCS (Figura
6.3b) é derivado de pBR322, embora somente a origem de replicação e o gene amp* permaneçÍìm. A seqüência de nucleotídeos do gene amp* foimodificada, de tal forma que ela não contém mais os sítios de restrição únicos; todos aqueles sítios de clonagem estão agora agrupados em um segmento curto do gene lacZ'presente no pUC8. O pUC8 possui três vantagens importantes, que o levaram a se tornaÍ um dos mais populares vetores de clonagem para E. coli. A primeira delas é casual: as manipulações envolvidas na construção do pUCS foram acompanhadas por uma mutação inesperada, dentro da origem de replicação, que resultou no plasmídeo apresentando um número de cópias de 500 a 700, mesmo antes da amplificação, o que tem um efeito significativo no rendimento do DNA clonado, obtido a partir de células de E. coli transformadas com plasmídeos pUC8 recombinantes.
estando presente com é de grande relevância quan-
é o rendimento do plasmíambos os plasmídeos podem pam um número de cópias suentanto, o número de cópias
l7 em células normais torna dequado, caso o objetivo do o estudo das função do gene cuÌsos, a dosagem gênica
tor-
pois, com a existência
de
gene clonado, maior a proo efeito do gene clonado nas seja detecrado. o pBR327,
ro de cópias, é, portanto, a tipo de trabalho do que
esse
A segunda vantagem é que a identificação de células recombinantes pode ser realizada em um processo de uma única etapa, por meio do plaqueamento em meio ágar contendo ampicilina e X-gal (p. 105). Com ambos. pBR322 e pBR327, a seleção de recombinantes é um procedimento em duas etapas, necessitando de placas-réplicas, de um meio com um antibiótico para o outro (p. 103). Um experimento de clonagem com pUC8 pode, portanto, ser realizado na metade do tempo necessário para com pBR322 ou pBR327. A terceira vantagem de pUC8 está relacionada com o agrupamento dos sítios de restrição, o qual permite que um fragrnento de DNA com duas extremidades.coesivas diferentes (digamos, -EcoRI em uma extremidade e BamHI na outra) seja clonado sem a utilização de manipulações adicionais, tais como a ligação de uma molécula de ligação (do inglês linker) (Figura 6.4a). Outros vetores pUC carregam combinações diferentes de sítios de restrição e fornecem uma flexibilidade ainda maior para os tipos de fragmentos de DNA que podem ser clonados (Figura 6.4b). Ademais, o agrupamento de sítios de restrição em tais vetores é o mesmo que os agrupÍÌmentos nas séries de vetores M I 3 equivalentes (p. I25). O DNA clonado em um membro de uma série pUC pode, portanto, ser transferido diretamente para o seu M13mp correspondente, de tal forma que este pode ser analisado por intermédio de seqüenciamento de DNA ou mutagênese in vitro (Figura 6.4c; ver páginas 2ll e 244 para a descrição desses procedimentos).
I J
i l I
b clonagem plasmidiais de E
pGEM3Z: transcrição in vitro do DNA clonado o pGEM3Z (Figura 6.5a) é muito semelhante a um vetor puc: lacZ',
ele contém os genes amp* e
último contendo um agmpamento de sítios de restrição, além de ser quase exatamente do mesmo tamanho. A diferença é que o pGBM3Zpossui dois pedaços de DNA extras, esÍe
12O
T.
A. Bnowr,r
RNA-pol
(a) Sítios de restrição em pUCB
fragment zado con que objet
síntese dr
Hitúlll
Os pr
Psll
cias-paú é específ limerase
Sali, Accl, Hirrcll BamHl
Smal, Xmal
li com ur para utili
EcoRl
(lembre-
do que or
I a21tgr
(b) Sítios de restrição em pUCIB
padrão
dr
Hindlll Sphl Psfl
puc18
SaÃ, Accl, Hincll Xbal BamHl
Smal, Xmal Kpnl EcoRl
(c)TransÍerência de um Íragmento de DNA de pUCS para Mt3mp8 pUCS recombinante
BamHl DNA novo
(:_1ï'
Clivagem
com EanrHl e EcoRl
EcoRl
\
Sítios de restrição
com BamHl e EcoRl
\ \
Figura 6.4 Os plasmídeos pUC. (a) O agrupamento de sÊ tios de restrição no int+ rior do gene lacZ'de pUC8. (b) O agrupamento de sítios de restrição em pUC18. (c) TransÍerência de um fragmento de DNA de pUCS para M13mp8.
Figul pGEM3z. (a) Ma
Ëí.
(b) Síntese de
itmÌuf,fo. R =
cada um atuando como sítio de reconhecimento para a ligação de uma enzima RNA-polimerase. Essas duas seqüências promotoras situam-se em cada um dos lados do ug*pì-"nto dos sítios de restrição utilizados para a introdução de um DNA novo em uma molécula de pGElú3Z.Isso significa que, se uma molécul a de pGBM3Zrecombinante for misturada com
agrupaÍ
üsÍtios de restriçã
M,
ra EcoRl, Sac{, Smal, BanrHl,
Sat, Acd, Hircll,
Sphl e H
--=.-
Ct-oruncev GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA
121
RNA-polimerase purificada em um tubo de ensaio, a transcrição ocorrerá e cópias de RNA do fragmento clonado serão sintetizadas (Figura 6.5b). O RNA que é produzido poderá ser utilizado como uma sonda de hibridizaçáo (p. 174), ou poderá ser necessário para experimentos que objetivam o estudo do processamento de RNA (por exemplo, a remoção de íntrons) ou síntese de proteínas.
Os promotores presentes no pGEM3Z e nos demais vetores desse tipo não são seqüências-padrão reconhecidas pela RNA-polimerase de E. coli.Ao contriírio, um dos promotores é específico para a RNA-polimerase codificada pelo bacteriófago T7 e o outro pela RNA-polimerase do fago SP6. Essas RNA-polimerases são sintetizadas durante a infecção de E. co/i com um ou outro fago e são responsáveis pela transcrição dos genes do fago. Sua escolha para utilização na transcrição in vitro deve-se ao fato de essas enzimas serem muito ativas (lembre-se de que um ciclo lítico de infecção inteiro leva somente 20 minutos [30], de modo que os genes do fago devem ser transcritos muito rapidamente) e capazes de sintetizar de I a21tg de RNA por minuto, substancialmente mais do que pode ser produzido pela enzimapadrão de E. coli.
(a) pGEM3Z
Promotor de T7
Promotor de SP6
(b) Síntese de RNA rn viÍro
Promotor de T7
Figura 6.4 Os plasmídeos pUC. (a) O agrupamento de sítios de restrição no int+ rior do gene lacZ'de pUC8. (b) O agrupamento de sítios de restrição em pUC18. (c) TransÍerência de um Íragmento de DNA de pUCS para M13mp8.
de uma enzima RNA-polime-
dos lados do agrupamento novo em uma molécula de inante for misturada com
Figura 6.5 pGEM3Z. (a) Mapa do ffiÍ. (b) Síntese de RNA rflmuúfo. R = agrupamento iüsítios de restrição para EcoRl, Sacl, Kpnl, *d" Smal, BamHl, Xbal, &t, Accl, Hirrcll, Psl|, Sphl
Transcritos de RNA
e Hidlll.
--
l
çt.z vel(.,rËì' qg ur(rrrageilr uaìteau(,st
rr(J
uaulerr(,rag(,
A exigência mais importante para qualquer vetor de clonagem
tut
tr,
é que ele possua uma manelra
de se replicar em uma célula hospedeira. Para vetores plasmidiais, essa necessidade é fácil de satisfazer, uma vez que seqüências de DNA relativamente curtas são capazes de atuar como origens de replicação plasmidial, e a maioria das enzimas necessárias para a replicação, se não todas, é fornecida pela célula hospedeira. Manipulações elaboradas, tais como aquelas que resultaram no pBR322 (Figura 6.2a), sáo, portanto, possíveis, contanto que a construção final tenha uma origem de replicação intacta e funcional. Com bacteriófagos, tais como Ml3, a situação em relação à replicação é mais complexa. Moléculas de fago, em geral, contêm vários genes essenciais à replicação, incluindo aqueles que codificam componentes do capsídeo protéico do fago e enzimas replicativas específicas para o DNA do fago. Alteração ou deleção de qualquer um desses genes irá impedir ou destruir a capacidade replicativa da molécula resultante. Existe, pois, uma liberdade muito menor paÍa se modificar moléculas de DNA de fago, e, via de regra, os vetores de clonagem de fago são apenas levemente diferentes das moléculas parentais. Os p'roblemas na construção de um vetor de clonagem de fago são ilustrados considerando M13. O genoma normal de M13 possui 6,4 kb de comprimento, a maioria ocupada por l0 genes extremamente compactados (Figura 6.6), cada um essencial para a replicação do fago.
Há somente uma única seqüência intergênica, de 507 nucleotídeos, dentro da qual novas moléculas de DNA podem ser inseridas, sem causar a intemrpção de um desses genes, e, na verdade, essa região inclui a origem de replicação, que ela própria deve permanecer intacta. Claramente, há apenas um limitado espaço para modificação no genoma de Ml3. No entanto, será relembrado que a maior atração de M13 é a oportunidade que ele oferece de obtenção de versões de fita simples do DNA clonado (p. 36).Tal característica tem afuado como estímulo para o desenvolvimento de vetores de clonagem M13.
6.2.1 Desenvolvimento do vetor de clonagem M13mp2 foi a introdução do gene lacT dentro da seqüência intergênica. Isso originou Ml3mpl, o qual forma placas azuis em meio ágar com X-gal (Figura 6.7a). M13mpl não tem qualquer sítio único de restrição no gene lacZ'.Ele contém, no entanto, o hexanucleotídeo GGATTC próximo ao início do gene. Uma única substituição de nucleoú-
Figura 6.7 @wstrução de (a)
M13mp1, e (b) a partir dc ggímÍna de M13 dc li:o selvagem,
O primeiro passo na construção de um vetor de clonagem M13
deo o tral
utilizandc
possui un
de ácido M13mp2
i
Ml3n coesil tinguidos des
Hl3mp7
O próxim, adicionais údeo curt<
tios de res clonagem 6.8b). um
lI Figura 6.6 O genoma de M13, mostrando as posições dos genes I ao
e
PsrI).
I
te o gene I de uma en
X
Cr-oruneev GÊrurcn e AruÁusr oe
DNA
123
(a) Construção de M13mp1
ele possua uma maneira essa necessidade é
fácil
de
,uz*-\,
são capazes de atuar como
para a replicação, se não tais como aquelas que reque a construção final
Clivagem, ligação
M13mp1
M13
replicação é mais complexa-
lacZ'
(b) Construção de M13mp2
incluindo aqueles imas replicativas específi cas senes irá impedir ou desi:s.- uma liberdade muito meos vetores de clonagem de
Mutagênese in vitro ............................*
EcoRl
on
lacz
M'l3mp2
M13mp1
úo ilustrados consideranmaioria ocupada por 10 para a replicação do fago. iaÌ dentro da qual novas moum desses genes, e, na ver'e perÍnanecer intacta. Cla.a
crportunidade que ele oferer. Tal caracteística tem atua-
foi a introduçáo do
gene
met - thr-met - ile - thr - asp - ser -AïG ACC ATG ATT ACG GAT TCA-
emM13mp1
- thr -met - ile - thr - asn - ser -ATG ACC ATG AT-r ACG AAT TCA-
emM13mp2
*
Figura 6.7 Gonstrução de (a) M13mp1, e (b) fil&np2, a partir do gEnoma de M13 do tipo selvagem.
met
;n1ç;edogenelacZ,
lpiçi6 dogenelacZ'
*
EcoRl
lacT
tbrma placas azuis em meio Z'. Ele contém, no entanto, substituição de nucleoú-
deo o transformará em GAATTC, o qual é um sítio para EcoRI. Essa alteração foi realizada utilizando-se mutagênese in vitro (p.2aD, resultando no Ml3mp2 (Figura 6.7b). M13mp2 possui um gene lacZ'levemente alterado (o sexto códon agora especifica asparagina, emvez de ácido aspártico), mas a enzima B-galactosidase produzida pelas células infectadas com M13mp2 ainda é perfeitamente funcional. Ml3mp2 é o vetor de clonagem M13 mais simples. Fragmentos de DNA com extremidades coesivas de EcoRI podem ser inseridos no sítio de clonagem, sendo os recombinantes distinguidos como placas claras em meio ágar com X-gal.
M13mp7: sítios de clonagem simétricos O próximo passo no desenvolvimento de vetores M13 foi a introdução de sítios de restrição adicionais dentro do gene lacZ', obtido pela síntese em um tubo de ensaio de um oligonucleotídeo curto, chamado de sítio de policlonagem (polylinker), qle consiste em uma série de sítios de restrição que possui extremidades coesivas de EcoRI (Figura 6.8a). Esse sítio de policlonagem foi inserido dentro daquele de EcoRI de Ml3mp2, originando M13mp7 (Figura 6.8b), um vetor mais complexo, com quatro sítios de clonagem possíveis (EcoRI, BamH\ Sail e PstI). O sítio de policlonagem foi projetado de tal forma que ele não interrompe totalmente o gene lacZ'; urna fase de leitura é mantida por intermédio do sítio de policlonagem, além de uma enzima B-galactosidase funcional, a qual, ainda que alterada, é produzida. as posições dos genes I ao X.
124
T. A. Bnowlr
(a) O sítio de policlonagem
AATTC
+
CCCGG
GGGGC
ATC C GTC G AC CTG
CTAG G C AG CT G G AC
EcoRl
C G
AG GTC G AC G G ATC C G G G G TC
C
AG CTG
C
EcoRl
Sall Accl Hincll
Sall Accl Hincll
(b) Construção de Ml3mp7
Figura 6.8 Sítios de restricão
EcoRl, ligação
rL/rv M13mp2
Sítio de policlonagem
+
CTAG G C C C CTTAA
M13mp7
Construção de M13mp7: (a) o sítio de policlonagem e (b) sua inserção no sítio de EcoRl de M13mp2. Note que os sítios de restrição para Sa/l são também reconhecidos por Acd
e Hircll. Figura 6.9 Clonagem com ffil3Ínp7 (ver o texto para detalhes).
Quando o M13mp7 é digerido taÍlto com EcoRI, BamHI ou SaII, uma parte ou todo o sítio de policlonagem é excisado (Figura 6.9a). Na ligação, na presença de um DNA novo, um de três eventos pode ocorrer (Figura 6.9b).
(1) (2) (3)
DNA novo
é inserido. O sítio de policlonagem é reinserido. O vetor se religa, sem inserção.
A inserção de um DNA novo quase que invariavelmente impede a produção de B-galactosidase, de forma que as placas recombinantes são claras em meio ágar com X-gal (Figuá 6.9c). Alternativamente, se o sítio de policlonagem é reinserido, e o M13mp7 original é novamente formado, então ocorrerá a formação de placas azuis. Porém, o que acontecerá se o vetor se religar, nem com um DNA novo e nem com o sítio de policlonagem inserido? Mais urna vez, o projeto do sítio de policlonagem entra em ação. Não importa qual o sítio de restrição utilizado, a auto-ligação resulta em um gene lacZ'funcional (Figura 6.9c), originando placas azuis. A seleção é, portanto, inequívoca: somente fagos Ml3mpT recombinantes darão origem placas claras. Uma grande vantagem de M13mp7, com seus sítios de clonagem simétricos, é que o DNA inserido tanto no sítio de BamHI, SalI ou PsrI pode ser excisado da molécula recombinante utilizando-se EcoRI (Figura 6.10). Pouquíssimos vetores permitem que um DNA clonado seja tão facilmente recuperado. a
6.2.3 Vetores Ml3 mais complexos Ml3 mais sofisticados possuem sítios de policlonagem mais complexos inseridos no gene lacZ'.lJmexemplo é o Ml3mp8 (Figura 6.11a), o qual é o correspondente do plasOs vetores
mídeo pUC8 (t sua capacida& Uma segun possui o mestr clonado em M M13mp9, estar
ciamento de D extremidade ú 6.11d). Somen ciamento; se o será seqüencia ção no vetor gi mitirá que a se Outros pan semelhantes ac de restrição dil
Vetores híbl
Embora os vetr nes clonados, r to de DNA qur mo o tamanho dos. Para soluc
---------15
CLoruncev GÊNrcA
(a) Clivagem de Ml3mpz
E
AnÁuse oe
DNA
125
Ïodo ou parte do sítio de policlonagem
Sítio de policlonagem EcoRl,
ou Sa/l
/\/ã.. (b) Religação com novos produtos de DNA passíveis
Figura 6.8
1
Construção de M13mp7: (a) o sítio de policlonagem e (b) sua inserção no sítio de EcoRl de M13mp2. Note que os sítios de restrição para SaÍ são também reconhecidos por Accl e Hirrcll.
Novos insertos de
(c) Coloração das placas em meio
DNA: /'l
ágar com X-gal
\
tabZ'lnterrompido
2
3
*Sem p-gal *Placa
clara
Sítio de policlonagem reinserido:
lacz. rcslaurade
*
-*Placa
azul
lacZ'reslaurado
*p-gal *placa
azul
B_gal
Sítio de policlonagem reinserido:
Figura 6.9 Clonagem com 1[ltl3rnp7 (ver o texto para detalhes).
SalI, uma parte ou todo o síde um DNA novo, um
a
produção de p-galacto-
meio ágar com X-gal (Figura e o M13mp7 original é novaím, o que acontecerá se o veiclonasem inserido? Mais uma qual o sítio de restrição 6.9c), originando placas recombinantes darão origem '7
simétricos,équeoDNA da molécula recombinante que um DNA clonado se-
mais complexos inseridos é o correspondente do plas-
mídeo pUCS (p. 119). Assim como no vetor plasmidial, uma vantagem do M13mp8 está na sua capacidade. de receber fragmentos de DNA com duas extremidades coesivas diferentes. Uma segunda característica é fornecida pelo vetor gêmeo M13mp9 (Figura 6.1 1b), o qual possui o mesmo sítio de policlonagem, mas na orientação inversa. Um fragmento de DNA clonado em M13mp8, se excisado por meio de uma restrição dupla, e, então, inserido em Ml3mp9, estará, agora, na sua orientação inversa (Figura 6.11c). Isso é importante no seqüenciamento de DNA (p. 211), durante o qual a seqüência de nucleotídeos é lida a partir de uma extremidade do sítio de policlonagem para o interior do fragmento de DNA inserido (Figura 6.11d). Somente cerca de 600 nucleotídeos podem ser lidos em um experimento de seqüenciamento; se o DNA inserido é mais longo que isso, uma das extremidades do fragmento não será seqüenciada. Uma alternativa é virar o fragmento ao contriírio, por sua excisão e reinserção no vetor gêmeo. Um experimento de seqüenciamento de DNA com esse novo clone permitirá que a seqüência de nucleotídeos da outra extremidade do fragmento seja determinada. Outros pares de vetores M13 também estão disponíveis. Ml3mp10/l 1 e M13mp18/19 são semelhantes ao M13mp8/9, mas possuem sítios de policlonagem diferentes e, portanto, sítios de restrição diferentes.
Vetores híbridos plasmídeo-M1 3 Embora os vetores M13 sejam muito úteis para a produção de versões de fita simples dos genes clonados, eles têm uma desvantagem. Existe uma limitação prÌra o tamanho do fragmento de DNA que pode ser clonado em um vetor M13, com 1.500 pb, em geral, sendo tido como o tamanho máximo, embora fragmentos de até 3 kb tenham sido ocasionalmente clonados. Para solucionar esse problema, inúmeros vetores novos (fagomídeos, do inglês phage-
126
T.A.Bnowru
,^"-ü^ Extremidades de Sau3A (GATC)
Clivagem com BamHl (extremidades GATC)
Ligação, clonagem
1 Sítios de BamHl não são restaurados
t/,,4t\, \ \ sítios oara SauSA Fragmento de \ / \ Satt3A i
2 M13 possui muitos
/ \ 3 Portanto, recuperação do fragmento por clivagem com EcoRl
a,,u"n"m com EcoRt
I \<*í /\
Extremidades coesivas de EcoRl
9\ ,/
clivagem oo u",o.
\
Figura 6.10 Recuperação de um DNA clonado a partir de uma molécula de M13mp7 recombinante por meio da clivagem dos sítios mais externos do sítio de policlonagem.
mids) forandesenvolvidos pela combinação de uma paÍe do genoma de M13 com o DNA do plasmídeo. Um exemplo é fornecido pelo pEMBL8 (Figura 6.12a), construído pela transferência para pUCS de um fragmento de 1.300 pb do genoma de Ml3. Esse pedaço de DNA de Ml3 contém a seqüência-sinal reconhecida pelas enzimas que convertem a molécula de Ml3 de fita dupla normal em DNA de fita simples, antes da secreção de novas partículas de fago. Essa seqüência-sinal ainda é funcional, mesmo que separada do restante do genoma de Ml3, de forma que moléculas de pEMBLS são também convertidas em DNA de fita simples e secretadas como partículas de fago defectivas (Figura 6.12b). É necessário qïe as células de E coli ltilizadas como hospedeiras em um experimento de clonagem co{rì pEMBL8 sejam subseqüentemente infectadas com um M13 normal para atuar como um fago auxiliar (do inglês helper phage), fornecendo as enzimas replicativas necessárias e as proteínas do capsídeo do fago. O pEMBL8, sendo derivado de pUC8, possui os sítios de policlonagem no interior do gene lacZ' , de forma que placas recombinantes podem ser identificadas da maneira padrão em meio ágar contendo X-gal. Com pEMBLS, versões de fita simples dos fragmentos de DNA clonados de até 10 kb de tamanho podem ser obtidas, aumentando significativamente a amplitude do sistema de clonagem de M13.
Figura 6.11
ll13mp8 e M13mpg.
ì-
{
Li
L.
Crorueeera GÊrurcr e ANÁLtsE oe
DNA
(a) O sítio de policlonagem de M13mp8/9
AAT TCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGCC A
cGGòôóò
in òccÀôc ieoÀcôióèe i rcon I
EcoRl
Hindlll
Sa/l
Smal Xmal
Accl Hincll
(b) A orientação do sítio de policlonagem
aHindlll
,_ff<.''"t
EcoRl
-
Hindl
. EcoRl
-y_,rÈ
(c)TransÍerência de DNA de M13mp8 para M13mpg
EcoRl
Hind|,t
Hindtlt
Hindlll I
d n
N R
Figura 6.10
Clivagem
Recuperação de um DNA clonado a partir de uma molécula de M13mp7 recombinante por meio da clivagem dos sítios mais eÍernos do sítio de policlonagem.
Ml3 com
o DNA do
ído pela transferência pade DNA de Ml3 cona molécula de M13 de fita
partículas de fago. Essa sedo genoma de M13, de forde fita simples e secretadas que as células de E coliutipEMBLS sejam subseqüenauxiliar (do inglês helper do capsídeo do fago. O
m no interior do gene da maneira padrão em meio fragmentos de DNA clonaificativamente a amplitude
t{
n
Ligação
P I
EcoRl
(d) Seqüenciamento de DNA utilizando M13mp8 e Ml3mp9
*-.-/,r'
,/ de
h1
Fsl
M13mpB \ recombinante
Sequência de DNA
,R recombinante
127
128
T. A. Bnowlr
6.3 Vetores d Dois proble
(a) pEMBLS
pudessem s Fragmento de DNA
(1)
de M13
Amol
preseÍ
maior 3.997 pb
partícr
um fn gura 6
ampR
Agrupamento de sítios (ver Figura 6.4a)
(2)
O gen
mento
lizada
de um
(b) Conversão de pEMBLB em DNA de Íita simples Região de
Ml3
muito 6.13U
zz>, Proheína de rePlicação
@
aeïtns A proteína de M13 replica pEMBLS em DNA de fita simples
pEMBLS de fita dupla
Figura
/\ tt \./ \__./ / ^ \/ \. / \_/
\
Moléculas de pEMBLS de fita simples
Figura 6.12 Partículas de "fago" de pEMBLB
F ì
pEMBLS: um vetor híbrido plasmídeo-M13 que pode ser convertF do em DNA de Íita simples.
6.11
,Í!s dois problemas qu llreram que ser resoM üs antes que os veto rcs de clonagem de, Fdessem ser desen rolvidos. (a) A limita ção do tamanho esta bebdda pelo genom ,üL, devido à necessi dade de empacotá-l m interior da cabeç üÍago. (b) O DNAd L possui múltiplos si de reconhecimentt paÍa quase todas a de res trição
CrorunGeu GÊrurcn e ANÁLtsE oe
Vetores de clonagem baseados no bacterióÍago
DNA
129
À
Dois problemas tiveram de ser solucionados antes que os vetores de clonagem baseados em pudessem se desenvolver: (1)
(2)
A molócula de DNA de l, pode ser aumentada em tamanho em somente cerca de 5vo,rcpresentando a adição de apenas 3 kb de DNA novo. Se o tamanho total da molécula for maior que 52 kb, ela não poderá ser empacotada dentro da estrutura da cabeça de l, e partículas de fago infectivas não serão formadas. Isso limita severamente o tamanho de um fragmento de DNA que pode ser inserido em um vetor l, que não foi modificado (Figura 6.13a). o genoma de l, é tão grande que ele possui mais do que uma seqüência de reconhecimento para virtualmente cada endonuclease de restrição. A restrição não poderia ser utilizadapara clivar a molécula de l" normal em uma forma que ela iria permitir a inserção de um DNA novo, pois a molécula seria clivada em vários pedaços pequenos, os quais, muito improvavelmente, iriam restaurar um genoma de l, viável após religação (Figura 6.1 3b).
(a) A limitação de tamanho Possível recombinante
Genoma normal de l"
>52kb
49 kb
\ t\ I Novo DNA > 3 I
kb
+
X Figura 6.13
Figura 6.12 pEMBLS: um vetor hÊ brido plasmídeo-M13 que pode ser convertido em DNA de Íita simples.
F
l,
dois problemas que que ser resolviantes que os vetoms de clonagem de l, pdessem ser desenrolvidos. (a) A limita@ do tamanho estaHecida pelo genoma 1" devido à necessidade de empacotá-lo nn interior da cabeça bfago. (b) O DNA de fl, possui múltiplos sÊ de reconhecimento para quase todas as de restrição.
Muito grande para ser empacotado
?
Empacotamento
(b) Múltiplos sítios de restrição
,
1
,2,3,4,5,6,
EcoRl
k*, ' PU
g Cl tgt
É!
Retisação
Mistura complexa
de moléculas
uul(-lalttçs, rur )urPtççlluçlltç quç ur[41 allllPla valt clonagem de l, se desenvolvesse, com sua utilização principal sendo a clonagem de grandes pedaços de DNA, desde 5 a25kb, muito extensos pÍÌra manipulação em vetores plasmidiais
ou
h,m
suíam
Ml3.
6.3.1 Segmentos do genoma de sua viabilidade
)',
poucas tios par
podem ser deletados sem preiuízos a
eventua ra EcoI
A maneira que impulsionou o desenvolvimento dos vetores de clonagem de l, foi fornecida pela descoberta de que um grande segmento na região central da molécula de DNA de l, pode ser removido sem prejudicar a capacidade do fago de infectar células de E. coli. A remoção de toda ou de parte dessa região não-essencial, entre as posições 20 e35 do mapa mostrado na Figura 2.9, diminui o tamanho da molécula de l, resultante para até cerca de 15 kb. Isso significa que até 18 kb de um DNA novo podem agora ser adicionados, antes que o ponto de clivagem para o empacotamento seja alcançado (Figura 6.14). A região "não-essencial" de fato contém a maioria dos genes envolvidos na integração e excisão do profago de l, do cromossomo de E. coli. Um genoma de l, deletado é, portanto" não-lisogênico e pode seguir somente o ciclo lítico de infecção. Isso é, por si só, desejável pa. ra um vetor de clonagem, uma vez que a indução não é necessária antes que as placas sejern formadas (p. 58).
ô3.3
Vetorer
Uma ve plos síti diferent a serem
E.
:O2EE
Componentes do
capsídeo
b2
o.EO.Eó oooc$ ì(ú rrú
O
r(ú È
E6i
@
Í.
fi g€ H,B g gE E E .E t
E
=
Figura 6.14 O mapa genético de 1", mostrando a posição da região não-essencial que pode ser deletada sem prejuízos à capacida& do Íago de seguir o ciclo lítico de infecção.
6.3.2 A seleção natural pode ser utilizada para o isolamento de l, modiÍicados que não possuem determinados sítios de restrição Mesmo um genoma de À deletado, com a sua região não-essencial removida, possui múlt sítios de reconhecimento para a maioria das endonucleases de restrição. Trata-se de um blema freqüentemente encontrado quando um vetor novo está sendo desenvolvido. Se te um ou dois sítios necessitam ser removidos, então atécniea de mutagênese in vitro (p. pode ser utilizada. Por exemplo, um sítio para EcoRI, GAATTC, poderia ser modificado ra GGAITC, que não é reconhecido pela enzima. No entanto, a mutagênese invitro estaya sua infância quando os primeiros vetores de l, se desenvolveram, e, mesmo nos dias de ela não seria uma maneira eficiente para a modificação de mais que uns poucos sítios em única molécula.
<
ção de DNA d
Figura 6.15
iülzando-se a se-
llftão natural para to de fal" que não pos-
sítios de res-
ütiiPo Para EcoRl.
Cloruncev GÊrurcn e AnÁuse oe
variedade de vetores dc sendo a clonagem de grandes em vetores plasmidiais
sem preiuízos a clonagem de À foi fornecida molécula de DNA de À pocélulas de E. coli. A remo20 e35 do mapa mostraparaaté cerca de 15 kb. Isantes que o ponto
DNA
Em vez disso, a seleção natural foi utilizada paÍa fornecer linhagens de l" que não possuíam os sítios indesejados. A seleção natural pode ser posta em funcionamento pela unlização de uma linhagem hospedeira de E. coli que produz EcoRI. A maioria das moléculas de DNA de À que invadem a célula é destruída por essa endonuclease de restrição, mas umas poucas irão resistir e produzirão placas. Esses serão fagos mutantes, nos quais um ou mais sítiospara EcoRI foram espontaneamente perdidos (Figura 6.15). Viírios ciclos de infecção irão, eventualmente, resultar em moléculas de À que não possuem todos ou a maioria dos sítios para EcoRI.
83,3 Vetores de inserção
e substituição
Uma vez que os problemas apresentados pela dificuldade de empacotamento e pelos múltiplos sítios de restrição foram resolvidos, o caminho estava aberto para o desenvolvimento de diferentes tipos de vetores de clonagem baseados em 1,. As primeiras duas classes de vetores a serem produzidas foram os vetores de l, de inserção e de substituição (ou troca).
envolvidos na integração e de À deletado é, poÍanto, lsso é, por si só, desejável paia antes que as placas sejam 5 sítios para EcoRl
,..-t
Ç
'4ll\DNA de l, normat
I ttlll
r \
\ infecção de células de E.coli produtoras de EcoRl
de 1,, mostrando a poião não-essencial que pode sem prejuízos à capacidade seguir o ciclo lítico de inÍec-
de
Placa formada Por fago
mutante
Somente 3 sítios
"..-JÏ:T' Muito poucas placas
?u
sítios de restrição Repetição da inÍecção com o fago mutante
removida, possui múltiplos e restrição. Trata-se de um prosendo desenvolvido. Se somende mutagênese invitro (p.244)
poderia ser modificado pa-
Figura 6.15
mutagênese invitro estava na , e, mesmo nos dias de hoje, que uns poucos sítios em uma
llliNizando-se a seleção natural para oisolamento de fagm l, que não possram sítios de resüião para EcoRl.
, a
t-F
:
I
131
Sem sítios
rt' Mais algumas placas
oara Eco9l
Segupda linhagem de fago mutante
t
132 ï
A. Bnowlr
Vetores de inserção
dess:
Em um vetor de inserção (Figura 6.16a), um fragmento grande da região não-essencial foi removido e os dois braços ligados um ao outro. Um vetor de inserção possui ao menos um único sítio de restrição, dentro do qual um DNA novo pode ser inserido. O tamanho do fragmento de DNA que um vetor individualmente pode carrear dependerá, é claro, da extensão da deleção de sua região não-essencial. Dois vetores de inserção populares são:
l,gt10 (Figura 6.16b), que pode caffear até cerca de 8 kb de um DNA novo, inserido em um único sítio de EcoRI, localizado no interior do gene cI. A inativação por inserção desse gene resulta em recombinantes que são distinguidos como placas claras, emvez de placas turvas (p. 109).
LZ^PI (Figura 6.16c), com o qual inserções de até 10 kb de DNA no interior de qualquer um dos seis sítios de restrição dentro do sítio de policlonagem irão inativar o gene lacZ'presente no vetor. Os recombinantes originam placas claras, em vez de placas azuis, em meio ágar com X-gal. Vetores de substituição Um vetor de ì, de substituição possui dois sítios de reconhecimento para a endonuclease de restrição utilizada para a clonagem. Tais sítios flanqueiam um segmento de DNA que é substituído pelo DNA a ser clonado (Figura 6.I7a). Freqüentemente, o fragmento substituível (ou fragmento stuffer, no jargão de clonagem) carrega sítios de restrição adicionais que podem ser utilizados para clivá-lo em pedaços pequenos, de forma que a sua própria reinserção du-
fer,
.
l,GE
kb (p liclor most mais
NNh
menl tanto que ( po st
6.3.4 Experime ou substi Um experi
um vetor F ligada e as
rante um experimento de clonagem é bastante improvável. Os vetores de substituição são, em geral, projetados para carïear pedaços de DNA maiores do que os que os vetores de inserção podem suportar. A seleção dos recombinantes é, freqüentemente, com base no tamanho, uma vez que os vetores não-recombinantes são muito pequenos pÍÌra serem empacotados nas cabeças do fago (p. 109). Dois velores de substituição populares são:
ÀEMBL4 (Figura 6.17b),
que pode carrear até20kb de DNA inserido pela substituição de um segmento flanqueado por pÍÌres dos sítios de EcoRI, BamHIe SalI (qualquer uma
(a) Construção de um vetor de l, de inserção DNA de À normat (49
kb)
- |*
clivagem'
rigação
yï1,.',::rà"
Figura 6.17
(35-40kb)
tlfrfiores de À de nôstituição. (a)
Região não-essencial
(b)
l.sr10
LTrj-+oxo Deleção
(c) rzAPil
'
7à '-\ lacZ'
'41 kb Deleção
Figura 6.16 Vetores de l, de inserção. P = sítio de policlonagem no gene lacZ'de l.ZAPll, contendo sítios de restrição únicos para Sad, Notl, Xbal, Spel, Eco Rle Xhol.
lDbnagem com um vetor de l, ü zubstituição. {b) Clonagem oom i.EMBL4. (c) A estrutura de },GEM11, mmnslrando a orffirn dos sítios ürestrição nos dcÍs sítios de policlonagem.
È
b b
t i
d
dem nho.
===: È-r
Cr-oueerv GÊNtcA
não-essencial foi repossui ao menos um úniO tamanho do fragmenÉ claro, da extensão da desao:
DNA novo, inserido em
{
inativação Por inserção
rcLìüno
placas claras, em vez
DNA no interior de qualirão inativar o gene claras, emYez de Placas
E ANÁLlsE oe
DNA
133
dessas três endonucleases de restrição pode ser utilizadapararemover o fragmento stufpofer, deforma que fragmentos de DNA com uma vaÍiedade de extremidades coesivas no tamapode basear-se de ì"EMBL4 recombinantes dos A seleção dem ser clonados).
nho, ou pode utilizar o genótipo Spi (p. 109). 2,,GEM11 e ?r,GEM12 (Figura 6.1'7c), cada um dos quais possui uma capacidade de 23 kb (próxima ao máximo teórico), com o fragmento stuffer flanqueado por sítios de policlonagem que contêm sete sítios de restrição diferentes. Os sítios de policlonagem mostram-Se levemente diferenteS nesses dois vetores, mas' em ambos os casos, os sítios mais externos são para a enzima de restrição S7ïI, a qual reconhece a seqüência GGCCNNNNNGGCC. Essa seqüência é muito rara e improvável de estar presente no fragmento de DNA que foi clonado. A restrição do vetor recombinante com SfI pode, portanto, ser utilizada para excisar o fragmento clonado, com uma grande probabilidade de que o fragmento seja recuperado intacto. Como com }"EMBL4, o tamanho ou o fenótipo Spi podem ser utilizados para a seleção dos recombìnantes'
n3.4 Experimentos de clonagem com vetores de ?r, de inserção ou substituição para a endonuclease de de DNA que é subso fngmento substituível (ou !ão adicionais que Podem a sua própria reinserção du-
Um experimento de clonagem com um vetor de l" pode seguir as mesmas etapas como com um vetãr plasrnidial - as moléculas de ì" são clivadas, o DNA novo é adicionado, a mistura é ligada e as moléculas resultantes utilizadas para transfectar uma linhagem de E. coli hospe-
de substituição são, em os que os vetores de inserção com base no tamanho. uma empacotados nas cabe-
(a) Clonagem com um vetor de
I
de substituição Clivagem, ligação
t------T-------rJ Fragmento stuffer
inserido pela substituição BamHIe SalI (qualquer uma
v77V77'
I
z
L--Y,J
\
I
DNA novo
(b) ).EMBL4 EcoRl, BamHl, Sa/l ou uma combinação
RBS
Figura 6.17
ffiores de ), de
Figura 6.16
Í
lb bçao
Vetores de l, de inserÇão. P = sítio de Policlonagem no gene IacZ'de l,ZAPll, contendo sítios de restrição únicos Para Sac{, Notl, Xbal, Spel, Eco Rle Xhol.
B=
0onagem com un vetor de l. üsubstituição.
S = Sail
ffi___)
\\
DNA novo, de até 23 kb
R = EcoRl
urbstituição. (a)
{b) Clonagem oom ÀEMBL4. [p) A estrutura de ÀGEM11, nmtrando a orffin dos sítios restrição nos dois sítios de policlonagem.
SBR
r
BamHl
(c) }"GEMI1
SfiI - Sacl - Xhol -
Bam\l - Avrll- EcoRl Xbal
-
Eco?l
"rr\
- Avrl Bamïl - Xhol Sacl- Sfll
F
b
I
%:
.:
134
T. A. Bnowr.r
deira competente (Figura 6.18a). Esse tipo de experimento necessita que o vetor esteja na sua forma circular, com os sítios cos ligados entre si por meio de pontes de hidrogênio. Embora bastante satisfatório para muitos propósitos, um procedimento baseado em transfecção não é particularmente eficiente. Um número mais elevado de recombinantes será obtido se um ou dois refinamentos forem introduzidos. O primeiro é auttlização da forma linear do vetor. Quando a forma linear do vetor é digerida com a endonuclease de restrição apropriada, os braços direito e esquerdo são liberados como fragmentos separados. Uma molécula recombinante pode ser construída misturando-se o DNA a ser clonado com os braços do vetor (Figura 6. 1 Sb). A ligação resulta em vários rearranjos moleculares, incluindo catenanos constituídos de braço esquerdo-DNA-braço direito, repetidos muitas vezes (Figura 6.18b). Se o DNA inserido possui o tamanho correto, então os sítios cos, que separam essas estruturas, estarão a uma distância correta um do outro para o empacotamenÍo in vitro (p. 101). Os fagos recombinantes são, portanto, produzidos em um tubo de ensaio e podem ser utilizados para infectar uma cultura de E. coli. Essa estratégia, em especial a utilização do empacotamento ln vitro, restlta em um grande número de placas recombinantes.
(a) Clonagem com um DNA de
I
( );* ( \cos'
Vetor de l. de inserção forma
circular
protéico do
\cos
-
À_-_-
/
Transfecção de
DNA
/
Molécula recombinante
E. coti
(b) Clonagem com um DNA de l" linear
,orflEcoeì
e*t^tÊ"*"
Braços
d"
N
@.."nF{\
,ra'%," DNA
novo
Ligação
'..--%_q
i^\ ô^ \,
? ? ?------./
,/ //L
lnfecção de E. coli
F
t Ï
Figura 6.18
cos
recombinantes
a
J
ll= I
Mistura do empacotamenlo in vitro
DiÍerentes estratégias de clonagem com um vetor de 1". (a) Utilizando-se a Íorma circular de l. como um plasmÊ deo. (b) Utilizandose os braços esquerdo e direito do genoma de 1,, além do empacotamento in vitro, para a obtenção de um número maior de placas recombinantes.
f
ootamento ra lécula que cr Um cosu também nect
'Fr*"
,.---.---',:!coat
/
\__-/
O último e o entre uma Ín trada no fato
circular
."o*, U
./---\ /\
6.3.5 Fragmentc utilizande
Figura 6.19 ülm cosmídeo típico
ea maneira como dts é utilizado para ndonagem de Íragrmttos de DNA longos.
Ct-ouoeu que o vetor esteja na sua de hidrogênio. imento baseado em trans-
recombinantes será obtia utilizaçfie da forma linear de restrição apropria-
Uma molécula recom os braços do vetor incluindo catenanos consvezes (Figura 6.18b). Se o essas estruturas, es-
GÊrurcn e ANÁLtsE oe
DNA
135
53.5 Fragmentos muito grandes de DNA podem ser clonados utilizando-se um cosmídeo O último e o mais sofisticado tipo de vetor baseado em l" é o cosmídeo, o qual é um híbrido entre uma molécula de DNA de fago e uma de plasmídeo bacteriano, com sua estratégia centrada no fato de que enzimas que empacotam a molécula de DNA de l, dentro do capsídeo protéico do fago necessitam somente dos sítios cos parafuncionar (p. 3a).4 reação de empaGotamento in vitro funciona não somente com genomas de 1,, mas também com qualquer molécula que cilïegue sítios cos separados por um DNA de 37 a 52kb. Um cosmídeo é basicamente um plasmídeo que caÍrega um sítio cos (Figura 6.19a). Ele também necessita de uma marca de seleção, tal como o gene que confere resistência à ampi-
in vitro (p. 101). Os fagos e podem ser utilizados para do empacotamento in
(a) Um cosmídeo típico
BamHl
(b) Clonagem com pJBB
BamHl BamHl
Clivagem com BamHl
I
a
cos
lo-t
BamHl ampH -=l
la-l
pJBB linear pJBB
/
u:rn,
Figura 6.18 DiÍerentes estratégias de clonagem com um vetor de 1". (a) Utilizando-se a Íorma circular de l" como um plasmÊ deo. (b) Utilizandose os braços esquerdo e direito do genoma de À, além do empacotamento in vitro, para a obtenção de um número maior de placas recombinantes.
-
circular
Bam*r
/--=-
BamHr
DNA novo
(r^" "r, Empacotamento
invitro Figura 6.19 lllin cosmídeo típico e a maneira como de é utilizado para sdonagem de ÍragfiEíìtos de DNA longos.
3:l#:.ï15
"*-
/
'h-%
,2"
ç??
Partícuraso"'\ ::J:i::;$:ïJs3[:lïil;:.,",
lnfecção de E.
coli -t--__
U
/ I
,
Meio com ampicilina
b :==1.*iryrr
136
T.
A. Bnowrrr
cilina, além de uma origem de replicação plasmidial, rmayezque os cosmídeos não todos os genes de À e, portanto, não produzem placas. Ao contriírio, colônias são meio seletivo, exatamente como com um vetor plasmidial. um experimento de clonagem com um cosmídeo é realizado como segue (Figura 6.1 O cosmídeo ó aberto em seu único sítio de restrição e novos fragmentos de DNA são in dos. Tais fragmentos são normalmente produzidos pela digestão parcìa7 com uma endonucl* se de restrição, uma vez que a digestão total quase que invariavelmente resulta em fragmentos que são muito pequenos para serem clonados em um cosmídeo. A ligação érealizadade forma que os catenanos são formados. Com a condição de que o inserto de DNA possua o tamanho correto, o empacotamenÍo in vitro cliva os sítios cos e coloca os cosmídeos recombinantes dentro das partículas de fago maduras. Esses fagos À são, então, utilizados para infectar uma cultura de E. coli, apesar, é claro, de que placas não serão formadas. Em vez disso, as células infectadas são plaqueadas em um meio seletivo e colônias resistentes ao antibiótico irão aparecer. Todas as colônias serão recombinantes, já que cosmídeos lineares não-recombinantes são muito pequenos para serem empacotados dentro das cabeças de À.
&zironrÍn &procuraú [ma soh
insertos de I dos nos cror somes), os q
lativamente plasmidiais reduzindo o
tros vetores vantagem. e de capsídeo
clonar fragr nam as cara dos de Pl ( dade de até
6.4
outros vetores de alta capacidade permitem que bibliotecas genômicas sejam construídas
Àe
O principal uso de todos os vetores baseados em À é a clonagem de fragmentos de DNA muito grandes piìra serem suportados por vetores plasmidiais ou M13. Um vetor de substituição, tal como ÀEMBL4, pode carrear até20kb de DNA novo, enquanto alguns cosmídeos podem sustentar fragmentos de até 40 kb. Isso confronta com o tamanho máximo do inserto de cerca de 8 kb para a maioria dos plasmídeos e menor do que 3 kb para os vetores Ml3. A capacidade para clonar fragmentos de DNA tão extensos significa que bibliotecas genômicas podem ser produzidas. Uma biblioteca genômica é um conjunto de clones recombinantes que contém todo o DNA presente em um organismo individual. Uma biblioteca genômica de E. coli, por exemplo, contém todos os genes de E. coli, de forma que qualquer gene desejado pode ser retirado da biblioteca e estudado. Bibliotecas genômicas podem ser mantidas por muitos anos, além de multiplicadas, de maneira que cópias podem ser enviadas de um grupo de pesquisa para outro. A grande questão é quantos clones são necessários para uma biblioteca genômica? A resposta pode ser calculada com a fórmula:
6.5 Vetores p Vetores de
incluindo
r
S
plasmídeos
pla faixa dr Uns poucos ses vetores lizações.
r
Tabela 6.1 organismos
ln(l- p)
r"ír-9ì \
na qual
b)
Né
o número de clones que são necessários, P é a probabilidade de um gene qualquer estarpresente, a é o tamanho médio dos fragmentos deDNA inseridos no vetor, ebéotama-
nho total do genoma. A Tabela 6.1 mostra o número de clones necessário para bibliotecas genômicas em uma variedade de organismos, construídas utilizandtr um vetor de substituição de l" ou um cosmídeo. Não é, de forma alguma, impossível obterem-se várias centenas de milhares de clones, e os métodos utilizados para identificar um clone carregando um gene desejado (Capítulo 8) podem ser adaptados para lidar com números tão grandes, de maneira que bibliotecas genômicas çom esses tamanhos não são, em absoluto, impraticáveis. No entanto, maneiras para se re-
t
l
Espécies
E. coli Saccharom,
Drosophila
Anoz Homem Sapo " Calculado
p
'Fragmenros 'Fragmentos
CLoruneev GÊucn e ANÁLrsE oe
DNA
137
os cosmídeos não possuem
duzir o número de clones necessário para uma biblioteca genômica estão continuamente sen-
colônias são formadas em
do procuradas. Uma solução está no desenvolvimento de novos vetores de clonagem, capazes de suportar insertos de DNA longos. Durante os últimos anos, os progressos nessa área foram centralizados nos cromossomos artificiais bacterianos (BACs, do inglês bacterial artificial chromosomes), os quais são vetores modernos baseados no plasmídeo F (p. 29). O plasmídeo F é relativamente grande e os vetores dele derivados têm uma capacidade maior do que os vetores plasmidiais normais. Os BACs podem sustentar insertos de DNA de até 300 kb de tamanho, reduzindo o tamanho de uma biblioteca genômica humana para somente 30.000 clones. Outros vetores de alta capacidade foram construídos a partir do bacteriófago Pl, o qual possui a vantagem, em relação a À, de ser capaz de comprimir 110 kb de DNA dentro da sua estrutura de capsídeo. Vetores do tipo cosmídeos, baseados em P1, foram projetados e utilizados para clonar fragmentos de DNA variando em tamanho desde 15 até I00 kb. Os vetores que combinam as características de vetores de Pl e BACs, chamados cromossomos artificiais derivados de Pl (PACs, do inglês PI-derived artificial chromosomes), também possuem a capacidade de até 300 kb.
como segue (Figura 6.19b). de DNA são inseriial com uma endonuclearesulta em fragmen. A ligação é realizada de inserto de DNA possua o taos cosmídeos recombientão, utilizados para infecformadas. Em vez disso, as ias resistentes ao antibiótico ídeos lineares não-recomcabeças de
1".
6.5 Vetores para outras bactérias fragmentos de DNA mui. {Jm vetor de substituição, alguns cosmídeos podem máximo do inserto de cerca os vetores Ml3. ignifica que bibliotecas ge. conjunto de clones recombi-
Vetores de clonagem também foram desenvolvidos para várias outras espécies de bactérias, incluindo Streptomyces, Bacillus e Pseudomonas. Alguns desses vetore\ são baseados em plasmídeos específicos para o organismo hospedeiro, enquanto outros são iriasmídeos de ampla faixa de hospedeiro, capazes de replicar em uma variedade de hospedeiros bacterianos. Uns poucos são derivados de bacteriófagos específicos para esses organismos. A maioria desses vetores é muito semelhante aos vetores de E. coli em termos de objetivos gerais e de utilizações.
idual. Uma biblioteca genG forma que qualquer gene genômicas podem ser mantid,e
podem ser enviadas de um
Tabela 6.L Número de clones necessário para bibliotecas genômicas em uma variedade de organismos
biblioteca genômica? A resNúmero de clones'
idade de um gene qualquer idos no vetor, e b é o Íamassário para bibliotecas geum vetor de substituição de de milhares de clones, e desejado (Capítulo 8 I poa que bibliotecas genômientanto, maneiras paÍa se re-
F
F
t
Tamanho do genoma (pb)
Fragmentos
Espécies
de 17 kbà
Fragmentos de 3-5 kb'
E. coli
4,6
x IO6 1,8 x 107
820
4to
3.225
1.500
1,2
10.000
100.000
49.000
Homem
x 108 x 108 3,2x l}e
21.500
5,7
564.000
274.000
Sapo
2,3
4.053.000
1.969.000
S accharomy c e
s
ce
rev
isiae
Dros ophila me lanogaster
Arroz
x
l01o
" Calculado para uma probabilidade (P) de 957o de que um gene qualquer estará presente na biblioteca. 'Fragmentos adequados paÍa um vetor de substituição, tal como }"EMBL4. 'Fragmentos adequados para um cosmídeo.
CLoruneev GÊucn e ANÁLrsE oe
DNA
137
os cosmídeos não possuem
duzir o número de clones necessário para uma biblioteca genômica estão continuamente sen-
colônias são formadas em
do procuradas. Uma solução está no desenvolvimento de novos vetores de clonagem, capazes de suportar insertos de DNA longos. Durante os últimos anos, os progressos nessa área foram centralizados nos cromossomos artificiais bacterianos (BACs, do inglês bacterial artificial chromosomes), os quais são vetores modernos baseados no plasmídeo F (p. 29). O plasmídeo F é relativamente grande e os vetores dele derivados têm uma capacidade maior do que os vetores plasmidiais normais. Os BACs podem sustentar insertos de DNA de até 300 kb de tamanho, reduzindo o tamanho de uma biblioteca genômica humana para somente 30.000 clones. Outros vetores de alta capacidade foram construídos a partir do bacteriófago Pl, o qual possui a vantagem, em relação a À, de ser capaz de comprimir 110 kb de DNA dentro da sua estrutura de capsídeo. Vetores do tipo cosmídeos, baseados em P1, foram projetados e utilizados para clonar fragmentos de DNA variando em tamanho desde 15 até I00 kb. Os vetores que combinam as características de vetores de Pl e BACs, chamados cromossomos artificiais derivados de Pl (PACs, do inglês PI-derived artificial chromosomes), também possuem a capacidade de até 300 kb.
como segue (Figura 6.19b). de DNA são inseriial com uma endonuclearesulta em fragmen. A ligação é realizada de inserto de DNA possua o taos cosmídeos recombientão, utilizados para infecformadas. Em vez disso, as ias resistentes ao antibiótico ídeos lineares não-recomcabeças de
1".
6.5 Vetores para outras bactérias fragmentos de DNA mui. {Jm vetor de substituição, alguns cosmídeos podem máximo do inserto de cerca os vetores Ml3. ignifica que bibliotecas ge. conjunto de clones recombi-
Vetores de clonagem também foram desenvolvidos para várias outras espécies de bactérias, incluindo Streptomyces, Bacillus e Pseudomonas. Alguns desses vetore\ são baseados em plasmídeos específicos para o organismo hospedeiro, enquanto outros são iriasmídeos de ampla faixa de hospedeiro, capazes de replicar em uma variedade de hospedeiros bacterianos. Uns poucos são derivados de bacteriófagos específicos para esses organismos. A maioria desses vetores é muito semelhante aos vetores de E. coli em termos de objetivos gerais e de utilizações.
idual. Uma biblioteca genG forma que qualquer gene genômicas podem ser mantid,e
podem ser enviadas de um
Tabela 6.L Número de clones necessário para bibliotecas genômicas em uma variedade de organismos
biblioteca genômica? A resNúmero de clones'
idade de um gene qualquer idos no vetor, e b é o Íamassário para bibliotecas geum vetor de substituição de de milhares de clones, e desejado (Capítulo 8 I poa que bibliotecas genômientanto, maneiras paÍa se re-
F
F
t
Tamanho do genoma (pb)
Fragmentos
Espécies
de 17 kbà
Fragmentos de 3-5 kb'
E. coli
4,6
x IO6 1,8 x 107
820
4to
3.225
1.500
1,2
10.000
100.000
49.000
Homem
x 108 x 108 3,2x l}e
21.500
5,7
564.000
274.000
Sapo
2,3
4.053.000
1.969.000
S accharomy c e
s
ce
rev
isiae
Dros ophila me lanogaster
Arroz
x
l01o
" Calculado para uma probabilidade (P) de 957o de que um gene qualquer estará presente na biblioteca. 'Fragmentos adequados paÍa um vetor de substituição, tal como }"EMBL4. 'Fragmentos adequados para um cosmídeo.
a
Cnpíruto 7
ion of new cloning vectors. IL is packageable in vitro in
Vetores de Clonagem para Eucariotos
75.4242-6. plasmids. Nucleic Acids vectors carrying polylinker
propagation of large human t 1984) Efïtctent in
vitro
ning a bacteriophage SP6 clonado em um plasmídeo do
in single-stranded -78. [Vetores Ml3.] 300 kilobase-pair fragments of the National Academy of Sc and recoveru of DNA Sciences of the USA, 87,103-7Yectors and host strains:
Vetores para leveduras e outros Íìngos, I 39 Vetores de clonagem para pìantas superiores, 148
Vetores defuríagem para animais, 157
A maioria dos experimentos de clonagem é realizada tendo como organismo hospedeiro E coli, e a maior variedade dos vetores de clonagem que está disponível é para esse organismo. é particularmente popular quando o objetivo do experimento de clonagem é estudar as caracteísticas básicas da biologia molecular, tais como a estrutura e a função do gene. No entanto, sob certas circunstâncias, pode se tornar desejável autilização de um hospedeiro diferente para um experimento de clonagem. Isso é especialmente verdadeiro em biotecnologia (Capítulo 13), na qual o objetivo pode não ser o estudo de um gene, mas a utilização da clonagem para controlar ou melhorar a síntese de um produto metabólico importante (por exemplo, um hormônio, tal como a insulina) ou para modificar as propriedades de um organismo (por exemplo, introduzir a resistência a herbicida em uma planta cultivável). Devemos, portanto, considerar os vetores de clonagem para organismos diferentes de E. coli.
A E. coli
Vetores para leveduras e outros fungos A levedura Saccharomyces cerevisiaeé um dos organismos mais importantes
na biotecnologia.
Assim como seu papel na fabricação de cerveja e na produção de pão, a levedura tem sido utilizada como hospedeiro para a produção de importantes compostos farmacêuticos, a partir de genes clonados (p.29I). O desenvolvimento de vetores de clonagem para levedura foi grandemente estimulado pela descoberta de um plasmídeo presente na maioria das linhagens de S. cerevisiae (Figrxa 7.1). O plasmídeo de 2 ytn, como ele é chamado, constitui-se em um dentre uma quantidade bastante limitada de plasmídeos encontrados em células eucarióticas.
14O
T.A. Bnown
FLP
Figura 7.1 O plasmídeo de 2 pm de levedura. REP| e REP2 esttu envolvidos na replicação do plasmídeo, e FLPcodifica uma proteína que pode converter a Íorma A do plasmÊ deo (mostrada aqui) para a Íorma B, na qual a ordem dos genes Íoi reorganizada pela recombinação intrarnolecular. A Íunção de D não é exatamente conhecida.
7.1.1 Marcas de seleção para o plasmídeo de 2 Frm O plasmídeo de 2 pm é, de fato, uma excelente base para um vetor de clonagem. Ele kb de tamanho, o que é ideal para um vetor, e existe na céluÌa de levedura em número de pias entre 70 e 200. A replicação utriliza a origem de replicação do plasmíÇéó, ìárias enzir fornecidas pela célula hospedeira, além das proteínas codificadas pelos g6nes REPl e Rl presentes no plasmídeo No entanto, tudo não é perfeitamente direto na utilização do plasmídeo de 2 pm como vetor de clonagem. Primeiro, existe a questão da marca de seleção. Alguns vetores de gem para levedura contêm genes que conferem resistência a inibidores, tais como me to e cobre, mas a maioria dos vetores populares faz uso de um tipo radicalmente diferente sistema de seleção. Na prática, um gene de levedura normal é utilizado, geralmente um que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de aminoácidos. um exemplo é o LEU2, que codifica B-isopropil-malato-desidrogenase, uma das enzimas envolvidas na versão de ácido piúvico a leucina. A fim de úllizar LEU2 como marca de seleção, um tipo especial de organismo ro é necessário. o hospedeiro deve ser um mutante auxotrófico, que possui um gene não-funcional. Tal levedura leu2- é incapaz de sintetizar leucina e pode sobreviver some esse aminoácido for fornecido como um nutriente no meio de crescimento (Figura 7.2a). A leção é possível porque os transformantes contêm um plasmídeo que carrega uma c gene LEU2, e, assim, são capazes de crescimento na ausência do aminoácido. Em um mento de clonagem, as células são espalhadas em meio mínimo (ao qual não foi adici qualquer aminoácido). Somente células transformadas são capazes de sobreviver e formar lônias (Figura7.2bt.
72 o
[.8.t2
l[Iìa
@se ü!m
epissômico
7.'|..2 Vetores baseados no plasmídeo de 2 pm: plasmídeos epissôm icos para levedura os vetores derivados do plasmídeo de 2 pm são chamados de plasmídeos epissômicos levedura (YEps, do inglês yeast episomal plasmids).Alguns yEps contêm o plasmídeo pm inteiro, outros incluem somente a sua origem de replicação. um exemplo desse últi po é YEpl3 tFigura 7.3;.
OYEpl3
apr
Prim€irc. ele é u tde
replicação de
ra de pBR322. e
I
Crorunçev GÊNrcA
E ANÁLrsE oE
DNA
141
(a) Levedura leu2-
+
REP| e REP2 estão e.FLP codiÍica
atorm{A do plasmÊ
O meio deve conter leucina
B, na Qgal a ordem Cromossomos - ausência do gene LEU2
recombina]ão intrame
(b) Utilizando LEU2 como uma marca de seleção
TransÍormar levedura
Frgiura7.2 de clonagem. Ele possú lel'edura em número de
plasmídeo, viírias enzi pelosgenes REP| e
gle
r@mo Uma
de se-
em um .
^\ -\
o
LEU2
Somente células transformadas podem sobreviver
Vetor - carrega o gene LEU2 correlo
de 2 pm como Alguns vetores de
Meio mínimo
-
sem leucina
radicalmente diferente izado, geralmente um . Um exemplo é o imas envolvidas na
que possul um gene sobreviver somente imento (Figura 7 .2a). A que cilïega uma cópia ninoácido. Em um exor (ao qual não foi adic de sobreviver e formar
I
@e
contêm o plasmídeo dc exemplo desse último
)
10,7
kb
ori
DNAdepBR322 DNA de 2
- t/'
zz
pLm
DNA do cromossomo
de levedura
Figura 7.3 epissômico de levedura, YEp13.
OYEp13 apresenta várias caracteísticas gerais dos vetores de clonagem para levedura. Primeiro, ele é um vetor de transferência (do inglês shuttle vector). Assim como a origem de replicação de 2 pm e o gene de seleção LEU2, o YEp13 também possui a seqüência inteira de pBR322, e pode, portanto, replicar e ser selecionado tanto em levedura qtanto em E. co-
142
T. A. Bnowlr
Ii,1g1átvârias linhas de raciocínio subjacentes à utilização de vetores de transferência. Uma dessas é que pode ser difícil recuperar a molécula de DNA recombinante de uma colônia de levedura transformada. Isso não é um grande problema com YEps, os quais estão presentes
em células de levedura primeiramente como plasmídeos, mas com outros vetores para levedura, que podem integrar-se em um dos cromossomos da levedura (p. 1a3), a purificação pode ser impossível. Isso é uma desvantagem porque, em muitos experimentos de clonagem, a purificação do DNA recombinante é essencial para identificação da construção correta por intermédio, por exemplo, do seqüenciamento do DNA. O procedimento-padrão para clonagem em levedura é, portanto, realizar o experimento de clonagem inicial com E coli e selecionar recombinantes nesse organismo. Os plasmídeos recombinantes podem, então, ser purificados, caracterizados, e a molécula correta introduzida na levedura (Figura 7.4).
a definição
d
vetor como
r
no DNA cror entre o gene do plasmído permanecer ì ja excisado r
7.1.4 Outros tiP
Além dosY
destacando-t
(1)
7.1.9 UmYEp pode se inserir no DNA cromossômico da levedura
Plasm
ba éYIp5 orotidi são
A palavra "epissômico" indica que umYEp pode replicar como um plasmídeo independentq mas também implica que a integração em um dos cromossomos da levedura podqocorrer (ver
sintétir mente já que
)
breviv
Moléculas de YEpl3 recombinantes
ção oc
(2) O recombinante
Plasm
são ca seqüêr
desejado \
origen
cluind 7.6b) t
TRPl
Vetor religado Meio com ampicilina
Extrair o DNA de vários clones, identiÍicar a molécula correta
Transformar levedura
Levedura recombinante
Meio mínimo sern leucina
-
Í
ltrcombinação entre LEU2plasmidial e d
sorno pode integrar !D{A cromossômico t ra Após a integraF duas cópias do m$malmente uma é Ít a outE
ç
Figura 7.4 Clonagem com um vetor de transÍerência
I
Ëi
t
E colr-levedura, tal comoYEpl3'
Cr-orunceu
Fm outros vetores para lt 1., tp. t+S), a purificação de clonagem,
reahzar o experimento Os plasmídeos ula correta i
levedura
e ANÁLtsE oe
DNA
143
a definição de "epissomo" na página 27). Aintegração ocorre porque o gene carregado pelo vetor como marca de seleção é extremamente homólogo à versão mutante do gene presente no DNA cromossômico da levedura. ComYEpl3, por exemplo, a recombinação pode ocoffer entre o gene LEU2 do plasmídeo e o gene LEU2 mutante da levedura, resultando na inserção
llores de transferência. U inbinante de uma colônia fos, os quais estão
construção correta por
GÊlrcr
i
do plasmídeo inteiro em um dos cromossomos da levedura (Figura 7.5). O plasmídeo pode permanecer integrado, ou um evento de recombinação mais tardio pode fazer com que ele seja excisado novamente.
Outros tipos de vetores de clonagem para levedura Além dos YEps, há vários outros tipos de vetores de clonagem utilizados com S. cerevisae, destacando-se os segunites
(1)
plasmídeo i levedura pode ocorrer (
(2)
:
Plasmídeos integrativos para levedura (YIps, do inglês yeast integrcttive plasmids) são basicamente plasmídeos bacterianos que contêm um gene de levedura. Um exemplo é YIp5, que é pBR322 com um gene URA3 inserido (Figura 7.6a). Esse gene codifica orotidina-5'-fosfato-decarboxilase (uma enzima que cataÌisp um dos passos da rota biossintética para nucleotídeos de pirimidina) e é utllizadolúmo marca de seleção exatamente da mesma maneira como LEU2. UmYIp não pode replicar como um plasmídeo, já que ele não possui qualquer pedaço do plasmídeo de 2 pm, e, em vez disso, a sua sobrevivência depende da sua integração no DNA cromossômico da levedura. A integração ocorre exatamente conforme descrito para umYEP (Figura 7.5). Plasmídeos replicativos para levedura (YRps, do inglês yeast replicative plasmids) são capazes de multiplicarem-se como plasmídeos independentes, pois possuem uma seqüência de DNA cromossômico que inclui uma origem de replicação. Sabe-se que as origens de replicação estão localizadas muito próximas a vários genes de levedura, incluindo um ou dois que podem ser utilizados como marcas de seleção. YRpT (Figura L6b) é um exemplo de um plasmídeo replicativo, composto de pBR322, além do gene TRPI de levedura. Esse gene, que está envolvido na biossíntese do triptofano, localiza-
Meio com ampicilina
YEpl3
\r-euz
f, \ Figura 7.5 entre os genes plasmidial e do cromoswno pode integrar YEp13 no cromossômico da leveduRApós a integração existem úlas cópias do gene LEUZ uma é funcional e a outra, mutada.
LEU2
muÌado
I
I
Recombinação
I
LEU2 --u'>>t&
LEU2
t--J DNA plasmidial
da levedura
144
T.A. Bnowu
clonado, j do produt, Então, combinan cromosso binantes c quando as
(a)Ylp5 URAs
YEp
apre:
plasmíder
últimos
ar
ge que as
em cultur
) (b)YRp7
7,1.5 Cromost de longc
O último cial de le nova piÌrÍ básica so
TRPl
nentes fu
Oc
(1)
dos
(2) Figura 7.6 UmYlp e umYRP.
Doi
sári cro:
(3)
As caç
seadjacenteàorigemdereplicaçãodocromossomo.ofragmentodeDNAdelevedura presente emYRpT contém tanto TRP| quanto a origem' de vetor para levedura é o Três fatores devem ser considerados na decisão de qual tipo o primeiro desses é a fre' clonagem. mais adequado para um determinado experimento de passíveis de serern de transformantes qüência áe transformação, uma medidã do número elevada é transformação de obtidos por micrograma de DNA plasmidial. uma freqüência pouco existe se ou imprescindível, necessária se um número grande àe recombinantes é entre fornecendo elevada, mais DNA inicial. YEps possueà a freqüência de transformação produtivos' bastante são também 10.000 e 100.000 células transformadas por pg. YRps rende menos que 1'000 dando entre 1.000 e 10.000 transformantes por pg, mas umYIp especiais seprocedimentos que transformantes por pg, quase que somente 1 a 10, a menos necessidada o fato reflete YIp jam utilizador. À Uuiiu ireqtiência de transformação de um uma céem retido ser possa vetor de da ocorrência do raro evénto de integração, antes que o
lula de levedura.
cópias: 2O a50 e 5 a lOQ Ademais, YEps e YRps também apresentam o maio. número de apenas uma cópia por com presente urt., um YÌp está usualmente respectivamente. Em "ont a partir do gene proteína da célula. Tais números são important*t i" o objetivo é a obtenção
Uma
de que o:
combina
artificial. várias ce
tihcial,
a
Ct-onneeu GÊr.ircn e AnÁusE oe
DNA
145
clonado, já que com um maior número de cópias do gene, maior será o rendimento esperado do produto protéico. Então, por que alguém haveria de desejar utilizar um YIp? Porque os YIps produzem recombinantes muito estáveis, uma vez que a perda de um YIp que tenha se integrado em um cromossomo ocolTe somente em uma freqüência extremamente baixa. Por outro lado, recombinantes de YRp são muito instáveis, com os plasmídeos tendendo a reunir-se na célula-mãe quando as células-filha brotam, de forma que estas são não-recombinantes; recombinantes de YEp apresentam os mesmos problemas, embora um melhor entendimento sobre a biologia do plasmídeo de 2 trtm tenha permitido que YEps mais estáveis tenham sido desenvolvidos nos últimos anos. Apesar disso, umYlp é o vetor de escolha se a necessidade do experimento exige que as células recombinantes de levedura devam reter o gene clonado por longos períodos em cultura.
7.1,5 Gromossomos artificiais podem serruüilizados para a clonagem de longos pedaços de DNA em leveòúra O último tipo de vetor de clonagem para levedura a ser considerado é o cromossomo artiÍicial de levedura (YAC, do ingTês yeast artificíal chromosome), uma abordagem totalmente nova pÍÌra a clonagem gênica. O desenvolvimento dos YACs foi um subproduto da pesquisa básica sobre a estrutura dos cromossomos eucarióticos, trabalho que identificou os componentes fundamentais de um cromossomo como sendo (Figura 7.7):
(1) (2)
(3)
to de DNA de levedure
de vetor para levedura é o
0 primeiro
desses é a fre' tes passíveis de serem
de transformação elevada é ildível, ou se existe pouco elevada, fornecendo entre são bastante produtivos,
O centrômero, o qual é necessário para os cromossomos serem corretamente distribuídos para as células-filhas durante a divisão celular. Dois telômeros, as estruturas nas extremidades de um cromossomo, as quais são necessárias para as extremidades serem replicadas corretamente, além de impedirem que o cromossomo seja degradado por exonucleases. As origens de replicação, que são posições ao longo do cromossomo, nas quais a replicação do DNA inicia. similares à origem de replicação de um plamídeo.
Uma vez que a estrutura do cromossomo tenha sido assim definida, surgiu a possibilidade de que os componentes individuais pudessem ser isolados por meio de técnicas de DNA recombinante e, depois, reunidos novamente em um tubo de ensaio, criando um cromossomo artificial. Como as moléculas de DNA presentes nos cromossomos naturais de levedura têm várias centenas de quilobases de comprimento, tornou-se possível, com um cromossomo artificial, a clonagem de pedaços de DNA bastante extensos.
Telômero
rende menos que 1.0fi! procedimentos especiais sereflete o fato da necessidapossa ser retido em uma céPosições das
de cópias: 2O a5O e 5 a 108 com apenas uma cópia pm da proteína a partir do genc
origens de replicação
Figura7.7 Estrutura do cromossomo.
Telômero
146
T. A. Bnowlr
A estrutura e a utilização de um vetorYAC Vários vetores YAC foram desenvolvidos, mas cada um construído seguindo as mesmas linhas, com pYAC3 constituindo-se em um exemplo típico (Figura 7.8a). À primeira vista, pYAC3 não se paÍece muito com um cromossomo artificial, mas, com uma avaliação mais cuidadosa, suas características únicas tomam-se aparcntes. O pYAC3 é essencialmente um plasmídeo pBR322. no qual uma certa quantidade de genes de levedura foi inserida. Dois desses genes, URÁ3 e TRPl,iá,haviam sido descobertos como marcas de seleção paraYIp5 eYRp7, respectivamente. Como emYRpT, o fragmento de DNA que contém TRPI também contém uma origem de replicação, mas, em pYAC3, esse fragmento foi prolongado ainda mais para incluir a seqüência chamada CEN4, a qual contém o DNA da região do centrômero do cromossomo 4. O fragmento ZrRPl-oigem-CEN4, portanto, contém dois dos três componentes do cromossomo arti-
hcial. O terceiro componente, os telômeros, é fornecido pelas duas seqüências chama$as IÃ'L. Essas não são por si próprias seqüências teloméricas completas, mas, uma vez no inQrior do riúcleo da levedura, atuam como seqüências de disseminação, sobre as quais os telômdos po-
dem ser con mencionada o experimer
A
estrat(
mente cliva mentos. O fi qüência ZEI
des cegas (5
TACGTA),
r
ção de proto de S. cerevi
ura3,queé Os transfom
nimo, no qu são capazes
to, contendo
crescer em n
)
to de DNA r qual é realiz lônias vermr
(a) pYAC3
Aplicaçõc SUP4
O estímulo i levedura, os mento dos c meiose. Tais te a propaga
11,4 kb
utilizados cc mento em ul
que 100 kb d muito além r (p. 136), ma abriram um I anteriorment nante. Uma de que, sob i ros, permitit mente é encr Os cromr
BamP'l
(b) A estratégia de clonagem com pYAC3
Clivaoem com Bamúl + SnaBl
\ e--w-J Braço BamHl
esquerdo
BamHl
I r
r
Braço direito
nômicas. k ra os vetorer
Ligação com um inserto de DNA com extremidades cegas
UBAS
TEL TRPlori-CEN
|-WZ
I
I r_D
-
DNA inserido
TEL
uma bibliote
Figura 7.8
lizados para
UmvetorYACeamaneia
até 1.400 kb humana pari mas de instal dos pela recc
como ele é utilizado para a clonagem de pedaços de DNA extensos.
Ct-ouneeu GÈrurce e ANÁLtsE oE DNA
r:eguindo as mesmas linhas" \ primeira vista, pYAC3 não iação mais cuidadosa, suas te um plasmídeo pBR32f Dois desses genes, URÁ3 e
il1p5 e YRp7, respectivamencontém uma origem de mais para incluir a seqüêndo cromossomo 4. O fragdo cromossomo art! seqüências chamadas ZEL mÍÌs, uma vez no interior do as quais o1:elôrneros po-
147
dem ser construídos. Isso tudo deixa somente uma outra parte de pYAC3 que não foi ainda mencionada: SUP4, que é a marca de seleção, dentro da qual o DNA novo é inserido durante o experimento de clonagem. A estratégia de clonagem com pYAC3 é como se segue (Figura 7.8b). O vetor é primeiramente clivado com uma combinação de BamHI e SnaBI, cortando a molécula em três fragmentos. O fragmento de BamHI é removido, deixando dois braços, cada um ligado a uma sèqüência TEL e a um sítio de SnaBI. O DNA a ser clonado, o qual deverá possuir extremidades cegas (SnaBI é uma enzima que produz extremidades cegas, reconhecendo a seqüência TACGTA), é ligado entre os dois braços, produzindo o cromossomo artificial. A transformação de protoplastos (p. 110) é, então, utilizada para introduzir o cromossomo artificial dentro de S. cerevisiae. Alinhagem de levedura utilizada é um duplo mutante auxoÍróïrco, trpl ura3- , que é convertido a trpl' ura' pelas duas marcas de seleção do cromossomo artificial. Os transformantes são, portanto, selecionados por intermédio do plaqueamento em meio mínimo, no qual sdt1e19 as células contendo o cromossomo artificial corretamente construído são capazes de crescer. Qualquer célula transformada com um cromossomo artificial incorreto, contendo dois braços esquerdos ou dois direitos, emyez de um de cada, não será capaz de crescer em meio mínimo, pois uma das marcas de seleção estará ausente. A presença do inserto de DNA no vetor pode ser conferida pelo teste para a inativação por inserção de SUP4, o qual é realizado por um simples teste de coloração: colônias brancas são recombinantes, colônias vermelhas não o são.
Aplicações para os vetoresYAC
Figura 7.8 Um vetorYAC e a como ele é utilizado para clonagem de pedaços de DNA extensos.
O estímulo inicial para o desenvolvimento de cromossomos artificiais veio de geneticistas de levedura, os quais desejavam utilizá-los para estudar vários aspectos da estrutura e comportamento dos cromossomos, por exemplo, examinar a segregação dos cromossomos durante a meiose. Tais experimentos determiniÌram que os cromossomos artificiais são estáveis durante a propagação em células de levedura e sugeriram a possibilidade de que eles poderiam ser utilizados como vetorgs para genes muito extensos paÍa serem clonados como um único fragmento em um vetor para E. coli. Diversos genes importantes de mamíferos são maiores do que 100 kb de comprimento (por exemplo, o gene para fibrose cística humano possui 250 kb), muito além da capacidade de todos e dos mais sofisticados sistemas de clonagem em E. coli (p. 136), mas bem dentro do alcance de um vetorYAC. Os cromossomos artificiais, portanto, abriram um caminho para os estudos das funções e maneiras de expressão de genes,que eram, anteriormente, considerados impossíveis de analisar por meio de técnicas de DNA recombinante. Uma nova dimensão desses experimentos foi recentemente fornecida pela descoberta de que, sob algumas circunstâncias, os YACs podem ser propagados em células de mamíferos, permitindo que a análise funcional seja realizada no organismo no qual o gene normalmente é encontrado. Os cromossomos artificiais são igualmente importantes na produção de bibliotecas genômicas. Lembre-se de que, com fragmentos de 300 kb, o tamanho máximo do inserto para os vetores de E. coli de maior capacidade, cerca de 30.000 clones são necessários para uma biblioteca genômica humana (p. 1 37). No entanto, vetores YAC são rotineiramente utilizados para clonar fragmentos de 600 kb, e tipos especiais são capazes de suportar DNA de até 1.400 kb de extensão, estes últimos diminuindo o tamanho de uma biblioteca genômica humana para somente 6.500 clones. Infelizmente, esses "mega-YACs" apresentam problemas de instabilidade do inserto, pois os DNA clonados algumas vezes tornam-se rearranjados pela recombinação intramolecular. Entretanto, YACs têm sido de enorme valor pelo for-
l,
rl
l
1
148
T. A. Bnowlr
necimento de extensos pedaços de DNA clonado, que são utilizados, em larga escala, em projetos de seqüenciamento de DNA.
7.1.6 Vetores para outras leveduras e fungos Vetores de clonagem para outras espécies de levedura e fungos são necessários pÍÌra estudos básicos da biologia molecular desses organismos e para estender as possíveis utilizações de leveduras e fungos na biotecnologia. Plasmídeos epissômicos baseados no plasmídeo de 2 pm de S. cerevisiae sáo capazes de replicar em alguns poucos outros tipos de leveduras, mas a extensão não é ampla o suficiente pÍÌra os vetores de 2 pm serem de utilidade geral. Em qualquer caso, as necessidades da biotecnologia são mais bem satisfeitas pelos plasmídeos integrativoq equivalentes aosYlps, uma vez que eles fornecem recombinantes estáveis que podem ser multiplicados por períodos longos em biorreatores (p.277). Vetores integrativos eficientes estão agora disponíveis para um certo núrpero de espécies, incluindo leveduras, tais como Pichia pastoris e Kluveromyces lqctis, alén{ dgs fungos filamentosos Aspergillus nidulans e Neurospora crassa.
7.2 Vetores de clonagem para plantas superiores Os vetores de clonagem para plantas superiores foram desenvolvidos na década de 1980 e a sua utilização originou as culturas geneticamente modificadas (GM, do inglês geneticallt modified crops), que estão em evidência atualmente. As modificações genéticas das plantas cultiváveis e de outras plantas serão examinadas no Capítulo 15. Aqui serão vistos os vetores de clonagem e como são utilizados. Três tipos de sistemas de vetores têm sido empregados, com uma graduação variada de sucesso, com plantas superiores:
(1) (2) (3)
Vetores baseados nos plasmídeos que o'correm naturalmente em Agrobacterium. Transferência gênica direta utilizando diversos tipos de DNA plasmidial. Vetores baseados nos vírus de plantas.
7.2.1 Agrobacterium tumefaciens: o menor engenheiro genético da natureza Embora nenhum plasmídeo de ocorrência natural seja conhecido em plantas superiores, um plasmídeo bacteriano, o plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens, é de grande importância. O A. tumefaciens é w microrganismo do solo, que caÌrsa a doença do tumor de galhe (crown gall disease) em muitas espécies de plantas dicotiledôneas. A doença do tumor de galha ocorre quando um ferimento no caule permite às bacterias A. tumefaciens invadirem a planta. Após a infecção, as bactérias induzem uma proliferação cancerosa do tecido do caule na região do tumor (Figura 7.9). A capacidade para induzir a doença do tumor de galha está associada com a presença do plasmídeo Ti (indutor de tumor, do inglês tumor inducing) dentro das células bacterianas. Esse é um plasmídeo grande (com mais de 200 kb) que contém numerosos genes envolvidos no processo infectivo (Figura 7.10a). Uma característica extraordiniíria do plasmídeo Ti ó que, após a indução, parte da molécula é integrada no DNA cromossômico da planta (Figurrr 7.10b). Esse segmento, chamado T-DNA, possui entre 15 e 30 kb de tamanho, dependendo da
Figura 7.9 A doença do tumor
de galha.
linhagem. Ele t
lhas como parü plasmídeo Th é tal, além de sel Tais genes taml bactérias utiliz: te programa as
Utilizando o célula vegd Muito rapidarn
vos genes no in nes dentro do l
cromossômico porque o grand
O principal de em um plasr a
inserção de
(1)
u
A estraté
DNA
não
Cloneoev GÊrurcn e ANÁLrsE oe
DNA
149
zados, em larga escala, em Planta saudável
são necessários para estudofi
r as possíveis utilizações dc no plasmídeo de 2 pm ripos de leveduras, mas a exutilidade geral. Em qualquer pelos plasmídeos integrativoc, esúveis que podem ser mulintegrativos efi cientes estão leveduras, tais como nidulans e Ne
vidos na década de 1980 (GM, do inglês
Bactéria invade o Íerimento
Agrobactéria
Divisões celulares rápidas-tumor de galha
de galha e
genéticas das .
Aqui serão vistos os ve
Figura 7.9
ftdoença do tumor uma graduação variada de
de galha.
em Agrobacterium. .A plasmidial.
linhagem. Ele é mantido de uma forma estável na célula da planta e transmitido às células-filhas como paÍe integrante dos cromossomos. Porém, a característica mais extraordinária do plasmídeo Ti é que o T-DNA contém oito ou mais genes que são expressados na célula vegetal, além de serem responsáveis pelas propriedades cancerígenas das células transformadas.
genético
Tais genes também comandam a síntese de compostos incomuns, chamados de opinas, que as bactérias utilizam como nutrientes (Figura 7.10c). Em resumo, o A. tumefaciens geneticamente programa as células da planta pila seu próprio benefício.
em plantas superiores, , é de grande i a doença do tumor de A doença do tumor de A. tumefocierzs invadirem cancerosa do tecido do associada com a presença das células bacterianas.
genes envolvidor
do plasmídeo Ti é
ico da planta
(
de tamanho, depende
Utilizando o plasmídeoTi para introduzir novos genes em uma célula vegetal Muito rapidamente foi percebido que o.plasmídeo Ti poderia ser utilizado para introduzir novos genes no interior de células vegetais. Tudo que seria necessário seria inserir os novos genes dentro do T-DNA e, então, abaciériarealizaria o trabalho árduo de integrá-los no DNA cromossômico da planta. Na prática, isso demonstrou ser uma proposta enganosa, sobretudo porque o grande tamanho do plasmídeo Ti dificulta a manipulação da molécula. O principal problema é, obviamente, que um sítio de restrição único é uma impossibilidade em um plasmídeo de 200 kb de tamanho. Estratégias modernas foram desenvolvidas para a inserção de um DNA novo dentro do plasmídeo Ti. Duas são, em geral, utilizadas:
(1)
A estratégia dos vetores binários (Figura 7.1 l) está baseada na observação de que o TDNA não necessita estar fisicamente ligado ao restante do plasmídeo. Um sistema de
150
T.A. Bnown
(a) Um plasmídeoTi T-DNA (oncogenes)
Região de virulência
Figura 7.11 Região de especificidade ao hospedeiro
-/l
A estratégia sentes na rÍ rido para o I no plasmíde
(b) lntegração doT-DNA no genoma da planta
dois p
do pla
getais suem Recombinação
f
DNA cromossômico da planta
r-oÍí-------r
ï-DNA integrado
bastar nicas-
(2)
A
estr
basear
na por
que, s
de intr
tanto,
duziú
combi ta lev:
(c) Expressão dos genes doT-DNA
ÍnOSS(
T-DNA
-
\
DNA da planta
Produçãr Se bactéria
\
Figura 7.10
uma planta lulas do tur mente, de p vo gene em Existem tura de célu
O plasmídeo Ti e sua integração no DNA cromossômico da planta, após a infecção com Á. tumefaciens.
ma maneira
Rápida divisão celular
Síntese de opinas
getais e pro
Croruncev GÊNrcA
E ANÁLrsÊ
oe DNA
151
Sítio de restrição único
Região de
virulência Região de especificidade ao hospedeiro
Plasmídeo A
-170 kb
O Plasmídeo B
-20
kb
Figura 7.11 ao hospedeiro
A estratégia do vetor binário. Os plasmídeos A e B complementam um ao outro quando presentes na mesma célula de A. tumeíaciens. O T-DNA carregado pelo plasmídeo B é transferido para o DNA cromossômico da planta p,ç!as proteínas codiÍicadas pelos genes presentes / '', no plasmídeo A. dois plasmídeos, com o T-DNA em uma molécula relativamente pequena, e o restante do plasmídeo na forma normal, é da mesma forma eficiente para transformar células vegetais. De fato, algumas linhagens de A. tumefaciens, e agrobactérias relacionadas, possuem sistemas naturais de plasmídeos binários. O plasmídeo do T-DNA é pequeno o bastante para possuir um sítio de restrição único e ser manipulado utilizando-se de técnicas-padrão.
cromossomrco
(2)
A estratégia da co-integração (Figura 7.12) ttrliza um plasmídeo inteiramente novo, baseado no pBR322 ou um vetor pma E. coli semelhante, porém contendo uma pequena porção do T-DNA. A homologia entre a nova molécula e o plasmídeo Ti pressupõe que, se ambos estão presentes na mesma célula de A. tumefaciens, a recombinação pode integrar o plasmídeo pBR dentro da região do T-DNA. O gene a ser clonado é, por-
tanto, inserido dentro de um sítio de restrição único do pequeno plasmídeo pBR, introduzido em células de A. tumefaciens qtte contêm um plasmídeo Ti, e o processo de recombinação natural permite a integração do novo gene no T-DNA. A infecção da planta leva à inserção do novo gene, juntamente com o restante do T-DNA, dentro dos cromossomos da célula vegetal. da planta
Ì
F, : I i
após a infecção com Á.
Produção de plantas transÍormadas com o plasmídeoTi Se bactérias A. tumefacien.ç que contêm um plasmídeo Ti modificado são introduzidas em uma planta pela maneira natural, por infecção de um ferimento no caule, então somente as células do tumor de galha resultante irão possuir o gene clonado (Figura 7.13a).Isso é, obviamente, de pouco valor para o biotecnologista. Ao contriírio, uma maneira de introduzir o novo gene em cada uma das células da planta é necessária. Existem várias soluções, a mais simples sendo infectar não a planta madura, mas uma cultura de células vegetais ou protoplastos (p. I l0) em meio líquido (Figura 7.13b). Células vegetais e protoplastos, cujas paredes celulares foram reconstruídas, podem ser tratados da mesma maneira que microrganismos: por exemplo, eles podem ser plaqueados em um meio sele-
152
T.A.Bnowru
a fim de isolarem-se transformantes. Uma planta madura, regenerada a partir de transformadas, irá conter o gene clonado em todas as células e irá passar o gene clonado a sua descendência. No entanto, a regeneração de uma planta transformada pode ocorrer somente se o vetor "desarmado", foi de forma que as células transformadas não apresentam as propriedades cerígenas. O desarmamento é possível porque os genes cancerígenos, todos os quais se si no T-DNA, não são necessários para o processo infeccioso; a infectividade é controlada, cipalmente, pela região de virulência do plasmídeo Ti. De fato, a única parte do plasmídeo que está envolvida na infecção são duas seqüências repetidas, de 25 pb, encontradas nas midades esquerda e direita da região integrada no DNA da planta. Qualquer DNA tre essas duas seqüências repetidas será úatado como "T:DNA" e transferido para a planta. na-se, portanto, possível remover todos os genes cancerígenos de um T-DNA normal e tuí-los com um conjunto inteiramente novo de genes, sem prejuízos ao processo infecciosoNumerosos vetores de clonagem com Ti desarmados estão disponíveis atualmente, exemplo típico sendo o vetor binário pBIN19 (Figura 7.14). As et{gmidades esquerda e reita do T-DNA presentes nesse vetor flanqueiarrruma cópia do {enè\lacZ', contendo rosos sítios de clonagem, e um gene para resistência à canamicina, que funciona após a
tivo,
Íigua7"13 (b poÍ
Plasmídeo pequeno tipo pBR
Íê
&
Especificidade ao
(
\regÊ
hospedeiro
Fragmento do T-DNA
s(>
t
ürnor de
'1/=3
'-\ Gene a ser
-zl
'frblTransncr-
una su$ lanbdas dadaÍÌta á fans-
I Plasmídeo Ti normal
Recombinação
clonado
5ÍÍnadas-
Virulência
Gene novo
(a) lnum íeri-
_*
Figura7.12 Plasmídeo Ti recombinante
A estratégia
co-integração
tiÉrbdeï
çpaonbre red
Cr-oruncev GÊNtcA E AruÁusE oE DNA
paÍir de células pÍìssar o gene clonado para
re_qenerada a
(a) A inÍecção de um Íerimento por Á. tumeíaciens Íecombinante
ocorrer somente se o vetor Ti tam as propriedades can-. todos os quais se situem ividade é controlada, prina única parte do plasmídeo fi 5 pb, encontradas nas extreQualquer DNA colocado entransferido para a planta. Torum T-DNA normal e substi ao processo infeccioso. disponíveis atualmente, nn extremidades esquerda e digene lacZ', contendo numeque funciona após a inte-
)]=-
) Aplicação da bactéria
Gene clonado somente está presente no tumor de galha
fecombinante (b) TransÍoÍmação de células vegetais em cultura lnoculação com A. tumefacìens recombinante
o
Bactéria
@'
+
Célula vegetal
Plaqueamento em meio sólido
Células vegetais em suspensão Calos transÍormados
Figura 7.13 TransÍormação de vegetais por
A-tumeíaciensrerwnbinante. (a) ln-
TransÍerência para meio com equilíbrio de hormônios de crescimento diÍerentes
Formação de galhos
@ão
de um Íericélulas vegellds transÍormadas presentes soiilrEnte no tumor de gúta. (b) TransÍorde uma suscelular: todas cáulas da planta são transÍormadas.
,un," no
*,o
q NZ 77777-7 Planta transformada
Sítios de restrição Repetição esquerda
Figura7.12 A estratégia da co-integração.
<-''.-1
Figura7.14 iÍluetor binário de Ti, pBlN19
. l1s11q
= eêrlê
que conÍere resistência à canamicina.
Repetição direita
154
T. A. Bnowr.r
gração das seqüências do vetor dentro do cromossomo da planta. Como com o vetor de transferência de levedura (p. 1a0), as manipulações iniciais, que resultam na inserção do gene a ser clonado em pBIN19, são realizadas em E coli, amolécula de pBIN19 recombinante correta é, então, transferida para A. tumefaciens e, depois, para a planta. As células vegetais transformadas são selecionadas por plaqueamento em meio ágar contendo canamicina.
que ele é diÍ há necessidar
De fato, a int mossomo da
A transfer
O plasmídeo Ri
mente um pla leção apropri
Durante os anos, surgiu também o interesse no desenvolvimento de vetores de clonagem para plantas baseados no plasmídeo Ri de Agrobacterium rhízogenes. Os plasmídeos Ri e Ti têm muitas semelhanças, a diferença principal sendo que a transferência do T-DNA de um plasmídeo Ri para a planta não resulta em um tumor de galha, mas na doença daraiz cabeluda, caractenzada por uma proliferação massiva de um sistem?radicular altamente ramificado. A possibilidade de crescimento de raízes transformadas e\r uma densidade elevada em cultura líquida tem sido explorada pelos biotecnologistas como uma potencial maneira de ob' terem-se quantidades elevadas de proteínas, a partir de genes clonados em plantas (p.296).
clonado forar plasmidial pa
Limitações de clonagem com os plasmídeos de Agrobacterium As plantas superiores são divididas em duas amplas categorias, as monocotiledôneas e as dicotiledôneas. Vários fatores foram combinados para facilitar a clonagem de genes em dicotiledôneas, tais como o tomate, o tabaco, abatata, a ervilha e o feijão, porém muito mais complicada é a obtenção dos mesmos resultados com as monocotiledôneas. Isso tem sido frustrante, pois estas incluem o centeio, a cevada, o artoz e o milho, as quais são as plantas
podem ser reg sivelmente m Um métor
leno-glicol,
cr
DNA sobre a 7.16a). Ospn
ra 7.16b) ou c tas com DNA
Após o tn que estimula
meio seletivo quais plantas
Agrobacteriui
cultiváveis mais importantes e, portanto, o alvo mais desejado para projetos de engenharia genéÍica.
A principal dificuldade resulta do fato de que, na natuteza, A. tumefaciens
e
A. rhizoge-
nes infectam somente plantas dicotiledôneas; as monocotiledôneas estão excluídas da faixa de hospedeiros naturais. Durante algum tempo acreditou-se que essa barreira natural era in-
superável e que as monocotiledôneas eram totalmente resistentes à transformação com vetores Ti e Ri, mas, finalmente, técnicas artificiais pararcahzar a transferência do T-DNA foram desenvolvidas. Isso, porém, não é o final da história. A transformação com um vetor de Agru> bacterium normalmente envolve a regeneração de uma planta intacta, a partir de culturas de protoplastos, células ou calos transformados. A facilidade com a qual uma planta pode ser
regenerada depende bastante da espécie em particular envolvida e, mais uma vez, as plantas mais difíceis são as monocotiledôneas. Tentativas para solucionar esse problema têm centralizado a utilização da biobalística - o bombardeamento com microprojéteis (p. 111) - para introduzir o DNA plasmidial diretamente no interior de embriões vegetais. Embora esse seja um processo de transformação bastante violento, ele não aparenta ser tão danoso pÍìra os embriões, os quais ainda continuam seu programa de desenvolvimento normal para produzir plantas adultas. A estratégia tem sido bem-sucedida com o milho e diversas outras monocotiledôneas importantes.
7.2.2 Clonagem gênica em plantas pela transÍerência direta de genes A biobalística mascara a necessidade de utlTizar Agrobacterium como maneira de transferir o DNA para dentro das células vegetais. A transferência gênica direta entra no processo urn passo à frente e dispensa, em geral, o plasmídeo Ti.
A transferência gênica direta está baseada na observação, primeiramente realizada em 1984, de que um plasmídeo bacteriano supertorcido, embora incapaz de replicar em uma célula vegetal por si próprio, pode tomar-se integrado, por meio de recombinação, em um cro mossomo da planta. O evento de recombinação é pouco entendido, mas é praticamente certo
Figura Z.
fursÍerência gênica dire
Cloneorv Como com o vetor de m na inserção do gene a pBINl9 recombinante As células vegetais
de vetores de clonagem . Os plasmídeos Ri e
flerência do T-DNA de mas na doença
daraiz
radicular altamente rami uma densidade elevada uma potencial maneira de
emplantas (p.296)-
Agrobacterium as monocotiledôneas e a clonagem de genes em e o feijão, porém muito
iledôneas. Isso tem si
ilho,
as quais são as pl para projetos de en
GÊNtcA E Ar'rÁlrse oe
DNA
que ele é diferente da integração de um vetor de levedura no cromossomo (p. 143), pois não há necessidade de uma região de homologia entre o plasmídeo bacteriano e o DNA da planta. De fato, a integração parece ocolïer aleatoriamente em qualquer posição em qualquer cromossomo da planta (Figura 7.15). A transferência gênica direta, portanto, faz uso de DNA plasmidial supertorcido, possivelmente um plasmídeo bacteriano simples, tal como pBR322, dentro do qual uma marca de seleção apropriada (por exemplo, o gene que confere resistência à canamicina) e o gene a ser clonado foram inseridos. A biobalística é freqüentemente utilizada para introduzir o DNA plasmidial para dentro de embriões vegetais, mas, se as espécies que estão sendo modificadas podem ser regeneradas a partir de protoplastos ou células únicas, então outras estratégias, possivelmente mais eficientes que a biobalística, são possíveis. Um método envolve a ressd,qpensão dos protoplastos em uma solução viscosa de polietileno-glicol, composto polimérico)-negativamente carregado, que é utilizado para precipitar o DNA sobre as superfícies dos protoplastos e para induzir a entrada por endocitose (Figura 7 .l6a). Os protoplastos também podem ser fusionados com lipossomos contendo DNA (Figura7 .l6b) ou células intactas podem ser vigorosamente agitadas com agulhas de sílica cobertas com DNA, as quais perfuram a parede celular e transferem o DNA para o interior. Após o tratamento, os protoplastos são deixados durante alguns dias em uma solução que estimula a regeneração das paredes celulares. As células, então, são espalhadas sobre meio seletivo para identificar transformantes e para fornecer culturas de calos, a partir das quais plantas intactas podem desenvolver-se (exatamente como descrito para o sistema com A g ro b act e rium, Figlur a 7. 1 3b).
A. tume.faciens e A. rhi estão excluídas da essa barreira natural era i à transformação com com um vetor deÁg tacta, a partir de culturas a qual uma planta pode e. mais uma vez, as pla esse problema têm ce roprojéteis (p. 111) vegetais. Embora esse nta ser tão danoso para imento normal para produzi e diversas outras
Transformação de protoplastos vegetais
-.-* o$ts-
pBR322
\
supertorcido
\
Recombinação não-homóloga
direta de genes como maneira de transferir direta entra no processo urn
primeiramente realizada en apaz de replicar em uma cérecombinação, em um cr<> mas é praticamente certo
155
Figura 7.15
'lfiansÍerência gênica
di
reta.
Gene novo inserido no DNA da planla
156
T. A. Bnowrl a
do DNA viral sobre
(a) Precipitação de DNA
. Protoplastos vãgetais
DNA ) )
)
J
I
ria os vírus por toda O potencial dos' rios anos, mas sem ! vírus de plantas pos como possíveis vetc mais difíceis de real
riores são conhecidi
condições ideais par
Caulimovírus cr
Embora um dos pri-r ano de 1984, tenhau nabo, duas dificuldar (b) Fusão com lipossomos contendo DNA
A primeira foi ç la necessidade de en regiões não-essencia
Protoplasto vegetal
K, ---/ ìo/ DNA
fìca muito limitada- I blema por meio da u gomídeos (p. 125). Ìt da couve-flor (CaM senciais, o que sienil prio, comandar a inft genoma de CaÌvfV n tor de clonagem seja Essa abordagem é a extremamente lin tos de clonagem a so polhos e couves-flori tica como fontes de; são utilizados para a plasmídeo Ti ou pela
o
o
\/
Lipossomos
)
,ãa DNA transferido para o núcleo
ízJ
\J
K
Lipossomo Íusionado
Figura 7.16 TransÍerência gênica direta por meio de (a) precipitação de DNA na superfície dos protoplastos, e (b) Íusão de protoplastes com lipossomos contendo DNA.
Geminivírus cor
E sobre os geminivíl cluem plantas, tais o para essas e outras n tos de dificuldades.
7-2-3 Tentativas para utilizar vírus de plantas como vetores de clonagem Versões modificadas dos bacteriófagos l, e
Mi3 são vetores de clonagem importantes para E. maioria das planras está sujeitã à infeição viral, poderiam, dessa forma, os vírus ser utilizados para clonar genes em plantas? Em caso positivo, eles poderiam ser muito mais convenientes para utilização do que outros tipos de vetãres, porque, com muitos vírus, seria possível a transformação ser obtida simplesmente por meio Oa ffcçao coli (Capítrilo 6). Considerando que
r
alguns geminivírus adicional que tenha quisas nos últimos e ençontrar aplicações cente, previsto para
[3
Vetores de clol
a
Esforços considerár
clonagem gênica en síntese de proteína
Crounorv
GÊrurcn e ANÁLtsE oe
DNA
157
t:
do DNA viral sobre a superfície de uma folha. O processo de infecção natural, então, espalharia os vírus por toda a planta.
O potencial dos vírus de plantas como vetores de clonagem vem sendo explorado há vários anos, mas sem grande sucesso até o momento. Um problema é que a grande maioria dos vírus de plantas possui genomas não de DNA, mas de RNA. Vírus de RNA não são tão úteis como possíveis vetores de clonagem, pois as manipulações com RNA são particularmente mais difíceis de realizar. Somente duas classes de vírus de DNA que infectam plantas superiores são conhecidas, os caulimovírus e os geminivírus, mas nenhuma dessas apresenta condições ideais para a clonagem gênica.
Caulimovírus como vetores
Figura 7.16 Transferência gênica direta por meio de (a) precipitação de DNA na sw perf ície dos protoplastos" e (b) Íusão de protoplastos com lipossomos corr tendo DNA.
vetores rclonagem importantes para
sujeita à infecção viral, lantas? Em caso positivo, .tros tipos de vetores, lesmente por meio da f ! i
:
Embora um dos primeiros experimentos bem-sucedidos de modificação genética de plantas, no ano de 1984, tenha utilizado um vetor de caulimovírus para clonar um novo gene em plantas de nabo, duas dificuldades gerais com esses vírus limitaram sua utilidade. A primeira foi que o tamanho total do genoma de um caulimovírus é, como À, controlado pela necessidade de empacotá-lo no interior de seu capsídeo protéico. Mesmo após a deleção de regiões não-essenciais do genoma do vírus, a capacidade para cÍÌrïegaÍ um DNA inserido ainda fica muito limitada. Pesquisas recentes têm mostrado que pode ser possível solucionar esse problema por meio da utilização da estratégia do vírus auxiliar, semelhante às utilizadas com os fagomídeos (p. 125). Nessa estratégia, o vetor de clonagem é o genoma de um vírus do mosaico da couve-flor (CaMV, do inglês cauliflower mosaic virus) que não possui vários dos genes essenciais, o que significa que ele pode carregar um gene longo inserido, mas não pode, ele próprio, comandar a infecção. As plantas são inoculadas com o DNA do vetor, juntamente com um genoma de CaMV normal. O genoma viral normal forrece os genes necessários para que o vetor de clonagem seja empacotado pelas proteínas virais e espalhado por toda a planta. Essa abordagem tem um potencial considerável, mas não resolve o segundo problema, que é a extremamente limitada faixa de hospedeiros dos caulimovírus. Isso restringe os experimentos de clonagem a somente umas poucas plantas, principalmente brássicas, tais como nabos, repolhos e couves-flores. Os caulimovírus têm, entretanto, sido importantes na engenharia genética como fontes de promotores extremamente ativos que funcionam em todas as plantas e que são utilizados para a obtenção da expressão de genes introduzidos por meio da clonagem com o plasmídeo Ti ou pela transferência gênica direta.
Geminivírus como vetores E sobre os geminivírus? São eles interessantes sobretudo porque seus hospedeiros naturais incluem plantas, tais como o milho e o centeio, e eles poderiam, portanto, ser vetores potenciais para essas e outras monocotiledôneas. Mas os geminivírus apresentam seus próprios conjuntos de dificuldades, sendo um dos problemas que, durante o ciclo de infecção, os genomas de alguns geminivírus sofrem rearranjos e deleções, os quais iriam embaralhar qualquer DNA adicional que tenha sido inserido, uma desvantagem óbvia para um vetor de clonagem. Pesquisas nos últimos anos têm focalizado tais problemas e os geminivírus estão começando a encontrar aplicações especializadas na clonagem em plantas, com um papel importante e crescente, previsto para o futuro.
Vetores de clonagem para animais Esforços consideráveis foram aplicados no desenvolvimento de sistemas de vetores para a clonagem gênica em células animais. Esses vetores são necessários na biotecnologia para a síntese de proteínas recombinantes a partir de genes que não são expressos corretamente
158 ï
A. Bnowr
quando clonados emE. coli ou levedura (Capítulo l3), além de métodos para clonagem em humanos, que estão sendo procurados por biologistas moleculares clínicos, na tentativa de desenvolver técnicas para a terapia gênica (p. 31a), na qual uma doença étratadapor meio dr introdução de um gene clonado dentro do paciente. O aspecto clínico sugere que a maior atenção tem sido direcionada aos sistemas de clonagem para mamíferos, mas progressos importantes também foram obtidos com insetos. A clo. nagem em insetos é interessante, pois utiliza um tipo de vetor completamente novo, o qrrrl ainda não havia sido encontrado. Iremos, portanto, examinar os vetores para insetos, antes de frnalizat o capítulo com uma visão geral dos métodos de clonagem utilizados com mamíferm"
7.3.1 Vetores de clonagem para insetos A mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, foi, e ainda é, um dos mais importantes org& nismos-modelo usados pelos biólogos. Seu potencial foi primeiramente reconhecido pelo famoso geneticista Thomas Hunt Morgan, que, em 1910, começou arealizar cruzamentos genéticos entre moscas-das-frutas com colorações de olhos diferentes e outras características hereditárias. Tais experimentos conduziram a técnicas, ainda utilizadas atualmente, para o mapeamento de insetos e outros animais. Mais recentemente, a descoberta de que os genes de seleção homeótica de Drosophila os genes que determinam a identidade das estruturas corporais da mosca são intimamentc relacionados aos genes equivalentes em mamíferos fez com que a D. melanogasterfosse utilizada como um modelo para o estudo dos processos de desenvolvimento humano. A importância da mosca-das-frutas na biologia moderna torna imperativo que vetores para a clonagenr gênica nesse organismo estejam disponíveis.
Elementos P como vetores de clonagem para Drosophita O desenvolvimento de vetores de clonagem p ara Drosophila tem seguido um caminho diferenutilizado com bactérias, levedura, plantas e mamíferos. Nenhum plasmídeo é coúecido em Drosophila e, embora a mosca-das-frutas seja, como todos os organismos, suscetível te daquele
à infecção por vírus, esses não têm sido empregados como base paÍa vetores de clonagem. Ao contrário, a clonagem em Drosophila uttlizaum transposon, chamado de elemento p. Transposons são comuns em todos os tipos de organismos. Eles são pedaços curtos de DNA (usualmente menores que l0 kb de comprimento), que podem se movir dsuma posição para outra no cromossomo de uma célula. Os elementos P, os quais são um de viírios tipos de transposons de Drosophila, possuem 2,9 kb de comprimento e contêm três genes flanqueados por seqüências curtas, invertidas e repetidas em ambos os lados do elemento (Figura7.l7a)Os genes codificam a transposase, a enzima qu e realizao processo de transposiçãã, e as repetições invertidas formam as seqüências de reconhecimento, que permitem que a enzima identihque as duas extremidades do transposon inserido. Assim como se movem de um sítio para outro dentro de um único cromossomo, os elementos P também podem saltar entre cromossomos, ou entre um plasmídeo que caÍïega um
elemento P e um dos cromossomos da mosca (Figura 7.|7b).Esse último evento é a chave para a utllização dos elementos P como vetores de clonagem. O vetor é um plasmídeo que cop tém dois elementos P, um dos quais contém o sítio de inserção para o DNA que irá ser clonado. A inserção de um DNA novo dentro desse elemento P resulta na intemrpçao de seu gene da transposase, de maneira que tal elemento torna-se inativo. O segundo elernento R presente no plasmídeo, é, portanto, aquele que possui a versão intacta do gene da transposas". A "ondição ideal é que esse elemento P não deva ser transferido para os cromossomo s de Drosophila, de forma que ele tem suas "asas coÍadas": suas repetições invertidas são removidas; as-
Figura7.17
Clonagem em I Transposição * trutura de um vt de clonagem (R um gene da trar "asas cortadas'
sim, a transposa clonado foi inset frutas. A transpo elemento P mod ocorfe dentro do
Crouacev GÊnrcr e AruÁuse oe
métodos para clonagem clínicos, na tentativa de é tratada por meio
Genes
-
um caminho
/ \ ---ì f"":--Ì---'-7-'1 F.r:------]
r-:
r
Repetições terminais invertidas
(b) A transposição de um elemento P
ïransposição
a
-.,'
/-\
homeótica de Drosophila mosca - são inti D. melanoga,r/er fosse imento humano. A i vetores para a c
159
(a) A estrutura de um elemento P
aos sistemas de obtidos com insetos. A pletamente novo, o para insetos, antes utilizados com mami
dos mais importantes reconhecido pelo arealizar cruzamentos e outras caracteísticas atualmente, para o
DNA
\
/ \
--'t
Elemento P inserido em um cromossomo da mosca
--/
Elemento P carregado pelo plasmídeo
(c) A estrutura de um vetor de clonagem de elemento p
-F'Íenhum plas mídeo é conlrc-
os organismos, suscetível vetores de clonagem. Ao de elemento P.
Eles são pedaços curtos de se mover de uma posição
são um de viírios tipos de três genes flanqueadul
do elemento (Figura l.lla). de transposição, e as repe= que a enzima idenuruco cromossomo, os ele_ rplasmídeo que caÍrega um último evento é a chave paé um plasmídeo que cono DNA que irá ser clona-
na rntem;pção de seu gene elemento P, presengene da transposase. A con-
cÌomossomo s de D ro s ophidas são removidas; as-
ElemenÌo com "asas cortadas"
R/ -----_|r-l---'-]l---------'.]''
,,\/ì ^ '
Repetições
|
invertidas
-'. DNA pìasmidial
Figura7.17 Clonagem em Drosophila com um vetor de elemento P. (a) Estrutura de um elemento p. (b) Transposição de um elemento P de um.plasmídeo para um cromossomo da mosca. (c) Estrutura de um vetor de clonagem de elemento P. O elemento P à esquerda contém um sítio de clonagem (R) que interrompe seu gene da transposase. O elemento p à direita possui um gene da transposase intacto, mas não pode transpor a si mesmo, porque ele tem suas "asas cortadas" - ele não possui suas repetições terminais invertidas.
sim, a transposase não o reconhece como um elemento P legítimo. lJma vez que o gene a ser clonado foi inserido no vetor, o DNA plasmidial é microinjetado em embriões da mosca-dasfrutas. A transposase fornecida pelo elemento P de asas cortadas comanda a transferência do elemento P modificado para o interior de um dos cromossomos da mosca-das-frutas. Se isso ocorre dentro do núcleo de uma linhagem germinativa, então a mosca adulta, que se desenvol-
160
ï. A. Bnowlr verá a partir do embrião, irá conter cópias do gene clonado em todas as suas células. A c gem com o elemento P foi primeiramente desenvolvida na década de 1980 e tem fornec inúmeras contribuições importantes para a genéticade Drosophila.
Vetores de clonagem baseados em vírus de insetos Embora os vetores virais não tenham sido desenvolvidos para a clonagem gênica em de vírus, o baculovírus, tem desempenhado um papel importante na c gênica com outros insetos. A principal utilização dos vetores de baculovírus está na prod de proteína recombinante, assunto ao qual iremos retornar quando considerarmos esse no Capítulo 13.
phila,umtipo
7.3.2 Clonagem em mamíferos Até o momento, a clonagem gênica em mamíferos
é
realizada devido a uma dentre as três
zões seguintes:
(1) (2)
(3)
Para a obtenção de um gene-nocaute, que é uma técnicrúrnportante, utilizada para xiliar na determinação da função de um gene não-ider{tificado (p. 268). Esses exp mentos são normalmente realizados com roedores, comò o camundongo, por exeml Para a produção de proteína recombinante em uma cultura de células de mamífero, mo em uma técnica relacionada de cultivo (pharmíng), a qual envolve a modific
genética de um animal defazenda, de forma que ele sintetize uma proteína como um produto farmacêutico, freqüentemente em seu leite (p.29D. Na terapia gênica, na qual células humanas são modificadas a fim de tratar uma ça (p. 315).
Vetores de clonagem para mamíÍeros Durante muitos anos, imaginou-se que os vírus provariam ser a chave para a clonagem mamíferos. Essa expectativa foi apenas parcialmente concretizada. O primeiro experi de clonagem envolvendo células de mamíferos foi realizado em 1919, com um vetor no vírus 40 do macaco (SV40, do inglês simian virus 40). Esse vírus é capaz de infectar rias espécies de mamíferos, realizando um ciclo lítico em alguns hospedeiros e um ciclo gênico em outros. O genoma possui 5,2 kb de tamanho (Figura 7.18a), contendo dois tos de genes, os genes "iniciais", expressados bem no início do ciclo de infecção e que ficam proteínas envolvidas na replicação do DNA viral, e os "tardios", que codificam as teínas do capsídeo viral. SV40 apresenta os mesmos problemas que ì" e os caulimovírus plantas, que é o limite restrito de empacotamento de uma quantidade de DNA novo que ser inserida no genoma. A clonagem com SV40 envolve, portanto, a substituição de um mais dos genes existentes pelo DNA a ser clonado. No experimento original, um segmento região gênica tardia foi substituído (Figura 7.18b), mas a substituição de um gene inicial bém é uma opção. Com os anos, desde 1919, inímeros outros tipos de vírus foram utilizados para clonar nes em mamíferos. Os adenovírus permitem que fragmentos mais extensos de DNA sej clonados, dos que são possíveis com um vetor SV40, embora eles sejam mais difíceis de nipular, devido aos genomas serem maiores. Os papilomaúrus, os quais também apresen uma capacidade relativamente alta para o DNA a ser inserido, apresentam a vantagem i tante de permitir que uma linhagem celular estável seja obtida. Muitos vírus de mamíferos destroem suas células hospedeiras logo após a infecção, forma que truques especiais são necessários, caso esses vírus sejam utilizados para qu finalidade que não sejam experimentos de transformação de curta duração. Os papi
i
L
Figun
S/40 e um exemplo
c
uüização como um ve únagem. Para clonar m da p-globina de coe fragmento de restriç tfidlll a BamHlfoidel (resultando em SVG substituído com o ge
c{
bovinos (BP ciclo de infer multicópia cr lula de camu lular. Vetores
plicação tantr dução de pro Até o mor de genes em
r
à qual se reto
Clonagem
Uma das raze em células de era a maneira
Embora se
tre
rianos, ou có1
Croraeeu GÊNrcA
todas as suas células. A c ada de 1980 e tem f
E
AruÁuse oe DNA
161
(a) O genoma de SV40
íla.
Híndll a clonagem gênica em papel importante na baculovírus está na
Genes tardios (proteínas do capsídeo)
considerarmos esse
Genes iniciais (replicação viral)
devido a uma dentre as três
importante, utilizada para (p. 268). Esses o camundongo, por e de células de mamífero. a qual envolve a modi ize uma proteína i
leite (p. 294) a
fim de tratar uma
a chave para a clonagem
O primeiro experi 1919, com um vetor r írus é capaz de inflectar hospedeiros e um ciclo li 7. l8a), contendo dois coni
ciclo de infecção e que ios", que codificam as que l, e os caulimovírus idade de DNA novo que to, a substituição de um original, um segmento ição de um gene inicial
utilizados para clonar mais extensos de DNA sei eles sejam mais difíceis de f b. os quais também apresel apresentam a vantagem imp b h[ileirus togo após a infecção, I sejam utilizados para qualq hrta duração. Os papiloma
h
(b) SVGT-sçqm o gene da B-globina de coetho inserido
I
Gene da B-globina de coelho
Figura 7.18 e um exemplo de sua como um vetor de . Para clonar o geda p-globina de coelho, o
ftagmento de restrição de a BamHl foideletado {resultando em SVGT-5) e sóstituído com o gene do coelho.
bovinos (BPV), que causam verrugas no gado, são particularmente atraentes, devido ao seu ciclo de infecção incomum em células de camundongo, adquirindo a fôrma de um plasmídeo multicópia com cerca de 100 moléculas presentes por célula. Ele não provoca a morte da célula de camundongo, sendo moléculas de BPV passadas para as células-filhas na divisão celular. Vetores de transferência consistindo em seqüências de BPV e pBR322, e capazes de replicação tanto em células de camundongo quanto bacterianas, têm sido utilizados paÍa a produção de proteínas recombinantes em linhagens celulares de camundongo. Até o momento, os retrovírus são os vetores mais comumente utilizados para a clonagem de genes em células de mamíferos. Suas aplicações mais importantes estão na terapia gênica, à qual se retornará quando esse tópico for discutido (p. 315).
Clonagem gênica sem um vetor Uma das razões pelas quais os vetores virais não têm se tornado comuns na clonagem gênica em células de mamíferos foi a descoberta, no início da década de 1990, de que a microinjeção era a maneira mais eficiente de transferir genes novos para o interior de células de mamíferos. Embora se trate de um procedimento difícil de realizar, a microinjeção de plasmídeos bacterianos, ou cópias de DNA lineares de genes, dentro do núcleo de células de mamíferos resul-
162
T.A.BRowN
ta na inserção do
um arran" DNA nos cromossomos, possivelmente como cópias múltiplas em
é geralmente visto coda cabeça para a cauda (Figura 7.19). Tal procedimento de que o possibilidade a pois evita mo mais satisfatório Ao que a utilização de um vetor viral, outro' DNA viral infecte as células e provoque defeitos de um tipo ou de gene clonado em todas as um de cópias possua 269),que o nocauteaã @' Um camundongo óvulo fertilizado, o qual é, subseqüentesuas células, pode ser gerado por microinjeção de um implantado em uma mãe ado' mente, cultivado invitropo, u.ál.iu, divisões celulares e, depois, embriogênica (ES, do inglê's embryonic stem celll
leituras adicio
jo seqüencial,
tiva. Alternativamente, uÀa célula-tronco inicial e, ao contrário da maioria pode ser utilizada. Essas são obtidas a partir de um embrião que seus modelos de desenvolvimendas células de mamíferos, são totipotentes, significando mesmas podem formar muitas er to não foram predeterminados e as células descendentes das a célula F'S é devolvida paÍa um truturas distintas no camundongo adulto. Após a microinjeção, resultante é uma quirnera" embrião, o qual é implantado .Ã umu -aeãOodva. O camundongo
porque o embrião qrr compreendendo uma mistura de células modificadas e não-modificadas, normais' que contribuem' recebe a célula ES também contém uma certa quantidade (?éìulas juntamente com a célula ES, para formar o camundongo a\utto' ""-""filï,1,1"^:lt:^tÏ; após permitir que a qúsão obtidos cos, que contêm o gene clonaão em todas as suas células, de óvulos com o gelrB mera se reproduza, uma vez que alguns descendentes irão originar-se clonado.
Anderson, C. (19!
da utilização Bevan, M. (1984) Brisson, N., Pasd gene in plant
caulimovírur Broach, J.R. (198 Burke, D.T., Carl tificial chron
Chilton, M.D. (l! mídeo Ti.l Evans, M.J., Cn
370-'74.Írc,
Grúam, F.L. (19 Hamer, D.H. & I 281, 35-40.
Hansen, G. &Wt Monaco, A.P. & Biotechnolo, Nadolska-Orc21'l technique Parent, S.A.
&
eta
Yeast,l,8! !
Paszkowski, J..
Múltiplas cóPias do DNA clonado
((l\\
Rubin, G.M. &
S
ce, 218,348
Timmermans, M
nml
Reviett
Viaplana, R., Tu virus replac
Figura 7'19 -r^,.r^a incarir{a como um arranlo sequ"rencial em uma mG ^ranaâac inseridas uúniptas cópias de moléculas clonadas lécula de DNA cromossômico.
i
estratégia d
CnpÍrulo 8 Como Obter um Clone de um Gene Específico
\e O problema da seleção, I 65 Seleção dìreta. 167
ldentificação de um clone a partir de uma biblioteca genôrnica. 169 Métodos para identificação do clone. 1 74
Nos capítulos anteriores foi examinada a metodologia básica utilizadapara clonar genes e foram avaliados os vários tipos de vetores que são usados com bactérias, leveduras, plantas e animais. Agora, deve-se observar os métodos disponíveis para obtenção de um clone de um gene individual e específico. Esse é o ponto cítico de um experimento de clonagem gênica; o sucesso ou o fracasso geralmente dependem do fato de a estratégia aplicada permitir ou não que clones do gene desejado possam ser selecionados diretamente ou, de modo alternativo, diferenciados de outros recombinantes. Uma vez que tal problema tenha sido resolvido e que um clone tenha sido obtido, o biólogo molecular está capacitado afazer uso de uma ampla variedade de diferentes técnicas que extrairão informações sobre s gene. As técnicas mais importantes serão descritas nos Capítulos l0 e 1 l.
O problema da seleção O problema enfrentado pelo biólogo inolecular que deseja obter um clone de um gene único e específico foi ilustrado na Figura 1.4. Mesmo os organismos mais simples, como E. colí, contêm milhares de genes e a clivagem do DNA celular total produz não apenas o fragmento que contém o gene desejado, mas, também, muitos outros fragmentos, que são portadores de todos os outros genes (Figura 8.la). Durante a reação de ligação não há seleção de um fragmento individual: inúmeras moléculas diferentes de DNA recombinante são produzidas, todas contendo diferentes porções de DNA (Figura 8.1b). Conseqüentemente, uma variedade de clones recombinantes é obtida após a transformação e o plaqueamento (Figura 8.lc). De algum modo, o clone correto deve ser identifìcado.
166
T. A. Bnowlr
(a) Clivagem de uma molécula de DNA extensa
EcoRl
-_-* {
Muitos
Hnfi,ï'"' O gene a ser
_ìr a-
?.----
a
clonado
(b) As moléculas de DNA recombinantes
lnserção no vetor
resultantês
(c) Todas
produzirão colônias
Figura 8.1 O problema da seleção.
ts
estratégias btfu
rndas para obter u üaleção direta. (b) nante desejado
8.1.1 Existem duas estratégias básicas para a obtenção do clone desejado Embora existam muitos procedimentos diferentes, pelos quais o clone desejado pode ser tido, todos correspondem a variações de dois temas básicos.
(1) (2)
!.2
i
Seleçãt
ob
Seleção direta do gene desejado (Figura 8.2a), o que significa que o experimento de clonagem é projetado de tal modo que os únicos clones obtidos são clones do gene pre curado. Quase invariavelmente, a seleção ocoÍre na etapa de plaqueamento. Identificação do clone a partir de uma biblioteca genômica (Figura 8.2b), o que requer um experimento de clonagem inicial, que servirá como "ferramenta", fornecendo uma biblioteca de clones que representam todos os genes presentes na célula, ou a maiu ria deles, seguida da análise dos clones individuais para identificar qual o clone coÍreto-
Em termos gerais, a seleção direta é o método preferido, uma vez que é rápida e em geral não-ambígua. Entretanto, deve-se notar que ela não é aplicável a todos os genes. As técnicas para a identificação dos clones são, assim, muito importantes, especialmente porque bibliotecas genômicas completas de diversos organismos estão agora disponíveis.
Para poc
com ága
cas colô la de DIt
Oex tência a que conl D€S Qu€
i
e suHon mentos ( PaÍa
de um vr tes molé
tência à
CrorureEu GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA
167
(a) Seleção direta
OO
>_
P t-
\
I
\ X
Apenas o recombinante correto Pode sobreviver
a
(b) ldentiÍicação do clone
i i
!
.aaaa aaaaaaa a.aaaaa
Uma biblioteca de clones
aaaaaaa
Figura 8.2 Figura 8.1 O problema da leção.
ffs estratégias básicas que podem ser utilipara obter um determinado clone. (a) direta. (b) ldentiÍicação do recombinante desejado a partir de uma biblioteca de clones.
a ìa
a
a
a
Clone corÍeto
Seleção direta desejado pode ser
que o experimento são clones do gene
ueamento.
(Figura 8.2b), o que
"ferramenta", fl na célula, ou a
car qual o clone
1".,
qrr" é rápida e em
Jtoaos os genes. As
piahente fu,oníveis.
té<
porque bit
Para poder selecionar um gene clonado é necessário plaquear os transformantes em um meio com ágar onde apenas os recombinantes desejados, e nenhum outro, possam crescer. As únicas colônias obtidas serão, portanto, aquelas formadas pelas as células que contêm a molécula de DNA recombinante desejada. O exemplo mais simples de seleção direta ocorre quando o gene desejado especifica resistência a um antibiótico. Como exemplo, consideraremos um experimento para clonar o gene que confere resistência à canamicina, a partir do plasmídeo R6-5. Esse plasmídeo contém genes que
conferem resistência
a
quatro antibióticos: canamicina, cloranfenicol, estreptomicina
e sulfonamida. O gene que confere resistência à canamicina localiza-se em um dos 13 fragmentos de EcoRI (Figura 8.3a). Para clonar esse gene, os fragmentos EcoRI do R6-5 devem ser inseridos no sítio de EcoRI de um vetor como pBR322. A mistura de ligação compreenderá muitas cópias das 13 diferentes moléculas de DNA recombinantes, um grupo das quais portando o gene que confere resis-
tência à canamicina (Figura 8.3b).
168
T. A. Bnowlr
A inativação por inserção não pode ser usada para selecionar recombinantes quando o sítio de EcoRI do pBR322 é utilizado. Isso se deve ao fato de esse sítio não estar localizado noa genes que conferem resistência tanto à ampicilina quanto à tetraciclina desse plasmídeo (Figura 6.1). Porém, tal fato é insignificante para a clonagem do gene que confere resistênciaà canamicina, pois, nesse caso, o gene clonado pode ser usado como uma marca de seleção. Os transformantes são plaqueados em meio ágar com canamicina, no qual as úniças células capazes de sobreviver e produzir colônias são aquelas recombinantes que contêm o gene que confere resistência à canamicina clonado (Figura 8.3c).
&2.1 A recuperação
De fato, a seleção d nes que conferem n se uso de linhagens Como exemplo. gene codifica a enz essencial triptofanc nal, é chamada de r de crescimento. E
Essa E coli mu total é primeiramer ria. O processamen
i
(a) Plasmídeo R6-5
produz numerosÍìs uma cópia intacta c
/l
l
kant\
Sítios
-t EcoRl \
Í---.--.1T] LJ í'1 rrLJ\
EcoRl
de=
-..+
---
t---'-a
-
obtido a partir da li A mistura de li trpA- (Figtra8.4b)
-\
13 Íragmentos
diÍerentes
\
Ligação no sítio de EcoRl do pBR322
(b) A ligação origina 13 moléculas de DNA recombinantes diÍerentes
o o \
é capaz de comandr
realizada pelo plaq suplemento adicior tróficos não podem binantes que contêr
O emprego e as
Embora a recup€ra nes, duas limitaçõe
(1) (2)
TransÍormação de E coÍ, plaqueamento
Uma linhager Um meio on<
A técnica de rs ticas, pois os clone descitaparao trpÁ linhagens auxotróf cuperação do marc
Ademais, muta
XX
seleção de alguns g
(c) Mas apenas uma possibilita o crescimento em meio ágar com canamicina
Meio contendo 50 pg/ml de canamicina
uns poucos terão. Í binantes são não-ar
Apenas o recombinante que contém o gene kanR pode sobreviver
Figura 8.3 Seleção direta para o gene que confere resistência à canamicina clonado de R6-5 (kana).
tre enzimas equila exógena funcione t deiro para o tipo s€
ldentificação l biblioteca geÍ
Embora a recupera utilizada e existem do. Diversos mutar
Clonacev GÊnrca e ANÁLrsE oe
recombinantes quando o sítio não estar localizado iclina desse plasmídeo gene que confere resistênci uma marca de seleção. no qual as únicas células tes que contêm o gene
.J t-)
lsfragmentos
DNA
169
A recuperação do marcador ampria o emprego da seleção direta De fato, a seleção direta seria muito limitada se somente pudesse ser utilizada para clonar genes que conferem resistência a antibióticos. Felizmente, aiécnicapode ser ampliada fazendose uso de linhagens mutantes de E. coti como hospedeiras para a transformação. Como exemplo, consideraremos um experimento para clonar o gene trpA de E. coli.Esse gene codifica a enzima triptofano sintase, a qual está envolvida na biossíntese do aminoácido essencial triptofano. Uma linhagem mutante de E. coli, que possui um gene trpAnáo-fincional, é chamada de trpA- e é capaz de sobreviver apenas se o triptofano for adicionado ao meio de crescimento. E. coli trpA- é,portanto, outro exemplo de auxotrofia (p. 140). Essa -E coli mrÍante pode ser utilizada para clonar a versão correta do gene r4pÁ. O DNA
total é primeiramente purificado a partir de uma linhagem normal (tipo selvagem) da bactéria. O processamento com uma endonuclease de restrição, seguido pela ligação em um vetor, produz nu}Érosas moléculas de DNA recombinantes, uma das quais pode, com sorte, conter uma cópia intacta do gene trpA (Figura 8.4a). Trata-se, é claro, do gene funcional, já que foi obtido a partir da linhagem de tipo selvagem. A mistura de ligação é, então, usada para transformar as células auxotróficas de E. coli trpA (Figura 8'4b). A grande maioria dos transformantes que resulta será auxotrófìca, mas uns poucos terão, agora, a cópia correta do gene trpA, onginada do plasmídeo. Tais recombinantes são não-auxotróficos - eles não necessitam mais do triptofano, pois o gene clonado é capaz de comandar a produção da triptofano sintase (Figura 8.4c). A seleção direta é, assim, realizada pelo plaqueamento dos transformantes em meio mínimo, o qual carece de qualquer suplemento adicional e, particularmente, não possui triptofano (Figura 8.4d). Mutantes auxotróficos não podem crescer em meio mínimo, logo, as únicas colônias a aparecer serào recombinantes que contêm o gene trpAclonado.
o emprego e as limitações da técnica de recuperação do marcador Embora a recuperação de um marcador possa ser usada para obtermos clones de muitos genes, duas limitações são impostas a essa técnica.
(1) (2)
ïransformação de
E
colr, plaqueamento
uma linhagem mutante deve estar disponível para o gene em questão. um meio onde apenas o tipo selvagem possa sobreviver é necessário.
A técnica de recuperação é aplicável à maioria dos genes que codifica enzimas biossintéticas, pois os clones desses genes podem ser selecionados em meios mínimos da maneira já descrita para o trpA. Entretanto, a técnica não está limitada a E. coli,nem somente a bactérias; Ìinhagens auxotróficas de leveduras e fungos filamentosos estão também disponíveis, e a recuperação do marcador tem sido usada para selecionar genes clonados em tais organismos. Ademais, mutantes auxotróficos de E. coli podem ser utilizados como hospedeiros para a seleção de alguns genes de outros organismos. Com freqüência, há similaridade suficiente entre enzimas equivalentes de diferentes bactérias, ou mesmo de leveduras, para que a enzima exógena funcione em E' coli, de modo que o gene clonado sejacapazde transformar o hospedeiro para o tipo selvagem.
ldentiÍicação de um clone a partir de uma biblioteca genômica clonado de R6-S (kanR1.
Embora a recuperação do marcador seja uma técnica poderosa, não é sempre que ela pode ser utilizada e existem muitos genes importantes que não podem ser selecionados por esie método. Diversos mutantes bacterianos não são auxotróficos, de modo que as Ìinhagens mutantes
17O
T. A. Bnowrl
(a) Construção do pBR322 recombinante
ooü trpA
ligação
(b)TransÍormação de
E
coti
trpA- a/
"trDA-
/
trpANão-
rêcombinante t I
Recombinantes
--=-
(c) O gene do plasmídeo é expressado
ptoleína trpA
(d) Plaqueamento em meio mínimo
trpA+
Õ \
@ /
or"nu"recombinantes trpe* podem sobreviver
I ..<
Figura 8.4 Seleção direta para o gene trpA clonado em uma linhagem trpA- de E. coli.
e de tipo selvagem não podem ser distinguidas pelo plaqueamento em meio mínimo ou em qualquer outro meio especial. Além disso, nem a recuperação do marcador, nem qualquer outro método de seleção direta é de muita utilidade no fornecimento de bactérias complementadas por clones contendo genes de organismos mais desenvolvidos (isto é, animais e plantas), pois, nesses casos, as diferenças são geralmente tão grandes que as enzimas exógenas não funcionariam na célula bacteriana.
Uma estratégia alternativa deve, portanto, ser considerada. Isso ocorre quando um grandÊ número de clones diferentes é obtido e aquele que se deseja é, de alguma forma, identificado-
8.3.1 Bibliotecas genômicas Antes de se observarem os métodos utilizados para identihcar clones individuais, deve ser considerada a biblioteca propriiÌmente dita. Uma biblioteca genômica (p.136) é uma coleção de clones em número apaÍentemente suflciente para conter cada gene presente em um determinado organismo. Bibliotecas genômicas são preparadas pela purificação do DNA total da célula, ao qual se segue um processo parcial de restrição, resultando em fragmentos que podem ser clonados em um vetor adequado (Figura 8.5), geralmente um vetor de l" de substituição, um cosmídeo oq possivelmente, um cromossomo artificial de levedura (YAC, do inglês yeasr artificial chromo-
Figura 8.5 Freparação de uma biUioteca genômica em um vetor cosmidial.
some), um cro ou um vetor P
Para bacté
nômicacompl
mais, entretân clone desejaú blioteca, espu
maisl uliliílaÍl
E.3.2 Nem todos
Uma caracterí viduais. Um g celulares - céI de genes, mas
outros são sile
O fato de qualquer pode o DNA. mas
c
Cuorunceu GÊrurcr e ANÁLtsE oe DNA
171
DNA celular total
,4usde -35"not kb í-Í--1-------rr
Ligação no cosmídio
I
I I
Empacotamenlo in vitro, infecção de E. colí
i
,/-1--\
/'-' . - >a,/, /:..'...'x Í....,'.'l \.'....:'l \ ..'. .'
Figura 8.4 Seleção direta para o gene trpA clonado em uma linhagem trpA'& E. coli.
em melo mlnlmo ou marcador, nem qualquer de bactérias comp (isto é, animais e p as enzimas exógenas ocorre quando um alguma forma, identifi
Figura 8.5 de uma bigenômica em un vetor cosmidial.
colônias
./
+ outras ptacas de Petri = biblioteca genômica
some),um cromossomo artificial bacteriano (BAC, do inglês bacterial artificial chromosome) ou um vetor Pl. Para bactérias, leveduras e fungos, o número de clones necessários para uma biblioteca genômica completa não é tão grande que não possa ser manejado (Tabela 6.1). Para plantas e ani-
mais, enffetanto, uma biblioteca completa possuiria tantos clones diferentes, que identificar o clone desejado provar-se-ia uma tarefa gigantesca. Para tais organismos, um segundo tipo de biblioteca, específica não para todo o organismo, mas para um determinado tipo celular, seria de maior utilidade.
Nem todos os genes são expressados no mesmo momento individuais, deve ser (p. 136) é uma coleção de te
emum determinado
DNA total
da célula. ao
que podem ser clona
ituição, um cosmídeo yeast artificial
Uma característica da maioria dos organismos multicelulares é a especialização de células individuais. Um ser humano, por exemplo, é constituído por um grande número de diferentes úpos celulares - células cerebrais, sangüíneas, hepáticas, etc. Cada célula contém o mesmo conteúdo de genes, mas, nos diferentes tipos celulares, grupos distintos de genes são ativados, enquanto outros são silenciados (Figura 8.6). O fato de que, relativamente, apenas poucos genes são manifestados em um tipo celular qualquer pode ser utilizado na preparação de uma biblioteca, se o material a ser clonado não for o DNA, mas o RNA mensageiro (mRNA). Apenas aqueles genes que estiverem sendo expres-
4i I
I
Cr-orunceu GÊNrcA
E ANÁLrsE
oe
DNA
173
cialmente degradado, por tratamento com a ribonuclease H (RNase) (Figura 8.7b). Os fragmentos remanescentes de RNA servem, então, como iniciadores (p. 68) para a DNA-polimerase I, a qual sintetiza a segunda fita de cDNA (Figura 8.7c), resultando em um fragmento de DNA de fita dupla que pode ser ligado a um vetor e clonado (Figura 8.7d).
(a) Sínteqe$ primeira Íita
)
cú
mRNA
AAAAA
Cauda de Poli(A)
Anelamento de
oligo(dï)
um
lT
\
lnlclaclor
iniciador
Transcriptasereversa
RNA T-n-l-t-,rT-n-T-Tl
/
\I /
./
iH
DNA
(b) Degradação do RNA
/
,/RNase H
,/
Fragmentos de RNA
n
n
(c) Síntese da segunda Íita
/
8.6 diÍerentes são expresem tipos celulares dÌb
r-Ì1.]-r
DNA-poll
I
Fragmentos
de RNA atuam como iniciadores
n
DNA
\ T-T-I-TÍ-T-FTT-Ì-TTTT cDNA de fita dupla
AAAÁA
ÌrÍrr
União das extremidades
coesivas, ligação
(d) Ligação em um vetor
material iniciadot os de genes da célula. útil se o gene desej Por exemplo, o gene da no trigo, é expressado em
.-
cDNA
-olvimento. Em tais se pudéssemos clonar o lones específicos para g (e) TransÍormação
Figura 8.7 llüm esquema pos-
de clonagem. Entretanto,
(cDNA, do
j
(p 68), que sintetiza uma (Figura 8.7a). Uma la híbrida pode ser
úrd
Clones de cDNA
para a clonado cDNA (ver
detalhes). poliadeno= olip(dT) = olimidina.
= Clones da gliadina
172
T. A. Bnowr'r
cialmente
Célula do tipo A
r
mentos ren rase I, a qu
DNA de fit
\
u"n"..ir.o"Joo.
mRNA
--
proÌeína
Célula do tipo B
Genes silenciados
.--------*
\ mRNA
mRNA
-_
proteína
Figura 8.6 proteína
Genes diÍerentes são exprs sados em tipos celulares dib' rentes.
sados são transcritos em mRNA. Logo, se o mRNA for usado como material iniciador, os nes resultantes compreenderão apenas uma seleção do número total de genes da célula.
Um método de clonagem que utilize mRNA seria particularmente útil se o gene desej fosse expressado em altos níveis em um tipo celular individual. Por exemplo, o gene da dina, uma das proteínas nutricionais mais importantes presentes no trigo, é expressado em nível muito elevado nas células das sementes de trigo em desenvolvimento. Em tais cél mais de 307o do mRNA total especificam gliadina. Obviamente, se pudéssemos clonar o NA das sementes de trigo, iríamos obter um grande número de clones específicos para na.
8.3.3 O mRNA pode ser clonado como DNA complementar O RNA mensageiro não pode, ele próprio, ser ligado a um vetor de clonagem. mRNA pode ser convertido em DNA pela síntese do DNA complementar (cDNA, do i complementary DNA). A chave para esse método é a enzima transcriptase reversa (p. 68), que sintetiza uma polinucleotídica de DNA complementar a uma fita de RNA existente (Figura 8.7a). Uma que a fita de cDNA tenha sido sintetizada, o membro RNA da molécula híbrida pode ser
Frgura &7
pc.
peraa donacDl.lA (ver d€fralhes)"
=pdiadenc
= oli-
Crouoev
GÊNrcA E ANÁLrsE DE
DNA
173
cialmente degradado, por tratamento com a ribonuclease H (RNase) (Figura 8.7b). Os fragmentos remarescentes de RNA servem, então, como iniciadores (p. 68) para a DNA-polimerase I, a qual sintetiza a segunda fita de cDNA (Figura 8.7c), resultando em um fragmento de DNA de fita dupla que pode ser ligado a um vetor e clonado (Figura 8.7d).
(a) Síntese da primeira fita
5' mRNA
3'
Cauda de Poli(A)
n*r"r*r,tio" rr oligo(dT) iniciador
.## \ \ lnlclador I
Transcriptasereversa
RNA
i
/
/I
AAAAA l--t--l--t--l--lm u...J....J....J....l.-.4]-TfTI DNA
I
(b) Degradação do RNA
/ ,/
t
i
,/
RNase H
Fragmentos de RNA
.T ..'l
t
n
r-rì-rr
t
(c) Síntese da segunda Íita
Í t
l
,/
Ij
Fragmentos
de RNA atuam como iniciadores
L.",. pres diÍerentes são
exprr
DNA-pol
DNA
\
fdos em tipos celulares d
T-fT-'l-T-l-T-fT-fTTT"l-
Fn"r
cDNA de Íita
I I
!rc pl de genes da célula. pnte útil se o gene desej
por exemplo. o gene da g
fo
dupla
AAAAA
rrrrr
União das extremidades coesivas, ligação
(d) Ligação em um vetor
material iniciador, os,
trigo.
I
/
lr
CDNA
-.
é expressado em
loluimento. Em tais célu [se pudéssemos clonar o
r
fones específicos para gÌii l
(e) Transformação
F
I
frentar bde clonagem. pmentar (cDNA, do b. 68), que sinteriza uma bnte (Figura 8.7a). Uma nlécula híbrida pode ser
b
Figura 8.7 esquema posufuel para a clona-
do cDNA (ver para detalhes). = poliadenooligo(dT) = oligodesoxitimidina.
Clones de cDNA
174
T. A. Bnowlr
Os clones de cDNA resultantes são representativos do mRNA presente na preparação a paÍir das sementes de trigo, a biblioteca de cDNA suiria uma grande proporção de clones representando o mRNA da gliadina (Figura 8.7e).
ginal. No caso do mRNA preparado
tros clones também estarão presentes, mas localizar o cDNA da gliadina clonado é um cesso muito mais fácil do que identificar o gene equivalente a partir da biblioteca completa do trigo.
8.4 Métodos para identiÍicação do clone Uma vez que uma biblioteca adequada tenha sido preparada, viírios procedimentos podem empregados na tentativa de identificar o clone desejado. Embora uns poucos desses mentos sejam baseados na detecção do produto de tradução do gene clonado, é, via de mais fácil identificar diretamente a molécula de DNA recombinante correta, o que pode realizado por meio da importante técnica de sondagem por hibridização.
Frú
8.4.1 Fitas complementares de ácido nucléico hibridizam-se entre si Quaisquer duas moléculas de ácido nucléico de fita única têm o potencial de formar pares de base uma com a outra. Para a maioria dos pares de moléculas, as estruturas híbridas resultan tes são instáveis. pois somente um pequeno número de ligações individuais entre as fitas é for-
mado (Figura 8.8a). Entretanto, se os polinucleotídeos forem complementares, um extenso pareamento de bases pode ocorrer para formar uma molécula de fita dupla estável (Figura 8.8b). Isso pode ocorrer não apenas entre moléculas de DNA de fìta simples para formar unre hélice dupla de DNA, mas também entre moléculas de RNA de fita simples e entre combinações de fitas de DNA e de RNA (Figura 8.8c). A hibridização de ácidos nucléicos pode ser utilizada para identificar um determinado clone recombinante se uma sonda de DNA ou RNA, complementar ao gene desejado, estiver disponível. A natureza exata da sonda será discutida posteriormente neste capítulo. Primeiro" deve ser considerada a técnica propriamente dita.
@Íplementars híbrido DNA@mo o que ftrrnado entre
eseuü
ra 8.9
mole
8.4.2 Sondagem por hibridização para colônias e placas A sondagem por hibridização pode
nfsn:dização ì ilirilllnléico. (a) Un o,e híbrida insl nmnda entre dua MÌ{A não-homol tlm híbrido es mado entre d
gadas
identificar moléculas de DNA recombinantes tanto em colônias de bactérias quanto em placas de bacteriófagos. Graças às técnicas inovadoras, desenvolvidas no final da década de 1970, não é necessário purifïcar cada molécrrh recombinante. Um método de sondagem in situ, ao contriírio, é utilizado. Primeiro, as colônias ou placas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose m náilon (Figura 8.9a) e, então, são tratadas para remover todo o material contaminante, deixando apenas o DNA (Figura 8.9b). Geralmente, esse tratamento também resulta na
ï
ser usada para
das moléculas de DNA, de modo que as pontes de hidrogênio entre as htas individuais na lice dupla são quebradas. Tais moléculas de fita simples podem, então, ser firmemente li à membrana por um curto período a 80'C, se uma membrana de nitrocelulose estiver
hÉ
utilizada, ou pela radiação ultravioleta, se for usada a membrana de náilon. As moléculas nam-se aderidas à membrana por meio de suas estruturas açúcar-fosfato, de modo que as b* ses ficam livres para parear com as molécuÌas de ácido nucléico complementares. A sonda deve agora ser marcada, desnaturada por aquecimento e aplicada à membrana uma solução de reagentes químicos que promovam a hibridização dos ácidos nucléicos (Fi
lation
ção a atir"id
ligad. por ar
o te
&r
Ír0 acl
Ilutrci guais
o reaçã
cham
sgr&
Cr-oruaoeur GÊrurcn e ANÁLrsE oe
Iesente na preparação
(a) Um híbrido instável
fliadina (Figura 8.7e). Oufiadina clonado é um pro" lir da biblioteca genômica
rprocedimentos podem ns poucos desses procedii E clonado, é, via de regra, le correta, o que pode sc
lzação.
nm-se entre si de formar pares
&
Itruturas híbridas resultaniyiduais entre as fitas é fa-
lplementares, um exteNo .fita dupla estável (Fi lsimples para formar lsimples e entre combinr
bntificar um dete iao gene desejado, D
175
oú
rbiblioteca de cDNA pos-
kncial
DNA
(b) Um híbrido estável
Figura 8.8 Hibridização de ácido nrcléico. (a) Uma moléqlla híbrida instável forflmnda entre duas Íitas de [D].lA não-homólogas. (b) Um híbrido estável Íormado entre duas Íitas ournplementares. (c) Um híbrido DNA-RNA, tal como o que pode ser rbrmado entre um gene e seu transcrito.
Pequenas regiões não-complementares não afetam a estabilidade geral
(c) Um híbrido DNA-RNA
neste capítulo. Pri
ls rlas de DNA recombinan!s. Graças às técnicas inob purificar çsds mql{çula hado. brana de nitrocelulose ut [ial contaminante, deixanim resulta na desnatura@ *as fitas individuais na h6 b, ser firmemente ligadro ilrocelulose estiver sendo, rnáilon. As moléculas tg'cf,ato, de modo que as bamplementares. ; aplicada à membrana em m ácidos nucléicos (Figu-
ra 8.9c). Após um peíodo para permitir que a hibridização aconteça, o filtro é lavado para remover as sondas que não se ligaram, é seco e então são detectadas as posições das sondas ligadas (Figura 8.9d). Tradicionalmente, a sonda é marcada com um nucleotídeo radioativo, tanto por nick translation quanto por preenchimento das extremidades (p. 81), ou, alternativamente, por iniciação aleatória (random priming) (Figtra 8.10), uma técnica que resulta em uma sonda com atividade bem mais elevada e, portanto, capaz de detectar quantidades bem menores de DNA ligadas à membrana. Com esses métodos, a posição do sinal de hibridização é determinada por auto-radiografia. Os métodos de marcação radioativa, porém, estão começando a entrar em desuso, em parte devido aos riscos qÌre trazem ao pesquisador e em parte devido aos problemas associados ao acondicionamento dos resíduos radioativos. A sonda de hibridização pode, portanto, ser marcada de uma maneira não-radioativa. Diversos métodos tôm sido desenvolvidos, dois dos quais são ilustrados na Figura 8.1 l.
O primeiro faz uso de nucleotídeos desoxiuri.dina trifosfato (dUTP) modificados pela reação com a biotina, uma molécula orgânica que possui alta afinidade por uma proteína chamada avidina. Após a hibridização, as posições das sondas biotinizadas e ligadas podem ser determinadas pela lavagem com avidina, associada a um marcador fluorescente (Figura
176
T.A.Bnowru
(a)TransÍerência das colônias paÍa nitÍocelulose ou náilon Membrana de nitrocelulose/náilon --!'--
I
"---l--------l_-!ì lÌ---:-:::Jl
\/\/
Bactérias aderidas à membrana
(b) Degradação das células'e puriÍicação do DNA DNA
Bactérias
/
\
Árcari+ Protease
Bases não-Pareadas
/I\
}*tY;rr DNA e ligado pela estrutura
açúcar-Íosfato
J
\\
sooc
\ Pot z ou noras )
inadiação ultravioleta
DNA ligado à membrana
Figura 8.10 Marcação do DNA Por iniciação ale alória ( ran&m priming). A mistura @ hexâmeros randomidos (oligonucleotídeos lfiptaméricos de seqüêncla randomizada) é suÍicientemente complexa para incluir, pelo menos, @umas moléculas que possam parear com a dNTP = 2'-desoxi-
Filme de raio X
(c) Sonda com o DNA marcado
*^*ã â.?-lá. lavaoem .ffi ,/ ')Çl,,w,Y\ " -'%r,,,v-Ìf APlicação / \ Ligação de raio X Ligação nãoespecífica esPecíÍica
ffi
\
do Íilme
(d) A auto-radiograÍia Íesultante
nmrrieotídeo 5'{rifosÍato. Hibridização positiva
Figura 8.9 A hibridização em colônias com uma sonda marcada radioativamente.
cada 8.11a). Esse método é tão sensível quanto a sondagemradioativae está se tornando mais popular. não-ra O mãsmo também é verdadeiro para o segundo método de hibridização com sonda sil rábano de peroxidase a enzima com é complexada DNA dioativa, no qual a sonda de lum degradar em enzimática habilidade pela peroxi.dase) detecÍada (horserudish e é x tre fi com a emissão de quimioluminescência (Figura 8.11b). O sinal pode ser registrado em
fotográfico normal de maneira análoga à auto-radiografia'
b
Exemplos do uso;
obviamente, o sucesso ( determinado clone recot
possa ser usada como so
cia do gene clonado. Se
menteéocasoseoobjr
ser utilizado como sond Na prática, a nature, gene desejado. Serão co
(1)
Aquela na qual o 1 tir do qual uma bil
Cr-onneeu GÈrutcn e Ar.tÁrtse oe
DNA
1TI
Sonda de DNA de fita dupla
Desnatu ração pelo aquecimento
DNA de fita simples
Adição de hexâmeros randomizados de oligonucleotídeos
LJJ
rs formam Alguns; hexâmeros h pares de bases
.P
Figura 8.10 Marcação do DNA Por üriciação alealória (ranMn priming). A mistura ú hexâmeros randomidos (oligonucleotídeos Itsaméricos de seqüêncã randomizada) é suÍicientemente complexa pra incluir, pelo menos, rlgumas moléculas que possam parear com a dNTP = 2'-desoxinnrcleotídeo 5'-triÍosÍato.
Figura 8.9 A hibridização em colônias com uma sonda marcada radioativamente.
va e está se tornando cada
hibridização com sonda não-ra peroxidase de rábano silve imática em degradar lumino( pode ser registrado em filrrr
\ \
Adição da polimerase de Klenow + dNTPs, um dos quais está marcado
\
DNA marcado
Exemplos do uso prático da sondagem por hibridização Obviamente, o sucesso da hibridização em colônia ou placa como meio para identificar-se um determinado clone recombinante depende da disponibilidade de uma molécula de DNA que possa ser usada como sonda. Essa sonda deve compartilhar, pelo menos, uma parte da seqüência do gene clonado. Se o gene propriamente dito não estiver disponível (o que presumivelmente é o caso se o objetivo do experimento for fornecer um clone dele), então, o que pode ser utilizado como sonda? Na prática, a natuÍeza da sonda é determinada pela informação disponível a respeito do gene desejado. Serão consideradas três possibilidades.
(1)
Aquela na qual o gene desejado é expressado em altos níveis em um tipo celular, tir do qual uma biblioteca de clones de cDNA tenha sido preparada.
a
par-
178 ï
A. Bnowlr
l'
Sondagem por (a) Marcação com um nucleotídeo biotinizado
Sondade
DNA / ./
Conforme descrito
ra a obtenção de un determinado tipo ce em desenvolvimenú
I
durP-biotina
{\(
gene da gliadina (Fï
\ -\=\ preenchimento das extremidades ou Nick
A identificação
transtation,
iniciação aleatória
\
Hibridização
diferentes clones us da biblioteca seja d gliadina e analisado lamento do produto
\
,%
l{><->
BBBB +-{-r! ,r>ü
.-/
r
nados clones de cDl teca (Figura 8.12). L te é purificada, nuìÍ(
---\
Sondas de oligr tenham sido ca
,/r*xïï** a um marcador fluorescente
Freqüentemente, o Í detalhamento. Em p
7-7-7rr-7-7-7-77-2-777-7 ^t
(b) Marcação com a peroxidase de rábano silvestre
Peroxidase de rábano silvestre + glutaraldeído __.t\_\
HP
HP -/
H>--'-''
./
\ \
Hibridizaeão
\ HP HP
À<,r{r\
,.'/ -,-
.O}<"À
777-7777-777-7'7-7-
Adição de luminol
Figura 8.11 Dois métodos para a m€ìÍ-
cação não-radioativa das sondas de DNA. !
i1
(2)
ú
I
(3)
I t I
t i F
Aquela na qual a seqüência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene é ta ou parcialmente conhecida. Aquela na qual o gene é membro de uma família de genes relacionados.
Figu Sondagem em uma bibliotec identiÍicar um clone ahtr
Clotnçenr GÊNtcA
E ANÁLtsE
oe
DNA
179
Sondagem por abundância para analisar uma biblioteca de cDNA Conforme descrito neste capítulo, uma biblioteca de cDNA é, com freqüência, preparada para a obtenção de up clone de um gene expressado em um nível relativamente elevado em um determinado tipo \elular. No exemplo da biblioteca de cDNA, a partir das sementes de trigo em desenvolvimentb/uma grande proporção dos clones é cópia dos transcritos de mRNA do gene da gliadina (Figura 8.7e). A identificação dos clones da gliadina é simplesmente um caso de utilização de determinados clones de cDNA, a partir da biblioteca, para sondar todos os demais membros da biblioteca (Figura 8.12). Um clone é selecionado aleatoriamente e a molécula de DNA recombinante é purificada, marcada e utilizada para sondar os clones remanescentes. Isso é repetido com diferentes clones usados como sondas até que um que hibridize com uma grande proporção da biblioteca seja obtido. Esse cDNA abundante é considerado como um possível clone da gliadina e analisado mais detalhadamente (por exemplo, por seqüenciamento do DNA e iso lamento do produto de tradução), a fim de confirmar a identihcação.
Sondas de oligonucleotídeos para genes cuios produtos de tradução tenham sido caracterizados Freqüentemente, o gene a ser clonado codifica uma proteína que já foi estudada com algum detalhamento. Em particular, a seqüência de aminoácidos da proteína deve ter sido determi-
B
sonda
Figura 8.Í
A
/ /\
Á,0,,0,'"nr\ em colônia \
Biblioteca de clones
sonda B
1
Dois métodos para a marcação não-radioativa das sondas de DNA.
ada pelo gene é
relacionados.
Auto-radiografias
Figura 8.12 Sondagem em uma biblioteca para identiÍicar um clone abundante.
Sonda A = Clone pouco abundante
Sonda B = Clone muito abundante
180
T. A. Bnowlr
nada utilizando técnicas de seqüenciamento disponíveis há mais de 40 anos. Se a seqüência de aminoácidos é conhecida, então é pospÍvel utilizar o código genético para deduzir a seqüência nucleotídica do gene relevante. é sempre aproximada, pois somente Qssl dedução metionina e triptofano podem ser associados de maneira não-ambígua às trincas de códons; todos os outros aminoácidos são codificados por, pelo menos, dois códons cada. Contudo, na maioria dos casos, os diferentes códons paÍa um aminoácido individual são relacionados. Alanina, por exemplo, é codificada por GCA, GCT, GCG e GCC, logo, dois dos três nucleotídeos da trinca que codifica a alanina podem ser deduzidos com certeza. Como um exemplo para esclÍÌrecer como tais deduções são feitas, considere a citocromo c,.uma proteína que desempenha um papel importante na cadeia respiratória de todos os organismos aeróbicos. A proteína citocromo c de levedura foi seqüenciada em 1963, com o resultado mostrado na Figura 8. 13. Essa seqüência contém um segmento, iniciando no aminoácido 59, com a seqüência Trp-AspGlu-Asn-Asn-Met. O código genético determina que esse hexapeptídeo é codificado por TGG-GAë-GAâ-AAë-AAë-ATG. Embora isso represente um total de 16 seqüências diferentes possíveis, 14 dos 18 nucleotídeos podem ser deduzidos com certeza. Oligonucleotídeos com cerca de 50 nucleotídeos de extensão podem ser facilmente sintetizados em laboratório (Figura 8.14). Assim, uma sonda de oligonucleotídeos poderia ser construída de acordo com a seqüência nucleotídica deduzida e tal sonda sei.acapaz de identificar o gene que codifica a proteína em questão. No exemplo da citocromo c de levedura, mi 16 oligonucleotídeos possíveis, que podem codificar Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Meq seriam sintetizados, separados ou em conjunto, e então utilizados para sondar uma biblioteca genômica ou de cDNA de levedura (Figura 8.15). Um dos oligonucleotídeos da sonda terá a seqüência correta para essa região do gene da citocromo c e o seu sinal de hibridização indicará quais clones são poÍadores desse gene. O resultado pode ser verificado por meio de uma segunda sondagem com uma mistura de oligonucleotídeos cujas seqüências são deduzidas a partir de um segmento diferente de proteína citocromo c (Figura 8.15). Entretanto, o segmento da proteína empregado para dedtzir a seqüência de nucleotídeos deve ser escolhido com cuidado: o hexapeptídeo Ser-Glu-Tyr-Leu-Thr-Asn, que segue imediatamente o primeiro hexapeptídeo escolhido. poderia ser codificado por milhares de seqüências diferentes de l8 nucleotídeos, claramente uma opção inadequada para uma sonda sintética.
Sondas heterólogas permitem que genes relacionados seiam identiÍicados Geralmente, uma considerável similaridade entre nucleotídeos é vista quando dois genes mesma proteína, mas de organismos diferentes, são comparados, o que reflete a da estrutura dos genes durante a evolução. Com freqüência, dois genes de organismos rel
Figura I
üün esquema sin
lib
da síntesr
olgonucleotíú Osgrupama ligade
rüerridades
3
pevinem reaç ünüemononude
ôos
indivirJu
Corn um cont mrÈ{adOSO çlg
I
iuilltgtb Íìo qua
são rer ufrüas,
@em
;dkinadc
nrc mmrffiotídeos, ut
úctlipnud€ 15
GLY_SER-ALA_LYS- LYS-GLY.ALA_THR_ LEU_ PHE_ LYS_THR_ARG-CYS_GLU 30 LEU- CYS- HIS-THR.VAL-GLU- LYS_ GLY _GLY_ PRO_ HIS- LYS _VAL_GLY_ PBO45
PHE-GLY-ARG-HIS -SER-GLY_GLN-ALA-GLN *GLY60 TYH - SER -TYR -THR_ASP-ALA_ASN _ ILÊ _ LYS_ LYS_ ASN - VAL_LEU.TRP_ASP_ ASN_LEU_HIS_GLY_
ILE _
GLU ASN ASN_T,4ET_SER-GLU.TYR-LEU-THR-ASN-PRO-LYS_LYS_TYR_ILEPRO- GLY_THR
_ LYS
- IVET-ALA-PHE *GLY.GLY _LEU _ LYS_ LYS. GLU
ARG.ASN -ASP- LEU _ ILÉ _ÌHR -ÍYR _LEU - LYS _LYS_ALA_CYS _GLU
75 90
- LYS-ASP-
103
Figura 8.13 A seqüência de aminoácidos da citocromo c de levedura. O hexapeptídeo que está destacado em vermelho é utilizado para ilustrar como uma seqüência nucleotídicar pode ser deduzida, a partir de uma seqüência de aminoácidos.
crcsoÍne
narlos: Ìrm gÊt
imint estrutu
Ct-onnoev GÊrurcn e ANÁLrsE oe
DNA
181
ris de 40 anos. Se a seq
p
genético para deduzir a sepre aproximada. pois so prbígua às trincas de cr lilois códons cada. Contudo,
I
ilividual
são relacionados. bgo, dois dos três
-.-
5'
-
Ç61$sPs 5'Protesido
Suporte
tigaçaodoprimeiro
de
nucleotídeo ao suporte
\ / sílica {
r{}
Y.a.
bfeitas, considere a citocro lia respiratória de todos os fiíienciada em 1963, com o hrnento. iniciando no amin
ïflïr*!v:':eil"Ï:n""'
I J ^ ' -fr;o*o I--,4\ v;\. ,lRemocãoda
-/lõË::
fgo genético determina que Embora isso repres Lcleotídeos podem ser dedr
r
lerc.
1
\!-,/
\,/
Cond.ensação
\
f@Ot
'*n*Jnucreotídeo
seri
3'
da /-\ .Jlproteção5' o\1/' I
,l Remocão
sondar uma biblioteca genô. deos da sonda terá a se-
I
sinal de hibridização i sondagem com uma mi um segmento diferente ína empregado para
cuidado: o hexapept iro hexapeptídeo escolhi I8
nucleotídeos, claram
i
I
pnados
lé
vista quando dois genes reflete a cons
ps. o que
! g.n.r
de organismos
Fa 8.13
da proteção 3
aat---/
podem ser faciÌmente s poderia sonda seria capaz de i citocromo c de levedura-
Asn-Asn-MeL
/'--\ -t-j-| 3'
/r
A\o -Ã*""; _t)-o ",
Figura 8.14 ü[n esquema simplilfuado da síntese de
5'
Remoção da
Proteção3'
olgonucleotídeos. Os grupamentos ligados às úemidades 3'e 5' prwinem reações runbe mononucleotÊ deos individuais. Com um controle widadoso do moÍnento no qual as sao removÍ1as, podem ser dcionados monom:.rdeotídeos, um a ao oligonucleotÊ em crescimento.
r@ Nucteotídeo
O
T
Suporte de sílica
Continua até o
comprimento desejado - então, é clivado do suporte
o
Grupamento protetor 5', por exemplo, dimetoxi-tritil
o
Grupamento protetor 3', por exemplo, dimetilJosforamidita
lçüência de aminoácidos da
Íomo c de levedura. O hexaHeo que está destacado em
Hho é utilizado para ilustrar
I uma seqüência nucleotídica ser deduzida, a partir de seqüência de aminoácidos.
I
i
t
P
nados são suficientemente similares paÍa que uma sonda de fita simples, preparada a partir de
um gene, forme um híbrido estável com o segundo gene. Embora as duas moléculas não sejam inteiramente complementares, pares de bases suficientes são formados para produzir uma estrutura estável (Figura 8.16a).
182
T. A. Bnowlr
bndizarán2 Oligonucleotídeos sintéticos, marcados nas udues
extremidades '[tr
nes (Figura
^
de nucleotí
complexo
;:;
g
lia multigê
\
\
bros poden
\..:.:'./ por -:- '-z
8.4.4 Métodos tradução
Sondagem hibridização em colônia
\ /
ffiz
--6.h
..t
,/
B,,rf:ïff""J,ï,*."
\\\
--
3J'3"JJ:ï::::ïï
As sondas
il3:fl'ffl
\
r
terminado r com as mo 10.000 recr investigada
Auto-radiograÍia
\
r
uma sonda nam impos
Provável clone da citocromo c
tégia difere
Sinal não-específico? Nova sondagem com um segundo oligonucleotídeo deduzido
Figura 8.15 O uso de um oligoldentiÍicação definitiva do clone da citocromo c
nucleotídeo sintético, marcado na extremidade, para identiÍicação de um clone do gene da citocromo c de levedura.
As sondas heterólogas fazem uso da hibridização entre seqüências relacionadas para e identificação dos clones. Por exemplo, o gene da citocromo c de levedura, identifïcado na seção anterior por sondas de oligonucleotídeos, poderia ser utilizado como sonda de hibridização para identificar genes de citocromo c em bibliotecas de clones de outros organismos. Ume sonda preparada a partir do gene de levedura não seria inteiramente complementar ao gene dc Neurospora crassa, mas um pareamento de bases suficiente deveria ocorrer para que um híbrido fosse formado e detectado por auto-radiografia (Figura 8.16b). As condições experimentais seriam modificadas de modo que a estrutura heteróloga não fosse desestabilizada c perdida antes da auto-radiografia. As sondas heterólogas também podem identificar genes relacionados no mesmo organismo. Se o clone de cDNA da gliadina do trigo, identihcado anteriormente no capítulo por meio da sondagem por abundância, for utilizado na sondagem de uma biblioteca genômica, ele hi-
;Mas
Figura 8-16 heterólogas.
CLoruncev GÊrurcn e ANÁLrsE oe
DNA
1&l
bidizará não somente com seu próprio gene, mas também com uma variedade
de outros genes (Figura 8.16c). Todos eles relacionam-se ao cDNA da gliadina, mas possuem seqüências de nucleotídeos levemente diferentes. Isso ocorre porque as gliadinas do trigo formam um complexo grupo de proteínas relacionadas que são codificadas pelos membros de uma família multigênica. Uma vez que um gene da famflia tenha sido clonado, todos os demais membros podem ser isolados pela sondagem heteróloga.
Métodos de identificação baseados na detecção do produto de tradução do gene clonado As sondas de hibridização são, geralmente, o método preferido para a identificação de um determinado recombinante a partir de uma biblioteca de clones. A técnica é de fácil execução e, com as modificações introduzidas nos últimos anos, pode ser usada para analisar mais de 10.000 recombinantes por experimento, permitindo que grandes bibliotecas genômicas sejam investigadas em um tempo razoavelmente curto. Entretanto, as necessidades para obtenção de uma sonda que seja, no mínimo, parcialmente complementar ao gene desejado às vezes tornam impossível utilizar a hibridização para identificar os clones. Nessas ocasiões, uma estratégia diferente torna-se necessária.
(a) Um híbrido entre duas Íitas de DNA relacionadas
Pareamento de bases suÍiciente para Íormar uma estrutura estável
Figura 8.15 O uso de um oligonucleotídeo sintéli" co, marcado na extremidade, para identiÍicação de clone do gene da citocromo c de le' vedura.
(b) Sondas heterólogas entre espécies Gene da citocromo c de levedura marcado (
"\hÍ.
Provável clone da ciÌocromo c de Neurospora Biblioteca genômica do DNA de Neurospora
seqüências relacionadas para c de levedura, identificado na
(c) Sondas heterólogas dentro de uma mesma espécie
ilizado como sonda de hibri clones de outros organismos. complementar ao gene deveria ocoffer paÍa que um 8.16b). As condições ex não fosse desestabilizada relacionados rto mesmo nte no capítulo por uma biblioteca genômica, ele
I
I
zíõ-ì\
/a
f
l3
:-1
cDNA da gliadina marcado .\
. o r
tt7 \.t."1. \i__2,
Figura 8.16 heterólogas.
) ("
:.'j'.ì "( .
'
xì.J
I
Biblioteca genômica do trigo
Membros da Íamília multigênica da gliadina
184
T. A. Bnowlr
Utilizaçã colônias
A principal alternativa à hibridização com sondas é a sondagem imunológica (screening immunological). A diferença está no fato de que, enquanto por meio das sondas de hibridização o próprio fragmento de DNA clonado é diretamente identificado, um método imunológico detecta a proteína codificada pelo gene clonado. Logo, as técnicas imunológicas pressu-
Existem vá dução diret feridas a ut
põem que o gene clonado esteja sendo expressado para que a proteína esteja sendo sintetizada e que a mesma proteína não esteja normalmente presente nas células hospedeiras.
tendo o ant brana pode teína bacte
Os anticorpos são necessários para os métodos imunológicos de detecção
(Figura 8.1 tadas por z
purificada de uma proteína for injetada na corrente sangüínea de um coelho" o sistema imune do animal responde por meio da síntese de anticorpos que se ligam e ajudam a degradar a molécula estranha (Figura 8.17a). Essa é uma versão do mecanismo de defesa natural que os animais utilizam para lidar com invasões bacterianas, virais e de outros agentes infecciosos. Uma vez que a proteína é injetada no coelho, os níveis de anticorpos presentes em sua corrente sangüínea perÍnanecem suficientemente elevados pelos próximos dias para que quantidades substanciais sejam purifìcadas. Não é necessiírio matar o coelho, pois apenas 10 nú dc sangue fornecem uma quantidade razoável de anticorpos (Figura 8.17b). Esse anticorpo purificado liga-se somente à proteína que fora originalmente injetada no animal. Se uma amostra
nescente P
(a) Anticorpos ligam-se às moléculas exógenas
)
o,\
-?
Molécula exógena, J Por exemolo, Proteína pí F-'-=- Anticorpos I
Figura 8.1t llüülização de um an
(b) PuriÍicação dos anticorpos
Remoção de 10 ml de sangue
ï-l Coelho inletado com a proteína exógena
ï-
v
Sangue
AnÌicorpo puriÍicado
Figura 8.17 Anticorpos. (a) Os anticorpos na corrente sangüínea ligam-se a moléculas exógenas e ajudam a degradá-las(b) Anticorpos purificados podem ser obtidos de um pequeno volume de sangue retirado de um coelho injetado com a proteÊ na exógena.
tborpo purificaü
pra
detectar Proteí ffils em colônias re combinantes. En wda proteína mat cada A, o PróPú mticorpo pode se rnarcado ou, alter mrdiì/amente, um s€ gundo anticorP rmrcado que se I glrn esPeciÍicament @ primeiro anticol p pode ser usaü
( m
imunológica,(scret
io das sondas de hibri um método im
imunológicas esteja sendo si células hospedeiras.
imunológicos sangüínea de um
que se ligam e aj do mecanismo de defesa virais e de outros
Cloruncera GÊNrcA E ANÁLrsE DE
DNA
Utilização de um anticorpo puriÍicado para detectar proteínas em colôn ias recombinantes Existem várias versões da sondagem imunológica, mas o método mais utilizado é uma reprodução direta da sondagem por hibridização em colônias. As colônias recombinantes são transferidas a uma membrana de polivinil, as células são lisadas e é adicionada uma solução contendo o anticorpo específico (Figura 8.18a). O próprio anticorpo pode ser marcado ou a membrana pode ser subseqüentemente lavada com uma solução de proteína A marcada, uma proteína bacteriana que se liga especificamente às imunoglobulinas que constituem os anticorpos (Figura 8.1 8b). A marcação pode ser radioativa, caso no qual as colônias marcadas são detectadas por auto-radiografia, ou não-radioativa, quando um sinal fluorescente ou quimioluminescente pode ser utilizado.
presentes em sua mos dias para que
(a) Sondagem imunológica
coelho, pois apenas 10 ml 8.17b). Esse anticorpo no animal.
Colônias Lise das células (cloroÍórmio)
/\
Tt>>_7
ZHz'
Membrana
\noiçao de anticoÍpos
,
/
específicos
,/
Anticorpos ligam-se às células Iisadas proteína clonada ( contendo a
llr.[
z-+H--z Proteína A liga-se ao anticorpo
,/
,,/
aatçao da proteína A marcada com 1125
I
Figura 8.18 de um an-
Figura 8.17 Anticorpos. (a) Os ticorpos na corrente sangüínea ligam-sea moléculas ajudam a (b) Anticorpos puriF cados podem ser dos de um pequeno volume de sangue re tirado de um coelho injetado com a na exógena.
185
?il?
zffi
ümrpo puriÍicado detectar proteÊ ern colônias recornbinantes. Em
(b) A auto-radiograÍia resultante
da proteína marcada A, o próprio rrüicorpo pode ser nmarcado ou, altergundo anticorpo mnnrcado que se liespecificamente primeiro anticorp pode ser usado.
Srnal positivo = recombinante sintetiza a proteína clonada
186
T. A. Bnowr.r
O problema da expressão gênica A sondagem imunológica depende do fato de o gene clonado estar sendo expressado, de modo que o produto protéico traduzido esteja presente nas células recombinantes. Entretanto, como será discutido em maiores detalhes no Capítulo 13, um gene de um determinado organismo geralmente não é expressado em um organismo diferente. Em particular, é bastante improvável que um gene clonado de um animal ou planta (com exceção dos genes dos cloroplastos) seja expressado em células de E. coli. Esse problema pode ser contornado empregando-se um tipo especial de vetor, chamado de vetor de expressão (p.279), destinado especificamente a promover a expressão do gene clonado em um hospedeiro bacteriano. A sondagem imunolô gica de colônias de E. coli recombinantes, contendo genes animais clonados em vetores de expressão, tem, de fato, sido muito útil para a obtenção de genes de viírios hormônios importantes.
Leituras adicionais Benton, W.D. & Davis, R.W. (1977) Screening ì,gt recombinant clones by hybridization to single plaques in sinrScience, 196, I 80-82. Dyson, N.J. & Brown, T.A. (2001) Immobilization of riucleic acids and hybridization analysis. ln'. Essential Moleculs Biology: A Practical Approach, Yol.2 (ed. T.A. Brown), 2nd edn. In press.IRL Press at Oxford University Press. Oxford. Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. (1983) A technique for labelling DNA restriction fragments to high specific activity. Analytical Biochemistry, 132,6-13. [Marcação com iniciadores aleatórios (random priming).f Grunstein, M. & Hogness, D.S. (1975) Colony hybridization: a method for the isolation of c'loned cDNAs that co*' tain a specihc gene. Proceedings of the National Academy of sciences of the usA, 72, 3961-5. Gubler, U. & Hoffman, B.J. (1983) A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Ganc" 2s,263-9Thorpe, G.H.G., Kricka, L.J., Moseley, S.B. & Whitehead, T.P (1985) Phenols as enhancers of the chemiluminesceil horseradish peroxidase-luminol-hydrogen peroxide reaction: application in luminescence-monitored enzym immunoassays. Ctinical Chemistry,3l, 1335-41. [Descreve o princípio do método de marcação não-radioatirt-l Young, R.A. & Davis, R.W. (1983) Efficient isolation of genes by using antibody probes. Proceedings of the Nati* nalAcademy ofSciences ofthe USA,80,
ll94-8.
A reação em 187
PCR em deta
Como resu
básicos da como a an
DNA_DN da princip: glès
polym
que uma cl
tas vezes p mas que p( Este ca se entenda vante, segl
volvidos p
A reação A reação
e
umamolá desde que
extremidar
cleotídeos dupla (Fig síntese de Via de
ticus. Con
Cnpírulo 9
sendo expressado, de
recombinantes. Entretanto, de um determinado particular, é bastante i
A Reação em Cadeia da Polimerase
dos genes dos clorop
contornado empregando- se )- destinado especifica iano. A sondagem i clonados em vetores de vários hormônios im
to single plaques in analysis. ln: Es s ential IRL Press at Oxford University
A reação em cadeia da polimerase em linhas gerais, 187
fragments to high specific r
Problemas com a freqüência de erro da DNApolimerase de Taq,200
PCR em deLalhes, 190
random priming).1
i:olation of cloned cDNAs that
usA.72.396t-s. generating cDNA libraries, a-s
enhancers of the chemi
in luminescence-monitored metodo de marcação nãoprobes. P roc e edin g s of the
Como resultado dos últimos sete capítulos, tornaram-se familiares não apenas os princípios básicos da clonagem de genes, mas, também, as técnicas fundamentais da biologia molecular, como a análise por restrição, a eletroforese em gel, a marcação do DNA e a hibridização DNA-DNA. Para completar o estudo básico de análise do DNA, é retomada, agora, a segunda principal técnica para o estudo dos genes, a reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglès polymerase chaín reaction). A PCR é uma técnica muito simples: tudo o que acontece é que uma curta região de uma molécula de DNA, um único gene, por exemplo, é copiada muitas vezes por uma enzima DNA-polimerase (Figura 1.2). Esse parece ser um exercício trivial, mas que possui múltiplas aplicações em pesquisas genéticas e em amplas áreas da biologia. Este capítulo inicia com uma visão geral sobre a reação em cadeia da polimerase, para que se entenda exatamente qual o seu alcance. Posteriormente, será abordada a metodologia relevante, seguindo os passos envolvidos na PCR e os métodos especiais que vêm sendo desenvolvidos para o estudo dos fragmentos de DNA amplificados que são obtidos.
1 A reação em cadeia da polimerase em Iinhas gerais A reação em cadeia da polimerase resulta na amplificação seletiva de uma região escolhida de uma molécula de DNA. Qualquer região de qualquer molécula de DNA pode ser selecionada, desde que as seqüências nas extremidades dessa região sejam conhecidas. As seqüências das extremidades devem ser conhecidas porque, pararealizar uma PCR, dois pequenos oligonucleotídeos devem hibridizar com a molécula de DNA, um com cada uma das htas da hélice dupla (Figura 9.1). Esses oligonucleotídeos, que atuam como iniciadores para as reações de síntese de DNA, delimitam a região que será amplificada. Via de regra, a amplificação érealizadapela enzima DNA-polimerase I de Thermus aqua-
ticus. Conforme mencionado na página 68, esse organismo vive em ambientes quentes e mui-
188
T.A. Bnown
3'
5'
5'
5',
3',
Adição dos oligonucleotídeos iniciadores 3'
5'
3' Região a ser ampliÍicada
Figura 9.1 Hibridização dos oligonucleotídeos i com o DNA-molde no início de uma PCR.
tas das suas enzimas, incluindo a polimerase de Taq, são termoestáveis, o que significa tência à desnaturação pelo calor. Como se tornará evidente a seguir, a termoestabilidade
polimerase de Taq é essencial para a metodologia da PCR. Para iniciar uma amplificação por PCR, a enzima é adicionada ao DNA-molde aos iniciadores e incubada, para que sintetize as novas fitas complementares (Figura 9.2a mistura é então aquecida a94"C, para que as fitas recém-sintetizadas separem-se do (Figura 9.2b) e, posteriormente resfriadas, permitam que mais iniciadores hibridizem suas respectivas posições, incluindo aquelas das novas fitas sintetizadas. A polimerase de que, diferentemente da maioria dos tipos de DNA-polimerases, não é inativada pelo agorarealiza uma segunda rodada de síntese de DNA (Figura 9.2c). O ciclo bridização-síntese é repetido, geralmente 25 a3o vezes, resultando, ao final, na síntese de tenas de milhões de cópias do fragmenro de DNA amplificado (Figura 9.2d). Ao término de uma PCR, uma amostra da mistura de reação é geralmente anâiisada eletroforese em gel de agarose; DNA suficiente foi produzido para que o fragmento cado seja visível como uma banda discreta após a coloração com brometo de etídio 9.2e). A própria análise pode fornecer informações úteis a respeito da região de DNA que
I
Figura
92
ffi,mea@o em ca-
dhiada polimera-
úlTPs =2'4effiosÍiatos.
amplifica de bacter mo o seqì
CLoruncev GÊrurcn e ANÁLrsE oe DNA
3' ffi
189
5'
r
5'
3',
,5'
@ 5',
\
3'
(a) Adição da DNA-potimerase
\
de lag+dNTPs
ffi
t--,--,-.,--,--,--,--,--,.-,--,--,--,a Síntese da Íita nova
É:rrrrrrrr /
/
I
I
|
I
@
-rFl?|ll,,
(b) Desnaturação
(c) Segundo ciclo de síntese
Figura 9.1 Hibridização dos oligo nucleotídeos inici com o DNA-molde no início de uma PCR.
(d) Demais ciclos
is, o que signifìca seguir, a termoestabilidade
(e) Visualização do produto
Produto da PCR
:
:
ao DNA-molde
(Figura 9 separem-se do iniciadores hibridizem A polimerase de não é inativada pelo 9.2c). O ciclo desnatu ao final, na síntese de (Figura 9.2d). é geralmente analisada para que o fragmento com brometo de etídio ( ito da região de DNA que
Figura 9.2 A reação em caia da polimera-
ôlTPs =2'-de-
ACÚMULO EXPONENCIAL DE FRAGMENÏOS AMPLIFICADOS
,/\ Marcadores
Gel de agarose
de tamanho
APOS 30 CICLOS: 228 = 268.435.456 FRAGMENTOS
trifosÍatos.
amplificada ou, alternativamente, o produto da PCR pode ser ligado a um vetor plasmidial ou de bacteriófago, clonado pelo método normal e examinado por meio de técnicas-padrão, como o seqüenciamento de DNA.
190
T.A. BRowN
9.2 PCR em detalhes Embora experimentos com PCR sejam de muito fácil execução, é necessário um planej: to cuidadoso, caso espere-se que os resultados tenham algum valor. As seqüências dos i dores são críticas para o sucesso do experimento, assim como a precisão das te lizadas nos estágios de aquecimento e resfriamento do ciclo da reaçáo. Há também a i tante questão sobre o que pode ser feito com as moléculas de DNA amplificadas, uma vez tidas.
9.2.1 Determinação dos oligonucleotídeos iniciadores para uma pcR os iniciadores são a chave do sucesso ou da falha de um experimento de pcR. Se forem jetados corretamente, o experimento resulta na amplificação de um único fragmento de correspondente à região-alvo da molécula-molde. Se os iniciadores forem projetados de do incorreto, o experimento fracassará, possivelmente porque a amplificação não possivelmente porque um fragmento errado, ou mais de um fragmento, será amplificado gura 9.3). Obviamente, grande parte do planejamento deve ser destinada à determinação iniciadores. Desenvolver as seqüências apropriadas para os iniciadores não é um problema: elas corresponder às seqüências das extremidades da região-alvo da molécula-molde. Cada ini dor deve ser complementar (mas não idêntico) à sua fita-molde para que a hibridização ocoffer, e as extremidades 3' dos iniciadores que hibridizaram devem apontar uma em dire ..
(Figura 9.4r. o fragmento de DNA a ser amplificado não devó ter mais do que ct i à outra de 3 kb de extensão e, idealmente, é inferior a 1 kb. Fragmentos de mais de l0 kb podem I
Figura
9,
de in'lciadon para ampli da u"glot ftfi.nrano. Os éxot sao mostraú
fecfi
c
íntrons, con melârpulos aberto
üm,
amplificad
ciente é a a
ficação de
Marcadores de tamanho
especiaisO ptin pequenosindesejadr
um experi
dos, na ter
rios fragm esses
inici
tios possír
Isso signil único e es
Figura 9.3 Os resultados das PCRs com iniciadores bem e pobremente planejados. A linha 1 mostra um único fragmento amplificado do tamanho esperado, resultante de um experimento bem realizado. Na linha 2, não há produto de ampliÍicação, sugerindo que um ou ambos os iniciadores Íoram incapazes de hibridizar com o DNA-molde. As linhas 3 e 4 mostram, respectiva mente, um produto de amplificação de tamanho incorreto e uma mistura de produtos (o pro duto certo mais dois produtos errados);ambos os resultados devem-se à hibridização'de urn ou dos dois iniciadores em sítios que não os alvos da molécula de DNA-molde.
O que 9.4, fosser acada4t'genoma h
sítio de hi ria, portar Por qu o compú
iniciadort
mero de n
CLonnceu GÊNrcA
E
AruÁuse oe
DNA
191
Gene da o1-globina humano é necessário um .
T
As seqüências dos ini
\
reação. Há também a i amplificadas, uma vez ...G
para uma PCR de PCR. Se forem único fragmento de forem projetados de amplificação não ocorrená, nto, será amplificado inada à determinação
um problema: elas écula-molde. Cada inici Fra que a hibridização apontar uma em di deve ter mais do que de mais de l0 kb podem é
lnejados. A linha 1 mostra lüe de um experimento bem b que um ou ambos os inicia.
ls 3 e 4 mostram, respectirra
i
mistura de produtos (o pro híem-se à hibridização de de DNA-molde.
:
roo nn
\
isão das temperaturas
TG TC
\
ÏGA GTC TC TCT TGGG
@
5',
5' Figura 9.4 par de iniciadores para amplifio gene da a,-globimB humano. Os éxons são mostrados rmn retângulos fechaüs, os íntrons, como retângulos abertos.
TGG.. J
...C A C A G A C T C A G A G A G A A C C C A C C...
...A
TGGGGGCACCAGAA AC
T
TA T T T... 5'
3',
..,T
@ ACCC
CC GTGG TC T T TGAA TA 4A...3,
amplihcados por técnicas-padrão de PCR, porém, quanto mais longo o fragmento, menos eficiente é a amplificação e mais difícil torna-se a obtenção de resultados consistentes. A amplificação de fragmentos muito extensos - com cerca de 40 kb - é possível, mas requer métodos especiais. O primeiro ponto importante a ser definido é o tamanho dos iniciadores. Se forem muito pequenos, podem hibridizar com sítios que não os alvos e originar produtos de amplificação indesejados. Para ilustrar essa questão, imagine que o DNA humano total seja utilizado em um experimento de PCR com um par de iniciadores de 8 nucleotídeos de extensão (chamados, na terminologia do PCR, de "8-mers"). O resultado provável seria a amplificação de vários fragmentos diferentes. Isso acontece porque se espera que ocorram sítios de ligação para esses iniciadores, em média, a cada 48 = 65.536 pb, originando, aproximadamente, 46.000 sítios possíveis na seqüência de nucleotídéos de 3.000.000 kb que constitui o genoma humano. Isso signiÍìca que seria muito incomum que um par de iniciadores de S-mers originasse um único e específico produto de amplificação para o DNA humano (Figura 9.5a). O que aconteceria se os iniciadores de 17 nucleotídeos de extensão, mostrados na Figura 9.4, fossem utilizados? A freqüência esperada para uma seqüência de 17 nucleotídeos é de I a cada 411 = 17 .179.869 .184 pb. Esse tamanho é cerca de cinco vezes maior que a extensão do genoma humano, logo se esperaria que um iniciador de 17 nucleotídeos tivesse somente um sítio de hibridização no DNA humano total. Um par de iniciadores de l7 nucleotídeos deveria, portanto, originar um produto de amplificação único e específico (Figura 9.5b). Por que simplesmente não se desenvolvem iniciadores tão longos quanto possível? Porque o comprimento do iniciador influencia o ritmo no qual ele se hibridiza com o DNA-molde; iniciadores longos hibridizam em um ritmo mais lento. A eficiência da PCR, medida pelo número de moléculas amplificadas produzidas durante o experimento, é, conseqüentemente, re-
I
il
192
T. A. Bnowlr
(a) PCR de DNA humano com iniciadoÍes de 8 nucleotídeos de extensão
Sítios de hibridização
/l \ ,/ l\ r_ J \
3'1
kb
5'
vanos pares 0e rntcladores podem originar produtos de ampliÍicação
(b) PCR de DNA humano com iniciadores de 17 nucleotídeos de extensão
3',
5'
Apenas o Íragmento desejado é ampliÍicado
Figura 9.5 O comprimento dos iniciadores é crítico para a especiÍicidade da PCR.
duzida se os iniciadores forem muito longos, pois a hibridização completa com as moléculm do molde não pode ocorrer no tempo permitido durante o ciclo da reação. Na prática, inicia. dores de mais de 30 nucleotídeos de extensão são raramente utilizados.
g.2.2 Estabelecimento das temperaturas corretas a serem utilizadas Durante cada ciclo de uma PCR, a mistura de reação é submetida
a
três temperaturas (Figura
e.6):
(1)
A temperatura de desnaturação, geralmente 94'c,
a qual quebra os pares de bases e libera as fitas únicas de DNA para atuarem como moldes na próxima rodada da síntese de
DNA. (2) (3)
A temperatura
de hibridização ou de anelamento, na qual os iniciadores aderem-se ao,s moldes. A temperatura de extensão, na qual ocorre a síntese do DNA. É comumente determinada em74"C,logo abaixo da temperatura ótima para a DNA-polimerase de Taq.
A temperatura de anelamento é a mais importante, pois pode afetar a especificidade da reação. A hibridização DNA-DNA é um fenômeno dependente da temperatura. Se a temperatura for muito elevada, nenhuma hibridização ocorrerá e, ao contrário, os iniciado.", o, moldes permanecerão dissociados (Figura 9.7a).Entretanto, se a temperatura for muito "bai-
Figun
perfil de temPen típico para uma t
lültm
xa, híbridor dos - são e
mento apn
dos perfeit, reamento f aumenta si não os alvt A temp entre o inir dos incom
peratura
(
de.AZ.é se ("derret
mitir que
r
brido com rém, mais
T^ = (4x
na qual [G mero de nr
CLorunceu GÊNrcA
E Ar.rÁr-rse
oE
DNA
193
Desnaturação (1 min)
()
I I
(ú
l
670
Extensão (2 min)
o
oE
.(l)
F
9-5
dos iniciadores é para a especiÍicidade da
completa com as da reação. Na prática, in
serem utilizadas a três temperaturas (Fi
quebra os paÍes de bases e próxima rodada da síntese os iniciadores aderem-se
A. E comumente dete -polimerase de Taq.
afetar a especificidade da temperatura. Se a
contriírio, os iniciadores e a temperatura for muito bai-
üllm perfil de
Figura 9.tr temperatura
típico para uma PCR.
xa, híbridos incorÍetos - aqueles em que nem todos os pares de bases são corretamente formados - são estáveis (Figura 9.7b). Caso isso aconteça, os ciilculos prévios a respeito do compri-
mento apropriado dos iniciadores tornam-se irrelevantes, pois presumia-se que apenas híbridos perfeitos entre iniciadores e moldes fossem çapazes de ser formados. Se os erros de pareamento forem tolerados, o número de potenciais sítios de hibridização para cada iniciador aumenta significativamente e há maior tendência de que a amplificâção ocorra em sítios que não os alvos da molécula-molde. A temperatura ideal de anelamento deve ser baixa o suficiente para permitir a hibridização entre o iniciador e o molde, mas alta também o suficiente para prevenir a formação de híbridos incorretos (Figura 9.7c). Essa temperatura pode ser estimada pela determinação da temperatura de fusão ou T-(do inglês melting temperature) do híbrido entre o iniciador e o molde. A Z- é a temperatura na qual os híbridos com as bases corretamente pareadas dissociamse ("derretem"): uma temperatura !3ïC abaixo dessa deve ser baixa o suficiente para permitir que os híbridos corretos formem-se, porém igualmente muito elevada para que um híbrido com um único erro seja estável. A Z. pode ser determinada de forma experimental, porém, maiícomumente, é calçulada a partii ãa fórmula simples (Figura 9.8):
T^ = (4x [G +
C\ + (2x
[Á + fl)"C,
naqual[G+QéonúmerodenucleotídeosGeCnaseqüênciadoiniciadorelA+Tféonúmero de nucleotídeos A e T.
194
T.A.Bnown
Portail cálculo da da. Note-s
(a)Temperatura de anelamento muito elevada
tenham
lniciadores e moldes permanecem dissociados
Á4 a
^-attt
I-
iniciador
)
p
Após a P
A reação e perimento recer irtfor
tudos dess nagem gêr variedade técnicas v
(b)Temperatura de anelamento muito baixa
aít----"-'''fr B
-R...--,'" \
\ __ FTl'Tlì
Hibridização incorreta nem todos os pares
(1) Eletr (2) Clor (3) Seqi
-
As dut
de bases corretos foram Íormados
tulo 10, qr
EletroÍo
Conforme
rif,rcados I (c) Temperatura de
Umabanc dé etídio r hibridizaç
anelamento coÍÍeta
,-----(tt-"'ta
Figura 9.7 A temperatura exer@
B
um importante eÍeito sobre a hibridização dos iniciadores com o DNA-molde.
A iniciação ocorre apenas nos sítiosalvo desejados
nais estivt
Emall
se um exl Por exeml
determina
restrição, análise d, restrictiot nômicos (
Alterr Seqüência do
iniciador: 5' AGACTCAGAGAGAACCC
4Gs
3'
se o
5Cs 7As 1T
I,=(4x9)
DNA
gura 9.9).
profiling',
Em al diagróstir
+(2xB)
= 36 + 16
identifica
= 52oC
Realizar I rém uma
Figura 9-8 Cálculo da
I,de
um iniciador.
muitasF( zida pela
Crouecev GÊrurcn e ANÁLtsE oe
DNA
195
Portanto, a temperatura de anelamento para um experimento de PCR é determinada pelo cálculo daT^para cada iniciador, utilizando-se uma temperatura I a2"C inferior à encontrada. Note-se que isso significa que os dois iniciadores devem ser determinados de modo que tenham Çs idênticas. Se não for esse o caso, a temperatura de anelamento apropriada para um iniciador pode ser muito elevada ou muito baixa para o outro membro do par.
Após a PCR: estudo dos produtos da PGR A reação em cadeia
da polimerase geralmente é o ponto de partida para longas séries de experipentos, nas quais o produto de amplificação é estudado de várias maneiras, a fim de oferecer informação a respeito da molécula de DNA que atuou como molde original. Muitos estudos desse tipo encontram-se nas partes 2 e 3, quando são examinadas as aplicações da clonagem gênica e das análises de DNA nas pesquisas e na biotecnologia. Embora uma ampla
variedade de procedimentos tenha sido desenvolvida para o estudo dos produtos da PCR, três técnicas são particularmente importantes.
(1) (2) (3)
*\
Eletroforese em gel dos produtos da PCR. Çlonagem dos produtos da PCR. Seqüenciamento dos produtos da
PCR.
I
ì
)
As duas primeiras técnicas são descritas neste capítulo. A terceira será adiada aÍé o Capí-
tulo 10, quando serão abordados todos os aspectos do seqüenciamento de DNA.
EletroÍorese em gel dos produtos da PCR
Figura 9.7 A temperatura um importante efeib sobre a hibridização dos iniciadores com DNA-molde.
b h 7-de um iniciador.
Conforme indicado na Figura 9.2, os resultados da maioria dos experimentos de PCR são verificados fazendo-se migrar uma porção da mistura de reação amplificada em gel de agarose. Uma banda representativa do DNA amplificado deve ser visível após coloração com brometo dé etídio ou, se a produção de DNA for baixa, o produto pode ser detectado pelo método de hibridização de Southern (p. 201). Se a banda esperada estiver ausente ou se bandas adicionais estiverem presentes, algum erro ocorreu e o experimento deve ser repetido. Em alguns casos, a eletroforese em gel de agarose é utilizada não apenas para determinar se um experimento de PCR funcionou, mas também para oferecer informações adicionais. Por exemplo, a presença de sítios de restrição na região amplificada do DNA-molde pode ser determinada por intermédio do processamento do produto da PCR com uma endonuclease de restrição, antes de fazer a amostra migrar no gel de agarose (Figura 9.9). Fsse é um tipo de análise de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP, do inglês restriction fragment length polymorphism) e é importante tanto na construção de mapas genômicos (p.262) quanto no estudo de doenças genéticas (p. 311). Alternativamente, o tamanho exato do produto da PCR pode ser utilizado para estabelecer se o DNA-molde contém alguma mutação de inserção ou deleção na região amplificada (Figura 9.9). As mutações de comprimento desse tipo formam a base do perfïl do DNA (DNÁ proftling), uma técnica central na ciência forense (Capítulo 16). Em alguns experimentos, a simples presença ou ausência do produto da PCR tem caráter diagnóstico: por exemplo, quando a PCR é utllizada como um procedimento de seleção para identificar um gene desejado em uma biblioteca genômica ou de DNA complementar (cDNA). Realizar PCRs com cada clone em uma biblioteça genômica parece ser uma tarefa tediosa, porém uma das vantagens da PCR é que experimentos individuais são rapidamente montados e muitas PCRs podem ser executadas paralelamente. A carga de trabalho também pode ser reduzidapela sondagem combinatória, um exemplo da qual é mostrado na Figura 9.10.
196 ï
A. Bnowlr
.L-
t,
O-\-
\
'+\
PCR
--.
-
\ PCR
\ Clivagem
.L/
Figura 9.9 A eletroÍorese err gel do produto da PCR pode informações sobru a molécula de DNA-molde. As F
nhasle2mostram, respectiva-
t-
f-
Marcadores de tamanho
mente, um de PCR não-clirra do e um prodúo clivado com urìa enzima que cliva no sítio R. A mostra o obtido quando o DNA-molde corr tém uma inser@ na região ampliÊ cada.
Clonagem dos produtos da PCR Algumas aplicações necessitam que, após
a PCR, os produtos resultantes sejam ligados a vetor e examinados por qualquer um dos métodos-padrão utilizados nos estudos de c do DNA. Isso pode parecer fácil, entretanto há complicações. O primeiro problema diz respeito às extremidades dos produtos da PCR. Ao se exarni a Figura 9.2, é possível pensar que os fragmentos amplificados por PCR possuam des cegas. Se assim fosse, eles poderiam ser inseridos em um vetor de clonagem por li cega entre as extremidades ou, de modo alternativo, os produtos da PCR poderiam receber tremidades coesivas pela união com moléculas de ligação ou adaptadores (p. 88). Infelì te, a situação não é tão simples. A DNA-polimerase de Thq tende a acrescentar um deo adicional, em geral uma adenosina, à extremidade de cada fita que ela sintetiza. Isso nifica que um produto de PCR de fita dupla não possui extremidades cegas e, ao contrári maioria das terminações 3'possui um único nucleotídeo sobressalente (Figura 9.11). Os cleotídeos sobressalentes poderiam ser removidos pelo tratamento com uma enzima clease, resultando produtos de PCR com extremidades cegas verdadeiras, porém essa uma conduta popúlar, pois é difícil de impedir que a exonuclease se torne hiperativa e outros danos às extremidades das moléculas. Uma solução é utilizar um vetor de clonagem especial, que contenha timidinas (T) salentes e que, conseqüentemente, possa ser ligado ao produto da PCR (Figura 9. 1 2). En ral, tais vetores são preparados segundo a restrição de um vetor-padrão em um sítio de nação cego e depois tratado com a DNA-polimerase de Taq, somente na presença de 2' xitimidina 5'trifosfato (dTTP). Nenhum iniciador está presente, de modo que tudo que a limerase pode fazer é adicionar um nucleotídeo T às extremidades 3' da molécula cega do
i
& Ë, .-tt I
Figura 9-10
A sondagem cr nes é sondada nações de don
positivo(s) seia plaa2, na linh deduzir que exi ção não é arrü resultados pci sárias se existir
Brown, T. A. (1Í
Clorunceu GÊNrcA
,",/
Figura 9.9 A eletroÍorese em gel do produto da PCR pode inÍormações sobre a molécula de DNA-molde. As lF
-?.-i.*-*-*-*-#.F,F*?
,-t':-,'" ,:";: :':-:r -,t ,,'" :i,r:t {+;''' t*
7 ,,*t 1,,"-;t.r,^ ;"r- ,-;.*
r*} ,$1 {}}. *t9.ige.6 ï:;w;;.n'l : ; ::. w. :.
{*e
nhasle2mos-
oe
DNA
197
Mistura, PCR
/
.t -1' "' ,// /Ú
Repetida para todas as linhas em todas as 10 placas = 80 PCRs
tram, respectiva' mente, um de PCR do e um produb clivado com ufiÌar enzima que cliva no sítio R. A mostra o obtido quando o DNA-molde corr' tém uma inser@ na região amplifr. cada.
,Á
E ANÁLrsE
Mistura, PCR
Repetida para todas as colunas em todas as 10 placas = 120 PCRS Mistura com cavidades A1 de todas as outras
I
placas, PCR
resultantes sejam ligados a nos estudos de da PCR. Ao se e por PCR possuÍìm vetor de clonagem por da PCR poderiam adaptadores (p. 88). lende a acrescentar um nuc fita que ela sintetiza. Isso s cegas e, ao ente (Figura 9.11). Os com uma enzlma verdadeiras, porém essa se
torne hiperativa
e
contenha timidinas (T) da PCR (Figura 9.12). Em -padrão em um sítio de somente na presença de 2' de modo que tudo que a 3' da molécula cega do
Repetida para todas as cavidades = 96 PCRs Total de PCRS = 296
Figura 9.10 A sondagem combinatória de clones em placas de microtitulação. Uma biblioteca de 960 clones é sondada por uma série de PCRs, cada uma com uma combinação de clones. As combi-
nações de clones com resultados positivos permitem que a(s) cavidade(s) contendo clone(s) positivo(s) seja(m) identiÍicada(s). Por exemplo, se PCRs positivas são obtidas na linha A da placa 2, na linha D da placa 6, na coluna 7 da placa 2 e na coluna 9 da placa 6, então se pode deduzir que existam clones positivos nas cavidades A7 da placa 2 e D9 da placa 6. Essa dedução não é ambígua e pode ser feita sem que se realizem as PCRs nas cavidades (que teriam resultados positivos para as cavidades A7 e D9). As PCRs das cavidades somente são necessárias se existirem dois clones positivos na mesma placa. (Reproduzida com permissão de Brown, T. A. (1999) Genomes. BIOS Scientific Publishers, OxÍord.)
198
T. A. Bnowrl
eficientemente 3'
5',
AGAC TC AGA..............,,.......,...AAC T T A TT T A lllllllll ttttttltt A TC TGAG TC T........,.,......,.........T TGA A T A AA q,'
é
Figura 9.11
limitada àqut
sentes no DNI tensão da extn zar com a mol
Polinucleotídeos sintetizados pela DNA-polimerase de laq geralmente possuem uma adenosina extra nas suas terminações 3'.
PCR que poss,
Produto da PCR
Vetor com a cauda de T
Figura 9.13 Obtenção de um produto de PCR @ín uma extremidade coesiva Pelo uso um iniciador cuia seqüência inclui um sítio de restrição.
ú
Figura 9.12 Utilização de um vetor especial com uma cauda de T para clonar um produto de PCR.
tor, resultando em um vetor com uma cauda de I na qual os produtos da PCR podem ser inseridos. Uma segunda solução é desenvolver iniciadores que possuam sítios de restrição. Depois da PCR, os produtos são tratados com uma endonuclease de restrição que, ao clivar cada molécula na seqüência iniciadora, gera fragmentos com extremidades coesivas, que podem ser
Fi PCF de iniciador Um de restrição Present extensão na extrel
Cloruneeu GÊNrcA
sintetizados pela de ïag geralmente adenosina extra nas
E ANÁLrsE DE
DNA
199
eficientemente ligados em um vetor de clonagem padrão (Figura 9.13). Essa abordagem não é limitada àquelas circunstâncias nas quais os iniciadores transpõem os sítios de restrição presentes no DNA-molde. Pelo contrário, o sítio de restrição pode ser incluído em uma curta extensão da extremidade 5'de cada iniciador (Figura 9.14). Essas extensões não podem hibridizar com a molécula-molde, porém são copiadas durante a PCR, resultando em produtos de PCR que possuem os sítios de restrição terminais.
Seqüência do iniciador
5',
CTCTGGATCCAGATATG
3',
Produto resultante da PCR A T G..... CAGAT C TCT G G ATC I I I r r r rl ll I tt trr AGAGAC C TA G GT CT A T A C.,,.. I
A extra
Figura 9.13
(Dtenção de um GATCCAGATATG,.., llllllll GTCTATAC,,,.
produto de PCR extremidaiva pelo uso iniciador cuja ia inclui um sïb de restrição.
um vetor especial com clonar um produto de
Extremidade . coesiva
DNA-molde
3' ...GTG TC TGAG TC TC TCT TGGGTGG..
IrìrïililìÌtÌllïÌ
da PCR podem
Figura 9.14 sítios de restrição. ição que, ao clivar cade s coesivas, que podeu
a-
lniciador
lúiador de PCR com sítio nestrição presente em uma
,r#nsão na extremidade 5'
5'
200
T. A. BRowN
9.3 Problemas com a Íreqüência de erro da DNApolimerase de fag Todas as DNA-polimerases cometem erros durante a síntese do DNA, ocasionalmente rindo um nucleotídeo incorreto na fita de DNA em crescimento. A maioria das poli entretanto, é capaz de corrigir tais erros, retornando a eles e ressintetizando a seqüência reta. Essa propriedade é conhecida como uma função de " leitura de revisão" e está na dência da polimerase possuir uma atividade de exonuclease no sentido 3'para 5' (p. 6a). A DNA-polimerase de Taqparece não possuir a atividade de leitura de revisão e, como Íêsultado, é incapaz de corrigir seus eÍros. Isso significa que o DNA sintetizado pela DNA limerase de Taq nem sempre é uma cópia acurada do DNA-molde. O índice de erro tem estimado em I para cada 9.000 nucleotídeos de DNA sintetizados, o que pode paÍecer q insignificante, mas que se traduz em 1 erro a cada 300 pb para os produtos da PCR após 30 ciclos. Isso porque a PCR envolve cópias feitas de cópias das cópias, de modo que erros induzidos pela polimerase gradualmente se acumulam e os fragmentos produzidos ao nal de uma PCR contêm cópias dos erros iniciais, além de quaisquer outros novos erros i duzidos durante a rodada final de síntese. Para muitas aplicações, esse alto índice de erro não representa um problema. Em parti lar, o seqüenciamento direto de um produto de PCR (p.216) providencia a seqüência do molde, mesmo que os produtos da PCR contenham os erros introduzidos pela DNAmerase deTaq.Isso ocorre porque os eÍros são distribuídos aleatoriamente, logo, para molécula que possua um eÍro em um nucleotídeo em uma determinada posição, haverá tas moléculas com a seqüência correta. Nesse contexto, a freqüência de erro é, de fato, insi
nificante. lsso não acontece se os produtos da PCR forem clonados. Cada clone resultante múltiplas cópias de um único fragmento amplihcado, logo o DNA clonado não possui, sariamente, a mesma seqüência da molécula-molde original utilizada na PCR (Figura 9.1 Tal possibilidade gera uma incerteza para todos experimentos realizados com produtos PCR clonados e determina que, sempre que possível, o DNA amplificado deva ser diretamente em vez de ser clonado.
Figura 9.15 AÍreqüência elevada de erro da DNApolimerase de Taq lffina-se importante ,qpiando os produtos rlas PCRs são clonados.
Leituras adicio
Marchuk, D., Dn for direct clc Rychlik, W., Spe invitro. Nuc Saiki, R.K., Gelf table DNA p
CLorunceu GÊrurcn e AtÁuse oe DNA
NA. Produtos de fita dupla da PCR
DNA, ocasionalmente
-"------*t-rigação
A maioria
das rintetizando a seqüência de revisão" e está na de
'f-->'-
I
--j"-
hentido 3' paras' (p. 6a).
'/ -*.-
um
em ( vetor \ \
\ /
/ \---"
1
ileirura de revisão e. comorE 5intetizado pela DNA-p O índice de erro rem siü o fos. que pode parecer qrnr produtos da PCR obriü fos das cópias. de modo quec fs Fagmentos produzidos ao fi ! fiuer outros novos erros intu I
[A
Errosemposições / aleatórias/\\/
p.
\\---l
\
\
i
I \---l Motécutas de DNA recombinantes
,*"/
t
problema. Em particil lra um pvidencia a seqüência corrct pnroduzidos pela DNA-poü ptoriamente. Iogo, para cail pinada posição. haverá mli
pcia
Ae
O--a\
eno é. de fato. insQ
i
I
Fada clone resultante cont fAclonado não possui. nec lizada na PCR (Figura 9.1 I
realizados com produtos
deva ser estud: foplificado Ì I
I
I :
Figura 9.15 A Íreqüência eleva-
da de erro da DNApolimerase de Taq bna-se importante çrando os produtos das PCRs são clonados.
OÕ
Um clone único contém múltiplas cópias da mesma molécula todas com os mesmos erros
-
ras adicionais Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A. & Collins, F.S. (1991) Construction of T:vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodihed PCR products. Nucleic Acids Research, lg, I t 54. Rychlik, W, Spencer, WJ. & Rhoads, R.E. (1990) Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Research, 18, 6409- 12. Saiki' R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S. er ai. (1988) Primer-diÍected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239,487-91. [A primeira descrição de PCR utilizando polim erase de Taq.]
J
PARTE2
APLTCAçOES DA CLONAGEM GÊNICA E DA ANALISE DE DNA NA PESQUISA
l,
r!
Cnpírulo 10 Estudando a Localizaçáo e a Estrutura do Gene
Como estudar a localização de um gene, 205
Seqüenciamento de DNA: revelando a estruturâ de um gene, 2l I
A Parte I deste livro mostrou como um experimento de clonagem habilmente realizado ou uma reação em cadeia da polimerase (PCR) podem fornecer uma amostra pura de um gene individual, ou qualquer outra seqüência de DNA, separada dos demais genes e seqüências de DNA da célula. Agora, a atenção volta-se para as maneiras como a clonagem, a PCR e outras técnicas de análise do DNA são utilizadas para estudar os genes. Serão considerados três aspectos da pesquisa na biologia molecular:
(1) (2) (3)
As técnicas utilizadas para estudar a localização e a estrutura de um gene (este Capí-
tulo). os métodos utilizados para estudar
a expressão e função de um gene (capítulo l l). As várias técnicas coletivamente chamadas de genômicas e pós-genômicas (capítu-
lo
12).
1 Como estudar a localização de um gene Várias técnicas estão disponíveis para determinar alocalização de um gene em uma molécula de DNA. A natureza precisa do procedimento utilizado depende do tamanho da molécula de DNA envolvida, com as técnicas aplicáveis para moléculas pequenas, tais como versões normais e recombinantes de plasmídeos e cromossomos de fagos, sendo diferentes daquelas utilizadas para alocalização de um gene em moléculas de DNA extensas, pertencentes aos cromossomos eucarióticos.
I
l I
--u
ilt
206
T. A. Bnowlr
10.1.1 Localizando a posição de um gene em uma molécula de DNA pequena Considere novamente o exemplo da seleção direta utilizado no Capítulo 8, o qual resultou m gene que confere resistência à canamicina, originado de R6-5, sendo clonado como um fragmento de EcoRI portado pelo pBR322 (p. 167). Agora que o clone está disponível, seria bastante útil determinar-se em qual, dentre os 13 fragmentos de EcoRI de R6-5, o gene está lo" calizado, uma vez que essa informação permitiria que o gene fosse colocado no mapa de rer trição de R6-5 e posicionado em relação aos outros genes desse plasmídeo. Primeiramente, uma clivagem de restrição de R6-5 com EcoRI deve ser separada pm uma eletroforese em gel de agarose, de forma que os fragmentos individuais possam s€ü identificados (Figura 10.1a). Um desses fragmentos é o mesmo que aquele inserido na nx)lécula de pBR322 recombinante, a qual contém o gene que confere resistência à canamÈ
cina. O propósito é, portanto, marcar a molécula recombinante e utilizá-la como sonda ut reação de clivagem, o que pode ser obtido enquanto os fragmentos de restrição ainda exrtão contidos no gel da eletroforese, mas os resultados não são normalmente muito bomi, uma vez que a matriz do gel produz uma quantidade grande de sinais de hibridização da fundo inespecíficos, que mascaram o sinal de hibridização específico. Ao contrário, es bandas de DNA do gel de agarose são transferidas para uma membrana de náilon ou nitocelulose, fornecendo um ambiente muito mais "limpo" para o experimento de hibridizerção.
A transferência das bandas de DNA de um gel de agarose para uma membrana utiliza técnica aperfeiçoada eml975 por E. M. Southern e referida como transferência de (ott Southern-blot). A membrana é colocada sobre o gel e um tampão é forçado a passar vés dele, carregando o DNA do gel para a membrana, na qual o DNA é ligado. Aparelhos fisticados podem ser adquiridos para auxiliar esse processo, mas muitos biologistas lares preferem um dispositivo caseiro, que inclui uma grande quantidade de papéis-toalhe habilidades de equilíbrio consideráveis (Figura 10.1b). O mesmo método pode também utilizado para a transferência de moléculas de RNA (transferência de "northern") ou teínas (transferência de "western' '). Até o momento, ninguém sugeriu uma transferência eastern" . A transferência de Southern resulta em uma membrana que contém uma réplica das das de DNA do gel de agaÍose. Se a sonda marcada é então aplicada, a hibridização ocorre uma auto-radiografia (ou um sistema de detecção equivalente para uma sonda não-radioati revela qual fragmento de restrição contém o gene clonado (Figura l0.lc). Assim é poss posicionar-se o gene que confere resistência à canamicina no mapa de restrição de R6-5 gura 10.1d). A transferência de Southern e a hibridização podem ser utilizadas paralocalizar a ção de um gene clonado, ou um isolado por meio de PCR, dentro de uma molécula de qualquer, da qual um mapa de restrição foi obtido. Note que essa molécula de DNA ria ser, ela mesma, um plasmídeo ou fago recombinante, com a hibridização de Sou utilizada para determinar a posição exata de um gene no fragmento clonado. Isso é i tante, pois, com freqüência, o fragmento de DNA clonado é relativamente extenso exemplo, 40 kb para um vetor cosmidial), enquanto o gene de interesse, presente em ma parte do fragmento clonado, pode possuir menos que 1 kb de tamanho. Também o mento clonado pode caÍregar inúmeros genes, além daquele em estudo. As estratégias critas no Capítulo 8 para a identificação de um clone a partir de uma biblioteca genômi podem, pois, ser seguidas por uma análise de Southern da molécula de DNA recomb para localizar a posição exata, dentro do fragmento clonado, do gene que está sendo rado (Figura 10.2). "
i
I
Figura 10.1 A hibridização de Southern.
1.2 Localizando de DNA exte
A hibridização d
do para a molécu a maioria dos plr
Cr-oruaceu GÊnrcn
r
ANÁLrsE oe
DNA
2O7
Dlécula (a) EletroÍorese do DNA de R6-5 clivado com EcoRl 8, o qual resu pdo clonado como um e está disponível, seria R.I de R6-5, o gene está
bítulo
E colocado no mapa de
plasmídeo.
taRI deve ser separada los individuais possam lpe aquele inserido na úere resistência à ,e utilizála como sonda htos de restrição ainda normalmente muito c sinais de hibridização
(b) TransÍerência de Southern
pecífico. Ao contrário, inbrana de náilon ou ni
Papéis-toalha Membrana de náilon --- ou nitrocelulose
j
---1--:---
=E-El-f-t,E=
í-';e"t
experimento de hi Suporte
furna membrana utiliza
hansferência de pãoéforçadoapassar h*a e UgaOo. Aparelhos
(c) Resultado da sondagem por hibridização
huitos biologistas
m r
htiaaAe de papéis bmétodo pode também
fude"northern")
|l lll
ou
igeriu uma
htém uma réplica
Ha
a
(d) Posicionamento do Íragmento no mapa de restrição de R6-5
das
hibridização
luma sonda
h p
lll llll
l0.lc). Assim
a-
é
FragmenÌo 6 = posição
o"ï;"" n".-
de restrição de R6-5
---
ladas para localizar a
ldr u-u
Sítios de EcoRl
molécula de
h molécula de DNA lhibridização de hto clonado. Isso é i blativamente extenso
Figura 10.1 A hibridização de Southern.
Lteresse, presente em
ltamanho. Também o bstudo. As estratégias
I uma biblioteca nrla de DNA recombi Bene que está sendo
I
1.2 Localizando a posição de um gene em uma molécula de DNA extensa A hibridização de Southern é possível somente se um mapa de restrição pode ser determinado para a molécula de DNA em estudo. Isso significa que o procedimento é apropriado para a maioria dos plasmídeos, bacteriófagos e vírus, mas não pode ser utilizado paralocalTzar
208
T. A. Bnowlr
rede de poros tamanho podr gressivamenú que 50 kb nã
Molécula de DNA recombinante está o gene?
- onde
As limitar mais complic é mais bem il glès orthogor longo do con res de eletrod
ra 10.4a). O r reção continu
Hibridização de Southern
Uma vez r léculas de Dì nos reta (Figr DNA deve se pois uma mol mitindo que r mensão adicir
VETOR
Fragmento de restriÇão
contendo o gene
Figura 10.2 A hibridização de Southern ser utilizada para localizar a po. sição de um gene clonado em uma molécula de DNA recomt*. nante.
o mapeamento de restrição torna-se muito do com moléculas com mais de 250 kb de tamanho, conforÍne pode ser notado se for a Figura 4.18. Esse exemplo de mapeamento de restrição é bastante direto, uma vez quË molécula de l, não é muito extensa. Imagine o quanto a análise seria mais complexa se tisse uma quantidade de sítios de restrição cinco vezes maior. Outras técnicas devem, to, ser utilizadas para localizar as posições de genes eucarióticos nas moléculas de DNA genes em moléculas de DNA extensas.
mossômico.
Separando cromossomos por meio da eletroÍorese em gel A primeira questão a formular é: qual cromossomo contém o gene de interesse? para organismos isso pode ser respondido segundo um tipo especial de hibridização de Sou envolvendo, em vez de fragmentos de restrição, moléculas de DNA cromossômico i separadas por um tipo inovador de eletroforese em gel. Na eletroforese em gel convencional, conforme descrita na página 78, o campo elétrico tá orientado junto com o comprimento do gel e as moléculas de DNA migram em um linha ta em direção ao pólo positivo (Figura 10.3a). Moléculas com tamanhos diferentes podem separadas devido às suas velocidades diferentes, com as quais elas são capazes de migrar
Figura 10.3 em gel agarose convene suas limitações.
CLouceu
GÊNrcA E Ar.rÁr-rse oe
DNA
209
rede de poros que compõe o gel. No entanto, somente moléculas dentro de uma certa faixa de tamanho podem ser assim separadas, pois a diferença na velocidade de migração torna-se progressivamente menor para moléculas maiores (Figura 10.3b). Na prática, moléculas maiores do que 50 kb não podem ser eficientemente resolvidas por eletroforese em gel padrão. As limitações da eletroforese em gel-padrão podem ser resolvidas se um cÍìmpo elétrico mais complicado é utilizado. Viírios sistemas diferentes foram desenvolvidos, mas o princípio é mais bem ilustrado pela eletroferese em gel de campo pulsado ortogonal (OFAGE, do inglèn orthogonalfield alternation gel electrophoresls). Em vez de ser aplicado diretamente ao longo do comprimento do gel, o campo elétrico, nesse experimento, alterna-se entre dois pares de eletrodos, cada um ajustado em um ângulo de 45" em relação à extensão do gel (Figura10.4a). O resultado é um campo pulsado, com as moléculas de DNA no gel trocando de direção continuamente, de acordo com os pulsos. Uma vez que os dois campos alternam de uma maneira regular, o movimento final das moléculas de DNA no gel ainda é de uma extremidade para a outra, em uma linha mais ou menos reta (Figura 10.4a). No entanto, em cada troca na direção do campo, cada molécula de DNA deve ser realinhada por 90', antes que a sua migração continue. Esse é o ponto-chave, pois uma molécula pequena pode realinhar-se de forma mais rápida do que uma extensa, permitindo que a molécula curta progrida em direção à base do gel mais rapidamente. Essa dimensão adicional aumenta o poder de resolução do gel um tanto drasticamente, de forma que
a
(a) Eletroforesê em gel de agarose convencional
Jura 1O.2
fbridização de Southern
[úilizada para localizar
e
a
[-,-
po de um gene clonado em p molécula de DNA
Fe
//
M
//
mroracao Il
-----E--
foão torna-se muito lpode ser notado se for lstante direto, uma vez p seria mais complexa se hrtras técnicas devem, Ds nas moléculas de DNA
(b) A inÍluência do comprimento do DNA na velocidade de migração
Baixa resolução das moléculas de DNA acima de um determrnado tamanho
(ú
!^
o<
$e em gel
CZ oô .Eo
pne de interesse? Para lde hibridização de DNA cromossômico
F:
Figura 10.3 kgina 78, o campo elé DNA migram em um linha
panhos diferentes podem fas são capazes de migrar
L
Resolução adequada das moléculas de DNA nessa faixa de tamânho
O:i j.c) otõ
em gel agarose convene suas limitaçoes.
oE Distância migrada em x horas
21O
T.A.Bnowru
moléculas com mais de vários milhares de quilobases de comprimento podem ser separadasEssa amplitude de tamanho inclui moléculas cromossômicas de muitos eucariotos, incluindo levedura, viírios fungos filamentosos importantes e protozoários, tal como o parasita da mú[na plasmodiumfalciparum. Géis mostrando os cromossomos desses organismos podem, patanto, ser obtidos (Figura 10.4b). A eletroforese em gel de campo pulsado ortogonal e técnicas relacionadas, tais como on campos elétricos homogêneos de contornos grampeados (CHEF, do inglês contour clam' pediomogeneous electric fields) e a eletroforese em gel de campo invertido (FIGE' do inglê,sfietd irwersion gel electrophoresis), são importantes por inúmeras razões' Por exemplo'o bNa. a" cromossomos individuais pode ser purificado do gel, possibilitando que conjuntos & bibliotecas genômicas cromossômicas sejam preparadas. Cada uma dessas bibliotecas, colD' tendo os genes de somente um único cromossomo, é substancialmente menor e mais fácil & manipular do que uma biblioteca genômica completa. Além disso' moléculas de DNA cÍo" mossômicas podem ser imobilizadas em uma membrana de nitrocelulose ou náilon pela tram. ferência de Southern e serem submetidas à análise por hibridização. Assim, o c que possuir um gene clonado ou um gene isolado pela PCR pode ser identificado.
A hibridizaç cromossom As técnicas de
r
limitadas aos er culas muito ma de alguma fom
moléculas de D sui a vantagem do, mas tambér
A hibridiza
servar cromoss tos organismos pelo padrão de fornece uma lo tica de um croÍ As células r
com ribonucle DNA. O parea
(a) OFAGE
mossomos des enclausurados da e aplicada à mossômica hor
'mt \l-' ;i_ \
ção dessa manr ca difícil, a hib meros genes ni
Como uma sonda e a hibri
-/
\1
óptico. Se fluc mesmo tempo tas de suas flu inglês fluoresc
jas localizaçõt estudo de célu cromossômica
identificados r
(b) Separação dos cromossomos de levedura por meio da OFAGE
nicas de colon tV XV
íiO.2 Seqüencii
Xlll. XVI
-: xtv ---VII,
de um ger
--tl -xl
Provavelmentr ciamento de f Número do cromossomo
=
l-
ser determina<
Figura 10.4 EletroÍorese em gel de camPo do ortogonal (OFAGE).
Pul*
do e eficiente
Croxneev GÊrurcn e ANÁLrsE oe
podem ser
muitos eucariotos, inc tal como o parasita da organismos podem, relacionadas. tais , do inglês contour
invertido (FIGE, doi razões. Por e
bilitando que uma dessas bibliotecasmenor e mals sso, moléculas de DNA ulose ou náilon pela ;ão. Assim, o cr ser identificado.
DNA
211
A hibridização in siÍu para visualizar a posição de um gene em um cromossomo eucariótico As técnicas de eletroforese em gel não-convencionais, incluindo OFAGE, são, até o momento, limitadas aos eucariotos inferiores, cujos cromossomos são relativamente pequenos. As moléculas muito maiores (> 50.000 kb) dos mamíferos e outros eucariotos superiores estão ainda, de alguma forma, além da capacidade da tecnologia atual. A localização de um gene nessas moléculas de DNA extensas pode, no entanto, ser obtida pela hibridização in siÍa, a qual possui a vantagem adicional de não apenas identificar em qual cromossomo o gene está localizado, mas também fomecer informação a respeito da posição do gene no seu cromossomo. A hibridização in situ deriva das técnicas de microscopia óptica padrão, utilizadas para observar cromossomos em células que estão em processo de divisão (Figura 10.5a). Com muitos organismos, cromossomos individuais podem ser reconhecidos por meio de suas formas e pelo padrão de bandeamento produzido por vários tipos de corantes. A hibridização in situ fornece uma localização visual direta de um gene clonado sobre a imagem de microscopia óptica de um cromossomo. As células são tratadas com um fixador, ligadas a uma lâmina de vidro e, então, incubadas com ribonuclease e hidróxido de sódio para degradar o RNA e desnaturar as moléculas de DNA. O pareamento de bases entre as fitas polinucleotídicas individuais é desfeito, e os cromossomos desempacotam-se em um certo nível, expondo segmentos de DNA normalmente enclausurados dentro da sua estrutura (Figura 10.5b). Uma amostra de gene é, então, maÍcada e aplicada à preparação cromossômica. A hibridização ocorre entre o gene e sua cópia cromossômica homóloga, resultando em uma mancha escura em uma auto-radiografia. A posição dessa mancha indica a localização do gene em seu cromossomo. Embora seja uma técnica difícil, a hibridização in situ com sondas radioativas tem sido úilizadapnaposicionar inúmeros genes no mapa citogenético humano. Como uma alternativa à marcação radioativa, um marcador fluorescente pode ser ligado à sonda e a hibridização observada diretamente, utilizando-se um tipo especial de microscópio óptico. Se fluorocromos diferentes são utilizados, dois ou mais genes podem ser sondados ao mesmo tempo, com os diferentes sinais de hibridização sendo distinguidos pelas cores dístiÀtas de suas fluorescências. Essa técnica, hibridização in sítu com fluorescência (FISH, do inglês fluorescence in sitn hibridization), é também freqüentemente utilizada com sondas, cujas localizações cromossômicas normais já são conhecidas. Isso é particularmente útil para o estudo de células que sofreram rearranjos cromossômicos. Rearranjo.s, tais como duplicações cromossômicas, ou a translocação de um segmento de um cromossomo para outro, podem ser identificados relativamente rápido pela FISH, bem mais rapidamente do que por meio das técnicas de coloração convencionais.
Seqüenciamento de DNA: revelando a estrutura de um gene
110.4
h"r" er gel de campo lgonal(OFAGE). I I
I !
T
È
Ê I
I
ra'-'
Provavelmente, a técnica mais importante disponível para o biologista molecular é o seqüenciamento de DNA, pelo qual a ordem exata dos nucleotídeos em um segmento de DNA pode ser determinada. Somente a partir do final da década de 1970 o seqüenciamento de DNA rápido e eficiente tornou-se possível.
212
T.A.BRowN
10.2.1 O método de de cadeia
(a) Cromossomos humanos na metálase
t/.r,ts
Padrão de bandeamento reconhecível
flï=
*4 *Ço,Í*l ,, Nrly.;:5,,ía ' rnlrV ^r,t I
I
O método de termir a ser seqüenciada t to por terminação r plementar a um m(
O iniciador
ffi
-.--------**') /
O primeiro Pasn
romossomo
10 pm
e
lamento de um olil nante (Figura 10-ú
fita comPlementar,
ma relacionada" tal cada peloSãcïéã6 dupla, a Partir da q
(b) Hibridização in situ
+
/)
sição adjacente ao
3::ffi::i::"'
Síntese da Íita A reação de síntes cada um dos quan
f f
midina 5'-trifosfat fosfato [dCTP]).1
.Apricação da sonda,
auto-radiografia
Lâmina de vidro com as células
ra de reação. Esse
\
fixadas
rado na cadeia Pc
cleotídeo normal, cleotídeo não Pos Esse grupo é nect
deia ocorre, poru la enzima. Se didesoxi-l Manchas mostram a localizaçáo
cromossômica de um gene clonado
opostas às timina meira T, uma vez
/ -'t
,/ =-qj -/o
,4'
i i ,[/ |,/ -/ \
Figura 10.5 Cromossomos e hibridização rn sr tu.
didesoxinucleoú ser polimerizada
ja incorporada-
I
O
diferentes, mas c
Quatro reaçõ Íitas terminat A reação de síntr Duas tecnologias diferentes foram desenvolvidas quase que simultaneamente - o método' de terminação de cadeia por F. Sanger e A. R. Coulson, no Reino Unido, e o método de degradação química por A. Maxam e W. Gilbert, nos Estados Unidos. As duas técnicas são radicalmente diferentes, mas igualmente valiosas. Ambas permitem que seqüências de DNA de vrírios quilobases de tamanho sejam determinadas em um tempo mínimo. A seqüência do DNA é, no momento, a primeira e o tipo mais básico de informação a ser obtido, em relação a um gene clonado.
com didesoxi-Al soxi-CTP. O resr
uma famflia cent do em didesoxi-1 O próximo p tos de cada fita 1 gel, embora as cr
Croruecev GÊrurca e ANÁLtsE oe
DNA
213
O método de Sanger-Coulson: nucleotídeos terminadores de cadeia O método de terminação de cadeia necessita de um DNA de fita simples e, assim, a molécula a ser seqüenciada é normalmente clonada em um vetor M13. Isso é porque o seqüenciamento por terminação de cadeia envolve a síntese enzimática de uma segunda fita de DNA, complementar a um molde existente.
O iniciador O primeiro passo em um experimento de seqüenciamento por terminação de cadeia é o anelamento de um oligonucleotídeo iniciador pequeno Qtrimer) na molécula de M13 recombinante (Figura 10.6a). Esse iniciador atua como o ponto de partida paru arcação de síntese da fita complementar, realizada pelo fragmento de Klenow da DNA-polimerase I, ou uma enzima relacionada, tal como a "Sequenase", uma versão modihcada da DNA-polimerase codifi-
cadapeloE@'Lembre.sedequeessasenzimasnecessitamdeumaregiãodefita dupla, a partir da q'ual iniciam a síntese da fita (p. 68). O iniciador anela no vetor em uma posição adjacente ao sítio de clonagem.
Síntese da Íita complementar A reação de síntese
da fita complementar é iniciada pela adição da enzima, juntamente com cada um dos quatro desoxinucleotídeos (2'-desoxiadenosina 5'-trifosfato [dATP], 2'-desoxiti-
midina 5'-trifosfato IdTTP], 2'-desoxiguanosina 5'-trifosfato tdGTPl, 2'-desoxicitidina 5'-trifosfato tdCTPl). Além disso, um único nucleotídeo modificado é também incluído na mistura de reação. Esse é um didesoxinucleotídeo (p. ex., didesoxi-AlP), o qual pode ser incorporado na cadeia polinucleotídica em crescimento da mesma maneira eficiente como um nucleotídeo normal, mas que bloqueia o avanço da síntese da fita. Isso é porque o didesoxinucleotídeo não possui o grupo hidroxila na posição 3' da molécula de açúcar (Figura 10.6b). Esse grupo é necessiírio para que o próximo nucleotídeo seja adicionado; a terminação da cadeia ocorre, portanto, em todo o momento em que um didesoxinucleotídeo é incorporado pe-
laenzima.
Figura 10.5
Cromossomcü hibridização in tu.
Se didesoxi-AlP é adicionado na mistura de reação, a terminação ocoffe nas posições opostas às timinas no molde (Figura 10.6c). Porém, a terminação nem sempre ocorre na primeira I uma vez que dATP normal também está presente e pode ser incorporado, em vez do didesoxinucleotídeo. Arazão de dATP para didesoxi-ATP é tal que uma fita individual pode ser polimerizada por uma extensão considerável, antes que uma molécuia de didesoxi-AlP seja incorporada. O resultado é que uma famflia de fitas novas é obtida, todas de comprimentos diferentes, mas cada uma terminando em um didesoxi-ATP.
Quatro reações separadas resultam em quatro Íamílias de Íitas terminadas úmultaneamente
-
o
Unido,eométodode Às duas técnicas são radi e
seqüências de DNA de
ínimo. A seqüência do ser obtido, em relação a
A reação de síntese
da fita é realizadaem quatro reações simultâneas. Assim como a reação com didesoxi-ATP, existe uma com didesoxi-TTP, uma com didesoxi-GTP e uma com didesoxi-CTP. O resultado são quatro famflias distintas de polinucleotídeos recém-sintetizados, uma família contendo fitas em que todas terminam em didesoxi-ATP, uma de fitas terminando em didesoxi-TTP, etc. O próximo passo é separar os componentes de cada família, de forma que os comprimentos de cada fita possam ser determinados. Isso pode ser obtido por meio da eletroforese em
gel, embora as condições devam ser cuidadosamente controladas, pois é necessário separar as
214
T. A. Bnowr.r
fitas que diferem em extensão por apenas um nucleotídeo. Na prática, a eletroforese éreahada em géis de poliacrilamida muito hnos (com menos de 0,5 mm de espessura). Os géis cmtêm uréia, a qual desnatura o DNA, de forma que as fitas recém-sintetizadas dissociam-se dan fitas-molde. Ademais, a eletroforese érealizada em uma voltagem elevada, de maneira queo' gel é aquecido até 60oC ou mais, garantindo que as fitas não se irão reassociar de forma algu-
ção é introduzida.
ma.
A leitura da
Cada banda no gel contém somente uma pequena quantidade de DNA, de forma que urn auto-radiografia deve ser utilizada para a visualização do resultado (Figura 10.6d). A marw
mais, é localizadavido à incorporaçã essa banda aparec( qüência é, portantr A próxima bar cleotídeo mais lon Figura 10.7); o sq O processo coi nam-se tão aglorn partir de uma auto
(a) Anelamento do iniciador
Gene inserido em um vetor M13
M13
tivo (p. e*., "P-
r
on
experimento.
Lendo a seqüi seqüê
lniciador
10.2.2 O método de
NHr
b) Didesoxi-ATP DNA-polimerase dATP dTTP dGTP dCTP didesoxi-ATP
'G-
ï-O-P-?-O-P-o? P
lt
ô
ilill
ô
ô
I
/-"-"-\"
cH2
Existem somente
"ó\!l 'l-".-"2"" l-
r
Sanger-Coulson e
DNA de fita dupla
^
!,r"-.-l pC n'ficrc iJ tt
cial. Tampouco ur é a síntese de umi
Cu
reagentes químict
HH
.Posição onde o -OH (c) Síntese das Íitas
de um dNTP foi substituído por -H
qtrltr-r-
__
___
Novasfitas, -ôiiri i iii iii --òii todasterminamem Jjl
I rr
um
didesoxi-ATP
--a'r ::_i
i ii i
r
Didesoxi-ATp
i
\
\
lniciador (d) Auto-radiograÍia resultante
-ô
I
Fragmentos menorês
Figura 10.6 Seqüenciamento de DNA por terminação de cadeia.
lnterpretação da auto-radi duzida em um experimento ciamento por terminaçãc Cada canaleta contém os produzidos pelas sínteses presença de um dos quatro cleotídeos trifosÍatos (dide A seqüência é lida pela iden canaleta em que cada Írag rece, iniciando-sê com aqr grou para mais longe d
gradualmente avançando i autG
CLoNAcEM GÊrutcn e ANÁLtsE oe
DNA
215
radioação é introduzida, nas fitas recém-sintetizadas, pela inclusão de um deoxinucleotídeo t'S-dATP; do início fitas no síntese das de na etapa de reação mistura na (p. ou ex.,"Ptivo
eletroforese é de espessura). Os géis intetizadas dissociam-se elevada, de maneira irão reassociar de forma a
experimento.
Lendo a seqüência de DNA a partir da auto'radiograÍia é muito fácil (Figura 10.7). A primeira banda, ou seja, a que migrou mais, é localizada, a qual representa o menor segmento de DNA, a fita que foi terminada devido à incorporação do didesoxinucleotídeo na primeira posição do molde. A canaleta na qual essa banda apareceu é anotada. Digamos que foi na canaleta A; o primeiro nucleotídeo da seqüência é, Portanto, A. A próxima banda com maior mobilidade corresponde à molécula de DNA que é um nucleotídeo mais longa do que a primeira. A canaleta é registrada (T no exemplo mostrado na Figura 10.7); o segundo nucleotídeo é, portanto, I e a seqüência, aÍé o momento, é AIO processo continua ao longo de toda auto-radiografia até que as bandas individuais tornam-se tão aglomeradas que não podem mais ser separadas umas das outras. Geralmente, a partir de uma auto-radiografia, é possível ler-se uma seqüência de cerca de 400 nucleotídeos.
A leitura da seqüência de DNA, de forma que
(Figura 10.6d). A
10.2.2
NHp I
o método de Maxam-Gilbert: degradação química de DNA Existem somente umas poucas sirnilaridades entre os métodos de seqüenciamento de DNA de Sanger-Coulson e Maxam-Gilbert. O método de Maxam-Gilbert necessita de fragmentos de DNA de fita dupla, de forma que a clonagem em um vetor M13 não é um passo inicial essencial. Tampouco um iniciador é adicionado, pois o princípio da técnica de Maxam-Gilbert não é a síntese de uma fita nova, mas a clivagem de uma molécula de DNA existente, utilizando reagentes químicos que atuam especificamente em um determinado nucleotídeo.
"-"\" ltl
-*?t*
Didesoxi-NTP G
ATTGCGATTCG ddc
ATTGCGATTCddc ATTGCGATTddc
Figura 10.7
Figura mento de DNA por minação cadeia.
r_-
Interpretação da auto-radiograÍia proürzida em um experimento de seqüenciamento por terminação de cadeia. Cada canaleta contém os Íragmentos produzidos pelas sínteses das Íitas na de um dos quatro didesoxinudeotídeos triÍosÍatos (didesoxi-NTPs). seqüência é lida pela identiÍicação da canaleta em que cada Íragmento aparece, iniciando-se com aquele que migrou para mais longe da origem, e
gradualmente avançando ao longo da auto-radiograÍia.
ATTGCGATddT ATTGCGAddT ATTGCG ddA
ATTGCddc ATTG ddC
ATTddc
AÏddT AddT ddA
Direção da eletroforese
216
T.A.BRowN
Existem diversas variações do método de Maxam-Gilbert, diferindo em detalhes, tais como a maneira pela qual o DNA marcado é obtido e anaturezaexata dos reagentes de clivagem que são utilizados. A maioria desses reagentes é muito tóxica produtos químicos que clivam moléculas de DNA em um tubo de ensaio irão fazer o mesmo no organismo, devendo ser tomado um cuidado muito grande quando estes são utilizados. A descrição seguinte é uma versão popular da técnica de Maxam-Gilbert. Um fragmento de DNA de fita dupla que irá ser seqüenciado é, primeiramente, marcado pela ligação de um grupo fosfato radioativo na extremidade 5'de cada fita (Figura 10.8a). limãtilsutióxido (DMSO) é, eàtão, adicionado e a amostra de DNA marcada é aluecida a 90"C. Isso resulta na quebra do pareamento de bases e dissociação da molécula de DNA em suas duas fitas componentes, as quais são separadas uma da outra pela eletroforese em gel (Figura lg.Sb), com base no fato de que uma das fitas provavelmente contenha uma maior quantidade de nucleotídeos puínicos do que a outra, e irá, portanto, ser levemente mais pesada, movendo-se mais lentamente durante a eletroforese. Uma fita é purificada do gel e dividida em quatro amostras, cada uma delas tratada com um dos reagentes de clivagem. De fato, o primeiro conjunto de reagentes a ser adicionado provoca uma modificação química nos nucleotídeos para os quais eles são específicos, tornando a fita suscetível à clivagem naquele nucleotídeo, quando um produto químico adicional - piperidina - for adicionado (Figura 10.8c). A modificãção e as reações de clivagem são realizadas sob condições que resultam em apenas uma quebra por fita. Alguns dos fragmentos clivados retêm a marcação com "P nas suas extremidades 5'. Após a eletroforese, utilizando-se as mesmas condições especiais como paÍa o seqüenciamento por terminação de cadeia, as bandas são visualizadas pela auto-radiãgrafia qúe representa tais fragmentos marcados. A seqüência de nucleotídeos pode, então, ser lida da auto-radiograha exatamente como para o experimento de terminação de cadeia (Figura lO.gd).
10.2.3 Seqüenciamento de produtos de pCR Conforme descrito na página 195, alguns experimentos de PCR são projetados de forma que a informação desejada a respeito do gene, ou outra seqüência de DNA que está sendo estuãanoA" ser obtida simplesmente pela análise dos produtos por meio da eletroforese em gel.
{u'
Freqüentemente, no entanto, é necessário determinar a seqüãncia do fragmento de DNA amplificado, o que pode ser obtido pela clonagem do produto da pcR (p. 1 96) e pela utilização de um método de seqüenciamento padrão com terminadores de cadeà ou degradação química, conforme foi descrito.
Um problema com essa abordagem é que as seqüências dos clones individuais podem não representar fielmente a seqüência da molécula de DNA-molde originat, em decorrência dos erros ocasionalmente introduzidos pela DNA-polimerase de Taq durante o processo de amplifi-
cação (p. 200). Métodos que seqüenciam diretamente um produto de PCR, sem a necessidade de clonagem, são, portanto, necessários.
Figura 10.8 Uma versão do s+. qüenciamento de DNA pelo método de degradação química.
Seqüenciamento direto dos produtos da pCR O método de seqüenciamento direto está baseado na técnica de Sanger-Coulson e, portanto, requer DNA de fita simples como material inicial. O produto da PCR é, obviamente, de fita dupla, de forma que maneiras de purificar fitas simplãs são necessiírias. Há viírias possibilidades, a melhor delas é realizar-se a PCR inicial com um iniciador normal e um modificado, o iniciador modificado de tal maneira que as fìtas de DNA sintetizadas a partir dele sejam facilmente purificadas. Um modo brilhante de se realizar isso é pela ligação de pequenãs esferas magnéticas em um dos iniciadores. Após a PCR, o DNA de fita sìmples e òutioo pela se-
paração da fiti za um iniciadr na, uma protel Uma vez c
tes são semell culas com cad Sequenase. A
Cr-orueeeu GÊNrcA
E ANÁLrsE
oe
DNA
217
diferindo em detalhes, tais dos reagentes de cli
(a) Marcação e dissociação das Íitas
produtos químicos que no organismo, devendo ser
Polinucieotídeo-
*#:ËilÉ ÍÍÍrrflÍtÍÍÍr
-ãú@
Um marcado pela ligação de
@'.,
;PdATP*
5:1'ff[:;
DMSO
10.8a). Dimetilsulfóxido
90'C
ida a 90'C. Isso resulta na em suas duas fitas com (Figura 10.8b), com base idade de nucleotídeos movendo-se mais em quatro amostras, o primeiro conjunto de deos para os quais eles quando um
A modificação
.---.I
qurnase
,--"-O---l
o--
,---t--o
.-/ (b) Separação das Íitas leve e pesada
/
/
/ Marcação das extremidades 5'
Fitas simples marcadas
--"t-
e as
uma quebra por fita. nas suas extremidades 5'. para o seqüenciamento que representa ser lida da auto-radi , (Figura 10.8d).
Reações de clivagem
._A .-A
a a--------::4 ')----------.-A
.-T .- T_ o-1 T a.)-T
etc.
(d) A auto-radiograÍia resultante são projetados de
forma
DNA que está sendo meio da eletroforese em ia do fragmento de DNA PCR (p. 196) e pela uti cadeia ou degradação clones individuais podem iginal, em decorrência dos durante o processo de de PCR, sem a necess
Sanger-Coulson e, da PCR é. obviamente, de ssárias. Há várias
normal e um modifi a partir dele sejam pela ligação de pequenas fita simples é obtido pela I
t i
Figura 10.8 Uma versão do seqiirenciamento de DNA pelo método de degradação química.
paração da fita "magnética" da fita normal (Figura 10.9). Uma metodologia semelhante utiliza um iniciador marcado com biotina, com as fitas simples separadas pela ligação com avidina, uma proteína que possui uma elevada afinidade por biotina (p. 175). Uma vez que o DNA de fita simples tenha sido purificado, os procedimentos subseqüentes são semelhantes àqueles do método-padrão de Sanger-Coulson, no qual famílias de moléculas com cadeias terminadas são sintetizadas pela ação de uma DNA-polimerase, tal como a Sequenase. A única complicaçáo diz respeito ao iniciador utilizado no seqüenciamento, como
2'18
T. A. Bnowrrr
I I I II
lnlclar as reaço€ purificadas e, Pl com biotina.
lniciadores da fita
superior
Seqüenciam
lniciadores da fita inferior
*-)
DNA-molde
Sempre é neces posta é não, Pot ção, resultando
'Esferas
No seqüenc
magnéticas
te a uma mistur iniciador é adic da PCR não Por
fita do DNA-m,
reação é cicladi duz as cópias é
A
ÇflÍrÍ.rrÍIt' I
Desnaturação
I
ì
----
:.
//\ / l_-
deias terminad, DNA é lida de
pode ser utiliz: (p. 211), a mar centes, abrindc Marcadoret
--------.to -
<
I Á /\
r
Na metodologi
-' -Y
----------t'
que a Primeira
10,2.4 Seqüenciat
-------l'
------
r
tídeo diferente to, cadeias tern a corrida dos PI mo para um ex
I
II
segunda
-\
Separação das fitas marcadas com as esferas maonéticas
cada molécula
__________r-
- -------: -------:
Figura 10.9 Uma das maneiras de purificar DNA de fita simples, a partir de um produto de PCR de fita dupla. Um dos iniciadores é marcado com uma esfera magnética. Após a PCR, os produtos de fita dupla são desnaturados e as fitas magnéticao separadas das Íitas não-marcadas-
gura 10.11a). I NTPs, cujavar tro reações em to com todos o rentes podem s Como os si cessiário, um ti vez de confiar uma única can co tubo de um
(Figura 10.1 1t ponto de partida para as reações de síntese das fitas. No procedimento de seqüenciamento-pÈ drão, esse iniciador anela em um sítio do vetor Ml3, adjacente ao sítio de clonagem, dentm do qual o DNA a ser seqüenciado foi clonado (Figura 10.6). Esse iniciador "universal" nfu pode ser utilizado com produtos de PCR, uma vez que esses não possuem as seqüências fu M13 apropriadas. Ao invés dele, um dos iniciadores da PCR inicial é também utilizado pme
dados para o c seqüência pod te paÍa um arq 96 seqüências dos muito mai
Cronnceu GÊNrcA
E ANÁLrsE
oe
DNA
219
iniciar
as reações de seqüenciamento. Esse iniciador deverá ser complementar às fitas simples purificadas e, portanto, será o iniciador que não foi marcado com as esferas magnéticas ou com biotina.
Seqüenciamento em ciclos térmicos Sempre é necessiírio purificar fitas simples a fim de seqüenciar um produto de PCR? A resposta é não, porque é possível combinar PCR e seqüenciamento de DNA em uma única reação, resultando na técnica chamada seqüenciamento em ciclos térmicos. No seqüenciamento em ciclos térmicos, a mistura de reação que é preparada é semelhante a uma mistura de PCR, mas com duas exceções importantes. A primeira é que somente um iniciador é adicionado à reação, o que significa que o processo de amplihcação caracteístico da PCR não poderá ocorrer, e, em.vez disso, tudo o que acontecerá será a reprodução de uma fita do DNA-molde. No entanto, esse processo de reprodução é repetido muitas vezes, pois a reação é ciclada de forma térmica, exatamente como em uma PCR real, e a enzima que produz as cópias é termoestável, tal como a DNA-polimerase de Taq. A segunda diferença entre a reação de seqüenciamento em ciclos térmicos e uma PCR é que a primeiraérealizada em quatro reações simultâneas, cada uma com um didesoxinucleotídeo diferente incluído na reação. As novas moléculas que são sintetizadas possuem, portanto, cadeias terminadas (Figura 10.10), podendo a seqüência da molécula-molde ser lida após a corrida dos produtos das quatro reações em um gel de poliacrilamida, da mesma maneira como para um experimento padrão de Sanger-Coulson.
10.2.4 Seqüenciamento automático de DNA Na metodologia tradicional de seqüenciamento de Sanger-Coulson, as moléculas com as cadeias terminadas que são sintetizadas mostram-se radioativamente marcadas e a seqüência de DNA é lida de uma auto-radiografia. Essa não é a única estratégia de marcação e detecção que pode ser utilizada com a metodologia de terminação de cadeias. Como na hlbidização in situ (p.211), a marcação radioativa vem sendo substituída pela utilização de marcadores fluorescentes, abrindo novos horizontes pam o seqüenciamento do DNA.
das maneiras de purificar de Íita simples, a partir de um de PCR de Íita dupla. Um iniciadores é marcado com . esÍera magnética. Após a , os produtos de Íita dupla são e as fitas magnética das Íitas não-marcadas.
mento de seqüenciamento-p*te ao sítio de clonagem, denuu Esse iniciador "universal" não não possuem as seqüências do inicial é também utilizado pre
Marcadores fluorescentes são normalmente ligados aos didesoxinucleotídeos, de forma que cada molécula com a cadeia terminada contém uma única marcação na sua extremidade 3' (Figura l0.1la). Um fluorocromo diferente pode ser utilizado para cada um dos quatro didesoxiNTPs, cuja vantagem principal está no fato de que não se faz mais necessário realizar-se as quatro reações em tubos separados. Assim, é possível executar uma única reação de seqüenciamento com todos os quatro didesoxi-NTPs, pois as moléculas terminadas com didesoxi-NTPs diferentes podem ser identificadas por meio de seus sinais fluorescentes distintos. Como os sinais fluorescentes são detectados? Um tipo especial de sistema de imagem é necessário, um tipo que envolve a utilização de um computador para ler a seqüência de DNA, em vez de confiar nos olhos de um biologista molecular. Os produtos da reação são aplicados em uma única canaleta de um gel de poliacrilamida ou, na tecnologia mais moderna, em um único tubo de um sistema de e-letrofgrese capilar e, então, passados pelo detector de fluorescência (Figura 10.11b). O detector identifica o sinal fluorescente emitido pelas bandas e transmite os dados para o computador, o qual converte a informação na seqüência de DNA apropriada. A seqüência pode ser impressa para anillise pelo operador (Figura 10.1Ic) ou enviada diretamente para um arquivo de dados para análises futuras. Seqüenciadores automáticos podem ler até 96 seqüências diferentes em um período de duas horas e, por conseguinte, podem adquirir dados muito mais rapidamente do que é possível ao longo do seqüenciamento manual.
22O
T.A.Bnowru
PCR com um iniciador e didesoxi-ATP
Figura 10.11
rrrrrrrrttttttìtttttttì
Após quatro ciclos
L
L
ddA ddA
Fooa L
ddA
Figura 10.10 O princípio do seqüenciamento em ciclos térmicos. Uma PCR é realizada com somente um dos iniciadores e um dos didesoxi-NTPs. Uma das Íitas do molde é copiada, originando uma Íamília de polinucleotídeos com cadeias terminadas. ddA = didesoxi-AïP.
Seqüenciamento automático dê DNA. (a) Para o seqüenciamento automático, cada didesoxi-NTP é marcado com um marcador fluorescente. (b) Cada didesoxiNTP é marcado com um ÍluorocÍomo diÍerente, de Íorma que os polinucleotídeos com cadeias terminadas são distinguidos à medida que Passam Pelo detector. (c) Um exemplo de uma seqüência impressa.
podem ser local
10.2.5 Montando uma seqüência de DNA extensa Um único experimento de terminação de cadeia realizado pelos procedimentos manuais fornece cerca de 400 nucleotídeos da seqüência, assim como uma única corrida em um seqüenciador automático resulta em cerca de 750 nucelotídeos. Porém, a maioria dos genes é muito mais longa do que isso. como uma seqüência de viírios quilobases pode ser obtida? A resposta é: realizando experimentos de seqüenciamento de DNA com um conjunto de fragmentos clonados ou produtos de PCR diferentes, todos derivados a partir de uma única e extensa molécula de DNA (Figura l}.l2). Esses fragmentos deverão sobrepor-se, de forma que as seqüências de DNA individuais irão, elas mesmas, apresentar sobreposições, as quais
a seqüência
pú
sequence) é gra
Existem vál molécula de Dì zindo um conju
um métü tagem de que ot se era
tos individuais
I
quatro ou cinco chimento de lat
Croruncev GÊNrcA
E ANÁLrsE
oe
DNA
221
(a) Um polinucleotídeo com cadeia terminada, marcado com Íluorescência
ddA
:-:_
fluorescência
(b) Detecção de polinucleotídeos com cadeias terminadas
Figura 10.11
t
I I I I
II lFisura 10.10 O princípio do seqüencia f |mento em ciclos térmicc. [Uma PCR é realizada ]mm somente um dos inF lciadores e um dos dide. lsoxi-NTPs. Uma das Íitas [Oo motOe é copiada, orii fnando uma Íamília de f hnucleotídeos com caldeias terminadas. ddA = ]didesoxi-ATp
Seqüenciamento automático de DNA. (a) Para o seqüenciamento automático, cada didesoxi-NTP é marcado com um marcador fluorescente. (b) Gada didesoxiNTP é marcado com um Íluorocromo diÍerente, de forma que os polinucleotídeos com cadeias terrninadas são disünguidos à medida que passam pelo detector. (c) Um exemplo de uma seqüência impressa.
lwçt-
,r:,,
ffigB affi-
ddT ddC .
ddG .:::
tu
ww_
úé'
,* Ã{"
Sistema de imagem
Detêctor
ddG I I
+
Polinucleotídeos passam pelo detector
(c) A impressão de um seqüenciamento automático
TT
C
TTiìC
GTT 'GCTTGG
t
I I
I I I
hrcedimentos manuais frSa conida em um seqüenlmaioria dos genes é muito b
pode ser obtida?
bNA com um coniunto
dc
bs a partir de uma únicac Ho sobrepor-se. de forme far sobreposições,
as
qu*i*
podem ser localizadas, tanto pela inspeção visual quanto pela utilização de um computador, e a seqüência principal ou conüg (uma abreviação de seqüência contínua, do inglês contiguous s e quenc e) é gradualmente construída. Existem viírias formas de produzir fragmentos sobrepostos. Previamente à clonagem, a molécula de DNA deveria ser clivada com duas endonucleases de restrição diferentes, produzindo um conjunto de fragmentos com, digamos, Saa3A e outro comAlul (Figura 10.13). Esse era um método popular de produção de seqüências sobrepostas, mas apresentava a desvantagem de que os síúos de restrição poderiam estar inconvenientemente distribuídos e fragmentos individuais poderiam ser muito extensos para seqüenciamento completo. Freqüentemente quatro ou cinco endonucleases de restrição diferentes tinham que ser utilizadas para o preenchimento de lacunas na seqüência principal.
1
-"l
222
T. A. Bnowr.r
Uma alterna
r
de uma forma
resultantes irão da. Os fragmen
Molécula de DNA extensa
sobressalentes.
Clivagem em fragmentos sobrepostos
7-77
4 _ç-
,
/
/
10.2.6 As realizaE A primeira mol
cleotídeos do h seqüências do r vamente, o seqi seqüência do gr em 1982. Atualr de pesquisa ten
o--
tnserçao em um
vetor M13
/
:K â/--\ s:; /
o
Os projetos do a obtenção d primeira seqüêr
â--'
)
foi publicada
s"q,i"n"i"rento
er
ra seqüências g melanogaster. < nar as mais de I micos serão ex:
\-, /
r
to com enzimas
de cada
traomento
\
Leituras adicior
\ Seqüências individuais sobrepostas
m
Permitem que aseqüência extensa sela montada
Figura 10.12 Montando uma seqüência de DNA extensa, a partir de um conjunto de seqüências sobrepostas curtas.
Carle, G.E. & Olso Scìences of the Heiskanen, M., Pel 3'.79-82.
Maxam, A. & Gilbt ces of the USA Oliver, S.G., van de mosome ITI- -ìii Prober, J.M., Train minating dider Sanger, F., Nicklen
Molécula de DNA mostrando os sítios de SaUOA (S) e Alut (A)
the National Ar Southern, E.M. (l! Journal of Mol The ArabìdopsisG
Seqüências de diferentes Íragmentos de A/ul
g---
LJ pb
200
r
ft
r-+
Fragmentos individuais podem ser muito extensos para seqüenciamento completo
Seqüências de diÍerentes Íragmentos de Sarr3A
liana. Narure,,
Figura 10.13 Montando uma seqüência de DNA extensa por meio da determinação das seqüências de Íragmentos de restrição sobrepostos.
Ct-orueceu GÊucn e ANÁLrsE oe
DNA
223
Uma alternativa é quebrar a molécula de DNA por meio de sonicação, a qual cliva o DNA de uma forma mais aleatóna e, assim; fornece possibilidades maiores de que os fragmentos resultantes irão apresentar sobreposição e de que uma seqüência principal contínua será obtida. Os fragmentos resultantes da sonicação possuem uma variedade de extremidades 3' e 5' sobressalentes, mas essas podem ser convertidas em extremidades cegas seguindo o tratamento com enzimas apropriadas, antes da clonagem pelos métodos convencionais.
10.2.6 As realizações do seqüenciamento de DNA A primeira molécula de DNA
a ser completamente seqüenciada foi o genoma de 5.386 nucleotídeos do bacteríofago QX174, completada em 1975. Essa foi rapidamente seguida pelas seqüências do vírus SV40 (5.243 pb), em 19'77, e do pBR322 (a.363 pb), em 1978. Gradativamente, o seqüenciamento foi aplicado a moléculas maiores. O grupo de Sanger publicou a seqüência do genoma mitocondrial humano (16,6 kb) em 1981 e a do bacteriófago À (49 kb) em 1982. Atualmente, seqüências de 100 a 200 kb são rotineiras e a maioria dos laboratórios de pesquisa tem a experiência necessária para gerar tal quantidade de informação. Os projetos pioneiros de hoje são as massivas iniciativas genômicas, cada uma objeüvando a obtenção da seqüência nucleotídica do genoma inteiro de um determinado organismo. A primeira seqüência cromossômica, do cromossomo III da levedura Saccharomyces cerevisiae, foi publicada em 1992, e a do genoma completo da levedura ocoffeu em 1996. Existem agora seqüências genômicas completas do verme Caenorhabditis elegans, da mosca Drosophila melanogaster, da planta Arabidopsis thaliana e do humano Homo sapiens, paÍa não mencionar as mais de 100 diferentes espécies microbianas. Esses projetos de seqüenciamentos genômicos serão examinados com maiores detalhes no Capítulo 12.
Leituras adicionais Carle, G.E.
& Olson, M.V. (1985) An electrophoretic karyotype for
yeast. Proceedings of the National Academy
of
Sciences of the USA,82,3156-60. [Uma aplicação de OFAGE.]
10.12 uma seqüência de Dì|fl a partir de um conjunto ias sobrepostas
Heiskanen, M., Peltonen, L. 379-82.
& Palotie, A. (1996) Visual mapping by high resolutionFISH.
Maxam,A.&GilbeÍ,W.(1977)Anewmethodof
Trends in Genetics, 12,
sequencingDNA. ProceedingsoftheNationalAcademyofScien-
ces of the USA,74, 560-64.
Oliver, S.G., van der Hart, O.J.M., Agostine Carbone, M.T. et aL (1992)The complete DNA sequence of yeast chromosome lll. Nature, 357 ,38-46. Prober, J.M., Trainoq G.L., Dam, R.J. et al. (1987) A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science, 238, 336-41. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74, 5463-7 . Southem, E.M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology, 98,503-7 . [Hibridização de Southern.l The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Árabidopsis thaliana. Nature. 408. 796-8 I 5.
10.13 uma seqüência de eldensa por meio da dedas seqüências Íragmentos de restrição
i
Cnpírulo 11 Estudando a Expressão e a Função dos Genes
Estudando o transcrito de um gene clonado,226 Estudando a regulação da expressão gênica, 233
ldentificando e estudando o produto de tradução de um gene clonado, 242
Todos os genes devem ser expressados para que tenham funcionalidade. O primeiro passo na expressão é a transcrição do gene em uma fita de RNA complementar (Figura I I . I a). Para alguns genes - por exemplo, aqueles que codificam moléculas de RNA transportador (IRNA) e
! I
t
'
ii
de RNA ribossômico (rRNA) - o próprio transcrito é a molécula funcionalmente impoÍante. Para outros, o transcrito é traduzido em uma molécula de proteína. Para entender como é a expressão de um gene, o RNA transcrito deve ser estudado. Em es-
pecial, o biologista molecular irá querer saber se o transcrito é uma cópia fiel do gene, ou se segmentos do gene não estão presentes no transcrito (Figura I I .1b). Tais pedaços que faltam são chamados de íntrons e um interesse considerável está centralizado em suas estruturas e possíveis funções. Além dos íntrons, as localizações exatas dos pontos inicial e final do transcrito são importantes. A maioria dos transcritos é cópia, não apenas do próprio gene, mas também de ambos os lados de suas regiões nucleotídicas (Figura 11.1c). Os sinais que determinam o início e o término do processo de transcrição são apenas parcialmente entendidos, emboram devam ser localizados, caso a expressão de um gene esteja para ser estudada. Neste capítulo, serão examinados os métodos utilizados para a análise dos transcritos. Tais métodos podem ser utilizados para determinar se um gene contém íntrons e para mapear as posições dos pontos inicial e final de transcrição. Depois, serão consideradas brevemente algumas das numerosas técnicas desenvolvidas nos últimos anos para examinar como a expressão de um gene é regulada. Essas técnicas são importantes, pois aberrações na regulação gênica constituem a base para muitos problemas clínicos. Finalmente, será tratado o difícil problema de como identificar o produto da tradução de um gene.
226
T. A. Bnowr.r
11.1.1 A microscopii
(a) Os genes são expressados por
transcrição e tradução
A microscopia ele
desde que os Polin nem seus diâmeuc
Gene
Í---77-,--7--------I
I
Molécula de DNA
sualizar.
Transcrição
RNA
+
I ,W
Normalmente, mo c, a qual se lig
TRNA, IRNA
rraoueao do mRNA
léculas encobertas denso para aumen tanto espetacularq No passado, a zação entre moléc progressivamente ra determinar se u
Proteína
(b) Alguns genes contêm íntrons íntrons
,/\ /\ Ç7-'---------'-7T.--'-
ta de DNA, contel da fita de DNA nã
Molécula de DNA
lizar um pareamel tura característica
I
I Transcrição
Primário do RNA ainda contém íntrons
:l:T:::l: ,/l
-r--r,.-.- -.t I
e as Posições dessi
Processamento
ne. Informações a pela procura das I cDNA possui a su
_
compÍÌrada com a
------\__+__-------_F
mRNA maduro _ não
contém íntrons
II
.'tr
è ë'
rraouçao Proteína
(c) O RNA transcrito inclui regiões de ambos os lados do gene
.-.
Gene
Figura 11.1 Alguns princípios da expres.
Sinal de iniciação para a transcrição
Sinal de terminação
são gênica. mRNA = RNA mensageiro, IRNA = RNA transportadoç rRNA = RNA ribossômico.
11.1 Estudando o transcrito de um gene clonado A maioria dos métodos de análise dos transcritos está baseada na hibridização entre o transcrito de RNA e um fragmento de DNA contendo o gene de interesse. A hibridização dos ácidos nucléicos ocorre exatamente da mesma maneira entre fitas complementares de RNA e DNA como entre moléculas de DNA de fitas simples. O híbrido DNA-RNA resultante pode ser analisado por meio de microscopia eletrônica ou com nucleases específicas para fitas simples.
i
t
F
Preparando uma moláx para a observação com o n
Ct-oruneeu GÊr'rrcr e ANÁLrsE op
11
DNA
227
.1.1 A microscopia eletrônica das moléculas de ácidos nucléicos A microscopia eletrônica pode ser utilizada para visualizar moléculas de ácidos nucléicos, desde que os polinucleotídeos sejam primeiramente tratados com produtos químicos que tornem seus diâmetros visíveis. Moléculas não-tratadas são simplesmente muito finas para vi-
suaìizar.
Normalmente, as moléculas de DNA são misfuradas com uma proteína, tal como citocromo c, a qual se liga aos polinucleotídeos, cobrindo as fitas com uma camada espessa. As moléculas encobertas podem ser coradas com acetato de uranil ou algum outro material eletrodenso para aumentar a capacidade de visualização da preparação (Figura 11.2). Visões um tanto espetaculares das moléculas de ácidos nucléicos podem ser obtidas. No passado, a microscopia eletrônica foi primeiramente utilizada para analisar a hibridização entre moléculas de DNA diferentes, mas, em anos recentes , a técnica tem-se tornado progressivamente importante no estudo dos híbridos DNA-RNA. Ela é especialmente útil para determinar se um gene contém íntrons. Considere a aparência de um híbrido entre uma fita de DNA, contendo um gene, e seu RNA transcrito. Se o gene contém íntrons, essas regiões da fita de DNA não possuirão similaridade com o RNA transcrito e, assim, não poderão realizar um pareamento de bases. Ao contriírio, elas formarão uma "alça", originando uma estrutura característica, quando observadas com a microscopia eletrônica (Figura 11.3). O número e as posições dessas alças correspondem diretamente ao número e posições dos íntrons no gene. Informações adicionais podem, então, ser obtidas por meio do seqüenciamento do gene e pela procura das marcas características que delimitam os limites dos íntrons. Se um clone de cDNA possui a sua seqüência disponível, a qual, obviamente, não possui íntrons, ela pode ser comparada com a seqüência gênica paralocalizar os íntrons com precisão.
Figura 11.1 Alguns princípios da são gênica. mRNA = RNA mensaç;drqç IRNA = RNA transportadq, rFìNA = RNA ribossômirn
hado I
lhibridização entre o ts€. A hibridização dos áci fplementares de RNA e |RNA resultante pode serr [ecíficas para fitas simples.
h
Figura 11.2 Preparando uma molécula de DNA para a observação com o microscópio eletrônico.
o eletrônico
228
T. A. Bnowlt
Infelizmente, lntrons
Figura 11.3 A visualização por microscopia eletrônica de um híbrido DNA-RNA, formado entre um gene contendo um íntron e seu transcrito processado.
11.1.2 A análise dos híbridos DNA-RNA por meio do tratamento com nuclease
cial
e
final do transr
seqüência de DNA. No exemplo mo codificadora, juntar
um vetorMl3 e ob
é adicionada e pern
do, de fita simples, O restante, com ex( dado com rálcali, re
O segundo método para o estudo de um híbrido DNA-RNA envolve uma nuclease específica para fita simples, tal como a S1 (p. 65). Essa enzima digere DNA de fita simples ou polinucleotídeos de RNA, inclusive regiões de fita simples na extremidade de moléculas predominantemente de fitas duplas, mas não possui qualquer efeito em DNA de fita duplaou sobre híbridos DNA-RNA. Se uma molécula de DNA contendo um gene é hibridizada com seu RNA transcrito, e, então, tratada com a nuclease Sl, as regiões de DNA de fita simples não-hibridizadas em cada extremidade do híbrido são digeridas, juntamente com qualquer alça de íntron (Figura 11.4). O resultado é um híbrido completamente de fita dupla. Os fragmentos de DNA de fita simples protegidos da digestão pela nuclease Sl podem ser recuperados se a fita de RNA for degradada em um tratamento com álcali.
HíbridoDNArìNA
,@
\*''
,rW
Regiões de DNA de Íita simples são digeridas
Alcali para degradar o RNA
__-,/ -_--_---
ar
tamanhos dos fragl mas o procedimenl das. No entanto, m(
Fragmentos de DNA de Íita simples que Íoram protegidos pelo RNA
Figura 11.4 O efeito da nuclease 51 sobre um híbrido DNA-RNA.
Figura 11.5 Localizando um ponto de iniciação de transcrição pelo mapeamento com a nuclease 51.
Cr-oruneeu GÊrurcn e ANÁLrsE oe
b por microscopia
229
Infelizmente, as manipulações mostradas na Figura 11.4 não são muito informativas. Os tamanhos dos fragmentos de DNA protegidos poderiam ser medidos por eletroforese em gel, mas o procedimento não permite que as suas ordens ou posições relativas sejam determinadas. No entanto, modificações pequenas e sutis na técnica permitem determinar os pontos inicial e final do transcrito, bem como qualquer íntron que ele contenha pode ser posicionado na seqüência de DNA. No exemplo mostrado na Figura 11.5, um fragmento de Sau3{contendo 100 pb da região codificadora, juntamente com 300 pb da seqüêncialíder que precede o gene, foi clonado em um vetor Ml3 e obtido como uma molécula de fita simples. Uma amostra do RNA transcrito é adicionada e permitida anelar à molécula de DNA. A molécula de DNA ainda é, antes de tudo, de fita simples, mas agora ela possui uma pequena região protegida pelo RNA transcrito. O restante, com exceção dessa região protegida, é digerido pela nuclease S1 e o RNA é degradado com iílcali, restando um pequeno segmento de DNA de fita simples. Se tais procedimen-
ele-
h híbrido DNA-RNA,
b um gene contendo
hr
DNA
transcrito proces-
I
t
fatamento t
l* u-u
nuclease específice
ide nta simples ou polin$ de moléculas predoni-
_t
F
Oe nta dupla ou sobre lhiUriOizada com seu RML E fita simples não-hibriÕ fom qualquer alça de p- os fragmentos de P recuperados se a fita
h
Gene 7--?7--?--?--?-
\
Fragmento de 400 pb de SatÉA
lnserção do Íragmento de
\
X^emM13 \ /ìs"3A
[--l"*^ DNA de Íita simples
t./
rt
Anelamento do mBNA
\L
\r._-___-__çfl-...-.-
-/
DNA ,, / _-./ ffi RNA
Nuclease 51
l'**o
Ábdi
\
\
r \
DNA Tamanho por eletroÍorese,
\
porexemplo, 150pb
\ 150 pb
Hgura 11.4 D
efeito da nuclease 51 um híbrido DNA-RÌ.|^,
le
Figura 11.5 Localizando um ponto de iniciação de transcrição pelo mapeamento com a nuclease 51.
Região de fita duPla
a \
Ponto de iniciação de transcrição
23O
T.
A. Bnowlr
tos são examinados detalhadamente se tornará claro que o tamanho desse fragmento de fita simples corresponde à distância entre o ponto de iniciação de transcrição o rítio de Sau3A " por eletroforedo lado direito. O tamanho do fragmento de fita simples é, então, determinado se em gel e essa informação é utllizada para localizar o ponto de iniciação deìranscrição na seqüência de DNA. Exatamente a mesma estratégia poderia localizar o ponto de terminação da transcrição e os pontos dejunção entre íntrons e éxons. A única diferença seria posição a do sítio de restrição escolhido para delimitar uma extremidade do fragmento de DNA de frta simples protegido.
11.1.3 A análise dos transcritos por extensão de iniciador (primer extension) A análise com a nuclease S I é uma técnica poderosa que permite que ambas as extremidades 5'e 3' de um transcrito, bem como as posições dos limites íntron-éxon, sejam identihcadas. O método final da análise dos transcritos que iremos considerar a extensão de iniciador (pn:-
-
mer extension) - é menos adaptável, porque ele somente permite identificar a extremidade 5" de um RNA. Apesar de tudo, é uma técnica importante que é freqüentemente utilizada para conhrmar os resultados das análises com S l. A extensão de iniciador somente pode ser utilizada se uma parte da seqüência do transcrito é conhecida. Isso é porque um oligonucleotídeo iniciador pequeno deve ser anelado ao RNA em uma posição conhecida, idealmente dentro dos 100 a 200 nucleotídeos da extremidade 5' do transcrito. Uma vez anelado, o iniciador é estendido pela transcriptase reversa (p. 68)' a qual continua copiando a fita de RNA até que ela alcance a extremidade 5' (Figura 11.6). A extremidade 3' dessa fita de DNA recém-sintetizada corresponde, portanto, à extremidade 5' do transcrito. A localização da posição dessa extremidadè na seqiiência de DNA é facilmente obtida pela determinação do comprimento da molécula de DNA de fita simples e correlacionando essa informação com a posição de anelamento do iniciador.
11.1-4 outras técnicas para o estudo dos RNAs transcritos Nos últimos anos, uma grande variedade de técnicas de manipulação de RNA foi desenvolvida, cujo emprego resultou em numerosos e importantes avanços no entendimento de como os transcritos são sintetizados e processados. Essas técnicas incluem:
Hibridização de northern Trata-se de uma técnica equivalente de RNA da hibridização de Southern (p. 206). um RNA extraído é submetido à eletroforese em gel de agarose, utilizando-se um tampão de eletroforese desnaturante (por exemplo, um contendo formaldeído) para garantir qu" o, RNAs não formarão pares de bases inter ou intramoleculares, uma vez que o pareÍìmento de bases poderia afetar a velocidade com a qual as moléculas migram através do gel. Após a eletroforese, o RNA do gel é transferido para uma membrana de náilon ou de nitrocelulose e hibridizado com uma sonda marcada (Figura 11.7). se a sonda for um gene clonado, a banda que aparece na auto-radiografia é o transcrito daquele gene. O tamanho do transcrito pode ser determinado a partir da sua posição no gel e, se RNA de diferentes tecidos for aplicadà em canaletas diferentes do gel, então a possibilidade de que esse gene seja diferenciul-"nt" expressado poderá examinada.
ser
PCR com transcrição reversa (RT-PCR) Essa técnica possibilita que o RNA seja utilizado como molde em uma reação de polimerização em cadeia (PCR). O primeiro passo em uma RT-PCR é converter a molécula ãe RNA em um cDNA de fita simples com a transcriptase reversa. Uma vez que esse procedimento preli-
Figura 11.6 Localizando um ponto de iniciação de transcri@o por meio da e)densão de iniciador.
minar tenha sido dos e o experimr polimerases tern
de DNA (isto é, r se dependente dr
única reação. Os fita dupla (cDN1
da molécula de R tuam-se no interi crição reversa é I a presença de un gene. Uma versãr
Ct-ouoeu GÊuca r desse fragmento de fita lanscrição e o sítio de Sau3A
ANÁLtsE oe
DNA
231
Fnho
5'
p, determinado por eletroforeiniciaçao de transcrição na icalizar o ponto de terminação diferença seria a posição fnica ldo fragmento de DNA de fita
RNA transcrito
I
Anelamento do iniciador
g
lniciador
- _/
Extensão com transcriptase reversa
que ambas as extremidades sejam identificadas. O
extensão de iniciador (prüidentificar a extremidade í üentemente utilizada pan
Desnaturação do RNA, medida do tamanho do DNA por exemplo, 239 nucleotídeos
-
parte da seqüência do trans-
/
deve ser anelado ao
200 nucleotídeos da extrepela transcriptase reveÍa extremidade 5' (Frcorresponde, portanto. à na seqüência dc da molécula de DNA de fita amento do iniciador.
Correlação com a seqüência de DNA
#
Figura 11.6 de RNA foi desenvolvino entendimento de como ui
Southern (p. 206). Um RNA um tampão de eletrofe garantir que os RNAs nib pareamento de bases podedo gel. Após a eletroforese, o ulose e hibridizado com a banda que aparece rn ito pode ser determinado e icado em canaletas diferennte expressado poderá ser
uma reação de polimerizaa
molécula de RNA en
que esse procedimento preli-
F.
Localizando um ponto de iniciação de transcrição por meio da extensão de iniciador.
DNA
23epb \
iniciação transcrição
Ponto de de
,/\/
------
posição da extremidade 5' do iniciador
-
minar tenha sido realizado, os iniciadores da PCR e a DNA-polimerase de Taq são adicionados e o experimento prossegue exatamente como na técnica-padrão (Figura 11.8). Algumas polimerases termoestáveis são capazes de sintetizar cópias tanto de moléculas de RNA como de DNA (isto é, elas possuem ambas as atividades de transcriptase reversa e DNA-polimerase dependente de DNA) e, assim, podem realizar todos os passos de uma RT-pcR em uma única reação. Os produtos de uma RFPCR são muitas moléculas de DNA complementar de fita dupla (cDNA), cópias do RNA-molde, apesaÍ de essas, provavelmente, não serem cópias da molécula de RNA completa, pois, normalmente, os sítios de anelamento dos iniciadores situam-se no interior do transcrito, emvez de estarem nas suas extremidades. A PCR com transcrição reversa é freqüentemente utilizada para testar RNA extraído de tecidos diferentes para a presença de um determinado transcrito, a fim de determinar o padrão de expressão de um gene. Uma versão modificada, chamada de amplificação rápida de extremidades de cDNA
T. A. Bnowr.r
/ffi ffi ffi ffi ffi ffit
Gel de RNA
Hibridização
Arrastes de RNA
de northern
Auto-radiograÍia Banda de hibridização
Figura 1' A PCR com trans
ção reversa (RT-PCI
11.2 Estuda Figura Í 1.7 A hibridização de northern.Très extrações de RNA de tecidos diÍerentes Íoram submetidas à eletroÍorese em um gel de agarose. As extrações possuem muitas moléculas de RNA de tam+ nhos diÍerentes, de forma que cada uma Íornece um arraste de RNA, mas duas bandas distintas são visualizadas, uma para cada um dos RNAs ribossômicos mais abundantes. Os tamanhos desses rRNAs são conhecidos (por exemplo,4.718 e 1.874 nucleotídeos em mamÍÍeros), de forma que eles podem ser utilizados como marcadores de tamanho internos. O gel é transferido para uma membrana, sondado com um gene clonado e os resultados visualiiados por meio de auto-radíografia. Somente na canaleta 1 aparece uma banda, mostrando que o gene clonado é expressado somente no tecido do qual essa extração de RNA foi obtida.
(RACE, do inglês rapid amplification of cDNA ends), pode ser utilizada para identificar as extremidades 5'e 3'das moléculas de RNA.
Seqüenciamento de RNA O seqüenciamento de RNA é normalmente realizado pela análise da seqüência do produto de uma RT-PCR. Métodos diretos para o seqüenciamento de moléculas de RNA foram desenvolvidos, mas eles foram ineficientes e - muito importante a molécula de RNA teve de ser purificada antes de ser seqüenciada. É possível obterem-se amostras puras de genomas de RNA de vírus e de RNAs celulares muito abundantes, tais como as moléculas de RNA ribossômico, mas a purificação de um único mRNA é muito difícil. No entanto, se os iniciadores para uma RFPCR forem projetados corretamente, apenas o único mRNA-alvo será copiado eã análise da seqüência do produto da RT-PCR fornecerá a seqüência desse mRNA.
Poucos g ativados r de regula
gular a el produtos
as enzim: quantidar
triptofanc tose, são Nos orga
I
to maior
r
padrões d to necessi tes na exl
Muito
sica: ager te que os explorar i
ria dos av
os estudo DNA con sobre os t
Cr-onaceu GÊNrcA
E ANÁLrsE
oe
DNA
233
I
I
RNA
i
Ib
RNA
\
Transcriptasereversa
\
,--
Hí
tnrthern
-t---.---\
ftrto-radiografia
Figura 11.8
PCR-padrão
A PCR com transcri@o reversa (RT-PCR).
11,2 Estudando a regulação da expressão gênica Íoram submetidas à moléculas de RNA de tanr*. mas duas bandas dislir rnais abundantes. Os tarn+. rucleotídeos em mamÍferosft
internos.Ogel étrars. visualizados por mostrando que o geÍìe RNA Íoi obtida. ,
utilizada para identificar er
da seqüência do produto
&
de RNA foram desenv* de RNA teve de ser puríde genomas de RNAdc
las de RNA ribossômico, iniciadores para nmr
se os
serácopiadoeaanálise mRNA.
Poucos genes são expressados durante todo o tempo. Muitos estão sujeitos à regulação e são ativados somente quando a célula requisita seus produtos gênicos. Os sistemas mais simples de regulação gênica são encontrados em bactórias, como E. coli, por exemplo, a qual pode regular a expressão de genes paÍa os processos biossintéticos e metabólicos, de forma que os produtos gênicos desnecessiírios não são sintetizados. Por exemplo, os genes que codificam as enzimas envolvidas na biossíntese do triptofano podem ser inativados quando existem quantidades abundantes de triptofano na célula, e ativados novamente quando os níveis de triptofano diminuem. De maneira similar, os genes para a utilização de açúcares, como a lactose, são ativados apenas quando o açúcar em questão estiver presente para ser metabolizado. Nos organismos superiores, a regulação gênica é mais complexa, pois existe um número muito maior de genes para controlar. A diferenciação celular envolve mudanças volumosas nos padrões de expressão gênica, e o processo de desenvolvimento do óvulo fertilizado até o adulto necessita da coordenação entre células diferentes, além de mudanças temporais-dependentes na expressão gênica. Muitos dos problemas na regulação gênica necessitam de uma abordagem genética clássica: a genética possibilita que os genes que controlam a regulação sejam distinguidos, permite que os sinais bioquímicos que influenciam a expressão gênica sejam identificados e pode explorar as interações entre genes e famílias gênicas diferentes. É por essa razáo qlue a maioria dos avanços no entendimento do desenvolvimento nos organismos superiores iniciou com os estudos da mosca-das-frutas Drosophila melanogaster. A clonagem gênica e a análise do DNA complementam a genética clássica, pois fornecem informações muito mais detalhadas sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão de um único gene.
234
T.A.BRowN
Agora sabe-se que um gene sujeito à regulação possui uma ou mais seqüências contrç ladoras na sua região a montante (Figura 11.9) e que o gene é ativado e inativado pela ligação de proteínas reguladoras a tais seqüências. Uma proteína reguladora pode reprimir a expressão gênica, nesse caso, o gene é inativado quando a proteína está ligada às seqüênciar controladoras, ou, alternativamente, a proteína pode ter um papel positivo ou reforçador" ativando ou aumentando a expressão do seu gene-alvo. Nesta seção serão examinados os métodos paralocalizar seqüências reguladoras e determinar seus papéis na regulação da expressão gênica.
11.2.1 IdentiÍicando os sítios de ligação de proteínas na molécula de DNA Uma seqüência controladora é uma região do DNA onde uma proteína reguladora pode se ligar. Deveria ser possível, portanto, identificarem-se seqüências controladoras a montante de um gene pela procura da região relacionada ao sítio de ligação da proteína. Existem três maneiras diferentes de se realizar isso.
Uma proteína ligada d dade de um Íragmento te a eletn
Retardação em gel de complexos DNA-proteína As proteínas são estruturas um tanto volumosas e uma proteína ligada em uma molécula de DNA resulta em um aumento considerável da massa molecular total. Se esse aumento pode ser detectado, um fragmento de DNA contendo um sítio de ligação de proteína será identificado. Na prâtica, um fragmento de DNA com uma proteína ligada a ele é identificado por eletroforese em gel, pois possui uma mobilidade menor do que a molécula de DNA nãocomplexada (Figura 1 1. 10). O procedimento é referido como retardação em gel (gel retardation). Em um experimento de retardação em gel (Figura 11.11), a região do DNA a montante do gene que está sendo estudado é clivada com uma endonuclease de restrição e, então, misturada com a proteína reguladora ou, se a proteína reguladora não foi ainda identificada, com um extrato protéico nuclear não-fracionado (lembre-se de que a regulação gênica ocorre no núcleo). Os fragmentos de restrição contendo a seqüência controladora formam um complexo com a proteína reguladora: todos os demais fragmentos permanecem como DNA "descobertos". A localizaçáo da seqüência controladora é, enÍão, determinada pelo posicionamento, no mapa de restrição, do fragmento que foi retardado durante a eletroforese em gel. A precisão com a qual a seqüência controladora pode ser localizada depende de o quão detalhado é o mapa de restrição e de o quão convenientemente localizados estão os sítios de restrição. Uma única seqüência controladora pode ser menor do que 10 pb de extensão, de forma que a retardação em gel raramente é capaz de defini-la com exatidão. Técnicas mais precisas são, portanto, necessiírias para delimitar a posição da seqüência controladora dentro do fragmento identificado pela retardação em gel.
Realizando um experit Seqüências controladoras
l\
\
Gene
Promotor
200 pb
Figura 11.9 Posições possíveis para seqüências controladoras na região a montante de um gene.
Footprint
O procedim
controlador retardação
r
Cr-oruneeu GÊrlrcn e AruÁ-rse oe
DNA
235
lr ou mais seqüências conüG iativado e inativado pela
lig*
Fguladora pode reprimir a exÉna está ligada às seqüêncier
papel positivo ou reforçada; h seção serão examinados c
[s papéis na regulação
da
erGel de agarose
ls na I
i
Fìoteína reguladora pode se i controladoras a montante rda proteína.
ür
Existem três mr.
Figura 11.10 Uma proteína ligada diminui a mobilidade de um Íragmento de DNA durante a eletroforese em gel.
b ligada em uma molécula ds ttotal. Se esse aumento po&
içao
Oe
Canaleta 1: Fragmento de DNA Canaleta 2: Fragmento de DNA + proteÍna ligada
1234-Gene ..........-.................,.RRRRRRR
proteína será identif,-
a ele é identificado
-Ì
,t,-,
a molécula de DNA em geÌ (gel
Clivagem com a endonuclease de restrição
do DNA a montante restrição e, então, mi unda identifrcada, com uE lação gênica ocorïe no ú-
)
1
í--4
Á
2 4
3
{
formam um complexo como DNA "descober* pelo posicionamento, em gel. A
n-z-
Mi"tur"do. "or " otot"inu reguladora
\
5
1
deoquãodetalhadoéon
4
t--]-
os sítios de restrição. nsão, de forma que a reüilicas mais precisas são, pc, dentro do fragmenü!ì
I
/ Figura 11.11 Bealizando um experimento de retardação em gel.
I I
Determinação das mobilidades dos fragmentos por meio de eletroforese em gel
Footprinting com DNase I O procedimento geralmente denominadofootprinting ("pegada") possibilita que uma região controladora seja posicionada dentro de um fragmento de restrição que foi identificado pela retardação em gel. A técnica defootprintitcg funciona com base no fato de que a interação
236
T. A. Bnowr'r
com uma proteína reguladora protege o DNA da região de uma seqüência controladora da ação degradante de uma endonuclease, tal como a desoxirribonuclease (DNase) I (Figmr Il'12). Esse fenômeno pode ser utilizado paralocalizar o sítio de ligação da proteína na rnolécula de DNA. O fragmento de DNA em estudo é primeiramente marcado em uma extremidade com utrr marcador radioativo e, então, complexado com a proteína reguladora (Figura l1.l3a). Entã\ DNase I é adicionada, mas a quantidade utilizada é limitada, de forma que não ocorre a dogradação completa do fragmento de DNA. Ao contriírio, o objetivo é clivar cada molécula em uma única ligação fosfodiéster (Figura 1 1. l3b). Se o fragmento de DNA não possui uma pru teína ligada a ele, o resultado desse tratamento é uma famflia de fragmentos marcados, diferindo em tamanho em apenas um nucleotídeo cada. Após a separação em um gel de poliacrilamida, a famflia de fragmentos aparece corm uma escada de bandas em uma auto-radiografia (Figura 1 I . 13c). No entanto, a proteína ligan. te evita que determinadas ligações fosfodiéster sejam clivadas pela DNase I. Conseqüentomente, nesse caso, a família de fragmentos não estará completa, pois os fragmentos resultantes da clivagem dentro da região da seqüência controladora não estarão presentes. Essa ausência é notada na auto-radiografia como uma "pegada", claramente visualizada na Figun I 1.13c. A região da molécula de DNA contendo a seqüência controladora pode, agora, sor analisada a partir dos tamanhos dos fragmentos em ambos os lados da pegada.
Ensaios de interferência por modiÍicação As análises por retardação em gel e footprinting possibilitam que as seqüências controladoras sejam localizadas, mas não fornecem informações em relação às interações entre a proteíne ligante e a molécula de DNA. A técnica mais precisa dessas duas o footprinting somentc revela a região do DNA que é protegida pela proteína ligante. As proteínas são relativamentc grandes, se comparadas com uma hélice dupla de DNA, e podem proteger viírias dezenas dc pares de bases, quando ligadas a uma seqüência controladora que possua somente uns poucqüs pares de bases de comprimento (Figura I I .14). O footprinting, portanto, não delimita a região controladora propriamente dita, somente a região onde ela está localizada.
Proteína reguladora Par de base
I
Figura 11.13 Footprinting com DNase l.
Molécula de DNA
\
ol.t"."
r
fotri:o + -o
og
Os nucle ficados por fragmentos r
r
Figura 11.12
Fragmento de DNA protegido pela proteína ligada
Uma proteína ligada protege uma região de uma molécula de DNA da sua degradação por uma nuclease, tal como a DNase l.
eles são trata plo sendo o r 11.15). Essa
nucleotídeo
I
extrato protr
Clonnceu GÊNrcA
E ANÁLrsE
oe
DNA
237
h
seqüência controladora dr lmuclease (DNase) I (Figun Ëe Ìigação da proteína na
mr'
'/..-t
,--
'/
fu
uma extremidade com üm bdora (Figura 11.13a). Entfu lc forma que não ocoÍre a Fvo é clivar cada molécula eri lde nNe não possui uma Fnr" fc fragmentos marcados, difu'
Moléculas de
&'
DNA
/t, \
2'
fragmentos aparece cotrrl No entanto, a proteína pela DNase I. C
Extremidade
marcada
(a) Marcação da extremidade, adição da proteína reguladora
\
-a-
--t'-r.*ína
---;-
rigada
l
I
pois os fragmentos presentes. Essa
*::-
aufu
pode, agora, da pegada.
a-
control
\
\
interações entre a
-
o
footprinting
/
tul Limitada degradação
I
visualizada na Fi
as seqüências
--a-
-
Tamanhos dos fragmentos de DNA
proteínas são relati proteger viírias dezenm possua somente uns
F {-
zada.
ru:l:riruHËà::" protegida pela proteína "Ëtá"
(c) EletroÍorese em gel, auto-radiograÍia
\
Auto-radiograÍia
++ ++ + ++ ++ + + + .<
não delimita a
com DNase
-
-
a---------------
.+r -
)
"e"ouou'
-l
t-t + -t
I
I I
-t
'-J
Figura 11.13 Footprinting com DNase l.
Figura 11.12 Uma proteína ligada protege uma regiãoür uma molécula de Dl{fi da sua degradação uma nuclease, tal a DNase l.
Canaleta 1: Controle - sem proteína ligada Canaleta 2:Teste - DNA + proteína ligada
Posições onde a proteína está ligada
Os nucleotídeos que realmente formam ligações com a proteína ligante podem ser identificados por meio do ensaio de inteúerência por modificação. Como no footprinting, os fragmentos de DNA devem ser primeiramente marcados em uma das extremidades. Então, eles são tratados com um reagente químico que modifica nucleotídeos específicos, um exemplo sendo o dimetil-sulfato, que se liga nos grupos metila de nucleotídeos de guanina (Figura 11.15). Essa modificaçáo ércalizada sob certas condições limitantes, de forma que apenas um nucleotídeo por fragmento de DNA seja modihcado. Em seguida, o DNA é misturado com o extrato protéico. O ponto-chave do experimento é que a proteína ligante provavelmente não
238
T.A.Bnowru
Figura 11.14 Proteína ligante
Uma proteína li-
gada pode proteger uma região de DNA que é muito mais extensa do que a seqüência controladora.
irá se ligar ao DNA se um dos nucleotídeos de guanina dentro da região controladora estiver modificado, pois a metilação de um nucleotídeo interfere na reação química específica qm possibilita que ele forme uma ligação com a proteína. Como a ausência da proteína é monitorada? Se a mistura de DNA e proteína for examina por da eletroforese em gel de agarose, duas bandas serão visualizadas, uma correspondendo ao complexo DNA-proteína e, a outra, ao DNA não-ligado à proteína - em essência, essa paÍte do experimento constitui-se em um ensaio de retardação em gel (Figura I 1.15). A bande correspondente ao DNA não-ligado é purificada do gel e tratada com piperidina, um reager te químico que cliva moléculas de DNA nos seus nucleotídeos metilados (p.216). Os produtos do tratamento com piperidina são, agora, separados em um gel de poliacrilamida e o resultado é visualizado em auto-radiografia. O tamanho da banda ou das bandas que aparecem na auto-radiografia indica a posição no fragmento de DNA das guaninas, cujas metilações imp+ diram a ligação da proteína. Essas guaninas localizam-se dentro da seqüência controladora 0 ensaio de modihcação pode, agora, ser repetido com reagentes químicos que possuam corm alvos os nucleotídeos A, T ou C para determinar a posição precisa da seqüência controladora
Figura 11.15 Um ensaio de interferência por modificação.
11.2.2 ldentiÍicando seqüências controladoras por meio de ensaios de deleção
cap
A técni
Os experimentos de retardação em gel,footprinting e interferência por modificação são zes de localizar possíveis seqüências controladoras a montante de um gene, mas não fomecem informações sobre a função das seqüências individuais. O ensaio de deleção é uma abordagem totalmente diferente, que não só pode localizar seqüências controladoras (embora apena$
ra I 1.16). l veria resul
com a precisão de uma retardação em gel), como, mais importante, pode também indicar e
qüências
função de cada seqüência.
ções result
emumami
c,
Clorunoeu GÊNrcA
nl/_
/
./
Figura
Gs modificadas 11.1t1
Uma proteína Í" gada pode pro. teger uma de DNA que é muito mais extensa do que a seqüência cur troladora.
E ANÁLrsE
or
DNA
239
Fragmentos de restrição com uma extremidade marcada
\--
\
Dimetil-sulfato
?àr /r
do extrato nuclear
\Oieao Proteínas
t'o au"
è- ){ Eletroforese em gel de agarose
-tY <
-
Nenhuma
proteína ligada (sítio bloqueado)
região controladora
química específica
Purificacão do DNA ìJ
e
proteína for uma
-
em essencla, essa
P
/ ú
I (Figura I1.15). A piperidina, um ( p. 216). Os de poliacrilamida e o bandas que aparecem
cujas metilações seqüência que possuÍìm da seqüência
Figura 11.15
llm ensaio de in-
.
)
Pipendina
Determinação do tamanho por meio de eletroÍorese em gel de poliacrilamida
terferência por modiÍicação.
de por modificação são um gene, mas não de deleção é uma adoras (embora , pode também
A técnica baseia-se na suposição de que a deleção da seqüência controladora irá resultar em uma modificação na maneira pela qual a expressão de um gene clonado é regulada (Figura 1 1.16). Por exemplo, a deleção de uma seqüência que reprime a expressão de um gene deveria resultar naquele gene sendo expressado em um nível mais elevado. Similarmente, seqüências controladoras tecido-específicas podem ser identificadas, uma vez que as suas deleções resultam na expressão do gene-alvo em tecidos outros que o tecido correto.
24O T.A.Bnowru
Silenciador
Promotor
Expressão
\ Expressão menos
\ Expressão mais elevada
Tabela
I
Figura 11.16
em organ
O princípio subjacente à análise de deleção
Geneo
lacZ neo
Genes-repórteres Antes de realizar-se o ensaio de deleção, uma maneira deve ser encontrada para analisar o efeito de uma deleção sobre a expressão do gene clonado. Provavelmente, o efeito será apenas observado quando o gene for clonado nas espécies de onde ele foi originalmente obtidoç em nada resultará a análise de um gene vegetal, envolvido na regulação pela luz, se esse gene for clonado em uma bactéia. Existem, atualmente, vetores de clonagem desenvolvidos para a maioria dos organismm (Capítulo 7), de forma que a clonagem do gene em estudo de volta ao seu hospedeiro não d+ veria constituir-se em um problema. A dificuldade é que, na maioria dos casos, o hospedeiro já possui uma cópia do gene em seus cromossomos. Como poderão as mudanças no padrão de expressão de um gene clonado ser distinguidas do padrão normal de expressão exibido pela cópia cromossômica do gene? A resposta é uttllizar um gene-repórter. Trata-se de um gene-teste, que é fusionado à região a montante do gene clonado (Figura II.l7), substituindo esse gene. Quando clonado dentro do organismo hospedeiro, o padrão de expressão do gene-re-
pórter deverá mimetizar exatamente o do gene original, pois o gene-repórter estará sob a influência de exatamente as mesmas seqüências controladoras do gene original. O gene-repórter deve ser escolhido com cuidado. O primeiro critério é que ele deve codificar um fenótipo que não é ainda exibido pelo organismo hospedeiro. O fenótipo de um gene-repórter deve ser relativamente fácil de detectar após o gene haver sido clonado no hospedeiro, e, idealmente, deverá ser possível de submetê-lo a um experimento de quantificação fenotípica. Tais critérios não têm demonstrado dificuldade de serem satisfeitos e uma variedade de genes-repórteres diferentes é utilizada nos estudos de regulação gênica. Alguns exemplos estão listados na Tabela I 1.1.
cat
dhïr
aphN lux uidA
" Todos er
minescen
Realiz Umavs
ensaio d constru(
gura
ll,
organisr pórter. I
remoúr na esps
ladora t
Osr cuidadc
Clorureer,r GÊNrcA E Ar.rÁlrse oe
Seqüências
controladoras
DNA
241
Promotor
Gene sob investigação
/
sro.titriçao do gene por um oene-reoórrer
I Gene-repórter
+-nv?z\-
Figura 11.17 Um gene-repórter.
\ \\,/\ /
Promotor
Seqüências controladoras
LL.l Alguns exemplos de genes-repórteres utilizados no estudo da regulação gênica em organismos superiores Tabela
figura 11.16 D princípio subjacente à rnálise de deleção
Geneo
Produto gênico
Ensaio
lacZ
p-galactosidase
Teste histoquímico
neo
Neomicina-fosfotransferase Cloranfenicol-acetiltransferase Dihidrofolato-redutase Aminoglicosídeo-fosfotransferase Luciferase p-glucoronidase
Resistência Resistência Resistência Resistência
cat
dhfr Ìencontrada para anali petmente, o efeito seú fe foi originalmente paçao pela luz, se esse l
ja
maioria dos organismc lao seu hospedeiro não de iA aos casos, o hospedeiro fo as mudanças no padrão fü de expressão exibido pefórter. Trata-se de um ge I 1. l7), substituindo esb de expressão do gene-rcle-repórter estará sob a in-
F
be original. é que ele deve codiO tiro. fenótipo de um geier sido clonado no hospequantificação feinento de isatisfeitos e uma variedagênica. Alguns exemfção
fitério
aphN lux uidA o
à
canamicina
ao cloranfenicol ao metotrexato à
higromicina
Bioluminescência Teste histoquímico
Todos esses genes foram obtidos de E. coli, com exceção de lux, que possui três fontes: as bactérias lu-
minescentes Vibrio harveyii e
V.
fischeri e o vaga-lume Photinus pyralis.
Realizando um ensaio de deleção Uma vez que o gene-repórter tenha sido escolhido e feita a construção necessária, realizar um ensaio de deleção é bastante fácil. As deleções podem ser realizadas na região a montante da construção, por meio de uma das diversas estratégias. Um exemplo simples é mostrado na Figura 11.18. O efeito da deleção é, então, analisado pela clonagem da construção deletada no organismo hospedeiro e pela determinação do padrão e da extensão da expressão do gene-repórter. Uma elevação na expressão indicará que uma seqüência repressora ou silenciadora foi removida, uma diminuição indicará a remoção de um ativador ou reforçador, e uma mudança na especificidade do tecido (como mostrado na Figura 11.18) revelará uma seqüência controladora tecido-específi ca. Os resultados de um projeto de ensaio de deleção devem ser interpretados com bastante cuidado. Complicações podem surgir se uma única deleção remove duas seqüências contro-
242
T. A. Bnowr.r
nado. Ambas dep teínas em sisteme preparados a partì
Seqüência controladora específica para a semente
I
,
Gene-repórter
t
c
R
,
R
@-
\---=-
Figura 11.18 Expressáo gênica semente-especíÍica
Deleção da seqüência
controladora
\
ì
\
O gene agora é expressado em todos os tecidos
Ensaio de deleção. Um gene repórter foi ligado à região a montante de um gene espe cíÍico para a semente de uma planta. A remoção do Íragmento de restrição, situado entre os sítios R, deleta a seqüência controladora, a qud comanda a expressão gênica especíÍica para a semente, de Íorma que o gene-repórtsr é, agora, expressado em todos os tecidos da planta.
coelho (ambas ex as demais molécu sistema de traduç trados nas proteín moléculas de mR a qual pode ser se da representa um amostra. Tanto a HRT diretamente da ar bilizado em uma (Figura 11.20). C
nece ligado à me recuperado e tra<
proteína çerlifica ladoras bastante pÍóximas ou, como é bastante comum, duas seqüências controladoras distintas cooperam para a produção de uma única resposta. A despeito dessas potenciais dificuldades, ensaios de deleção, em combinação com estudos dos sítios de ligação de proteínas, frnecem informações importantes a respeito de como a expressão de genes individuais é regu lada, tendo complementado e ampliado as análises genéticas mais gerais sobre a diferencir ção e o desenvolvimento.
11.3 ldentiÍicando e estudando o produto de tradução de um gene clonado Nos últimos anos, a clonagem gênica tem se tornado progressivamente útil no estudo, não apenas dos genes propriamente, mas também das proteínas codihcadas pelos genes clonados. Investigações sobre a estrutura e a função da proteína têm se beneficiado enormemente do desenvolvimento de técnicas que permitem que mutações sejam introduzidas em pontos específicour de um gene clonado, resultando em mudanças diretas na estrutura da proteína codificada. Antes de se considerar tais procedimentos, será, primeiramente, focalizado o problenre mais real de como isolar a proteína codificada por um gene clonado. Em muitos casos, essr análise não será necessária, pois a proteínajá foi caracÍeizada muito antes de o experimento de clonagem gênica ser realizado, e amostras purificadas da proteínajá se encontram disponíveis. Por outro lado, há ocasiões em que o produto de ttadução de um gene clonado não foi identificado. Um método para o isolamento da proteína é, então, necessário.
11.3.1 HRT e HART podem identificar o produto de tradução de um gene clonado Duas técnicas relacionadas, tradução com liberação do híbrido (HRT, do inglês hybrid-release translation) e tradução com retenção do híbrido (HART, do inglês hybrid-arrest translation), são utilizadas para identificar o produto de tradução codificado por um gene clo-
I
Tradução lM
Crorunoev GÊNrcA
figura 11.18
Ensaio de deleção. Um gere Fpórter Íoi ligado à região a de um gene espe para a semente de unrr . A remoção do Íragde restrição, situado os sítios R, deleta a se. controladora, a qual a expressão gêni:r para a semente, Íorma que o gene-rePórt agora, expressado em te os tecidos da planta.
E ANÁLrsÊ
oe
DNA
243
nado. Ambas dependem da capacidade de um mRNA purificado conduzir a síntese das proteínas em sistemas de tradução livres de células. Esses são extratos celulares, normalmente preparados a partir de sementes de trigo na fase germinativa ou de células de reticulócitos de coelho (ambas extremamente ativas na síntese protéica), contendo ribossomos, tRNAs e todas as demais moléculas necessárias para a síntese protéica. A amostra de mRNA é adicionada ao sistema de tradução livre de células, juntamente com uma mistura dos 20 aminoácidos encon3sS-metionina é utilizado). As trados nas proteínas, um dos quais é marcado (freqüentemente moléculas de mRNA são traduzidas em uma mistura de proteínas radioativas (Figura 11.19), a qual pode ser separada por eletroforese em gel e visualizada por auto-radiografia. Cada banda representa uma única proteína, codificada por uma das moléculas de mRNA presentes na amostra. Tanto a HRT quanto a HART funcionam melhor quando um clone de cDNA, preparado diretamente da amostra de mRNA, está disponível. Para a HRT, o cDNA é desnaturado, imobilizado em uma membrana de nitrocelulose ou náilon, e incubado com a amostra de mRNA (Figura 11.20). O mRNA específico, correspondente ao cDNA, hibridiza com esse e permanece ligado à membrana. Após a remoção das moléculas não-ligadas, o mRNA hibridizado é recuperado e traduzido em um sistema livre de células, o que fornece uma amostra pura da proteína codificada pelo cDNA.
as controladoras
dessas potenciais di de ligação de proteínas, de genes individuais é is gerais sobre a dife
a\q \\t ^'
*?q*.
.lôï:..
\..\\ \\ \ ?
tradução
mRNAs
sistemade
traduçãolivre / '."o+ o" tu'''"' /r,or*oo".o,n \ tut-t"'
\ purificados \
I
útil no estudo, não pelos genes clonado*
-{
enormemente do em pontos da proteína codificada focalizado o rnado. Em muitos casos muito antes d" o "*p"# já se encontram
mRNA
I
\ \
Eletroforese em gel, auto-radiograÍia
\ \
tradução
codificado por um
t
/
de um gene clonado necessário.
(HRT, do inglês /t RT, do inglês hybrid
Proteína marcada
\'j=l
Produtos de tradução
marcados
Figura 11.19 Tradução livre de células.
Marcadores de peso molecular para proteínas
244
T. A. Bnowlr
cDNA específico
/\ Membrana
Aplicação da mistura de mRNA
\
Hibridização com o mRNA específico
/\
./\
,#ï;,TFFV, Remoção do mRNA hibridizado
Tradução livre de células, eletroforese e auto-radiografia
Proteína codiÍicada pelo cDNA
Figura 11.21
Figura 11.20
Tradução com retenção do híbrido.
Tradução com liberação do híbrido.
A tradução com retenção do híbrido
é ligeiramente diferente, no sentido de que o cDNA desnaturado é adicionado diretamente à amostra de mRNA (Figura 1I.21).4 hibridização mvamente ocorre entre o cDNA e seu mRNA correspondente, mas, nesse caso, o mRNA nãoligado não é descartado. Em vez disso, a amostra inteira é traduzida em um sistema livre
&
células. O mRNA hibridizado éincapazde conduzir a tradução, de modo que todas as proteí nas' com exceção daquela codificada pelo gene clonado, são sintetizadas. O produto de tradução do gene clonado é, portanto, identificado como a proteína que está ausente na auto-radio grafia.
11.3.2 A análise de proteínas por mutagênese in vitro Embora HRT e HART possam identificar o produto de tradução de um gene clonado, essas técnicas pouco informam a respeito da proteína propriamente dita. As principais perguntas, questionadas pelo biologista molecular de hoje, estão centralizadas na relação entre a estrutura de uma proteína e o seu modo de atividade. A melhor maneira de cuidar desses problemas é induzir uma mutação no gene que codifica a proteína e, então, determinar qual oifeito que a alteração na seqüência de aminoácidos tem nas propriedades do produto de tradução (Figuta 11.22). No entanto, sob circunstâncias normais, as mutações ocoÍrem aleatoriamente e um
grande núme ção proveito: se
in vitro, tt
específico de
DiÍerentes Uma quase i
mutações em
(1) (2)
Um fra Ogene
(3)
eogen Um ol
ser rem
ll.23c adicior
hélice.
CLorueoeu GÊr.lcr e ANÁLtsE oe
Ìïq( I \ i \\^ .,
N...ì preparação de
DNA
245
Adição do cDNA
es'ecíÍico
mRNA \
aï\
ü\s \\
Ct Hibridização do
cDNAcomo mRNA correspondente
Tradução livre de células
-9.,./ rQlt (\_-/ )r
I
// mRNA hibridizado não pode ser traduzido
lura
Figura 11.21
11.20
pdução com liberação do brido. ]
EletroÍorese em gel, auto-radiograf ia
Produtos de HART
Tradução com retenção do híbrido.
Produtos da
tradução total
È
I
t
no sentido de que o
It.2t). A hibridi nesse caso, o mRNA
ida em um sistema livre modo que todas as izadas. O produto de p estií ausente na auto-
grande número delas pode ter sido selecionado, antes que um4 que nos desse uma informação proveitosa, fosse encontrada. Uma solução para o problema é fornecida pela mutagênese in vitro, técnica que possibilita que uma mutação direciónada seja realizada em um local específico de um gene clonado.
DiÍerentes tipos de técnicas de mutagênese in vitro Uma quase ilimitada variedade de manipulações do DNA pode ser utilizada para introduzir mutações em genes clonados, destacando-se, a seguir, as mais simples.
t
(1) (2)
ib b d"
,r-
gene clonado, principais pe Eta.As
ps na relação entre
I
a
de cuidar desses oroble
ideterminar qual o efeito
Ë;;;;.o"';il;;;
rcorïem aleatoriamente e
F-
(3)
Um fragmento de restrição pode ser deletado (Figura ll.23a). O gene pode ser clivado em um único sítio de restrição, uns poucos nucleotídeos podem ser removidos com uma endonuclease específica para fita dupla, tal como Bal3l (p.&), e o gene religado (Figura ll.23b). um oligonucleotídeo pequeno pode ser inserido em um sítio de restrição (Figura ll.23c). A seqüência do oligonucleotídeo pode ser tal que a seqüência de aminoácidos adicional, inserida na proteína, produz, por exemplo, uma nova estrutura, tal como uma hélice-o, ou desestabilize uma estrutura existente.
246
T. A. Bnowr.r
Embora potenc Mutação, p. ex., T
*
Gene
7-7777---71
+
A
de restrição na
gonucleotídeo
v--.----a-7-7-71
cal do gene.
Utilizando r em um gen
#
Existem inúrnr mos considera forma de fita s
*
Proteína
Mutação, por exemplo, ile -) leu
ples é purifica
Um oligonucl
contendo a alü to, o oligonucl
\ \
\t
\ Propriedades da proteína normal
Propriedades da proteína mutante
Gompare
-
-
Figura11.22
da fita compl
Uma mutação pode alterara seqüência de aminoácidos de uma proteína, aÍetando, possivelmente, suas propri+ dades.
11.24b). Essa e a molécula n
(a) Deleção de um Íragmento de restrição
r
Após a int
DNA produz I
vativa da replir duzidas terá ar maneira semel mutada e metr
queados em m
Alul Gene r ,,ar,,,,o, ---F-
Alti
Alul
Alul ligação
I I
I
q$$S ProteÍna
"
Proteína com uma deleção importante
normat
4N
(b) Remoção de um nucleotídeo de um sítio de restÍição EcoRl
v)r---t
I
Ejtl _
I
conter a molá meio de hibrid dições muito t As células dividir (p. 36)
v-J-"-l Gene I' d"l"r"do
r
v-., Bdst ?-
ras, resultanú do pode ser p efeito de uma
Deleção pequena
/
ligação_
to, ser avaliad
771
O potencia
alï:fiã'"*,
qgsd{;:",lï"ï"
A mutagênes tencial extrac Por exemplo,
uma ^t"?g
Proteína com deleção pequena
maneira cornt
sível, por meì cidos que det zimática. As t tirem que o p alternativo e
(c) lnserção de um oligonuclêotídeo EcoRl
"-+I I
"sôs'
Proteína normal
EcoRl_ ú
,
rioâcão
at/!l /l Oligonucleotíde.
lnserÇão
r
A
Ur-? ( C (
Figura 11.23 d""""-
Diversas técnicas de mu-
tabitizada
tagênese rn
Proteína
vitro.
capacid
ráveis, segun engenharie r
vimento de nr
Cr-orueceu GÊNrcA E ANÁLrsE DE
DNA
247
Embora potencialmente úteis, tais manipulações dependem da ocorrência casual de um sítio de restrição na área de interesse, dentro do gene clonado. A mutagênese direcionada por oligonucleotídeo é uma tócnica mais versátil, que pode introduzir uma mutação em qualquer lo-
cal do gene.
Utilizando um oligonucleotídeo para introduzir uma mutação pontual em um gene clonado
ura11.22 Èna mutação pode alterara üência de aminoácidos uma proteína, aÍetando, ivelmente, suas proprbr
LFen" febtado I I F
i
b
h Ìr I
Existem inúmeras maneiras diferentes de realizar-se a mutagênese por oligonucleotídeo; iremos considerar o mais simples desses métodos. O gene a ser mutado deve ser obtido em uma forma de fita simples e, por isso, é em geral clonado em um vetor M13. O DNA de fita simples é purifìcado e a região a ser mutagenizada é identificada por seqüenciamento do DNA. Um oligonucleotídeo pequeno é, enÍão, sintetizado, complementar à região relevante, mas contendo a alteração nucleotídica desejada (Figura ll.24a). A despeito desse malpareamento, o oligonucleotídeo irá anelar ao DNA de fita simples e atuar como iniciador para a síntese da fita complementar, utilizando o fragmento de Klenow da DNA-polimerase I (Figura Il.24b). Essa reação de síntese defrtaé continuada até que uma nova fita completa seja feita e a molécula recombinante fique completamente de fita dupla. Após a introdução, via transfecção, em células de E. coli competentes, a replicação do DNA produz numerosas cópias da molécula de DNA recombinante. A natureza semiconservativa da replicação do DNA garante que a metade das moléculas de fita dupla que serão produzidas terá ambas as f,rtas não-mutadas, enquanto metade será mutada em ambas as fitas. De maneira semelhante, metade da progênie de fagos resultante portará cópias da molécula nãomutada e metade portará a mutação. Os fagos produzidos pelas células transfectadas são plaqueados em meio ágar sólido, de forma que placas são produzidas. Metade das placas deverá conter a molécula recombinante original, e metade a versão mutada, o que é determinado por meio de hibridização em placa, utilizando o oligonucleotídeo como sonda e empregando condições muito severas, de forma que somente o híbrido completamente pareado seja estável. As células infectadas com vetores M13 não são lisadas, mas, ao contriírio, continuam a se dividir (p. 36). O gene mutado pode, portanto, ser expressado nas células de E. coli hospedeiras, resultando na produção da proteína recombinante. A proteína codificada pelo gene mutado pode ser purificada a partir das células recombinantes e suas propriedades estudadas. O efeito de uma mutação em um único par de bases sobre a atividade da proteína pode, portanto, ser avaliado.
O potencial da mutagênese direcionada por oligonucleotídeo A mutagênese direcionada por oligonucleotídeo e as técnicas relacionadas possuem um potencial extraordinário, tanto para a pesquisa básica quanto para a biotecnologia aplicada. Por exemplo, o bioquímico pode, agora, formular questões muito específicas a respeito da maneira como a estrutura da proteína afetaa atividade de uma enzima. No passado, foi possível, por meio de análises bioquímicas, obter-se alguma noção da identidade dos aminoácidos que determinavam a ligação ao substrato e as funções catalíticas de uma molécula enzimâtica. As técnicas de mutagênese fornecem uma visão muito mais detalhada, por permitirem que o papel de cada aminoácido seja avaliado pela substituição desse por um resíduo alternativo e determinando-se o efeito que essa substituição causa na atividade enzimática. A capacidade para manipular enzimas dessa maneira tem resultado em avanços consideráveis, segundo nosso entendimento da catálise biológica, e tem nos levado ao novo campo da engenharia de proteínas, na qual as técnicas de mutagênese são utilizadas para o desenvolvimento de novas enzimas com propósitos biotecnológicos. Por exemplo, alterações cuidado-
L,çao
Figura t
Fína es-
Eada
1
Diversas nicas de tagênese vitro.
ir
248
T. A. Bnowr.r
(phage disph,
bilitam que e
(a) Oligonucleotídeo
gly -------- ccA
cói
GCT
AAT
leu TTA
ôóÀ
ÁrÀ
AAT
TAC
ala
tyr
leu
met
ala
gly
asn
\
met ATc
--------l -------Ì
)
Apresenta
Seqüência gênica normal
Essa técnica,
nas na superl clonagem do no gene clon do fago (Figr
otioonucleotioeo
Malpareamento não-complementar
(b) Síntese da tita complementar Gene no vetor M13 Fragmento
de Klenow,
(a) Apresentação d
dNTPs
Õ Oligonucleotídeo
Fila complementar é totalmente sintetizada
(c) lsolamento dos Íagos contendo a mutação Fagos contendo
(b) Fusão êntÍê o
o gene
normal
/
,/
/ Plagueamento
!
em ágar Placas contendo o gene mutado
Placas
Hibridização em placa,
sondagem com o oligonucleotídeo marcado
Figura 11.24 Um métõdo para a mutagênese direcb nada por oligonucleotídeo.
(c) Utilizando
ur
Placa de mbro sas na seqüência de aminoácidos da subtilisina, uma enzima utilizada no sabão em pó, resnl. taram em versões manipuladas com maior resistência aos desgastes térmico e de branqu* mento (oxidativos) que ocorrem nas máquinas de lavar roupas.
Lr
L
11.3.3 Estudando as interações proteína-proteína
c*
Nas células vivas, poucas, se é que existem, proteínas funcionam em total isolamento. Ao trário, as proteínas trabalham juntas em rotâs bioquímicas e em complexos multiprotéicos. Informações a respeito da função de uma proteína que não tenha sido previamente estudada dem, freqüentemente, ser obtidas por meio da determinação de quais outras proteínas trab*
p
lham juntamente com ela na célula. Duas técnicas importantes, a apresentação por
F
i
I
fagl
Figura 11.25 Apresentação por fagr nante. (b) O gene Íusit terações entre a Prote
Clorunoeu GÊrurcr e ANÁLrsÊ oe
Qthage display) e o sistema de dois
bilitam que
essas interações
DNA
249
híbridos de levedura $teast two hybrid systen), possi-
proteína-proteína sejam examinadas.
Apresentação por Íago Essa técnica é chamada de apresentação por fago porque envolve a "apresentação" de proteínas na superfície de um bacteriófago, normalmente M13 (Figura ll.25a).Isso é obtido pela clonagem do gene que codifica a proteína em um tipo especial de vetor Ml3, um que resulta no gene clonado tornando-se fusionado com um gene que codifica uma proteína do capsídeo do fago (Figura ll.2sb).Após a transfecção de E. coli, esse gene fusionado comanda a sínte-
(a) Apresentação da proteína na superÍície de um Íago Apresentação das proteínas
(b) Fusão entÍe o gene clonado e um gene do capsídeo do Íago
Gene do Íago
Expressao
Gene clonado
I
dogene \\
Proteína do capsídeo do Íago
Figura 11.24 Um método panaa mutagênese nada por oligonu cleotídeo.
t
\ì
(
* ! I
I
^A ffirffi, j\)v6'ò'
.-,,
Apresenraçáo da proteÍna
)
(c) Utilizando uma biblioteca de apresentação por íago
Placa de microtitulação
pada no sabão em pó, istes térmico e de brar
\
)
l
Biblioteca de apresentação por Íago
ì
/(
ffi
Lavagens
Fagos retidos
ProteÍna-teste
Fm total isolamento. Ao
firplexos multiprotéicoe. ho previamente esfudade lquais outras proteínas g, a apresentação por
E
F Ì F
Figura 11.25 Apresentação por Íago. (a) Apresentação de proteínas na superÍície de um Íago filamentoso recombimnte. (b) O gene Íusionado é utilizado para apresentar a proteína. (c) Uma maneira de detectar as inbrações entre a proteína-teste e um Íago de uma biblioteca de apresentação.
250
T. A. Bnowlr
se de uma proteína híbrida, parcialmente constituída da proteína do capsídeo e parcialmente do produto do gene clonado. Com sorte, essa proteína híbrida será inserida dentro do capsídeo do fago, de forma que o produto do gene clonado fique localizado na superficie das partículas de fago. Normalmente, essa técniça é realizada com uma biblioteca de apresentação por fago, constituída de muitos fagos recombinantes, cada um apresentando uma proteína diferente. Bibliotecas representativas podem ser preparadas por clonagem de uma mistura de cDNAs preparados a partir de um determinado tecido ou, menos facilmente, por clonagem de fragmentos de DNA genômicos. A biblioteca consiste em fagos apresentando uma variedade de proteínas e é uilizada para identificar aqueles que interagem com a proteína a ser testada. Essa proteína-teste poderá ser uma proteína pura ou uma que, ela própria, seja apresentada em urìit superfície de fago. A proteína é imobilizada nas canaletas de uma placa de microtitulação ou sobre partículas que podem ser usadas em uma coluna de cromatografia de afinidade, e, então, misturada com a biblioteca de apresentação por fago (Figura ll.25c). Os fagos retidos na placa de microtitulação ou dentro da coluna, após uma série de lavagens, serão aqueles que apresentam proteínas que interagem com a proteína-teste imobilizada.
O sistema de
dois híbridos de levedura
O sistema de dois híbridos de levedura é muito diferente da apresentação por fago. Esse procedimento está baseado na descoberta de que a expressão gênica na levedura Saccharomyces cerevisiae depende de interações entre pares de fatores de transcrição (Figura ll.26a). No sistema de dois híbridos, um pÍÌr de fatores de transcrição, responsável pela expressão de um gene de levedura, é substituído por proteínas fusionadas, cada uma parcialmente composta do fator de transcrição e parcialmente da proteína a ser testada. A capacidade desse par de híbridos de conduzir a expressão do gene-alvo da levedura é, então, testada. Para utilizar o sistema, dois experimentos de clonagem em levedura devem ser realizados.
O primeiro experimento de clonagem envolve o gene cujo produto protéico está sendo estudado. Esse gene é fusionado àquele de um dos pares de fatores de transcrição e a construção éligada em um vetor de levedura. As leveduras recombinantes produzidas não são capazes de expressar o gene-alvo, pois esse fator de transcrição modificado não pode interagir com o seu parceiro (Figura ll.26b). No segundo experimento de clonagem, uma versão híbrida do parceiro é construída e inserida nas células de levedura. A restauração da expressão do gene-alvo indica que os dois fatores de transcrição híbridos podem interagir. As fusões são projetadas de tal maneira que isso somente poderá acontecer se as interações oco1Terem entre os componentes das proteínasteste dos híbridos, e não entre os segmentos dos fatores de transcrição (Figura 11.26c). Pares de proteínas-teste que atuam um sobre o outro são, portanto, identificados. O segundo expe-
rimento de clonagem pode envolver uma biblioteca de recombinantes que representam proteínas diferentes, de forma que uma proteína poderá ser testada contra muitas outras.
F
Figura 11.26 O sistema de dois híbridos de levedura. (a) Um par de Íatores de
transcrição que devem interagil a Íim de um gene da levedura ser expressado. (b) A substituição do Íator de transcrição 1 pela proteÊ na híbrida 1. interrompe a expressão do gene, uma vez que 1* não pode interagir com o fator de transcrição 2. (c) A substituição do Íator de transcrição 2 pela proteína híbrida 2* restaura a expressão do gene, caso as partes hÊ bridas de 1* e 2* sejam capazes de interagir.
Cr-ounceu GÊrurcn e ANÁLrsE oe
capsídeo e parcialmente inserida dentro do capsí-
DNA
(a) Interações entre Íatores de transcrição
na superficie das par-
(ò
ooit fatores de transcrição
apresentação por fago" proteína diferente. Bi-
mistura de cDNAs pre-
/-;(^ \IX
por clonagem de fragmer uma variedade de pro ína a ser testada. Essa seja apresentada em u'na placa de microtitulação m de afinidade, e, * 1.25c). Os fagos retidosn serão aqueles qrc
por fago. Esse
\
\ Figura 11.26 O sistema de
dois híbridos de levedura. (a) Um par de Íatores de transcrição que devem interagir, aÍim de um genê da levedura ser o
pu
levedura Saccharom (Figura 11.26a). No pela expressão de um parcialmente composta idade desse par de devem serreali
protéico está sendo idas não são capazes pode interagir com o
parceiro é construída e indica que os dois de tal maneira quei componentes das
(Figura II.26c). ificados. O segundo que representam
F I
!' ì
tnteração
,
-_:::::j=:::=.=€;i
Expressao do gene
(b) O resultado do primeiro expeÌimento de clonagem
-o
@
Fator de transcrição
híbrido
o
@
Ausência de interação
\
Não ocorre a expressão do gene
(c) O resultado do segundo experimento de clonagem
@@ @
lnteração
{
Expressão do gene
251
CnpíruLo 12 I
Á. fnna, I
llL
in Biotechnology,
Estudando Genomas
vitusspecific RNA: analysis by
le.
itin
interactions. Trends in Gert-
i
fotft"tur.
chain reaction. Irendr
interactions by polyacrylamih from rare transcripts: ãrF the National Academy of Sciaof protein-DNA binding
ry-
binding of proteins to specift system. Nucleic Acith major groove regions at
t2,3129-33. An example
rh
offt
selection. Proceedings of b por oligonucleoídeo.l mapping by DNA.mRNA\I of the USA, 74, 437G74in phage and host biologffl.
Genômica: como seqüenciar um genoma, 254 Pós-genômica: tentando entender a seqüência de um genoma,265
Estudos do transcritoma e do proteoma, 269
No início do século XXI, a ênfase da biologia molecular passou do estudo de genes individuais para o estudo de genomas inteiros. Essa mudança foi possível graças ao desenvolvimento, durante adécadade 1990, de métodos para o seqüenciamento de grandes genomas. O seqüenciamento de genomas começou antes da década de 1990 - vimos, no Capítulo 10, como o primeiro genoma, aquele do fago QXl74, foi completado em 1975 -, mas somente 20 anos depois, em 1995, o primeiro genoma de um organismo de vida livre, o dabacténa Haemophilus influenzae,teve seu seqüenciamento concluído. Os cinco anos seguintes constituíram-se em um divisor de águas, com as seqüências dos genomas de quase 50 outras bactérias sendo publicadas, juntamente com as seqüências completas de genomas muito maiores, como o de levedura, o da mosca-das-frutas, o de Caenorhabditis elegans (um verme nematódeo), o da Arabidopsis thaliana (uma planta) e o humano. Em 2001, o seqüenciamento de genomas bacterianos já havia se tornado uma rotina e a execução de projetos dirigidos a genomas eucarióticos, passado a ser encarada com uma confiança muito maior do que a possível apenas uns poucos anos antes. Para o entendimento de um genoma, três tipos distintos de análise devem ser executados:
I
(1)
A genômica é a aquisição dos dados de seqüência. Os dados são adquiridos na forma de
(2)
muitas seqüências individuais de 500 a 800 pb, que devem ser montadas na seqüência genômica contínua. É necessário, portanto, ser elaborada uma estratégia para a montagem correta das seqüências. A pós-genômica ou a análise funcional é a análise da seqüência de um genoma para localizar os genes, as seqüências controladoras e outros elementos interessantes, seguida de vários experimentos para determinar as funções de quaisquer genes desconhecidos que tenham sido descobertos.
254
T. A. Bnowlr
(3)
é o uso de sistemas computadorizados para auxiliar as pesquisas genô. mica e pós-genômica. A bioinformática inclui a montagem computadorizada de contip de seqüências, o exame de seqüências para verificação da presença de genes, a previsão de função para genes identificados e o armazenamento da vasta quantidade de dados ge rados durante um projeto de seqüenciamento de genoma.
A bioinformâtica
12.1 Genômica: como seqüenciar um genoma
Figura 12.1 A abordagem de Íábrica para o seqüenciamento de DNA em grande escala.
Um experimento de seqüenciamento por terminação de cadeia simples executado manualmente produz em torno de 400 nucleotídeos de seqüência, enquanto uma única corrida em um seqüenciador automático gera em torno de 750 pb. Mas o tamanho de um genoma bacteriano típico é de 4.000.000 pb e o do genoma humano é de 3.200.000.000 pb (Tabela 12.1). Fica óL vio que um grande número de experimentos de seqüenciamento deve ser executado para determinação da seqüência completa de um genoma. Essa situação, aparentemente desanimadora, pode ser resolvida com o uso de sistemas robotizados para a preparação de DNA para seqüenciamento e para a execução dos experimentos de terminação de cadeia, com as seqüências sendo lidas por seqüenciadores automáticm que transferem os dados diretamente para um computador (Figura 12.1). Nos laboratórion com estilo de fábrica que executam esses projetos, o principal objetivo é manter os seqüenciadores automáticos operando em suas capacidades máximas. Cada seqüenciador é capaz & executaÍ até 96 experimentos em paralelo, gerando 72.000 pb de seqüência a cada duas horas As maiores iniciativas de seqüenciamento utilizam até 100 seqüenciadores automáticos operando 24 horas por dia, o que representa uma produção teórica diária de 50.000.000 pb. Nesse contexto, o seqüenciamento de genomas já não parece ser uma tarefa tão assustadora. Na prática, a geração de dados de seqüência suficientes é um dos aspectos mais rotineirm de um projeto de seqüenciamento de genoma. O primeiro problema real que surge é a necessidade de montar os milhares, ou, às vezes, milhões, de seqüências individuais de 750 pb em uma seqüência genômica contínua. Duas estratégias diferentes foram desenvolvidas para a montagem de seqüências (Figura 12.2).
E Figura12.2 (a) A abordagem aleatória (sf,otgun approach) e (b) a abordagem de contigs de clones para a montagem da seqüência de um genoma.
(1)
aleator
Tabela 12.1 Tamanhos de genomas representativos Espécie
Tipo de organismo
Mycoplasma genitalium
Bactéria Bactéria Bactéria Levedura
H ae mop hilu s infl ue nzae
Escherichia coli iae C aenorhab ditis e le g ans D ro s op hil a me lano g a s t e r S ac
charomy
ce
s
ce
rev
Arabidopsis thaliana Homo sapiens Triticum aestivum
b
is
Verme nematódeo Inseto Planta
Mamífero Planta (trigo)
A aboi
Tamanho do genoma (Mb) 0,58 1,83
4,64
t2,t
(2)
busca r A abor
rante
a
todel mente a
parti
91 180
12.1.1 A aborda
t25
A exigência breposições ra que seja t rado e não 1
3.200 17.000
Cr-oruncev GÊrurca e ANÁLrsE oe
nrxiliar
as pesquisas
-l t-*"*-" I I
genil
ontip imputadorizad henca de senes. a orevisfu p quantidade de dados gsa de c
I
t i.
I
i
Figura 12.1
lExeculamlllll
A abordagem de Íábrica para o seqüenciamento de DNA em grande escala.
or
I I
experimentos
| de I
F;"^Ã;ã lnurouÁrrcosl
------------*
lseqüenciamentol
| I
Lêemas I seqüências I
I
I
DNA
255
Ë"-Ã;;l I
--------------------=
| I
Analisam os
dados
I
I
I
I
I
I
executado puma única corrida em Iae um genoma bacteri f pb (Tabela l2.l ). Fica ser executado para
hrt"t
Molécula de DNA Quebra em fragmentos
aleatórios
Montagem de um
conlunto de fragmentos clonados com sobreposições parciais
fzve
12.1). Nos seqüenciador é, capaz
[iência a cada duas h iadores automáticos a de 50.000.000 pb.
efa tão assustadora aspectos mais rotinei real que surge é a na individuais de 750 pb desenvolvidas pmr
Frgura12.2 (a) A abordagem aleatória (shoÈ gun approach) e (b) a abordagem de contigs de dones para a montagem da seqüência de um genoma.
(1) (2)
iI
o,sS 1,83
. ', l2'r ,97 '
4,64
180
r25 I3.200 .000
F
F
Montasem da
seqüência
/ Seqüência de DNA
(a) A abordagem aleatória
(b) A abordagem de contigs de clones
A abordagem aleatória (do inglês shotgun approach), na qual o genoma é quebrado aleatoriamente em fragmentos curtos. As seqüências resultantes são examinadas em busca de sobreposições, utilizadas para a montagem da seqüência contínua do genoma.
Aabordagem decontigs declones, queenvolveumafasedepré-seqüenciamento,
durante a qual é identificada uma série de clones parcialmente sobrepostos. Cada segmento de DNA clonado é, então, seqüenciado e as seqüências são posicionadas adequadamente no mapa de contigs, para ordenar e gradualmente montar a seqüência genômica a partir das sobreposições.
12.1.1 A abordagem aleatória para o seqüenciamento de genomas A exigência fundamental para
a abordagem aleatória é a viabilidade da identificação de sobreposições parciais entre todas as seqüências individuais que forem geradas. Além disso, para que seja obtida a seqüência genômica correta, esse processo de identihcação deve ser acurado e não pode ser ambíguo. Um erro na identificação de um par de seqüências sobrepostas
256
T. A. Bnowr'r
parcialmente poderia levar à montagem da seqüência genômica em uma ordem incorreta ouà perda completa de algumas partes dela. Como a probabilidade de ocorrência desse tipo de erro aumenta para genomas maiores, a abordagem aleatória tem sido utilizada principalmenÍc com os genomas bacterianos menores.
ram executa rejeitadas, p, ram entrada
O projeto de seqüenciamento do genomade H. influenzae
genoma de,l Poderia I
A abordagem aleatória foi utilizada com sucesso pela primeira vez com abacténa H. influenzae,pnmeiro organismo de vida livre que teve seu genoma completamente seqiienciado, com os resultados publicados em 1995. A primeira etapa foi quebrar o genoma de 1.830 kb da bactéria em fragmentos curtos, que serviriam de molde para os experimentos de seqüenciamento (Figura 12.3). Poderia ter sido utilizada uma endonuclease de restrição, mas a sonicação (p223) for escolhida por ser mais aleatória e, portanto, capaz de reduzir a possibilidade de ap recimento de lacunas na seqüência do genoma. Foi decidido que o projeto concentrar-se-ia nos fragmentos de 1,6 a 2,0 kb, pois eles poderiam gerar duas seqüências de DNA, uma a partir de cada extremidade, reduzindo a quarF tidade de clonagens e de preparações de DNA que seriam necessárias. O DNA sonicado fo( portanto, fracionado por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos de tamanho deseja do, purificados a partir do gel. Após a clonagem, 28.643 experimentos de seqüenciamento fe
conjunto de
acabassem
sem, por aci
mos de tenrl lacunas indi a mais bempreparada er
gonucleotíd mentos. Em
dicando que estavam adj chada pelo
GENOMA (1.830 kb)
FRAGMENTOS ALEATORIOS
/
cronaoem
/ Figura í2.4
BIBLIOTECA DE CLONES
LJtilizando hibridiza-
/ Seqüenciamento
/a 24.304 SEOÜÊNCtAS
Figura 12.3 Montajem de seqüências
Uma representa-
ção esquemática 140 CONTTGS
das principais etapas do projeto de seqüenciamento do genoma de H. influenzae.
s
de seqüêncii grande quan
ção com oligonucleotídeos para fechamento das lacunas na seqüência do genoma de H. influenzae. Os oligonucleotídeos 2 e 5 hibridizam com o mesmo clone de À, indicando que os oütigs I e lll são adjacentes. A lacuna entre eles pode ser Íechada a partir do seqüenciamento de parte do clone de 1..
r
Cr-onecev GÊrutcn e ANÁltse oe
pma ordem incorreta ouà tsorrência desse tiPo de erf
to
utilizada princiPalmene
\t"rr"e lcom a bactéiaH. influet
con
Famente seqüenciado, 1.830 kb dabrlenoma de de seqüenciamem
mas a sonicação a
(r
possibilidade de aP*'
1,6 a2,O kb, pois eles 1n-
idade, reduzindo a qum as. O DNA sonicado fc* de tamanho deseja" de seqüenciamentofç
DNA
257
çias - 4'339 no total - foram ram executados com 1g.687 dos clones. Algumas dessas seqüên seqüências restantes derejeitadas, porque tinham extensões menores que 400 pb. As24.304 os dados' O resultado foi um ram entrada em um computador, que levou 30 horas analisando a um segmento diferente do conjunto de 140 seqüêncìas contínuas, cada uma correspondendo genoma de H. influenzae. sonicados, para que Poderia ter sido possível continuar o seqüenciamento dos fragmentos 11'631'485 pb Porém' individuais' acabassem sendo fechadas as lacunas entre os segmentos que uma sugerindo do genoma -, de seqüênciajá haviam sido gerados - seis vezes a extensão foscorretos que os fragmentos granO" quantldade de trabalho adicional seria necessiíria até terem eficiente J"-, poi acaso, seqüenciados. Nesse estágio do projeto, a abordagem mais das uma cada de *or.á" tempo foi a utilização de uma estratégia fu.igiOu para o fechamento lacunas' das para o fechamento lacunas individualment". V,áriu, abordagens foram utilizadas de uma biblioteca de clones por hibridização ã análise envolvendo delas a mais bem-sucedida com uma série de sondas (olipreparada em um vetor 1, (Figura I2.4). Abiblioteca foi triada de cada um dos 140 seggonucteotfOeos), cujas ,"quêï"iut correspondiam às extremidades com o mesmo clone de l" inmentos. Em alguns casos,ìois oligonuclóotídeos hibridizavam por aqueles oligonucleoúdeos dicando que aúxtremidades dos dois segmentos representados extremidades podia, então' ser feestavam adjacentes no genoma. A lacuna entre essãs duas de )"' chada pelo seqüenciaménto da parte apropriada do clone
(a) Preparação dos oligonucleotídeos a seÍem
utilizados como sondas
Contigl l---------12 Contigll !-----------: 34 Contiglll
Figura 12.3 Uma representação esquemática das principais eF pas do projeto dê seqüenciamento do genoma de H. influenzae.
È
Ë
Figura 12.4 Utilizando hibridização com oligonucleotídeos Para Íechamento das lacunas na seqüência do genoma de H. influenzae. Os oligonucleotídeos 2 e 5 hibridizam com o mesmo clone de ?r, indicando que os antigs I e lll são adjacentes. A lacuna entre eles Pode ser Íechada a Partir do seqüenciamento de parte do clone de L.
1ã
Sondas de oligonucleotídeos
ão
(b)Triagem de uma biblioteca genômica
Sonda com o oligonucleotídeo 2 ê*&€ô**4*& &&ê*èêeer& S9&A&**a6e eaa$ê*ô*s*
**ssss&*&ô 48sêô*4*S*
Gonclusão:
tlll |_--_-.:|-_-_-_-:l
1256
Sonda com o
oligonucleotídeo 5
6&&&&a**** ô&&ss&&*64 S*9&8Aea*A âessg&êaô? 9Sé**s*&ss **a6*?*ç**
Oscontgslelll estão adiacentes no genoma
258
T. A. Bnowlr
Problemas da clonagem aleatória A estratégia de clonagem aleatória foi exitosa com muitos genomas bacterianos. Isso
se del.e ao fato de tais genomas bacterianos serem pequenos, de modo que as exigências computacionais para a identificação de sobreposições de seqüências não são muito grandes. Ademais"
eles não contêm seqüências de DNA repetidas, que são seqüências de poucos pares de bases até várias quilobases, repetidas em dois ou mais locais em um genoma. Tais seqüências provocam problemas para a abordagem aleatória pois, quando são montadas, aquelas que se erF contram parcial ou inteiramente no interior de um elemento repetido podem ser alinhadas, por sobreposição acidental, com a seqüência idêntica presente em um elemento de repetição diferente (Figura 12.5). Isso pode levar ao posicionamento inconeto ou a perdas de parte ou de toda a seqüência quando da montagem do genoma. Por essa razão, o seqüenciamento aleatório é considerado inadequado para genomas eucarióticos, visto que eles possuem muitos elementos repetidos. Mais adiante, neste capítulo, será visto como essa limitação pode ser superada pelo uso de um mapa genômico para dirigir a montagem de seqüências obtidas pela abordagem aleatória.
12.1.2 A abordagem de contigs de clones A abordagem
de contigs de clones não tem as limitações do seqüenciamento aleatório e, portanto, é capaz de gerar uma seqüência acurada de um grande genoma com DNA repetitivo, clF jo inconveniente é envolver muito mais trabalho, o que a torna mais demorada e cara. O tempo e o esforço adicionais são necessários para a construção das séries de fragmentos de DNA clonados parcialmente sobrepostos. Depois de isso haver sido feito, cada fragmento clonado é seqüenciado pelo método aleatório e a seqüência do genoma é montada passo a passo (Fi* gura 12.2). Cada fragmento de DNA clonado deve ser o mais longo possível, de modo a minimizaro número total de clones necessário para cobrir todo o genoma. Um vetor de alta capacidade é por isso utilizado. O primeiro cromossomo eucariótico a ser seqüenciado - o cromossomo IIil de Saccharomyces cerevisiae - foi inicialmente clonado em um vetor do tipo cosmídeo (p-
139), com, te curto e c noma hurn
ciais (BAC
emcontigs
Montage (chromo
Uma das té
mossômic
um clone é
sonda de hi nes que ger
cialmente s blioteca. M
posições ac um procedi te quando c
lativamenú entre contil
Métodos
O ponto fn truir, apart pidas para
objetivo
Figura 12.5 Seqüências repetidas
(
idênticas
\ Molécula de DNA
Seqüência
Seqüência 2
1
Sobreposição das seqüências 1 e 2
Um problema da abordagem der tória. Uma sobreposição incorreta de duas seqüências é leita devido ao Íab de ambas termÈ narem em uma região interna um elemenlo r+ petido. lsso re. sulta na ausência de um segr mento da molê cula de DNA na
&
2 I
I
Montagem da seqüência
I
Y
-----
Seqüência de DNA deduzida
seqüência morr tada.
Figura 12.6 Caminhada cromossômica (chromosome walking).
i
a i,
Croueceu GÊNtcA
bacterianos. Isso se as exigências com
muito grandes. de poucos pares de Tais seqüências
aquelas que se podem ser alinhadas. elemento de repetição a perdas de parte ou de o seqüenciamento possuem muitos limitação pode ser obtidas pela
to aleatório e, com DNA repetifivois demorada e cara. O de fragmentos de
ito, cada fragmento c é montada passo a passo l, de modo a mini vetor de alta - o cromossomo vetor do tipo cosmídeo
E
AruÁlrsr oe
DNA
139), com o contig resultante incluindo 29 clones. Contudo, o cromossomo III é relativamente curto e o tamanho médio dos fragmentos era de apenas 10,8 kb. O seqüenciamento do genoma humano, muito mais longo, exigiu 300.000 clones de cromossomos bacterianos artificiais (BAC, de bacterial artificial chromosome) (p. lal). A montagem de todos esses clones em contigs cromossomo-específicos foi uma tarefa gigantesca.
Montagem de contigs de clones por caminhada cromossômica (chromosome walkingl Uma das técnicas que pode ser utilizada para montar um contig de clones é a caminhada cromossômica (do inglês chromosome walking). Para iniciar uma caminhada cromossômica, um clone é selecionado aleatoriamente a partir da biblioteca, marcado e utilizado como uma sonda de hibridização contra todos os outros clones da biblioteca (Figura 12.6a).Aqueles clones que geram sinais de hibridização são os que se sobrepõem à sonda. Um desses clones parcialmente sobrepostos é, então, marcado e utilizado em uma segunda etapa de triagem da biblioteca. Mais sinais de hibridização são, então, identificados, alguns deles indicando sobreposições adicionais (Figura 12.6b). Assim, o contig de clones é construído gradualmente, em um procedimento passo a passo. Entretanto, esse processo é laborioso, sendo utilizado somente quando o contig corresponde a um cromossomo curto, de modo a envolver um número relativamente pequeno de clones, ou quando o objetivo é o fechamento de uma ou mais lacunas entre contigs, que foram montados por métodos mais rápidos.
Métodos rápidos para a montagem de contigsde clones O ponto fraco da caminhada cromossômica é começar em um ponto de partida fixo e construir, a partir dali, o contig de clones em um lento processo passo a passo. As técnicas mais rápidas para a montagem de contigs de clones não utilizam um ponto de partida fixo e têm por objetivo a identificação de pares de clones parcialmente sobrepostos: quando um número su-
(a)Triagem da biblioteca com o clone A1
Figura 12.5 Um problema abordagem tória. Uma so breposição incorreta de duag seqüências é ta devido ao de ambas ternü narem em utna região interna um elemento re petido. lsso re sulta na ausàr cia de um segr mento da mdê cula de DNA m
seqüência tada.
f. 94 Ë
b
mm
259
ABCDEFGHIJ 1
at
r: a r, a a è t t
A1
2
3
4
B4
5 6
(b)Triagem da biblioteca com o clone
14
ABCDEFGHIJ 1
Figura 12.6 Caminhada cromossômica
(chromosome walking).
2 3
4 5 6
a6 * & t 6 t * i * ê a ? t a a, * * a 9r;*!&€t4t? ê 3 $ è I & ar * as ã*4***êgtè â?*ë4*eô?*
A1 B4
F2
260
T. A. Bnowr.r
ficiente desses pares for identificado, o contig é revelado (Figura 12.7). As várias técnicas que podem ser utilizadas para a identificação das sobreposições são conhecidas coletivamente por datiloscopia de clones (do inglês cloneftngerprinting). A datiloscopia de clones é baseada na identificação de características da seqüência que são compaÍtilhadas por um par de clones. A abordagem mais simples consiste em digerir cada clone com uma ou mais endonucleases de restrição e buscar pares de clones que compartilham fragmentos do mesmo tamanho, excluindo aqueles derivados do vetor e não do DNA nele inserido. Essa técnica pode parecer de simples execução, mas, na práti ca, ela é bastante demorada na parte de análise dos géis de agarose resultantes, em busca dos fragmentos compartilhados. Existe também uma possibilidade relativamente elevada de que dois clones que não se sobrepõem gerem, por acaso, fragmentos de restrição distintos, mas com tamanhos indistinguíveis por eletroforese em gel de agarose. Resultados mais acurados podem ser obtidos por PCR de DNA repetitivo, também conhecido como PCR de elemento repetido disperso (IRE-PCR, do inglês interspersed repeat element PCR). Esse tipo de PCR utiliza iniciadores projetados para anelar com seqüências de DNA repetitivo e para dirigir a amplificação de DNA entre repetições adjacentes (Figura 12.8). Repetições de um tipo determinado estão distribuídas essencialmente de maneira aleatória em genomas eucarióticos, com distâncias variáveis entre elas, de modo que produtos de diferentes tamanhos são obtidos quando tais iniciadores são utilizados com clones de DNA eucariótico. Se um par de clones gera produtos de PCR de mesmo tamanho, eles devem conter repetições espaçadas de maneira idêntica, possivelmente porque os fragmentos de DNA sobrepõem-se parcialmente.
Montagem de contigs de clones pela análise do conteúdo de sítios-alvo seqüência-específ icos Uma terceira maneira de montar um contig de clones é a busca sistemática de pares de clones que contêm uma seqüência de DNA específica, que ocoÍïe em apenas uma posição no genoma em estudo. Se dois clones diferentes contêm essa característica, então eles claramente devem sobrepor-se parcialmente (Figura 12.9). Uma seqüência desse tipo é chamada de sítio-alvo seqüência-especíÍico (srs, do inglê,s sequence tagged siÍe). Freqüentemente, uma STS é um gene que foi seqüenciado em um projeto anterior. Como a seqüência é conhecida, pode ser projetado um par de iniciadores de PCR específicos para aquele gene, os quais podem ser utilizados para identificar os membros de uma biblioteca de clones que o contêm. Entretanto, a STS não tem de ser necessariamente um gene, mas qualquer
F2
Figura 12.8 PCR de elemento repetido disperso (interspersed repeat element PCH) (rRE-PCR).
t4
: trb
tz
H7
Sobreposições identif icadas por datiloscopia de clones
B4
A1
A1
Figura 12.7
H7
F2
A1
u
Dedução do conÍrg de clones 14
G6
Montagem de um contig de clones pela tecnica de datiloscopia de clones (clone finger-
printingl.
z b Ë
t
::
Figura 12.9 A base do mapeamento por conteúdo de STS.
Clorueeeu GÊrurcr e ANÁLtsE oe
DNA
12.7). As viírias técnicas
hhecidas coletivamente
(a) A base da IRE-PCR
;
fbticas da seqüência que consiste em digerir hs de clones que vetor e não do DNÀ b prática,.ela é bastante fca dos fragmentos coq lde que dois clones que L mas com tamanhos i
Duas repetições idênticas
I lò
(\ J
Anetamento dos iniciadores
lrepetitivo, também i
inglês interspersed rqs
I
anelar com seqüências
O produto da PCR inclui a região entre repetições adjacentes
letições adjacentes (Fi fcialmente de maneira
I, de modo que produtos pados com clones de Itamanho, eles devem pe os fraementos de
(b) lnterpretação dos resultados
cc*
Clone
Marcadores
ht".ioo
I
ì
Clone ll
ì
(
Clone lll
,
I
de pares de ch" apenas uma posição m im
$emática
herística, então eles claralência desse tipo é cham p tagged sdÍe). Freqüenlointerior. Como a seqüêncie foecíficos para aquele go-
luma biblioteca de cloner P um gene, mas qualqrm
A banda compartilhada sugere que os clones ll e lll sobrepõem-se
Figura 12.8 PCR de elemento repetido disperso (interspersed re-
parcialmente
peat element PCR) (rRE-PCR).
I
Coleção de clones
-Éil
ilt IV
o V
Sítio-alvo seqúência-específ ico
Figura12.7 Montagem de um contig de clones pela técnica de datilos. copia de clones (clone finger-
printingl.
F
Figura 12.9 A base do mapeamento por conteúdo de STS.
-.l
IV
--a
il
Os clones lV e ll devem se sobrepor
261
262
T. A. Bnowrrr
segmento curto de DNA obtido a partir do genoma, desde que ele não seja oriundo de um
elemento repetitivo.
12.1.3 Utilizando um mapa para auxiliar na montagem de uma seqüência O mapeamento do conteúdo de sítios-alvo seqüência-específicos é um método particularmente importante para a montagem de contigs de clones, pois, muitas vezes, as posições das STSs no genoma foram determinadas por mapeamento genético ou mapeamento físico. Isso significa que as posições das STSs podem ser utilizadas para ancorar um contig de clones em um mapa genômico, permitindo que a posição do contig no interior de um cromossomo seja determinada. Veremos agora como esses mapas são obtidos.
Mapas genéticos Um mapa genético é aquele obtido por meio de estudos genéticos, utilizando princípios mendelianos e envolvendo progrÉÌmas de cruzamentos dirigidos, para organismos experimentaiq ou análise de pedigrees, para humanos. Na maioria dos casos, os lócus estudados são genes cujos padrões de herança são acompanhados pelo monitoramento dos fenótipos da progênie produzida após um cruzamento entre pais com características contrastantes (por exemplo, plantas altas e baixas, piÌra os pés de ervilha estudados por Mendel). Mais recentemente, foram elaboradas técnicas pÍÌra o mapeamento de seqüências de DNA que não são genes, mas que apresentam variabilidade na população humana. Dentre esses marcadores genéticos, os mais importantes são:
(1)
(2)
(3)
Polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs, do inglês restriction fragment length polymorphisms) são causados por uma variação na seqüência que resulta em uma alteração em um sítio de restrição. Quando digeridos com uma endonuclease de restrição, a perda do sítio é revelada porque dois fragmentos permanecem unidos. Originalmente, as RFLPs eram tipificadas por hibridizaçáo de Southern de DNA genômico clivado por endonucleases de restrição. Tal procedimento, porém, é demorado, de modo que, hoje em dia, a presença ou ausência de um sítio de restrição é geralmente determinada por PCR (Figura l2.l}). Existem aproximadamente 100.000 RFLPs no genoma humano. Repetições curtas em tandem (STRs, do inglês short tandem repeats), também chamadas de microssatélites, formadas por seqüências repetitivas curtas, como CACACA As unidades de repetição têm extensões de 1 a l3 nucleotídeos e estão geralmente repetidas 5 a 20 vezes. O número de repetições em um lócus pode ser determinado a partir de uma PCR utilizando iniciadores que anelam um em cada lado da STR, seguida da análise do tamanho dos produtos resultantes por eletroforese em gel de agarose ou pG liacrilamida (Figura l2.ll). Existem pelo menos 650.000 STRs no genoma humano.
PolimorÍismo de nucleotídeos individuais (SNPs, do inglês single nucleotide poly morphisms) são posições em um genoma nas quais qualquer um de dois ou mais nucleotídeos diferentes pode ocorrer (Figura I2.I2). Essas mutações pontuais são tipificadas por análise com sondas oligonucleotídicas curtas, as quais hibridizam com formas
Figura 12.10 Tipificação de um polimorfismo de sítio de restrição Por PCR. Na trilha central, o produto da PCR gera duas bandas, porque Íoi clivado pelo tÍatamento com a enzima de restrição. Na trilha direita, existe apenas uma banda, porque o DNAmolde não possui o sÊ tio de restrição.
lt,lt
I t_ |
á=,-
Figura 12.11
TipiÍicação d
doqueodal
unidade CA i
alternativas da SNP. O número de SNPs no genoma humano ainda permanece desconhe-
cido, mas é de pelo menos 1,4 milhão. Todos esses marcadores de DNA são variáveis, existindo, portanto, em duas ou mais formas alélicas. A herança de alelos alternativos em um determinado lócus é acompanhada pela anâ lise do DNA preparado a partir da progênie de cruzamentos genéticos.
Mapas Íísi
Um mapa ffs
específicas er cus estudadq
dores de seq
Clorunoev GÊNrcA
e não seja otion6s ds rrm
E ANÁLrsE
oe
DNA
263
Sítio de restrição
f - *-..-_->---/,
II
\ um método particularmen Yezes, as posições das STSm físico. Isso siç um contig de clones em utrt um cromossomo seja do-
utilizando princípios rnen organismos experi mentei** lócus estudados são gencr dos fenótipos da progênL trastantes (por exemplq .
Mais recent"-"nr".
\
Figura 12.10
ïpiÍicação de um polimorfismo de sítio de restrição por PCR. Na trilha central, o produto da PCR gera duas bandas, porque Íoi clivado pelo tratamento com a enzima de restição. Na trilha direita, existe apenas uma banda, porque o DNAmolde não possui o sÊ tio de restrição.
.
PCR, restrição
Marcadores
\l
{ú
(
lniciadores
daPCR
PCR, restrição
ú
: -:
f*]
que não são genes, mecr marcadores genéticos, m
(RFLPs, do inglês
ra-
uma variação na seqüêncie digeridos com uma elis fragmentos peÍmaneoel de Southem de DÌ{ü, mento, porém, é demqr
sítio de restrição é gereft. amente 100.000
RFLh
repeats), também ch* curtas, como CACAC"Tï. e estão geralmente reper. Fode
ser determinado a
prrfo
Fda lado da STR, seguida ôr iro.. gel de agarose ou F bTRs no genoma humano)g)ês single nucleotide pafir luer um de dois ou mais nrltações pontuais são tipifi*
lpais hibridizam com
form
Figura 12.11 Tipificação de uma STR por PCR. O produto da PCR na trilha direita é um pouco mais longo do que o da trilha central, porque o DNA-molde, a partir do qual ele Íoi gerado, contém uma unidade CA a mais.
n ainda permanece desconho
Mapas Íísicos pto, em duas ou mais
form
i:us é acompanhada pela anir
Éticos.
Um mapa físico é gerado por métodos que localizam diretamente as posições de seqüências específicas em uma molécula de DNA cromossômico. Como no mapeamento genético, os lócus estudados podem ser genes ou marcadores de DNA. Estes últimos podem incluir marcadores de seqüências expressadas (ESTs, do inglês expressed sequence /ags), que são se-
264
T.A.Bnowru
A impor
ATAGACCRTGGcAA
É possível co. Essa p
ATAGACTATGGCAA
na256,ep
[,*,
xflio de Figura12.12 Duas versões de uma SNp.
qüências curtas obtidas a partir das extremidades de DNAs complementares (cDNAs) (p. 172). Os marcadores de seqüências expressadas são, pois, seqüências parciais de genes, que" quando utilizadas na construção de um mapa, permitem o rrápido posiiionamento dos geneu correspondentes, mesmo que a identidade de cada gene não seja aparente a partir aa seqtiências dos ESTs. Dois tipos de técnica são utilizados no mapeÍìmento físico: (1)
(2)
Exame direto de moléculas de DNA cromossômico, como, por exemplo, pela hibridiza_ ção de fluorescência ,/r silu (FISH, do inglôs/a orescence in situ hyuìiaization) (p. 2rr')t Se a FISH é executada simultaneamente com duas sondas de DNA, cada uma delas mar_ cada com um fluorocromo diferente, as posições relevantes de ambos os marcadores representados pelas sondas podem ser visualizadas no cromossomo. Técnicas especiai* para o trabalho com cromossomos descompactados, cujas moléculas de DNA são esten_ didas, em oposição à compactação normal, permitem que os marcadores sejam posicio nados com um elevado grau de precisão. Mapeamento físico com um reagente mapeador é uma coleção de fragmentos de DNA parcialmente sobrepostos que cobre o cromossomo ou o genoma em estudo. os pares de marcadores que estão em um mesmo fragmento devem estar próximos um do outro no cromossomo: a distância entre ambos pode ser determinada pela medição da freqüência com a qual o par ocorre junto em diferentes fragmentos do reagente mapeador (pigu,a 12.13). Hfuridos de radiação constituem-se em um dos tipos de reagente mapeadr que tem sido de importância para o Projeto Genoma Humano. Esses híbridos de radiação são linhagens celulares de hamster que contêm fragmentos de cromossomos humanos, preparadas por um tratamento envolvendo irradiação (daí o 4ome). o mapeamento é executado por hibridização de sondas marcadas com um painel de linhagens celulares" cada uma contendo uma parte diferente do genoma humano.
ur
maior esú
car se als cias curtas
meios gen passa-se a
Mapas no e tamhx elegans e t
pas tambér am a aborc cação do s das, o que de modo a
dem ser el ma. Essa' promisson
12.2 Pós-ger
deuml
Depois de calizar tod ser trivial, e
por técni
qüência dr contém ce base em er
similar à d
ções descc
Apesar
completad fãos. É ner tá provand
12.2.1 ldentific A localizar nhecida, o
Figura 12.13 O princípio por trás do uso de um reagente mapeador. Pode-se deduzir que os marcadores 1 e 2 estão relativamente próximos, pois aparecem juntos em quatro Íragmentos de DNA. Ao contrário, os marcadores 3 e 4 devem estar relativamente distantes, pois aparecem juntos apenas em um fragmento.
corTespon(
qualquer
ir
Sob tais cir
ja dispoúr
Cloruneeu GÊNrcA
E ANÁLrsE DE
DNA
265
A importância de um mapa na montagem da seqüência
SNP.
(cDNAs)
(p
parciais de genes, q, posicionamento dos gro nte a partir da seqÍlb ffsico: as
exemplo, pela hibridize. hy b ridizati on) (p. 2l lfrDNA, cada uma delas mrambos os marcadoresrn* . Técnicas especiefo
su
ulas de DNA são estrsej am posicio.
É possível obter-se a seqüência de um genoma sem a utilização de um mapa genético ou físico. Essa possibilidade é ilustrada pelo projeto de H. influenzae, que acompanhamos na página256, e pelos de muitos outros genomas bacterianos que vêm sendo seqüenciados sem o auxflio de um mapa. Entretanto, um mapa passa a ter muita importância quando um genoma maior está sendo seqüenciado, pois ele se constitui em um guia que se pode usar para verificar se a seqüência do genoma está sendo montada corretamente a partir das inúmeras seqüências curtas que emergem do seqüenciador automático. Se um marcador que foi mapeado por meios genéticos e/ou físicos aparece na seqüência do genoma em uma posição inesperada, passa-se a suspeitar de um erro na sua montagem. Mapas genéticos e/ou fisicos detalhados foram importantes para o Projeto Genoma Humano e também para aqueles de seqüenciamento dos genomas de levedura, mosca-das-frutas, C. elegans e A. thaliana, todos eles baseados na mesma abordagem de contigs de clones. Os mapas também estão sendo utilizados para dirigir a montagem de seqüências em projetos que usam a abordagem aleatória. Conforme descrito na página 258, o principal problema para a aplicação do seqüenciamento aleatório em um grande genoma é a presença de seqüências repetidas, o que determina a possibilidade de que a seqüência montada "pule" entre duas repetições, de modo a excluir ou posicionar incorretamente parte do genoma (Figura 12.5). Tais eÍïos podem ser evitados se a montagem da seqüência referir-se constantemente a um mapa do genoma. Essa "abordagem aleatória dirigida" ("directed shotgun approach") parece ser bastante promissora como um método rápido para o seqüenciamento de grandes genomas.
marcadores
de fragmentos de Dtr{tr em estudo. Os pares&
próximos um do outÍo m pela medição da freqüêncirr Íeagente mapeador (Figurr s de reagente mapeadr Esses híbridos de radie. de cromossomos humero nome)..O mapeametrb Finel de linhagens celulaer,
b. t i
I
12.2 Pós-genômica: tentando entender a seqüência de um genoma Depois de a seqüência de um genoma haver sido completada, a etapa seguinte consiste em localizar todos os genes e determinar todas as suas funções. Trata-se de um processo longe de ser trivial, mesmo prÌra genomas que já foram extensivamente estudados por análise genética e por técnicas de clonagem gênica antes da conclusão do seqüenciamento. Por exemplo, a seqüência de S. cerevisiae,vm dos organismos mais bem-estudados, revelou que esse genoma contém cerca de 6.000 genes. Desses, somente 3.600 tiveram sua função determinada, com base em estudos previamente executados ou porque o gene da levedura tinha uma seqüência similar à de um já estudado em outro organismo. Restaram, portanto, 2.400 genes com funções desconhecidas. Apesar da quantidade massiva de trabalho investida desde que o genoma da levedura foi completado, em 1996, ainda não foram determinadas as funções da vasta maioria desses órffios. É nessa área que a bioinformáúica, às vezes chamada de biologia molecular in silico, está provando ser de maior valia, como um complemento aos experimentos convencionais.
12.2.1 ldentificando os genes em uma seqüência genômica A localização de um gene
deduzir que os marcadores ntro Íragmentos de DNA. Ao Ies, pois aparecem juntos
I
t
é fácil se a seqüência de aminoácidos do seu produto protéico é conhecida, o que permite que a sua seqüência nucleotídica seja predita, ou se um cDNA ou EST correspondente foi previamente seqüenciado. Todavia, para a maioria dos genes, não existe qualquer informação prévia que permita que a seqüência de DNA correta seja reconhecida. Sob tais circunstâncias, a localização de um gene pode ser difícil, mesmo que um mapa esteja disponível. A maioria dos mapas possui uma precisão limitada e é capaz apenas de delinear
266
T. A. Bnowlr
a posição aproximada de um gene, possivelmente deixando viírias dezenas ou mesmo centenas de quilobases por analisar para que o gene seja encontrado. Além disso, muitos genes não aparecem em mapas, pois a existência dos mesmos ainda não foi evidenciada. Como esses genes podem ser localizados em uma seqüência genômica?
Buscando fases abertas de leitura A seqüência de DNA de um gene é uma fase de leitura aberta (ORF, do inglês open reading frame), uma série de trincas de nucleotídeos, iniciando com um códon ds inicúção (g"d
mente, mas não sempre, um AUG) e terminado em um códon de terminação (TAA, TAG ou TGA, na maioria dos genomas). A análise de uma seqüência genômica em busca de ORFs" manualinente ou, mais comumente, com o auxílio de um computador, é, portanto, o primeiro passo pa-ra alocalização de um gene. É importante que a aniílise seja feita em todas as seis fases de leitura, pois os genes podem estar orientados em ambas as direções ao longo da hélice dupla de DNA (Figura l2.l4a). Em um genoma bacteriano, o resulrado típico deise tipo de análise é a identificação de longas oRFs, que quase certamente correspondem a genes, e de muitas ORFs mais curtas, parcial ou totalmente contidas nos genes, mas presentes em fases de leitura diferentes (Figura l2.l4b). Tais seqüências curtas quase certamente são combinações de nucleotídeos que formaram ORFs por acaso, mas não constituem genes. Se uma dessas ORFs curtas está inteiramente contida entre dois genes, existe a possibilidade de que ela seja erroneamente identificada como um gene real. Entretanto, na maioria dos genomas bacterianos, existe muito pouco espaço entre os genes, de modo que esse problema não é muito freqüente.
A localização
de genes em eucariotos é muito mais
difícil. Os genomas eucarióticos não existindo espaçadores muito mais longos entre os genes. Isso significa que a inspeção da seqüência revela muitas ORFs curtas que são tão densamente compactados como os bacterianos,
éxons e íntror
Diferencia Alguns genor to, o genoma molecular, pc
qüência disú gene. Mas ca sidade de mét
Para muit
neira útil de < aminoácidos, alanina, por t nomas, nem qüência. O h< tos códons: p vezes mais fr raros, então,
Essa busca, e
Figura 12.14
--ATT --TAT --TTA
tt 100 pb
ral2.l5),íd
interior de ínt
A identifi
5'_A TGACCAA TGACA TGCAA TAA _3' ìtttllttttttttltttttt 3'_T AC TGGT TAC TG TACGT TA T T _5'
+++
terminadas se
1
1 GAC--* 2 T GA -* 3 ATG ---*
o resultado típico
l
ria "questioná ria não corres No homer que muitos dr
apresentado de de ela con
(a) Cada seqüência de DNA possui seis Íases de leitura
(b)
não podem se de levedura,
4 5
6
de uma busca por oRFs em um genoma bacteriano
Genes
_-
ORFs espúrias
.Buscando fases de leitura abertas. (a) Cada seqüência de DNA possui seis Íases de leitura e qualquer uma delas pode conter um gene. (b) O resultado típico de uma busca por ORFs em um genoma bacteriano. As setas indicam as direções nas quais os genes e as ORFs espúrias estão orientados.
gênicas pres mente com g
todas as dem
Figura 12.11
As seqüênci vertebrados. cam as posir
Crorunoeu GÊNrcA
ou mesmo centedisso, muitos genes nfu iada. Como esses ge-
E ANÁLrsE oe
DNA
267
não podem ser descartadas, pois não se sobrepõem a qualquer gene real. A análise do genoma de levedura, por exemplo, identificou mais de 400 ORFs que foram colocadas nessa categoria "questionável". Possivelmente, algumas delas são genes reais, mas é provável que a maio-
ria não corresponda a seqüências codificadoras
',
do inglês open reading
de iniciação (g"dinação (TAA, TAG ou ica em busca de ORFs, ; é,
portanto, o primeiro
feita em todas as seis f+. s ao longo da hélitípico desse tipo dc a genes, e dc mas presentes em fases te são combina. m genes. Se uma despossibilidade de que el;r ioria dos genomas bacproblema não é muito
eucarióticos não muito mais lonmuìtas ORFs cwtas qw
Figura 12.14
hs I I
i
Buscando Íases de leitura abertas. (a) Cada se. qüência de DNA possui seis Íases de leitura e qualquer uma delas pode conter um gene. (b) O resultado típico de uma busca por ORFs em um genoma bacteriano. As setas indicam as direções nas quais os genes e as ORFs espúrias estão orientados.
No homem e em outros eucariotos, a busca de genes é ainda mais complicada pelo fato de que muitos deles são interrompidos, estando divididos em éxons e íntrons (Figura 11.1). Determinadas seqüências nucleotídicas sempre ocorrem nos limites entre éxons e íntrons (Figura 12.15), mas tais seqüências também são encontradas tanto no interior de éxons quanto no interior de íntrons. A definição de quais dessas seqüências marcam verdadeiros limites entre éxons e íntrons pode ser bastante difícil.
DiÍerenciando genes reais de ORFs casuais Alguns genomas apresentam indicadores bastante úteis da presença de um gene. Nesse aspecto, o genoma humano e os de outros vertebrados são particularmente acessíveis ao biólogo molecular, pois 50 a607o dos seus genes são acompanhados por uma ilha de CpG, uma seqüência distinta, rica em CG, cuja posição indica aproximadamente o local de início de um gene. Mas características como essa são mais exceção do que regra, o que determina a necessidade de métodos de uso mais geral para a identificação de genes. Para muitos genomas, o viés de códons (do inglês codon bias) constitui-se em uma maneira útil de conferir um certo grau de ceÍtezaà identificação de um possível gene. Todos os aminoácidos, exceto a metionina e o triptofano, são especificados por dois ou mais códons. A alanina, por exemplo, possui quatro códons - GCA, GCC, GCG e GCT. Na maioria dos genomas, nem todos os membros de uma família de códons são utilizados com a mesma fre-
qüência. O homem é típico em relação a esse aspecto, apresentando um viés distinto para certos códons: por exemplo, para a família de códons da alanina, o homem utiliza GCC quatro vezes mais freqüentemente do que GCG. Se uma ORF contém uma alta freqüência de códons raros, então, provavelmente, ela não corresponde a um gene. Considerando o viés de códons apresentado por uma ORF, pode então ser feita uma avaliação mais confiável da probabilidade de ela corresponder ou não a um gene. A identificação de um provável gene é em geral seguida por uma busca por homologia. Essa busca, executada por computador, compÍÌra a seqüência do gene com todas as seqüências gênicas presentes nas bases internacionais de dados de DNA. Tal comparação é feita não somente com genes conhecidos do organismo em estudo, mas também com todos os genes de todas as demais espécies disponíveis. Arazáo disso é que dois genes de diferentes organismos
íntron
Exon
Exon 3'
5
LI
/\
,t/
/\ AG{GTAAGT
LI \
PYPYPYPYPYPYNCAGü
Figura Í2.15 As seqüências de consenso para os limites éxon-íntron a montante e a jusante de íntrons de vertebrados. Py = nucleotídeo pirimidínico (C ou T), N = qualquer nucleotídeo. As setas indicam as posições dos limites.
268
T. A. Bnowlr
que possuem funções similares também apresentam seqüências similares, refletindo suas tórias evolutivas comuns (Figura 12.16). Para a execução de uma busca por homologia, a seqüência nucleotídica de um possível gone é geralmente traduzida em uma seqüência de aminoácidos, pois isso torna a busca rnaïs sensível. Isso ocorre porque existem 20 aminoácidos, mas apenas quatro nucleotídeos, o Tç determina que a chance de duas seqüências de aminoácidos parecerem similares por puro ÍErso é menor. A análise é executada através da Internet, a partir da conexão com a página (web site) lh um dos bancos de dados de DNA e da utilização de um programa de busca, como o BLAST (Basic ktcal Alignment SearchTool, ou ferramenta básica para a busca de alinhamento localilSe a seqüência-teste tiver uma extensão maior que 200 aminoácidos e uma identidade de ïIffi ou mais com uma seqüência no banco de dados (isto é, em 30 de 100 posições o mesmo aainoácido ocoffe em ambas as seqüências), então as duas são quasé com certeza homólogas ee ORF estudada pode ser confirmada como um gene real. Uma confirmação adicional, se mcessária, pode ser obtida com autllização de uma análise de transcrito (p.226), que permin demonstrar que o gene é transcrito em RNA.
12.2.2 Determinação da função de um gene desconhecido A
busca por homologia serve a dois propósitos. Além de testar a veracidade da identif,rca@ do provável gene, ela também fornece uma indicação a respeito da sua função, presumindose que a função do gene homólogo é conhecida. Quase 2.000 genes do genoma de levedurativeram suas funções estabelecidas desse modo. Muitas vezes, contudo, as homologias encontradas nas buscas são com outros genes cujas funções ainda não foram determinadas. Tais genes não-caracterizados são chamados de órfãos e a identificação de suas funções é um dm maiores desafios da ciência pós-genômica. Em anos futuros, provavelmente será possível utilizar a bioinformática para a obtenção de pelo menos uma indicação da função de um gene 6rfão. Jâ é possível utilizar-se a seqüêncie nucleotídica de um gene para prever as posições das hélices c e iolhas na proteína por ele B codificada, apesar da precisão limitada, e a informação estrutural resultante daí pode, às vezes, ser utilizada para inferências a respeito da função da proteína. Proteínas que se ligam a membranas podem freqüentemente ser identificadas por possuírem arranjos de hélices a quc atravessam a membrana, e motivos de ligação a DNA, como dedos de zinco, também podem ser reconhecidos. Uma abrangência e uma precisão maiores desse aspecto da bioinformáúca
AGGACCAGACCCATATAGGACC
Várias
í\ AGGGCCAGACCCATACAGGACC
\ AGGACCAGACTCATATAGGACC
Homologia entre duas seqüências que compartilham um ancestral comum. As duas se qüências adquiriram mutações durante suas histórias evolutivas, mas as similaridades entre suas seqüências indicam que elas são homólogas.
té<
das elas podt caute gênico são funciona
ção entre o g
resultar na sr tipo do orgar ção do gene.
-
mundongo-l
no estabeleci problemas. I qualquer efe fica que, apó teração fenor
12.3 Estudos
Até agora, c
de genes ind to de novos I
noma como
(1) Otrar (2)
teopa O prot quími<
Figura 12.16 Seqüência ancestrat
/\
Duas seqüências modernas
serão alcançz nas e as suÍÌs mente de exp
Figura 12.17 Nocaute gênico por recombinação entre uma cópia cromossômica de um geàe e uma versão deletada presente em um vetor de clonagem plasmidial.
Clonnceu GÊNrcA
Lares,
lúdica de um possível ge. 3 isso torna a busca mafu por puro Írc&.
h
a página (web site) lh bbusca, como o BLAST ba de alinhamento locall,
ï)fr
b posições o mesmo
ami-
h."tt"ru
homólogas ea
hmação adicional, se m. ftto (p.226), que permin I Ì
DNA
269
das elas podem ser aplicadas a órfãos. Uma estratégia não-descrita no Capítulo I I é a do nocaute gênico. Nessa técnica, uma versão deletada do gene é utilizada para "nocauteaÍ" a versão funcional presente nos cromossomos do organismo. Isso é possível porque a recombinação entre o gene deletado, presente em um vetor de clonagem, e a cópia cromossômica pode
latro nucleotídeos, o qtr
p uma identidade de
oe
serão alcançadas quando mais informações a respeito da relação entre a estrutura das proteínas e as suas funções forem obtidas. Até lá, a análise funcional de órftos depende principalmente de experimentos convencionais. Viárias técnicas pÍÌra o estudo das funções dos genes foram descritas no Capítulo 11 e to-
refletindo suas his-
h similares
E ANÁLrsE
.
.
resultar na substituição desta por aquela (Figura 12.17). O efeito do nocaute gênico no fenótipo do organismo é, então, analisado para a obtenção de alguma indicação a respeito da função do gene. O efeito de um nocaute de gene humano é inferido a partir do estudo de um camundongo-nocaute, portador da versão deletada do gene homólogo. Os nocautes auxiliaram no estabelecimento das funções de diversos genes, mas nem sempre tal abordagem é livre de problemas. Particularmente problemático é o fato de que alguns nocautes não apresentam qualquer efeito óbvio no fenótipo do organismo, ou porque o gene é dispensável, o que significa que, após a sua inativação, outros genes podem compensar a sua ausência, ou porque a alteração fenotípica é muito sutil para ser detectada.
lido facidade da identi fi cação pra função, presuminb b genoma de levedura tifo, as homologias encooh determinadas. Tais eeb suas funções é um dm
12.3 Estudos do transcritoma e do proteoma Até agora, consideramos aqueles aspectos da pesquisa pós-genômica que tratam de estudos de genes individuais. A mudança de ênfase de genes para genomas levou ao desenvolvimento de novos tipos de análise, os quais são direcionados para a compreensão da atividade do genoma como um todo. Esse trabalho levou à invenção de dois novos temos:
:
Láti"u p-u a obtenção de bI utilizar-se a seqüêncie F^ Ê nu proteína por eh $rltante daí pode, as re Proteínas que se ligam e lranjos de hélices a qu le zinco, também poden
(1) (2)
O transcritoma, que é o conteúdo de RNA mensageiro (nRNA) de uma célula e reflete o padrão geral de eípressão gênica daquela célula. O proteoma, que é o conteúdo de proteína de uma célula e reflete a sua capacidade bio-
química.
tpecto da bioinformátice !r
Gene completo ---
Figura 12.16 Homologia entre duas seqüências que compartilham um ancestral mum. As duas se qüências adquirÈ ram mutações rante suas historias evolutivas, mas as similarid+ des entre suas sÈ qüências indicam que elas são homólogas.
e
úr
--
DNA cromossômico
Gene deletado
I
Figura 12.17 Nocaute gênico por recombinação entre uma cópia cromossômica de um gene e uma versão deletada presente em um vetor de clonagem plasmidial.
DNA plasmidial \
Recombinação
I Nocaute gênico
27O
T. A. Bnowr.r
12.3.1 Estudando o transcritoma
do cancer<
As técnicas para o estudo do transcritoma foram inicialmente desenvolvidas como paÍte do projeto pós-genômico de levedura. Essencialmente, essas técnicas envolvem um tipo sofisticado de análise por hibridização. Todos os 6.000 genes de levedura foram obtidos como clones individuais e, a partir deles, produziram-se amostras que foram aplicadas sobre lâminas de vi dro, em arranjos de 80 x 80 pontos (cada ponto correspondendo à aplicação de uma amostra), o que é chamado de microarranjo. Para a determinação de quais genes estão ativos sob determinadas condições de cultivo, mRNA foi extraído das células e convertido em cDNA (p. 112), que, depois de marcado, foi hibridizado com os microarranjos (Figura 12.18). Foram utilizados márcadores fluorescentes, e a hibridi zação foi detectada pelo exame dos microarranjos por microscopia confocal. Os pontos que geraram um sinal indicaram os genes ativos sob as condições que estavam sendo estudadas. Alterações na expressão gênica quando a levedura era transferida para diferentes condições de cultivo (por exemplo, depleção de oxigênio) puderam ser monitoradas a partir da repetição do experimento com uma segunda preparação de cDNA. Os microarranjos estão agora sendo utilizados para a monitoração de alterações nos transcritomas de muitos organismos. Em alguns casos, a estratégia é a mesma utilizada para a levedura, com o microarranjo representando todos os genes do genoma. Mas isso é possível somente para aqueles organismos que possuem relativamente poucos genes. Um microarranjo de todos os genes humanos poderia ser executado utilizando-se apenas l0 lâminas de vidro de 18 x I 8 mm, mas a preparação dos clones para cada um dos 30.000 a 40.000 genes humanos seria uma tarefa gigantesca. Felizmente, isso não é necessário. Por exemplo, para estudar as alterações no transcritoma decorrentes de um câncer, poderia ser preparado um microarranjo com uma biblioteca de cDNA de tecido normal. A hibridização com cDNA marcado do teci-
ao estado
r
Uma a lício capa sintetizadr
I milhão 1 cional. A I mo os olil especiais,
jas seqüên
12.3.2 Estudat
O proteon
informaçõ pois um ú teína, devi
lipeptídeo pos quími forilação, nas. Para
er
separado canaleta d culares. O dessa vez
I
sional de
Microarranjo
/rtoriai. (
çao.o. \ cDNA
amostras de
Hibridização detectada por microscopia confocal
\
Figura 12.18 Análise por microarranjo. O microarranjo mostrado aquiÍoi hibridizado com duas preparações de cDNA dF Íerentes, cada uma delas marcada com um marcador Íluoreg cente. Os clones que hibridizam com os cDNAs são identificados por microscopia conÍocal.
Fl(
Um chipde DNA. Uì
conteria um núr maior de oligonucle que aqueles mostra cada oligonucleotíd a 30 nucleotídeos de
Ct-oruncev GÊNrcA E ANÁLrsE oe
ô
penvolvidas como parte pvolvem um tipo sofisti* foram obtidos como clom ifuadas sobre lâminas de vt [rplicaçao de uma amostnfu pnes estão ativos sob deE-
i"e.tiao em cDNA (p.
172fr.
iura l2.l 8). Foram uriliz* lrame
pu
dos microarranjos
ios genes ativos sob as oÍF
lica quando a levedura cnr pao Oe oxigênio) puderur pda preparação de cDli.L po de alterações nos trrc
DNA
271
do canceroso então revelaria quais genes têm a transcrição estimulada ou inibida em resposta ao estado canceroso. Uma alternativa para os microarranjos são os chips de DNA, isto é, pastilhas finas de silício capazes de carregar muitos oligonucleotídeos diferentes (Figura 12.19), os quais são sintetizados diretamente na superfície do chip e podem ser preparados em uma densidade de I milhão por cm', substancialmente maior do que a possível com um microarranjo convencional. A hibridização entre um oligonucleotídeo e a sonda é detectada eletronicamente. Como os oligonucleotídeos são sintetizados de novo, utilizando procedimentos automatizados especiais, é relativamente simples a preparação deum chip portador de oligonucleotídeos cujas seqüências são específicas para cada gene humano.
12.3.2 Estudando o proteoma
pas 10lâminas
O proteoma é a coleção completa de proteínas de uma célula. Estudos proteômicos fornecem informações adicionais que não podem ser obtidas simplesmente pelo exame do transcritoma, pois um único mRNA (e, conseqüentemente, um gene) pode dar origem a mais de uma proteína, devido ao processamento pós-tradução (Figura 12.20). Em eucariotos, a maioria dos polipeptídeos que são sintetizados por tradução é adicionalmente processada pela adição de grupos químicos. As adições específicas feitas determinam a função precisa da proteína. A fosforilação, por exemplo, é uma modificação importante, utilizada para ativar algumas proteí-
p a 40.000
nas.
[mesma utilizada para a Mas isso é possível
ina.
b"
n.
!s genes. Um microarranfu de ü genes hur
f exemplo, para estudrr |reparado um microarrmi h
cDNA marcado do
tqi
È
Para estudar o proteoma, todo o conteúdo protéico de uma célula ou tecido é inicialmente separado por eletroforese bidimensional. Nessa técnica, as proteínas são aplicadas em uma canaleta de um gel de poliacrilamida quadrado e separadas de acordo com seus pesos moleculares. O gel quadrado é então girado em 90o e uma segunda eletroforese é levada a efeito, dessa vez separando as proteínas com base em suas cargas. O resultado é um padrão bidimensional de manchas de diferentes tamanhos, formas e intensidades, cada uma delas represen-
Figura 12.18 Análise por miC G
croarranjo. O n*.
croarranjo mctrado aqui Írci bridizado com duas prepanações de cDNA Íerentes, cada uma delas nrarcada com um marcador
t*
Cente. Os
Clorn
que hibridizam com os cDNÂs são identificadc por microscoçia conÍocal.
C G
c c
A
A
c G
T T
A
A
CTA CTC CAG GCA AGA TGA
,
Oligonucleotídeos
T T
T
Figura 12.19 Um chipde DNA. Um chipreal conteria um número muito maior de oligonucleotídeos do que aqueles mostrados aqui e cada oligonucleotídeo teria 20 a 30 nucleotídeos de extensão.
A
+
Pastilha de silício
272
T. A. Bnowlr
tando uma diferente proteína ou grupo de proteínas relacionadas (Figura lL.2la).As diferenças entre dois proteomas são aparentes a partir de diferenças no padrão de manchas quando os dois géis são comparados. Para a identificação da proteína em uma determinada mancha, uma amostra da mesma é purificada a partir do gel e tratada com uma protease que cliva o po lipeptídeo em uma seqüência de aminoácidos específica (de uma maneira similar à atividade de uma endonuclease de restrição). Os peptídeos resultantes são então examinados por espectrometria de massa (Figura 12.21b). O espectrômetro de massa determina a composição de aminoácidos {e cada pepídeo. Essa informação é geralmente suficiente para permitir que o gene que codifica a proteína seja identificado a partir da seqüência genômica.
Um gene
ïranscrição
-
Um mRNA
Tradução
Figura 12.20
a+
Novos grupos químicos adicionados por processamento pós{radução
Um gene individual pode dar origem a duas proteÊ nas, cada uma com uma Íunção distinta, se o produto inicial de tradução puder ser modificado de duas maneiras diferentes por processamento pós-tradução.
Figura122
Análise prol (b) ldentifrc se seguido
CLoNAGEM GÊNtcA E ANÁLlsE DE
l2.2la).As
difer*
de manchas quando uma determinada mancht, protease que cliva o po ira similar à ativida& examinados por espscina a composição & para permitir qrc o
DNA 273
(a) EletroÍorese bidimensional das proteínas
Amostra de proteínas
l"
ru______]ru__-__l|___--:r-___--
l, Ë-l
;)tl= ltl
Gel de poliacrilamida
l:1",',,
I
1. Separaçáo de acordo com o tamanho 2. Rotação do gel 3. Separação de acordo com a carga
(b) ldentiÍicação de uma Proteína
PuriÍicação da proteína,
tratamento com Protease, exame por espectrometria de massa
\ I
I
I coMPosrçoES
oos pepríoeos Comparação dos peptídeos com as seqüências de genes
ldentif icação da proteína
gene individual pode origem a duas proteÊ cada uma com ume distinta, se o produ inicial de tradução puder modiÍicado de duas ne diÍerentes por pro
pós-tradu@.
Figura12.21
nútise proteômica. (a) Eletroforese bidimensionaldas proteínas em gel de poliacrilamida.
(b) ldeniiÍicação da proteína contida em uma mancha individual por tratamento com protease seguido por espectrometria de massa dos peptídeos resultantes.
PARTE 3 melanogaster. das técnicas para
publicada, em língur
,282,744-6. ofgene expressia ios no estudo de-um
263-70. [Descreve a
finções para
os genes-l
APLTCAçOES DA CLONAGEM GÊNICA E DA ANALISE DE DNA NA BIOTECNOLOGIA
and assemblyd um genoma bacteriam 1
of DNA microarrays
il
,t
of the human
t
Cnpírulo 13 Produção de Proteínas a Partir de Genes Clonados
Vetores especiais para a expressão de genes exógenos em E. coli,2'79
Produção de proteínas recombinantes por células eucarióticas. 29 I
Problemas gerais para a produção de proteínas recombinantes em E. coli-288
Agora que foram cobertas as técnicas básicas envolvidas na clonagem gênica e na análise de DNA e examinada a maneira como essas técnicas são utilizadas na pesquisa científica, pode-se seguir adiante e considerar como a tecnologia de DNA recombinante está sendo aplicada na biotecnologia. Esse não é um assunto novo, embora a biotecnologia venha recebendo muito mais atenção agora do que no passado. A biotecnologia pode ser definida como o uso de processos biológicos na indústria e na tecnologia. De acordo com os arqueologistas, a indústria biotecnológica britânica data de 4.000 anos, no final do período neolítico, quando os processos fermentativos que fazem uso de células vivas de levedura para a produção de cerveja e hidromel foram inicialmente introduzidos no Reino Unido. Com certeza, a fabricação de bebidas fermentadas, como a cerveja, já estava bem-estabelecida quando da invasão da Grã-Bretanha pelos romanos. Durante o século XX, a biotecnologia expandiu-se com o desenvolvimento de diversos usos industriais para os microrganismos. A descoberta por Alexander Fleming, em 1929, de que o fungo Penicillium sintetiza um potente agente antibacteriano levou à utilização em grande escala de fungos e bactérias para a produção de antibióticos. Inicialmente, os microrganismos eram multiplicados em grandes recipientes de cultura, a partir dos quais os antibióticos eram purificados depois da remoção das células (Figura 13.1a). Mais recentemente, contudo, esse método de cultivo estanque (batch culture) foi amplamente suplantado por técnicas de cultivo contínuo, que fazem uso de um fermentador. A partir do cultivo em fermentador, amostras do meio podem ser continuamente removidas, suprindo ininterruptamente a demanda pelo produto (Figura 13.1b). Esse tipo de processo não está limitado à produção de antibióticos, tendo sido também utilizado para a obtenção de grandes quantidades de outros compostos produzidos por microrganismos (Tabela 13.1). Uma das razões pelas quais a biotecnologia vem recebendo tanta atenção desde a última década é a clonagem gênica. Embora muitos produtos úteis possam ser obtidos de cul-
278
T. A. Bnowr.r
turas microt
(a) Gultivo estanque (batch culturel
mente sinter produzidos
I
dos dessa m CentriÍugação
-= L-..,
|--- --)-lI l- _--- _-l_t
í4Recipiente de cultura fechado
\\
capacidade, um animal c tor de clona
Preparação do produto a partir: do meio ou das células
executadas
,
bacteriana. l É claro c mo pode pa mento satisl tulo, tratare minaremos
Sedimento de células
(b) Cutivo contínuo
Entradade + meio Íresco
Saída de meio + células I
-il
--
il _ tt il --lJt
I
i Preparação do produto
Tabela 13.1 Alguns dos compostos produzidos
a
Figura Í3.1
13.1 Vetores exógen(
Dois diÍerentes sis-
temas para a multi-
Se um gene
plicação de microrganismos: (a) cultivo estanque e (b) cultivo contínuo.
clonado em
partir do cultivo de nucrorgamsmos
em escala indrstrial
Composto
Microrganismo
Antibióticos Penicilinas
Penicillium spp.
Cefalosporinas
Cephalosporium spp.
Gramicidinas, polimixinas Cloranfenicol, estreptomicina
Bacillus spp. streptomyces spp.
Enzimas Invertase
Bacillus
Álcool
S. cerevisiae, Saccharomyce s carlsbergensis S. cerevisiae S. cerevisiae, bactérias acéticas
Glicerol Vinagre Dextran Ácido butírico Acetona, butanol Ácido cítrico
;. F
F
Saccharomyc e s c e rev isiae ssp., Aspergillus spp.
Proteases, amilases
Leuconostoc spp. Bactérias produtoras de ácido butírico Clostridium spp.
Aspergillus niger
Figura 13.2 Um possível esquema para a produção de uma protêína animal em uma bactéria. mRNA = RNA mensageiro.
Cloruneeu GÊrurcn e ANÁLrsE oe
DNA
279
turas microbianas, a lista dos mesmos limitava-se, no passado, àqueles compostos natural-
mente sintetizados por microrganismos. Muitos medicamentos importantes que não são produzidos por micróbios, mas sim por organismos mais complexos, não podiam ser obtidos dessa maneira. Isso mudou a pafrir da aplicação da clonagem gênica à biotecnologia. A capacidade de clonar genes implica que um gene que codifica uma proteína importante de um animal ou planta pode agora ser retirado de seu hospedeiro normal, inserido em um vetor de clonagem e introduzido em uma bactéria (Figura 13.2). Se as manipulações forem executadas corretamente, o gene será expressado e a proteína será sintetizada pela célula bacteriana. Pode, então, ser possível a obtenção de grandes quantidades da proteína. É claro que, na prática, a produção de uma proteína recombinante não é tão simples como pode parecer à primeira vista. Tipos especiais de vetores são necessários e um rendimento satisfatório da produção da proteína é muitas vezes difícil de ser obtido. Neste capítulo, trataremos dos vetores de clonagem para a síntese de proteínas recombinantes e examinaremos alguns dos problemas associados ao uso dos mesmos.
Figura 13.1
13.1 Vetores espec:ais para a expressão de genes exógenos em E. coli
Dois diÍerentes sis-
temas para a multF plicação de micror-
Se um gene exógeno (isto é, não-bacteriano) for simplesmente ligado a um vetor comum e clonado em E. coli, é bastante improvável que uma quantidade significativa da proteína re-
ganismos: (a) cultF vo estanque e (b) cultivo contínuo. Célula animal
de microrganismos
a9\ Vetor portador do gene animal
spp
yces carlsbergensis
[de aciao burírico I
I t
Figura 13.2 Um possível esquema para a produção de uma proteína animal em uma bactéria. mRNA = RNA mensageiro.
@ mRNA
Proteína animal
Bactéria modificada por engenharia genética sintetizando a proteína animal
280
T. A. Bnowlr
combinante venha a ser sintetizada. Isso ocoÍre porque a expressão do gene depende de ele estar cercado por uma coleção de sinais que podem ser reconhecidos pela bactéria. Esses sinais, que são seqüências curtas de nucleotídeos, informam da presença do gene e fornecem instruções para os aparatos de transcrição e tradução da célula. Os três sinais mais importantes para genes de E. coli são os seguintes (Figura 13.3):
(1)
O promotor, que marca o ponto no qual a transcrição do gene deve iniciar. Em E. co' /i, o promotor é reconhecido pela subunidade o da enzima RNA-polimerase, respont sável pela transcrição. O terminador, que marca o ponto no final do gene onde a transcrição deve parar. Um terminador é geralmente uma seqüência nucleotídic a capaz de parear com ela mesma' formando uma estrutura de alça com haste (stem loop)' O sítio de ligação do ribossomo, uma seqüência nucleotídica curta reconhecida pelo ribossomo como o ponto no qual ele deve ligar-se à molécula de RNA mensageiro (pRNA). O códon de iniciação do gene está sempre uns poucos nucleotídeos a jusan-
(2) (3)
Existem ser paz de liga simplesmer Uma sol do a colocá possível, o
suprem a fa
combinantt
13.1.1 O prom<
O promoto controla o
;
se ao DNA de de prote
ponibilizad
te desse sítio. Os genes de organismos superiores também estão cercados por sinais de expressão, mas as suas seqüências nucleotídicas não são as mesmas das versões de E. coli' Esse aspecto é
ilustrado pela comparação entre promotores de E. coli e de genes humanos (Figura 13'4)'
PÍomotor
Sítio de ligação do
ribossomo rtt'-' llGene+ .
,
Terminador
_--t_t--DNA
Òt
TranscÍito de RNA
\
Figura 13.3 Os três sinais mais importantes para a expressão gênica em E. coli.
Ponto no qual o ribossomo liga-se ao mRNA
(a) E. coli
TTGACA box-35
TATMT
+
cene
box-10
(b) Animais vários
Figura 13.4
sinais
TATAAAT box
-25
+
Gene
Seqüências promotoÍas típicas de genes de E. coli e de células animais.
$'
Figura 13.5 A utilização de um vetor de expressão para a produção de uma proteína a Partir de um gene exG geno em E. coli-
Crorurceu GÊrutcn e ANÁLlsE oe
gene depende de ele [a bactéria. Esses sildo gene e fornecem h sinais mais imPor-
rye iniciar. Em E' co-
r-polimerase, respon"
rição deve Parar. Um rear com ela mesmÀ I
nrta reconhecida Pelo
.de RNA mensageim nucleotídeos a jusan'
DNA
281
caExistem semelhanças, mas seria improvável que uma RNA-polimerase de E' coli fosse coli E' em inativo permanece gene exógeno paz de ligar-se a um promotor humano. Um iimplesmente porque a bactéria não reconhece os seus sinais de expressão.
problema seria a inserção do gene exógeno em um vetor de mode um conjunto de sinais de expressão de E. coli. Se isso for do a colocá-lo que possível, o gene deverá ser transcrito e traduzido (Figura 13.5). Veículos de clonagem reproteínas de produção na usados podem ser ,upr"- a falta desses sinais e que, por isso, combinantes são chamados de vetores de expressão'
úma solução pàru
"rr" sob o controle
13.1.1 O promotor é o componente crítico de um vetor de expressão porque ele O promotor é o componente mais importante de um vetor de expressão' Isso RNA-polimeraenzima uma (a de ligação da expressão gênica controla o primeiro "itagio Portanto, a quantidase ao DNA) e determina a freqüência na qual o mRNA é sintetizado.
do promotor disde de proteína recombinante obtida depende em grande parte da rraívreza
ponibilizado pelo vetor de expressão'
de expressão, mali E coti. Esse asPecto é
pis
tmanos (Figura 13.4f' Vetor de expressão
P = Promotor R = Síiio de ligação do ribossomo T = Terminador
Sinais de expressão de E. coli:
Sítio de restrição único
lnserção de um gene exógeno no sítio de restrição único
I Fis mais importantes ressão gênica em
_-
\
Gene exógeno
,r"n.rort"
çâode E. coti
\ Figura 13.5 A utilização de um
Figura 13.4 Seqüências Promotorõ lípicas de genes de .E.colie de células 'animais.
vetor de expressão para a produção de uma proteína a Partir de um gene exógeno em E. coli.
O gene exógeno é expressado
em E. coli
l
t'
282
T.A.Bnowr
O promotor deve ser escolhido com muito cuidado As duas seqüências mostradas na Figura 13.4a são seqüências consensuais, médias de todas as seqüências de promotores de E. coli conhecidas. Embora a maioria dos promotores de E. coli não difira muito dessas seqüências consensuais (por exemplo, TTTACA ao invés de TTGACA), qualquer pequena variação pode ter um efeito importante na eficiência com a qual o promotor é capaz de dirigir a transcrição. Promotores fortes são aqueles capÍìzes de sustentar uma taxa elevada de transcrição; promotores fortes geralmente controlam genes cujos produtos de tradução são necessários em grandes quantidades na célula (Figura 13.6a). Promotores fracos, ao contrário, são relativamente ineficientes e dirigem u tr-rcrição de genes cujos produtos são necessários apenas em pequenas quantidãdes (Figura 13.6b). Fica claro que um vetor de expressão deve ser portador de um promotor forte, para que o gene clonado possa ser transcrito com a maior freqüência possível. Um segundo fator a ser considerado na construção de um vetor de clonagem é a possibilidade de regular o promotor de alguma maneira. Dois tipos principais de rãgulação gênica são reconhecidos em E. coli - indução e repressão. Um gene induzível é aquele cuja transcrição é ativada pela adição de um composto químico ao meio de cultura; muitas vLzes, esse composto químico é um dos substratos da enzima codificada pelo gene induzível (Figura 13.7a). Um gene reprimível, ao contriírio, é inativado pela adição de um composto químico regulador (Figura 13.7b). A regulação gênica é um processo complexo, que envolve o promotor apenas indiretamente. Contudo, muitas das seqüências importantes para a indução ou a repressão estão em regiões adjacentes ao promotor e, portanto, também estão presentes em um vetor de expressão. E, por isso, possível estender a regulação ao vetor de expressão, de modo qo" o
"o--
(a) Um promotor Íorte
Figura
posto
bém
-'
,..-F- :._ Transcrição /
|
_.\
\
-ra /J
binantr
_,-
Numerosos
--1'
Promotor Íraco
Tradução
transcritos
Íraco
^*\ /
,
.-- -r .t1 -rn/.nn/t'-_=-
Promotor Íorte (b) um promotor
4
dosamr seguidr
,,,?
rf3 gs
gene cl te não
r
te alto eventü
Numerosas
Transcrição
-=--
Exem
:i!ïï:ï" / í
Viírios
deder
..
-) J .-ã r -/ Tradução çí Retativamenre poucos transcritos Número u",Sno o" moléculas de proteína
L
tados
a
(1)
c
q
Figura 13.6
v
Promotores fortes
lz
e fracos.
Íi-
q
ca
impoú
Gene
-
1
Exemplos dos c maiores tipos de gulação gênica < ocorrem em ba< ria: (a) um gene duzível, e (b) um ne reprimÍ
Cloucer',1 GÊNtcA
, médias de
to-
E ANÁLlsE
oe
DNA
283
(a) Um gene induzível
ioria dos promotores TTTACA ao invés
Composto químico regulador.'
Gene normalmente inativo
na eficiência com são aqueles capazes mente controlam ge-
/|/
tesedirigematrans-
...ativa o gene
Gene
Promotor
na célula (Figura
A
X
Sem transcrição
I
I
-\-/"=\--#
Transcritos
7-
quantidades (Figura um promotor forte, para vel.
(b) Um gene rePrimível
declonageméapossiis de regulação gêniinduzível é aquele cuja de cultura; muitas vepelo gene induzível adição de um composto apenas indiretaou a repressão estão em em um vetor de expres-
de modo que o com-
Composto químico regulador...
Figura 13.7 Exemplos dos dois maiores tipos de regulação gênica que ocorrem em bactéria: (a) um gene induzível, e (b) um gene rePrimível.
Gene normalmente ativo I I
I 4-...*_ # #
...inativa o gene
i X
promotor é tamposto químico que induz ou reprime o gene normalmente controlado pelo uma vantagem pode representar Isso gene clonado. do bém câpaz de rãgular a expressão recomproteína se a Por exemplo, recombinantes. proteínas importante para a produçãó de cuidapode ser síntese sua a a bactéria, sobre danoso binante a seì produzida iem urnefeito conpode ser isso tóxicos: níveis até acumulaçáo sua a dosamente mãnitorada para impedir do expressão a para controlar regulador químico seguido pelo uso criterioso do composto recombinanproteína que a mesmo é desejável gene ólonado geïe ctonaao. A regulação do ie não seja prejudiõial para a célula hospedeira, pois um nível de transcrição continuamenà sua te alto póde atetar a capacidade de replicação do plasmídeo recombinante, levando eventual perda na cultura.
Exemplos de promotores utilizados em vetores de expressão facilidaVários promotores de E. coli combinam as características desejadas de força e de são lisde expressão vetores em utilizados freqüentemente mais Aqueles de de rãgulação. tados a seguir:
(1) Figura 13.6 Promotores fortes e Íracos.
È
!
È
G
g.
Ì
E
ê
gete lacZ, O promotor tac (Figura 13.8a) é a seqüência que controla a transcrição do nos ptesenÍe gênico lacz' (e fragmento , a do também qu; codifica a B-galactosidase por isopropiltiogainduzido é promotor lac O vetores pUC e tvtt:mp; p. 119 e 122). de lactosídão (IPTG, p 105), de modo que a adição desse composto químico ao meio
284
T.A.BRowN
cultura ativa a transcrição de um gene inserido um vetor de expressão. (2)
o promotor trp (Figura
a
jusante do promotor /ac presente em
13.8b) está normalmente a montante do agrupamento de ge-
nes que codificam viírias das enzimas envolvidas na biossíntese do arninoácido tripìo-
(3) (4)
fano. o promotor trp érep/.mido pelo triptofano, mas é mais facilmente induzido pe_ lo ácido 3-B-indolacrflico. o promotor tac (Figwa 13.8c) é um híbrido entre os promotores trp e lac.Ele é mais forte do que qualquer um deles, mas ainda é induzívei por IpTG. o promotor l,P" (Figura 13.sd) é um dos promotores responsáveis pera transcrição da molécula de DNA de 1,. o promotor l.p, é muito forte eiambém é ieconhecido pe_ la RNA-polimerase de E. coli, que é levadã por À a transcrever o DNA do bacteriófa_ go. o promotor é reprimido pelo produto do gene l,cl. vetores de expressão portadores do promotor l,P. são utilizados em uma linhagem de E. coli hospedeira que sinte_ tiza numa forma termossensível da proteína cI (p. 56). A uma baixaiemperatura (me_ nor que 30"c), essa proteína mutante é capazde reprimir o promotor l,pr; em temperaturas elevadas, a proteína é inativada, resultando na transc;ição do gene clonado.
13.1.2 Cassetr Um vetor
r
bém uma
s
maioria dc o gene ex( to de sinair tanto, na p Em alg sítio de lig gene de
E
executada
com o seg produto dr deo curto, proteína e;
(1)
Atra
nÍìs c
cia n
estru rir ni lidad
(a) O promotor lac IPTG
(b)
-35
-10
o promotor
trp
(2) Transcrição
-ll
Ácido
3-B-indolacrílico
trpA
#--
\
râme
A pr
molé não hosp O sq
1
Trlptofano
\ rranscnçao
(3) Semtranscrição
da pr
rivad (c) O pÍomotoÍ tac
-35
Transcrição
-10
(d) PromotoÌ ÀPL
-10
NCS ú
IPTG
-ll
rr
'
3o"c
- s",
transcriçãol
> 3o.c
Transcrição
Figura 13.! Um vetor de cassete
típicoeamaneiraco mo ele é utilizado
Figura 13.8 Quatro promotores utilizados Íreqüentemente em vetores de expressão. os promotores /ac e Írp são apresentados a montante dos genes que eles normalmente controlam em E. coli.
P-promotor,R=sí. tio de ligação do ri bossomo, T = termi
nador
Ct-orunceu GÊrurca e ANÁLrsE oe
lromotor /ac presente em P do agrupamento de geixe do aminoácido triptop facilmente induzido pe|rlÍes trp e lac.Eleé mai$
mG. onsavers pela transcnçãD mUem é reconhecido peter o DNA do bacteriófa-. ;es de expressão portade pali hospedeira que sinte-
pbaixa temperatura (mpromotor l"Pr; em tempcpição do gene clonado-
DNA
285
13.1.2 Cassetes e Íusões gênicas Um vetor de expressão eficiente não requer apenas um promotor foÍe
e regulável, mas também uma seqüência de ligação do ribossomo e um terminador reconhecíveis por E. coli.Na maioria dos vetores, esses sinais de expressão formam um cassete, assim chamado porque o gene exógeno é inserido em um sítio de restrição único presente no meio do agrupamento de sinais de expressão (Figura 13.9). A ligação do gene exógeno ao cassete o coloca, portanto, na posição ideal em relação aos sinais de expressão. Em alguns vetores de cassete, o sítio de clonagem não está imediatamente adjacente ao sítio de ligação do ribossomo, sendo, ao invés disso, precedido pelo segmento inicial de um gene de E. coli (Figura 13.10).A inserção do gene exógeno nesse sítio de restrição deve ser executada de modo a fundir as duas fases de leitura, produzindo um gene híbrido que inicia com o segmento de E. coli e progride sem interrupção até os códons do gene exógeno. O produto da expressão do gene é, portanto, uma proteína híbrida, que consiste em um peptídeo curto, codificado pela fase de leitura de E. coli, fusionado à porção aminoterminal da proteína exógena. Esse sistema de fusão possui quatro vantagens:
(1)
A tradução eficiente do mRNA produzido
a
partir do gene clonado não depende ape-
nas da presença do sítio de ligação do ribossomo, sendo também afetada pela seqüên-
(2\
(3)
cia nucleotídica no início da região codificadora. Isso provavelmente ocorre porque estruturas secundárias resultantes de pareamentos de bases intracadeia podem interferir na interação do ribossomo com o seu sítio de ligação (Figura I 3. I 1). Essa possibilidade pode ser descartada se a região pertinente for constituída por seqüências inteiramente naturais de E. coli. A presença do peptídeo bacteriano no início da proteína de fusão pode estabilizar a molécula e impedir a sua degradação pela célula hospedeira. Proteínas exógenas que não possuem o segmento bacteriano, ao contrário, são muitas vezes destruídas pela hospedeira. O segmento bacteriano pode ser um peptídeo-sinal, responsável pelo direcionamento da proteína de E. coli para a sua posição correta na célula. Se o peptídeo-sinal for derivado de uma proteína que é exportada pela célula (por exemplo, os produtos dos genes ompA e malU), a própria proteína recombinante poderá ser exportada. Essa expor-
Gene exógeno inserido no cassete
- > 30"c rl
Figura 13.9 Um vetor de cassete
FcÍição
típicoeamaneiracomo ele é utilizado.
Sn" "'oo"nornfl \
_(
P-promotor,R=sí-
bo
rsão. Os promotores pcontrolam em E. coli.
tio de ligação do ribossomo, T = terminador.
) \__,/
286
T.A.Bnown
ta ÍtI
lnício de um gene de E. coll
PFì
\
\
o
(4) o
Sítio de restrição único
L'J
ni
T
vl
s(
Ad
segmetr portantr
lnserção de um gene exógeno
lo trata
Gene exógeno
polipep exempl bromet (FiguÍa
PR
em sítir
\ Fusão correta
tue).
É
clivage
......GGA GCT ATA TT4...... E.
coli
O gene exógeno será traduzido
Fusão incorreta
......GGA GCATA TT4..,...
Segmento
O gene exógeno não
de E. coli
,;ï""0"'0" Extremidade C
Figura 13.10 A construção de um
genehíbridoeasíntese de uma proteína de Íusão.
Pareamento de bases
Figura 13.í1 O sítio de ligação do ribossomo fica encoberto
Um problema causado pela Íormação de estrutura secundária no início de um mRNA.
Figura 13.12 A utilização de cromatograÍia de aÍinidade para purificar uma proteína de Íusão com a glutationa-S-transferase.
F
r
{ É
f
Ê
F
lo
E
Ë
Cr-orueeeu GÊNtcA
(4)
E ANÁLtsE
oe
DNA
287
tação poderá ser para o meio de cultura ou para o espaço periplásmico, que fica entre as membranas interna e externa da célula. A exportação é desejável porque simplifica o problema da purificação da proteína recombinante a partir da cultura. O segmento bacteriano também pode auxiliar na purificação, permitindo que a proteína de fusão seja recuperada por cromatografia de afinidade. Por exemplo, fusões en-
volvendo a proteína glutationa-S-transferase de E. coli podem ser purificadas por adsorção a partículas de agarose com glutationa ligada a sua superfície (Figura 13.12).
A desvantagem dos sistemas de fusão decorre das possíveis alterações que a presença do segmento de E. colipode causar nas propriedades da proteína recombinante. São necessiírios, portanto, métodos para a remoção do segmento bacteriano. Geralmente isso é conseguido pelo tratamento da proteína de fusão com um composto químico ou enzima que cliva a cadeia polipeptídica na junção entre os seus dois componentes ou em um sítio próximo a ela. Por exemplo, se uma metionina está presente na junção, a proteína de fusão pode ser clivada com brometo de cianogênio, que cliva polipeptídeos especificamente em resíduos de metionina (Figura 13.13). Alternativamente, podem ser utilizadas enzimas como a trombina (que cliva em sítios adjacentes a resíduos de arginina) ou o fator Xa (que cliva após a arginina de GlyArg). É importante considerar-se sempre que as seqüências de reconhecimentó do agente áe clivagem não devem ocoÍrer no interior da proteína recombinante.
Adição da proteína de fusão com glutationa- S-transÍerase
lura 13.10
pnstrução de um
Matriz de glutationa-
frefrfOriOoeasínte f
ebsee_99f glutationa
agarose
de uma proteína de
po.
Proteína de
Figura 13.12
lura
13.11
lr problema causado fa Íormação de es-
iura secundária no
bo
$-
de um mRNA.
A utilização de cromatografia de afinidade para purificar uma proteína de Íusão com a glutationa-S-transÍerase.
Partícula de
agarose da matriz
fusão pura
r
'";.: ---------
Proteína de fusão ligada à glutationa pelo seu componente de glutationa- S{ransferase Moléculas de glutationa ligadas à superfície da partícula
288
T.A.BRowN
(2)
Ost coli
fa nl
Pept ídeo de E. coli
são
Proteína animal ou vegetal
I \
Tratamento com brometo de cianogênio
\
Figura 13.13
\ ,,
/t
Clivagem esPecif icamente no resíduo de metionina
Um dos métodos Para a recuperação de um Polipeptídeo exógeno a partir de uma Proteína de fusão. O resíduo de metionina na junção dos dois componentes da fusão deve ser o único presente em todo o polipeptídeo: se outros estiverem presentes, o brometo de cianogênio clivará a proteína de Íusão em mais de dois Íragmentos.
19.2 Problemas gerais para a produção de proteínas recombinantes em E. coli Apesar do desenvolvimento de vetores de expressão sofisticados, existem numerosas dificuldades associadas à produção de proteínas a partir de genes exógenos clonados em E- colj. Esses problemas podem ser agrupados em duas categorias: aqueles devidos à seqüência do gene ãxógeno, e aqueles devidos às limitações de E. coli como hospedeira para a síntese de proteínas recombinantes.
19.2.1 Problemas resultantes da seqüência do gene exógeno Existem três maneiras pelas quais a seqüência nucleotídica pode impedir a expressão eficiente de um gene exógeno emE' coli:
(1)
O gene exógeno pode conter íntrons. Esse seria um problema importante, pois genes de E. coli não possuem íntrons e, portanto, a bactéria não possui a maquinaria necessária para a remoção dos mesmos dos transcritos (Figura 13'14a)'
Figura 13 Três dos problen
que podem ser, contrados quando nes exógenos são pressados em E r (a) lntrons não t removidos em E r (b) Terminação I matura da trans ção. (c) Um proble de viés de codc
Clonnceu GÊrurcn e ANÁLtsE oe
(2)
DNA
289
O gene exógeno pode conter seqüências que atuam como sinais de terminação em E coli (Figuta 13.14b). Essas seqüências são perfeitamente inócuas na célula hospedeira normal, mas, na bactéria, resultam em terminação prematura e na perda da expressão gênica.
I
(al E. coli não é capaz de remover íntÍons
a
I
íntron
/
Í I
pra
13.13
I I
n dos métodos para a
I
-r--------
pperação de um po futioeo exógeno a
Transcrição
-
de uma proteína lfusão. O resíduo de
$r
íntron presente no mBNA
\\
rradução
iÉionina na junção
b dois componentes !fusão deve ser o únF lpresente em todo o heptídeo: se outros lnerem presentes, o [neto de cianogênio Lará a proteína de Íub em mais de dois
\
\
fà
/- f \
\
Um polipeptídeo incorreto é sintetizado
\ (b)Terminação prematura da transcrição
PR
l\l.
l
gmentos.
Seqüência semelhante a um terminador de E. coli no interior do gene exógeno
r
Somente parte do gene é transcrita
i: t
t-
Hnas
(c) Viés de
códons
i
Gene humano ì
ccA ccT ccA
I
kem numerosas difiLsclonados emE.coidevidos à seqüência
pedeira para
a sínte-
igeno I
[ndir a expressão efilportante, pors genqs
ia maquinariâ necesD.
CCC
A maioria dos códons de prolina é CCA, CCT ou CCC
Figura 13.14 Três dos problemas
que podem ser encontrados quando genes exógenos são expressados em E. coli. (a) íntrons não são removidos em E. coli. (b) Terminação prematura da transcrição. (c) Um problema de viés de códons.
Gene de E coll
CCG CCG
CCG
A maioria dos códons de prolina é CCG
RESULTADO: E. coli tem diÍiculdades na tradução dos códons de prolina de um gene humano
29O
T.A.BRowN
(3)
O viés de códons do gene pode não ser o ideal para a tradução em E. coli. Como descrito na página267, apesar de virtualmente todos os organismos utilizarem o mesmo código genético, cada um possui um viés associado à tendência de utilizar preferencialmente determinados códons. Esse viés reflete a eficiência com a qual as moléculas de RNA de transferência (tRNA) são capazes de reconhecer os diferentes códons no organismo. Se um gene clonado contém uma proporção elevada de códons desfavoráveis, os tRNAs da célula hospedeira podem encontrar dificuldades na tradução do gene, reduzindo a quantidade de proteína que é sintetizada (Figura 13.14c).
Esses problemas geralmente podem ser solucionados, embora as manipulações necessárias possam consumir tempo e ser de custo elevado (uma consideração importante em um projeto industrial). Se um gene contém íntrons, pode ser utilizado como alternativa o seu DNA
complementar (cDNA), preparado a partir do mRNA (p. 172) e, portanto, livre de íntronsA mutagênese dirigida por oligonucleotídeos pode então ser empregada para alterar as seqüências de possíveis terminadores e para substituir códons desfavoráveis por aqueles preferidos por E. coli. Uma alternativa para genes com extensão inferior a2kb é a produção de uma versão artificial. Isso envolve a síntese de um conjunto de oligonucleotídeos parcialmente sobrepostos, projetados de modo a garantirem que o gene resultante contém os códons preferidos por E. coli e não possui terminadores'
13.2.2 Problemas causados por E. coli Algumas das dificuldades encontradas quando da utilização de E. coli como hospedeira para ã síntese de proteínas recombinantes advêm de propriedades inerentes à própria bactériaPor exemplo:
(1)
(2)
(3)
E. colí pode não processar a proteína recombinante corretamente. As proteínas da maioria dos organismos são processadas após a tradução, por modificação química de aminoácidos presentes no polipeptídeo. Muitas vezes, esses eventos de processamento são essenciais para a atividade biológica coÍreta da proteína. Infelizmente, as pro' teínas de bactérias e de organismos superiores não são processadas de maneira idêntica. Em particular, algumas proteínas animais são glicosiladas, o que significa que elas possuem grupos de açúcar ligados a elas após a tradução. A glicosilação é extremamente incomum em bactérias e as proteínas recombinantes sintetizadas em E. coli nunca são glicosiladas corretamente. E. coli pode não enovelar a proteína corretamente e geralmente éincapaz de sintetizar as ligações dissulfeto presentes em muitas proteínas animais. Se a proteína não adota a sua estrutura terciáffia com enovelamento correto, ela geralmente é insolúvel e forma corpos de inclusão no interior da bactéria (Figura 13.15). A recuperação da proteína apartir de corpos de inclusão não é um problema, mas a sua conversão na forma corretamente enovelada é difícil ou impossível in vitro. Obviamente, sob tais circunstâncias a proteína é inativa. E. coli pode degradar a proteína recombinante. Não se sabe exatamente, entretanto, como E coli é capaz de reconhecer a proteína exógena e fazer dela um alvo preferencial para reciclagem.
Esses problemas são mais difíceis de serem resolvidos do que os problemas de seqüência descritos na seção anterior. A degradação de proteínas recombinantes pode ser reduzida com a utilização, como hospedeira, de uma linhagem de E. coli deficiente em uma ou mais proteases responsáveis por esse processo. O enovelamento correto de proteínas recombi-
Figura
Corpos de inc
nantes tam
se caso, uÍ rem respol a ausência
utilização maneira.
13.3 Produç
eucarid Os proble
recombini
temas de t tras bactér so
foi alct
/i
são euc
eucarioto
próximo
c
binantes t em cultivr a partir d€
milar àqu
13.3.1 Proteín Íungos O potenc
mente re( versas pr
Ct-ouneev GÊNtcA
E ANÁLtsE
oe
DNA
291
o em E. coli. Como des-
nos utilizarem o mesmo sia de utilizar preferenI com a qual as molécucer os diferentes códons levada de códons desfabuldades na tradução do fgura 13.14c).
Célula de
E coll Corpos de inclusão
anipulações necessárias I importante em um pron alternativa o seu DNA Drtanto, livre de íntrons. Egada para alterar as seoráveis por aqueles prenor a2 kb é a produção
I oligonucleotídeos parne resultante contém os
pli como
hospedeira paEntes à própria bactéria-
mente. As proteínas da modificação química de FYentos de processamen-
m. Infelizmente.
as pro-
Esadas de maneira idêndas, o que significa que r A glicosilação é extre-
r
sintetizadas em E. coli
E é incapaz de sintetizar Se a proteína não adota hnenteé insolúvel e for.
). A recuperação da pro. I sua conversão na forma mente, sob tais circuns-
exatamente, entretanto" dela um alvo preferen-
r
m problemas de seqüênmntes pode ser reduzida Eciente em uma ou mais n de proteínas recombi-
Figura 13.í5
Nucleóide
Corpos de inclusão.
nantes também pode ser promovido pela escolha de uma linhagem hospedeira especial, nesse caso' uma que sintetize grandes quantidades de proteínas chaperonas, que se acredita serem responsáveis pelo enovelamento de proteínas na célula. Porém, o principal problema é a ausência de glicosilação. Até o momento, esse problema não teve solução, o que limita a utilização de E. coli à síntese de proteínas animais que não precisam ser modificadas dessa
maneira.
13.3 Produção de proteínas recombinantes por células eucarióticas Os problemas associados com a obtenção de um alto rendimento na produção de proteínas recombinantes ativas a partir de genes clonados em E. coli levou ao desenvolvimenio de sistemas de expressão para outros organismos. Houve algumas tentativas de utilização de outras bactérias como hospedeiras para a síntese de proteínas recombinantes e algum progresso foi alcançado com Bacillus subtilis, mas as principais alternativas à utilização Ãe n. co/i são eucariotos microbianos. o argumento para a utilização desses organismos é que um eucarioto microbiano, como uma levedura ou um fungo filamentoso, ? um parente mais próximo de um animal e, por isso, pode ser capaz delidar com a síntese de proteínas recombinantes mais eficientemente do que E. coti. Leveduras e fungos podem ser multiplicados em cultivos contínuos tão facilmente quanto bactérias e podem expressar um gene clonado a partir de um organismo superior e processar a proteína resultante de uma maneira mais similar àquela que ocorïe naturalmente.
13.3.1 Proteínas recombinantes produzidas a partir de leveduras e de fungos filamentosos O potencial de eucariotos microbianos para a expressão de genes exógenos já foi amplamente reconhecido e esses organismos estão sendo utilizados na rotina de produção de diversas proteínas animais. Os vetores de expressão continuam sendo necessários, pois os
292
T. A. Bnowr.r
promotores e outros sinais de expressão de genes animais geralmente não funcionam de maneira eficiente nesses eucariotos inferiores. Os vetores utilizados são baseados naqueles descritos no Capítulo 7.
Saccharomyces cerevisiae como hospedeira para a síntese de proteínas recombi nantes A levedura Saccharomyces cerevisiae é atualmente o eucarioto microbiano mais popular para a produção de proteínas recombinantes. Os genes clonados são freqüentemente colocados sob o controle do promotor GAL(Figura 13.16a), que está normalmente a montante do gene que codifica a galactose-epimerase, uma enzima envolvida no metabolismo da galactose. O promotor GAL é induzido por galactose, constituindo-se, por isso, em um sistema simples para a regulação da expressão de um gene exógeno clonado. Outros promotores úteis são PHO5, que é regulado pelo nível de fosfato no meio de cultivo, e CUPl, qae é induzido por cobre. A maioria dos vetores de expressão de levedura também possui uma seqüência de terminação de um gene de S. cerevisiae, porque sinais de terminação de genes animais não funcionam eficientemente em leveduras. O rendimento da produção de proteínas recombinantes em S. cerevisiae é relativamente elevado, mas essa levedura é incapaz de glicosilar proteínas animais corretamente. Muitas vezes ela adiciona um número excessivo de unidades de açúcar ("hiperglicosilação"), embora isso possa ser evitado ou pelo menos amenizado a partir da utilização de uma linhagem mutante . S. cerevisiae também não possui um sistema eficiente para a secreção de proteínas para o meio. Na ausência de secreção, as proteínas recombinantes ficam retidas na célula e, conseqüentemente, têm sua purificação dificultada. O viés de códons (p. 290) também pode ser um problema.
Apesar desses inconvenientes, S. cerevisiae permanece sendo o eucarioto microbiano mais freqüentemente utilizado para a síntese de proteínas recombinantes. Isso se deve, em parte, ao fato de ela ser aceita como um organismo seguro para a produção de proteínas para utllizaçáo em medicamentos ou alimentos. Além disso, foi adquirida ao longo dos anos uma riqueza de conhecimentos muito grande a respeito da bioquímica e da genética de S. cerevisiae, o que torna relativamente mais fácil a elaboração de estratégias para a superação das dificuldades que eventualmente surgem.
Figura í3.16 Quatro promotores utilizados Íreqüentemente em vetores de expressão de eucariotos microbianos. P - promotor.
Outras leveduras e Íungos Embora S. cerevisiae seja o organismo eucariótico preferido por muitos biólogos moleculares para a síntese de proteínas recombinantes, existem outros eucariotos microbianos igualmente qualificados, se não mais eficientes, para a execução dessa tnefa. Pichia pastoris, em especial, uma segunda espécie de levedura, é capaz de sintetizar grandes quantidades de proteína recombinante (até307o da proteína celular total) e as glicosilações feitas por ela são muito similares àquelas de células animais. As estruturas de açúcar que ela sintetizanão são precisamente as mesmas que as versões animais (Figura 13.17), mas as diferenças são muito pequenas e provavelmente não têm um efeito significativo na atividade da proteína recombinante. Mais importante ainda, é improvável que as proteínas glicosiladas produzidas por P. pastorls induzam uma reação antigênica se injetadas na corrente sangüínea, um problema freqüentemente encontrado com proteínas glicosiladas em excesso sintetizadas por S. cerevisiae. Vetores de expressão para P. pastoris utilizam o promotor da álcool-oxidase (AOX) (Figura 13.16b), que é induzido por metanol. O único problema significativo com P pastoris é a degradação eventual das proteínas recombinantes antes de elas
Figura
l
Comparação entre estrutura de glicosil típica encontrada em proteína animal e a truturas sintetizada P.
pastoris e S. cerev,
Clonnoev GÊNrcA
&
não funcionam
E ANÁLrsE
oe
DNA
293
(a) O promotor GÁL
são baseados naqueles
Galactose
p
síntese de
..\
GAL 10
Transcrição
-a iano mais popular freqüentemente colo' mente a montante no metabolismo da ga por isso, em um sisteOutros promote
(b) O promotor -ll ÁOX Metanol
,
tambémpossui uma s de terminação de genes
(c) O promotor da glicoamilase
p
Muim
er
icosilação"),
tlrzaçáo de uma linh* para a secreção de pro-
n
inantes ficam retidas de códons (p. 290)
tan'
o eucarioto microbiam, . Isso se deve, de proteínas
oÏoo da glicoamilase ..+\tr
Xilose
Gene
relativamenE
is corretamente.
Transcrição
-a,------tr
cultivo, eCUPL,queê
é
Gene da álcool-oxidase
Figura 13.16 Quatro promotores utilizados freqüentemêntê êm vetores de expressão de eucariotos microbianos. P - promotor.
lrâÍìSCÍlQâO
+\
Sem transcnçao
-a'---=(d) O promotor da celobioidrolase Celulose
da \ p celobioidrolase \ Gene
lranscÍlçao
-a!-----.-D
prr
irida ao longo dos e da genética dc
t,
muitos biólogos
glicosilações feitas de açúcar que ela 13.17), mas as ivo na atividade as proteínas glicosi as na
corrente
ilizam o promotor da O único problema si inantes antes de
Figura 13.17 Comparação entre uma estrutura de glicosilação típica encontrada em uma proteína animal e as estruturas sintetizadas por P pastoris e S. cerevisiae.
YI I t
/
Vr
I
-Asn-
-Asn-
Homem
P pastoris
-AsnS. cerevisiae
Açúcares
294
T. A. Bnowr.r
poderem ser purificadas, mas isso pode ser controlado pelo uso de um meio de cultrvo especial. Outras leveduras que vêm sendo utilizadas para a síntese de proteínas recombinantes são Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica e Kluveromyces lactis. Esta última tem o atrativo especial de poder ser cultivada em meio derivado de resíduos da indústria de ali-
sadas corn a abordagt
mentos.
Produçã
Os dois fungos filamentosos mais populares são Aspergillus nidulans e Trichoderma reesei. As vantagens desses organismos são as suas boas propriedades de glicosilação e a capaci
13.3.2 Utilizando células animais para a produção de proteínas recombinantes
a
possibili,
procedime
Células dt
cultura, a: têm como produzirer O siste
em inseto: o gene da
corpos de
único gen
lares de pi ne exóger rias protet
corretam(
As dificuldades inerentes à síntese de proteínas animais inteiramente ativas em um hospedeiro microbiano levaram os biotecnólogos a explorarem a possibilidade de utilizar células animais para a síntese de proteínas recombinantes. Para proteínas com estruturas de glicosilação complexas e essenciais, uma célula animal pode ser o único tipo de célula hospedei-
vantagem
ra na qual a proteína ativa pode ser sintetizada.
Uma inor
Produção de proteínas em células de mamíÍeros
nantes é i em todas (p. 160).
Os sistemas de cultivo para células animais já estão disponíveis desde o início da década de 1960, mas somente durante os dez últimos anos foram desenvolvidos métodos para a cultura contínua e em larga escala dessas células. Um dos problemas de algumas linhagens de células animais decorre do fato de elas exigirem uma superfície sólida para sua multiplicação, o que complica a concepção dos recipientes utilizados no cultivo. Uma das soluções encontradas foi o preenchimento do interior do recipiente com placas, que suprem a demanda por uma grande área plana. Isso, contudo, tem a desvantagem de tornar bastante difícil a mistura completa e contínua do meio no interior do recipiente. Uma segunda possibilidade é a de uilizar um recipiente comum, mas colocar no seu interior pequenas partículas inertes (por exemplo, partículas de celulose) sobre as quais as células podem se multiplicar. Em comparação com microrganismos, a velocidade de multiplicação e as densidades celulares máximas que podem ser atingidas são muito menores para as células animais, limitando o rendimento da produção de proteínas recombinantes. Isso, contudo, pode ser tolerado, se essa for a única maneira para a obtenção da proteína ativa. Obviamente, a clonagem gênica pode não ser necessáriapara a obtenção de uma proteína animal a partir de um cultivo de células animais. Apesar disso, vetores de expressão e genes clonados são ainda utilizados para a maximizaçáo do rendimento, colocando o gene sob controle de um promotor que é mais forte do que aquele ao qual ele está normalmente ligado. Esse promotor é freqüentemente obtido de um vírus, como SV40 (p. 160). Linhagens de células de mamíferos derivadas de tecidos humanos ou de hamster vêm sendo utilizadas na síntese de várias proteínas recombinantes e, em todos os casos, essas proteínas são proces-
Pharmi de anin
rável, por ne clonat
Corpos de inclusi cleos de células
(
Cr-oruneeu GÊNrcA
;meio de cultivo esfteínas recombinan-
rni. Esta última tem p
da indústria de ali-
'lbns e Trichoderma
I de glicosilação e a ivantagem é uma ca-
lnatural, secretaenqual ele vive. As capduzir proteínas rePtores de expressão lra 13.16c), induziIomotor da celobioi-
fteínas f,inu,
.-
he de
utilìzar células
um hospe-
lot-turu, de slicGI de célula rrorJ.a"lf^ i i
I
lirri.io
da década de
fetoaos para a cultu[u*ur linhagens de
foara sua multiplica[- Urnu das soluções pe suprem a demanpar bastante difícil a
E ANÁLlsE DE
DNA
sadas corretamente e são indistinguíveis das versões não-recombinantes. Entretanto, essa é a abordagem mais cara para a produção de proteínas recombinantes, especialmente porque a possibilidade de co-purificação de vírus com as proteínas implica o emprego de rigorosos procedimentos de controle de qualidade para a garantia de que o produto é seguro.
Produção de proteínas em células de inseto Células de inseto representam uma alternativa para a produção de proteínas animais. Em cultura, as células de inseto comportam-se da mesma maneira que as de mamíferos, mas têm como grande vantagem a característica de, graças a um sistema natural de expressão, produzirem as proteínas recombinantes com um alto rendimento. O sistema de expressão é baseado nos baculovírus, um grupo de vírus que são comuns em insetos, mas apaÍentemente não infectam vertebrados. O genoma do baculovírus inclui o gene da poliedrina, cujo produto normal acumula-se nas células de inseto como grandes corpos de inclusão nucleares ao final do ciclo de infecção (Figura 13.18). O produto desse único gene freqüentemente chega a representar 5OVo da proteína celular total. Níveis similares de produção de proteína também ocorrem se o gene normal for substituído por um gene exógeno. Vetores de baculovírus vêm sendo utilizados com sucesso na produção de várias proteínas de mamífero, mas, infelizmente, as proteínas resultantes não são glicosiladas corretamente. Em relação a esse aspecto, o sistema de baculovírus não oferece qualquer vantagem em comparação a S. cerevisiae ou P' pastoris.
Pharming: proteínas recombinantes produzidas a partir de animais vivos Uma inovação recente e potencialmente importante para a produção de proteínas recombinantes é autllizaçáo de um animal transgênico, um animal que contém um gene clonado em todas as suas células, geralmente introduzido por microinjeção em um óvulo fecundado (p. 160). A produção de animais transgênicos é cara, mas a relação custo-benefício é favorável, porque, depois de o animal ter sido produzido, ele pode reproduzir-se e passar o gene clonado a sua progênie, de acordo com os princípios mendelianos básicos'
possibilidade
fuunda bnas partículas iner-
h se multiplicar.
Em
Citoplasma
pnsidades celulares himais, limitando o h'de ser tolerado.
se
Membrana nuclear
ì
foição de uma proteík de expressão e ge-
plocando o gene sob p normalmente ligaI too;. Linhagens de I sendo utilizadas na I
foteínas são proces-
295
Figura 13.18 Corpos de inclusão cristalinos em núcleos de células de inseto infectadas com um baculovírus.
Corpos de inclusão
296
T. A. Bnowlr
A abordagem mais bem-sucedida até agora para a produção de proteínas recombinantes em animais transgênicos utiliza animais de fazenda, como ovelhas ou porcos, com o gene clonado ligado ao promotor do gene da p-lactoglobulina do animal. Esse promotor é ativo no tecido mamário, o que significa que a proteína recombinante é secretada no leite (Figura 13.19)' A produção de leite pode ser contínua durante a vida adulta do animal, resultãndo em um grande rendimento na produção da proteína. Além disso, como a proteína é secretada, a sua purificação é relativamente simples. Mais importante ainda é ó futo d" on"lhâs e porcos serem mamíferos, de modo que proteínas humanas produzidas dessa maneira são modificadas corretamente. A produção de proteínas de uso farmacêutico em animais de fazenda vem sendo chamada de pharming (do inglês pharmaceuticals xfarming). Apesar de controversa, essa técnica é uma das que oferece maiores perspectivas para a síntese de proteínas humanas corretamente modificadas para utilização na medicina.
13.3.3 Proteínas recombinantes produzidas a partir de vegetais Os vegetais representam a última possibilidade para a produção de proteínas recombinantes. Plantas e animais possuem atividades de processamento de proteínas similares e a maioria das proteínas animais produzidas em plantas passa pelas modificações pós-tradução corretas, sendo, portanto, completamente funcionais. O cultivo de células ueg"tui, é uma tecnologia bem estabelecida, que já vem sendo utilizada para a síntese comercial de produtos naturais de plantas. Alternativamente, plantas intactas podem ser cultivadas a campo em altas densidades, o que determina um elevado rendimento na produção de proteínas recombinantes, com bom potencial para armazenamento de longo prazo, emórgãos como tubérculos ou frutos, naturalmente ricos em proteína. Seja qual for o sistema de produção utilizado, as plantas oferecem meios baratos e de baixa tecnologia para a produção massiva de proteínas recombinantes. Uma ampla gama de proteínas já foi produzida em sistemas experimentais, inclusive produtos farmacêuticos importantes, como interleucinas e anticorpos. Essa é uma ârea depesquisa intensa no momento, com viírias empresas de biotecnologia vegetal desenvolvendo sistemas que estão próximos da produção comercial. Uma das possibilidades futuras mais promissoras é a uìitirução de plantas para a produção de vacinas, o que serviria de base para programas de vacinação baratos e eficientes.
ra
!
296
T. A. Bnowlr
A abordagem mais bem-sucedida até agora para a produção de proteínas recombinantes em animais transgênicos utiliza animais de fazenda, como ovelhas ou porcos, com o gene clonado ligado ao promotor do gene da B-lactoglobulina do animal. Esse promotor é ativo no tecido mamário, o que significa que a proteína recombinante é secretada no leite (Figura 13.19). A produção de leite pode ser contínua durante a vida adulta do animal, resultando em um grande rendimento na produção da proteína. Além disso, como a proteína é secretada, a sua purificação é relativamente simples. Mais importante ainda é o fato de ovelhas e porcos serem mamíferos, de modo que proteínas humanas produzidas dessa maneira são modificadas corretamente. A produção de proteínas de uso farmacêutico em animais de fazenda vem sendo chamada de pharming (do inglês pharmaceuticals xfarming). Apesar de controversa, essa técnica é uma das que oferece maiores perspectivas para a síntese de proteínas humanas corretamente modificadas para utilização na medicina.
13.3.3 Proteínas recombinantes produzidas a partir de vegetais Os vegetais representam a última possibilidade para a produção de proteínas recombinantes. Plantas e animais possuem atividades de processamento de proteínas similares e a maioria das proteínas animais produzidas em plantas passa pelas modificações pós-tradução corretas, sendo, portanto, completamente funcionais. O cultivo de células vegetais é uma tecnologia bem estabelecida, que já vem sendo utilizada para a síntese comercial de produtos naturais de plantas. Alternativamente, plantas intactas podem ser cultivadas a campo em altas densidades, o que determina um elevado rendimento na produção de proteínas recombinantes, com bom potencial para arÍnazenamento de longo prazo, em órgãos como tubérculos ou frutos, naturalmente ricos em proteína. Seja qual for o sistema de produção utilizado, as plantas oferecem meios baratos e de baixa tecnologia para a produção massiva de proteínas recombinantes. Uma ampla gama de proteínas já foi produzida em sistemas experimentais, inclusive produtos farmacêuticos importantes, como interleucinas e anticorpos. Essa é uma fuea de pesquisa intensa no momento, com viirias empresas de biotecnologia vegetal desenvolvendo sistemas que estão próximos da produção comercial. Uma das possibilidades futuras mais promissoras é a utilização de plantas para a produção de vacinas, o que serviria de base para programas de vacinação baratos e eficientes.
Cr-oruaeeu GÊNrcA E ANÁLrsE oe
recombinantes lx)rcos, com o gene promotor é ativo no leite (Figudo animal, resultana proteína é se é o fato de ovedessa maneira em animais de xfarming). Apasar para a síntese dc
DNA
297
Promotor da p-lactoglobulina Clonagem em uma ovelha transgênica
is recombinar
ínas similares e I ificações pós-tra& células vegetais é síntese comercial dc ser cultivadas a caÍh em órgãos como meios baratos e dc Uma ampla gama& farmacêuticos
ir
intensa no momcr que estão próxi-
programas de vaci.
Figura 13.19 Proteína recombinante secretada no leite
Produção de uma proteína recombinante no leite de uma ovelha transgênica.
Cnpíruloí 4
.
)
hion in Biotechnology, 10, licl derived from Íhe
Clonagem Gênica e Análise de DNA na Medicina
trp anil
h-5. Qenic
Re
se
arch, 9,
27 9 -99 -
i
ldies: a comparison of Sac3. Gene, lg0, 87-gi . ix for biopharmaceuticals. I
Lession in Escherichia coF
ifor insect and mammalian Drstems for high level gene I
lgenic Research, 9, 301-4i ;
coli strains deficient in all |otechnology, 12, I 107-10. I
pntes
em E. coll.l ksion controlled by the P.,
Produção de medicamentos recombinantes, 299 Identificação de genes responsáveis por doenças
Terapia gênica,3l4
humanas. 309
hslation of genes in Escàei
Vin Escherichia coli
as
fu-
i
Iúesis and secretion of h€I
I
I
recombinant protein pro-
A medicina foi e continua
a ser a maior beneficiária da revolução do DNA recombinante; assim, um livro inteiro poderia ser escrito a respeito deste tópico. Mais adiante, neste capítulo, aborda-se a forma como as técnicas de DNA recombinante estão sendo utilizadas para identificar genes responsáveis por doenças hereditiírias e para o desenvolvimento de novos tratamentos para esses distúrbios. Inicialmente, será dada continuidade ao tema tratado no capítulo anterior e examinada a maneira como os genes clonados estão sendo utilizados na produção de medicamentos recombinantes.
14.1 Produção de medicamentos recombinantes Diversas doenças humanas podem ser identificadas como decorrentes da ausência ou do mau funcionamento de uma proteína normalmente sintetizada no colpo. A maioria dessas enfermidades pode ser tratada a partir do fornecimento ao paciente da versão coÍïeta da proteína, mas, para que isso seja possível, é necessário que a proteína relevante esteja disponível em quantidades relativamente grandes. Se o defeito pode ser corrigido apenas com a administração da proteína humana, a obtenção de quantidades suficientes da mesma pode ser um grande problema, a menos que sangue fornecido por doadores possa ser utilizado como fonte piÌra sua purificação. Por isso, proteínas de origem animal são usadas sempre que possível. Entretanto, não existem muitas enfermidades que podem ser tratadas com proteínas animais e, além disso, há sempre a possibilidade de ocorrência de efeitos colaterais quando elas são empregadas, como, por exemplo, uma resposta alérgica. O Capítulo 13 mostrou que a clonagem gênica pode ser utilizada para a obtenção de grandes quantidades de proteínas recombinantes humanas. Como essas técnicas estão sendo aplicadas à produção de proteínas que serão usadas como medicamentos?
5
Ì
F
n
[.'
300
T. A. Bnowr.r
14.1.1 Insulina recombinante A insulina, sintetizada pelas células
B das ilhotas de Langerhans, no pâncreas, controla o nível de glicose no sangue. Uma deficiência em insulina manifesta-se como diabete melito, um complexo de sintomas que podem levar à moÍe, quando não-tratados. Felizmente, muitas formas de diabete podem ser atenuadas por um programa contínuo de injeções de insulina, suplementando assim a quantidade limitada desse hormônio que é sintetizada pelo pâncreas do paciente. A insulina utilizadano tratamento é tradicionalmente obtida a partir de pâncreas de suínos e de bovinos abatidos para a produção de carne. Embora a insulina de origem animal seja geralmente satisfatória, ela pode eventualmente causar problemas quando utilizada no tratamento do diabete humano. Um dos problemas decorre das pequenas diferença's entre a proteína humana e as de origem animal, que podem levar a efeitos colaterais em alguns pacientes. Outro problema é a dificuldade dos procedimentos de purificação, que nem sempre eliminam contaminantes potencialmente perigosos. A insulina apresenta duas características que facilitam a sua produção por técnicas de DNA recombinante. Primeiramente, a proteína humana não é modificada após a tradução pela adição de moléculas de açúcar (p.289); portanto, a insulina sintetizada por uma bactéria deve ser ativa. A segunda vantagem relaciona-se ao tamanho da molécula. A insulina é uma proteína relativamente pequena, composta por dois polipeptídeos, um de 21 aminoácidos (a cadeiaA) e o outro de 30 (a cadeia B; Figura 14.1). No homem, tais cadeias são sintetizadas como um precursor chamado pré-proinsulina, que contém os segmentos A e B ligados por uma terceira cadeia (C) e é precedido por uma seqüênciaJíder. A seqüêncialíder e a cadeia C são removidas após a tradução, deixando os polipeptídeos A e B ligados um ao outro por duas pontes de dissulfeto. Viárias estratégias já foram utilizadas para a obtenção de insulina recombinante. Um dos primeiros projetos, envolvendo a síntese de genes artificiais para as cadeiâs A e B seguida pela produção de proteínas em E. coli, ilustra inúmeras técnicas gerais usadas na produção de
Lí
proteínas recombinantes.
Síntese e expressão de genes de insulina artificiaas No final da década de 1970, aidéia de sintetizar um gene artificial era extremamente inovadora. Naquela época, a síntese de oligonucleotídeos estava na sua infância e os métodos disponíveis para a produção de moléculas de DNA artificiais eram muito mais complicados do que as técnicas automatizadas atuais. Apesar disso, genes codificando as cadeias A e B da insulina foram sintetizadosjá em 1978. A estratégia utilizada sintetizava trinucleotídeos representando todos os códons possíveis, que foram então unidos na ordem ditada pelas seqüências de aminoácidos das cadeias A e B. Os genes artificiais não tinham necessariamente as mesmas seqüências nucleotídicas que os segmentos gênicos reais que codificam essas cadeias, mas, ainda assim, eles especificavam os polipeptídeos corretos. Dois plasmídeos recombinantes foram consffuídos, um carregando o gene artificial para a cadeia A e o outro, o gene da cadeia B. Em ambos os casos, o gene artificial foi ligado a uma fase de leitura de.lacZ',presente em um vetor do tipo pBR322 (Figura 14.2a). Os genes de insulina estavarri, portanto, sob o controle do forte promotor lac (p.283) e foram expressados como proteínas de fusão, as quais consistiam nos primeiros aminoácidos da B-galactosidase seguidos pelo polipeptídeo A ou B (Figura 14.2b). Cada gene foi projetado de modo a que seus segmentos de B-galactosidase e de insulina fossem separados por um resíduo de metionina, para que esses dois componentes pudessem ser liberados por clivagem, proporcionada por tratamento com brometo de ciano-
L. ?
E
Figura 14.1 A estrutura da molécula de insulina e um resumo da sua síntese por processamento da pré-proinsulina.
;-
gênio (p. 287r.
t
de pontes de dis A etaPa final
ciente. Um aprn duais, mas de to (Figura 14.l). Is
DNA, mas apro pontaneamente correspondente
proteolítica.
Ct-orueeeu GÊNtcA
pâncreas, controla o úbmo diabete melito, tm muitas foriFelizmente,
)
E
AlrÁr-sì-õí DNA
30 aminoácidos
:
ffeções de insulina, sw lizada pelo pâncreas do ia partir de pâncreas de hina de origem animal
CadeiaB
21 aminoácidos
A molécula de insulina
guando utilizada no ienas diferença's entre e platerais em alguns pabação, que nem sempÍE
$
Líder (Proinsulina = BCA
Pré-proinsulina
- sem líder)
I I
iú"çao por técnicas dc
j
iada após a tradução pe-
Enovelamento espontâneo
ha por uma bactéria def- A insulina é uma pK> b
2l
aminoácidos (a
e. e
pias sao sinteúzadas iA e B ligados por nÍrn
hlfdereacadeiaCsão
b um ao outro por dum I
i
precombinante. Um dm
ideiasAeBseguidape-
[usadas na produção dc
Clivagem
t
I'
t
Figura 14.1
f I
p
extremamente inov+ pncia e os métodos dirlo mais complicados &
[ascadeiasAeBdair i
ps
Fídos, um carregando o r
pde lacZ', presente €n
$, portanto, sob o conpÍnas de fusão, as qn*h po polipeptídeo A ou B de p-galactosidase
c
pses dois componentes bom brometo de ciano :
L
-
çç
SS I ^ A
I
Insulina
c
lq eles especificavam oe
i
B
os códons possíveis* das cadeias A e B-
lidos ps nucleotídicas que
$
A estrutura da molécula de insulina e um resumo da sua síntese por processamento da pré-proinsulina.
gênio (p. 287). As cadeias A e B purificadas eram então ligadas uma à outra, pela formação de pontes de dissulfeto em tubo de ensaio. A etapa final, envolvendo a formação de pontes de dissulfeto, mostrou-se bastante ineficiente. Um aprimoramento posterior da técnica permitiu a síntese não de genes A e B individuais, mas de toda a fase de leitura da proinsulina, especificando cadeia B-cadeia C-cadeia A (Figura 14.1). Isso constitui-se em uma proposição mais desafiadora em termos de síntese de DNA, mas a produção do pró-hormônio trouxe consigo a grande vantagem de enovelar-se espontaneamente na estrutura correta, com a formação das pontes de dissulfeto. O segmento correspondente à cadeia C podia, então, ser removido com relativa facilidade por clivagem
proteolítica.
302
T.
A. Bnowr.r
A son
(a) Os genes aÍtiÍiciais
lacZ' Promotor /ac
.a
Gene A
proteína n te adequar ma descrir tor lacZ' I
Gene B
nogênio. A sínt tem uma Í
()
ficial corr
fícil, pois
\_/
Vetor carregando o
Por isso, I mentar (c
Vetor carregando o gene B artiÍicial
gene A artificial
mensageir
(b) Síntese da proteína insulina
po human fina conú va em doi
írq T,4
/{ /\
/\ Á_ \ 1-- A
Segmento
da
1-. - -
---\
B
--\
Células de E coll transformadas sintetizam as proteínas de fusão A e B
l9l, foi n
nor foi su somatotÍo
modificad
I
B-galactosidase I
-)-,
cadeia A
met
I tt
I
I . rãI
Brometo
de
cranogenro
"^o"ru,
I
i Proteínas de Íusão clivadas
PuriÍicação das cadeias A e B, associação por pontes de dissulÍeto
-rrlnsulina
Figura 14.2 A síntese da insulina recombinante a partir de genes artiÍiciais
dascadeiasAeB.
14.1.2 síntese de hormônios de crescimento humanos em E. coti Aproximadamente na mesma época em que foi produzida pela primeira vez a insulina recombinante em E- coli, outros pesquisadores estavam trabalhando em projetos similares envolvendo os hormônios de crescimento humanos somatostatina e somatotrofina. Essas duas proteínas agem em conjunto para controlar processos de crescimento no corpo humano e o mau funcionamento das mesmas leva a enfermidades dolorosas e incapacitanìes, como a acromegalia (crescimento ósseo descontrolado) e o nanismo.
Fi
Produção de somdo cú
tË
*
k #
E-t a\ E F É
F
Ct-orunceu GÊnrcn e ANÁLtsE
or DNA
303
A somatostatina foi a primeira proteína humana a ser sintetizada em E coli.por ser uma proteína muito pequena, com uma extensão de apenas 14 aminoácidos, elaeç particularmente adequada para a síntese do gene artificial correspondente. A estratégia utitr iàadafoia mesma descrita para a insulina recombinante, envolvendo a inserção do genà artificial em um vetor lacZ'(Figura 14.3), a síntese de uma proteína de fusão e a clivagem com brometo de cianogênio. A síntese de somatotrofïna foi um problema de solução mais complexa. Essa proteína tem uma extensão de 191 aminoácidos, equivalente a quase 600 pb, e a síntese do gene artificial correspondente representava, no final da década de l97},uma tarefa extremamente difícil, pois seria um desafio até mesmo para a capacidade de síntese de DNA dos dias atuais. Por isso, foi utilizada uma combinação de síntese artificial e de clonagem de DNA complementar (cDNA) para a obtenção da linhagem de E. coli produtora de somatotrofina. RNA mensageiro (mRNA) foi obtido da pituitária, a glândula que produz a somatotrofina no corpo humano, e, a partir dele, foi preparada uma biblioteca de cDNA. O cDNA da somatotrofina continha um sítio único para a endonuclease de restrição HaeIlI, que, portanto, o clivava em dois segmentos (Figura 14.4a). O segmento mais longo, incluindo os códons de 24 a 191, foi mantido para utilização na construção do plasmídeo recombinante. O fragmento menor foi substituído por uma molécula de DNA artificial, que reproduzia o início do gene da somatotroÍina e incluía os sinais corretos para a tradução em E coli (Figura 14.4b). O gene modificado foi então ligado a um vetor de expressão portador do promotor /ac.
lacZ' Promotor /ac
Gene artificial da somatostatina
L.
-
>.Rí.
/ ( \ \--./
14.2 síntese da insulina te a paíÍ genes artiÍiciais cadeias A e B.
\
---.-
) /
a
rransrormação
\oee.cori
\
Segmento da p-galactosidase
E.
\
'1,"\' met \\
Somatostatina
coli insulina
Proteína oe Ìusao
Brometo de cianogênio
recm.
similares envolven Essas duas proteíhUmanO e O ÍÍtil
como a acrorln-
\ Figura 14.3 Produção de somatostatina recombinante.
Somatostatina
-
Cloruaoeu GÊrurca e ANÁLtsE oe
DNA
303
A somatostatina foi a primeira proteína hur{ana a ser sintetizada em E coli.Por ser uma proteína muito pequena, com uma extensão de a[gna$ 14 aminoácidos, ela era particularmente adequada para a síntese do gene artificial correspondente. A estratégia utilizada foi a mesma descrita para a insulina recombinante, envolvendo a inserção do gene artificial em um vetor lacZ' (Figura I4.3), a síntese de uma proteína de fusão e a clivagem com brometo de cianogênio. A síntese de somatotrofina foi um problema de solução mais complexa. Essa proteína tem uma extensão de 191 aminoácidos, equivalente a quase 600 pb, e a síntese do gene artificial correspondente representava, no final da década de 1970, uma tarefa extremamente difícil, pois seria um desafio até mesmo para a capacidade de síntese de DNA dos dias atuais. Por isso, foi utilizada uma combinação de síntese artificial e de clonagem de DNA complementar (cDNA) para a obtenção da linhagem de E. coli produtora de somatotrofina. RNA mensageiro (mRNA) foi obtido da pituitária, a glândula que produz a somatotrofina no corpo humano, e, a partir dele, foi preparada uma biblioteca de cDNA. O cDNA da somatotrofina continha um sítio único para a endonuclease de restrição HaeIII, que, portanto, o clivava em dois segmentos (Figura 14.4a). O segmento mais longo, incluindo os códons de 24 a 191, foi mantido para utilização na construção do plasmídeo recombinante. O fragmento menor foi substituído por uma molécula de DNA artificial, que reproduzia o início do gene da somatotrofina e incluía os sinais corretos para a tradução em E. coli (Figwa I4.4b). O gene modificado foi então ligado a um vetor de expressão poÍador do promotor /ac.
lacZ' Promotor /ac
 síntese da insulina a partir de genes artiÍiciais
--..) \
\ /
rransÍormação
\deeco/r
\_-,'
dascadeiasAeB.
E.
).4
/ ( \
Figura14.2
Gene artificial da somatostatina
L,
-
\
Segmento da p-galactosidase
.af\_ ' \ met \ Brometo de cianogênio
vez a insulina recom-
tl)
similares envolven. Essas duas
t
F_
F
r h F
t, F
É, E-
T
3
t
lusao
Somatostatina
coli
proteíe humano o mau como a acrome-
Proteína Oe
Figura 14.3 Produção de somatostatina recombinante.
--
Somatostatina
304
T. A. Bnowlt
cedimento coÍ
(a) Preparação do Íragmento de GDNA da somatotroÍina
cesso de
purifi
las virais presr
Códons 0
mofílicos por i
24
19.1
contaminação, O gene do: dido em 26 éx
Haelll I
I
(com 2.351 an pós-traduçtu, I
Restrição com Haelll
I
0 24 24
-
Descartado
-"'
7
dade maior, dc nor, derivada d 17 pontes & d teína tÍio grand
191
coli. Por isso, as
lulas de marní (b) Expressão
o24 ,/I
Líder
sintético /
191
separados
/ /
/
em células de I baixo. Issogo retamente nõ I va, compro{nÉí
CDNA
obtÍ
tro codificanü Pressão,
lnserçáo em um
ajnse
globina de cod
vetorde expressão
Os
plasmídec
Promotor /ac TransÍormação
em E.
coti
Síntese da
somatotrofina
Figura 14.4 Produção da somatotroÍina recombinante.
14.1.3 FatorVlll recombinante Embora vários compostos de uso farmacêutico tenham sido obtidos a partir de genes clona-
dos em E' coli, os problemas gerais associados ao uso de bactérias para síntese de proteínas exógenas (p. 288) levou, em muitos casos, à substituição desses organismos por eucariotos. um exemplo de medicamento recombinante produzido em células zucarióticas é o fatorvlll humano,,uma proteína que tem uma função õentral na coagulação sangüínea. A forma mais comum de hemofilia no homem resulta da incapacidade de sintãtizar útor vIII, o que leva a uma intemrpção na rota de coagulação sangüínea e aos conhecidos sintomas associados a essa doença. Até recentemente, a única maneira de tratar a hemofilia era com injeções da proteína fator vIII purificada de sangue humano obtido de doadores. A purificaçãoão rutorvtu é um pro-
Ë F È
F Ë
F E
È i:t f
F. Ë
I
Figura 14.5 O gene do fatorVlll e o seu produto de tradução.
Cr-oruaeeu GÊrrce e ANÁLtsE oe
DNA
305
cedimento complexo e, por isso, o tratamento é bastante caro. Para piorar a situação, o processo de purificação é problemático, especialmente no que diz respeito à remoção de partículas virais presentes no sangue. A hepatite e a AIDS podem ser, e já foram, transmitidas a hemofilicos por injeções de fator VIII. Assim, o fator VIII recombinante, livre de problemas de contaminação, seria uma conquista importante para a biotecnologia. O gene do fator VIII é muito grande. Ele tem uma extensão de mais de 186 kb e está dividido em 26 éxons e 25 íntrons (Figura 14.5a). O seu mRNA codifica um grande polipeptídeo (com 2.351 aminoácidos), que passa por uma série complexa de eventos de procesiamento pós-tradução, acabando por resultgr-eq uma proteína dimérica, que consiste em uma subunidade maior, derivada da região a Érontjünte do polipeptídeo inicial, e em uma subunidade menor, derivada do segmento a jusante (Figura 14.5b). As duas subunidades contêm um total de 17 pontes de dissulfeto e vários sítios glicosilados. Como pode ser antecipado para uma proteína tão grande e complexa, é impossível a síntese da sua versão recombinarúe ativa em E coli. Por isso, as tentativas iniciais para a obtenção do fator VIII recombinante envolveram células de mamíferos. Nos primeiros experimentos executados, o cDNA completo foi clonado em células de hamster, mas o rendimento da produção da proteína foi desapontadoramente baixo. Isso provavelmente aconteceu porque os eventos pós-tradução, embora executados corretamente nas células de hamster, não converteram todo o produto inicial em uma forma ativa, comprometendo o rendimento final. Como alternativa, foram utilizados dois segmentos separados obtidos a partir do cDNA, um codificando a subunidade polipeptídica maior e outro codificando a subunidade menor. Cada fragmento de cDNA foi ligado a um vetor de expressão, a jusante do promotor Ag (um híbrido entre seqüências de p-actina de galinha e Bglobina de coelho) e a montante de um sinal de poliadenilação do vírus SV40 @ìgura la.6). Os plasmídeos foram introduzidos em uma linhagem celular de hamstere obtidas as proteí-
(a) O gene do
i
ÍatorVlll
t4 I
somatotroÍina lda Ì lnte. ,
Exons
lntrons
I
20 kb
Itir de genes clona-
(b) PÍocessamento pós-tÍadução do Íator Vlll
liíntese de proteínas
hos por eucariotos.
fticas é o fatorVIII hea. A forma mais Eventos de processamento
lor VIII, o que leva fumas associados a i
bs da proteína fator
htor VIII é um pro-
:.
I
Figura 14.S O gene do fator Vlll e o seu produto de tradução.
\
\
\
Produto de tradução primário (2.351 aminoácidos)
\
*c
-A
ProteÍna Íator Vlll madura
306
T. A. Bnowr.r
Thbela 14.1 A dos em bactéri:
cDNA do Íator Vlll
Promotor Ag
Seqüência de de SV40
Proteína
Insulina Somatostatina
Figura 14.6 Os sinais de expressão utilizados na produção do fator Vlll recombinante. O promotor é um híbrido artiÍicial de seqüências de B-actina de galinha e B-globina de coelho e o sinal de po' liadenilação (necessário para o processamento correto do mRNA antes de sua tradução em proteína) é obtido do vírus SV40.
nas recombinantes correspondentes. O rendimento foi mais de l0 vezes superior àquele obtido a partir de células contendo o cDNA completo e a proteína fatorVIII resultante era funcionalmente indistinguível da forma nativa. A tecnologia mais recente para a produção do fator VIII envolve o pharming (p. 295). O cDNA humano completo foi ligado ao promotor do gene suíno da proteína acídica do soro do leite, levando à síntese do fator VIII humano em tecido mamário suíno e à subseqüente secre-
ção da proteína no leite. O fator VIII produzido dessa maneira parece ser exatamente o mesmo que a proteína nativa e é inteiramente funcional em ensaios de coagulação sangüínea.
14.1.4 Síntese de outras proteínas humanas recombinantes A lista de proteínas humanas sintetizadas por tecnologia recombinante continua a crescer (Tabela l4.l). Além das proteínas utilizadas no tratamento de doenças por substituição ou suplementação da atividade das versões não-funcionais, a lista também inclui viírios fatores de
Somatotrofila
FatorVIII Fator D(
Interferon-cr Interferon-p Interferon-y Interleucinas Fator
estimuk
Fator de necÍoÍ Fator de crescir Fator de crescir
Eritropoietina
Ativador de plz Superóxidodir Proteína surfac
ot,-antitripsina Albumina sfic Relaxina Desoxirribonrx
crescimento (por exemplo, interferons e interleucinas) com potencial para utilização na tera-
pia do câncer. Tais proteínas são sintetizadas em quantidades muito limitadas no corpo, de modo que a tecnologia recombinante representa a única maneira viável para a obtenção das mesmas nas quantidades necessárias para propósitos clínicos. Outras proteínas, como a albumina sérica, são mais facilmente obtidas, mas necessárias em quantidades tão grandes que a produção em microrganismos ainda é uma opção mais atraente.
14.1.5 Vacinas recombinantes
i:
; ; F
I I E
f
n
As grandr
em geral r da hepatit
Produção d
A utilização da
A categoria final
das proteínas recombinantes é um pouco diferente dos exemplos dados na Tabela 14.1. Uma vacina é uma preparação antigênica que, depois de injetada na coÍïente sangüínea, estimula o sistema imune a sintetizar anticorpos que protegem o corpo contra uma in-
pecíficos são às tra componentr das das proteír
fecção. O material antigênico presente na vacina é normalmente uma forma inativada do agente infeccioso. Por exemplo, vacinas antivirais freqüentemente consistem em partículas de vírus que foram atenuadas por aquecimento ou por um tratamento similar. No passado, dois problemas dificultaram a preparação de vacinas virais atenuadas.
identif,rcar e iru
(1)
:
(2)
cas de um detet
animais poderir utilização corn e de serem obti,
O processo de inativação deve ser IOOVo efrciente, pois a presença na vacina de apenas uma partícula viral viva já poderia resultar em infecção. Esse tem sido um problema para vacinas para a aftosa bovina.
Infelizment
porque as prote des antigênicas
Clorunoeu GÊNtcA
E Ar.rÁlrse
oe
DNA
907
Tabela 14'1 Algumas das-proteínas humanas que foram sintetizadas aparrirde genes clonados em bactérias e/ou células eucarióticas ot por pharming Proteína
Utilizada no tratamento de
Insulina
Diabete Anomalias no crescimento Anomalias no crescimento
Somatostatina
i
Somatotrofina
I
Ante.Opromotoréum
poelhoeosinaldepe
p
de sua tradução ent
i faes
p
superior àquele resultante era
úti-
funcie
t
Io pharming (p. 295)- O peína acídica do
soro&
peàsubseqüentesecÍÈ ser exatamente o
F
ÍÍH-
VIII Fator IX Fator
Hemofilia
Interferon-cr Interferon-B Interferon-y Interleucinas Fator estimulador de colônia de granulócitos Fator de necrose tumoral Fator de crescimento epidérmico Fator de crescimento de fibroblastos
Eritropoietina Ativador de plasminogênio tecidual Superóxido-dismutase
[agulação sangüínea
i
Proteína surfactante pulmonar
prtes I
p continua a crescer (T* substituição ou
sr4b
& na E*.
inclui viírios fatores para utilização
cr,-antitripsina
Albumina sérica Relaxina Desoxirribonuclease
Doença de Christmas
Leucemia e outros cânceres Cânceres, AIDS
Cânceres, artrite reumatóide Cânceres, enfermidades do sistema imune Cânceres Cânceres
úlceras
úlce.u. Anemia Ataque cardíaco Danos por radicais livres em transplantes renais Insufi ciência respiratória
Enfisema Utllizada como um suplemento de plasma Utilizada como auxiliar no parto Fibrose cística
limitadas no corgn-- &, para a obtenção dr: proteínas, como a db tão grandes qrcn
(2)
As grandes quantidades de partículas virais necessárias para a produção de vacinas são em geral obtidas a partir de culturas de tecidos. Infelizmente, uìgun, vírus, sobretudo o da hepatite B, não se multiplicam nesse tipo de cultura.
Produção de vacinas como proteínas recombinantes A utilização
dos exemplos dadorin iiol"tuou nu corrente srF p o corpo contra u'nf,foF lma forma inaúvada &,
i
lnsistem em partículro&, Fmitar. No passado, dú; I
I
[ça
na vacina de apenc
hm sido I
F
:
:-D
a
umproblemapr
da clonagem
gênica na áreabaseia-se na descoberta de que anticorpos vírus-específicos são às vezes sintetizados em resposta não a toda a partícula virat, mas também contra componentes isolados do vírus. Isso é particularmente verdade para preparações purificadas das proteínas presentes no capsídeoìiral (Figura 14.7).4; h;iesse possibilidade de identificar e inserir em um vetor de expressão os genes que codificam as proteínas antigênicas de um determinado vírus, os métodos descrito-s ant".iorm"nte p*u à ,int"r. de proteínas animais poderiam ser empregados para a produção de proteínas rËcombinantes passíveis de utilização como vacinas, as quais teriam ai vantagens dã não conter partículas virais e de serem obtidas em grandes quantidades.
intactas
Infelizmente, tal abordagem não tem sido aplicada com inteiro sucesso, principalmente porque as proteínas de capsídeo recombinantes muitas vezes não posru"-,odu, as propriedades antigênicas do vírus intacto. uma experiência bem-suceoida foi feita com o vírus da he-
308
T. A. Bnowlr
a
aa a'a
lnjeção na correntê sangüínea
a Proteínas de capsídeo viral isoladas
ts
.C.t r.
. o)--
P o:= )/
t/
Anticorpos especíÍicos contra a proteína de capsídeo
/ lnlecçâo posterior por
/
um vírus completo
'
>.Ì'3% -{.tcrn // tF a}-
'l'$ : í
;'"'
ËT[ï'"ï;ff."ffffiãi"
Figura 14.7 O princípio subjacente ao uso de uma preparação de proteínas de capsídeo viral isoladas como uma vacina.
patite B, cuja proteína de capsídeo (o "antígeno de superfície principal") foi sintetizada em Saccharomyces cerevisiae, utilizando um vetor baseado no plasmídeo de 2 pm (p. lag). A proteína foi obtida em quantidades razoavelmente elevadas e, quando injetada emmacacos, protegeu os animais contra a hepatite B. Essa vacina recombinante já foi aprovada para utilização em humanos.
Vacinas recom
bi
nantes vivas
O uso do vírus da vacínia vivo como uma vacina para a varíola data de 1796, quando Edward Jenner descobriu que esse vírus, inócuo para humanos, eracapazde estimular imunidade contra o vírus da varíola, muito mais perigoso. O termo "vacina" vem de vacínia; o seu uso resultou na erradicação mundial da varíola em 1980.
Uma idéia mais recente considera que vírus de vacínia recombinantes poderiam ser usados como vacinas vivas contra outras doenças. Se um gene codificando uma proteína de capsídeo viral, como, por exemplo, o antígeno de superfície principal da hepatite B, for ligado ao genoma de vacínia sob o controle de um promotor do próprio vírus, ele será expressãdo 1pigura 14.8). Após injeção na corrente sangüínea, a replicação do vírus recombinante resulta não apenas em novas partículas de vacínia, mas também em quantidades significativas do antígeno de superfície principal. O resultado disso é o desenvolvimento de imunidade tanto contra varíola quanto contra hepatite B. Essa técnica notável tem um potencial considerável. Vírus de vacínia recombinantes expressando vários genes exógenos já foram construídos e se demonstraram capazes de confe-
Figura t4-O O princípio subjacente ao uso potencial de um vírus de vacínia recombinante.
rir imunid
possibilid ção de qu do vírus d
rus do her quesüio il
logia viral fera por n
14.2 ldentiÍir
doença
Uma segu grande 14s. fJma cífico (Tat sição ao d hereditária
iq
r
Cr-orunceu GÊrurcn e AruÁr-lse oe
Promotor
vacínia
de -- _ ,/-
z\ íl
DNA
30g
Gene do antígeno de superfÍcie principal da hépatite B
---
/\
\
/ de vacínia
)
---_\
Genoma recombinante
\
\
tnjeção das partícutas de vacínia recombinates na corrente sangüínea
proteÍna da hepatite B
O sistema imune sintetiza anticorpos tanto contra vacínia como contra hepatite B
14.7 ípio subjacente ao de uma preparação proteínas de capsídeo isoladas como uÍna
nl") foi
n
Figura 14.8 O princípio subjacente ao uso potencial de um vírus de vacínia recombinante.
%.
-
ï=
Y=
Vírus de vacínia
Antivacínia Anti-hepatite B
sintetizada en
de 2 pm (p. 140). A o injetada em macacosi foi aprovada para utili-
?1196, quando Edward fimular imunidade conlracínia; o seu uso resul-
rir imunidade contra as doenças correspondentes em animais experimentais (Thbela l4.z). A possibilidade do desenvolvimento de vãcinas de amplo espectro surge a partir da demonstração de que um único vírus de vacínia recombinante,expressando os genes da hemaglutinina do vírus da gripe, do antígeno de superfície principal aa hepatite Beã glicoproteína do vírus do herpes simples, confere imunidade u u-u d"rru, d";;;* em macacos. uma questão importante que agora deve ser "ont "ádu respondida é se sabemos o ,un"ìãnr" a respeito da biologia viral para estarmos certos de que a liberação de vírus a" ua"rnia.e"ombinantes na bios_ fera por meio de programas de vacinação pode ser permitida.
:
btes poderiam
b u.u
ser usa-
proteína de
cap
lepatite B, for ligado ao He será expressado
(E-
b recombinante resulte fes significativas do anle imunidade tanto conI
hia recombinantes extam capares de confe-
1t I
ii
14.2 ldentifica.ção de genes responsáveis por doenças humanaè uma segunda iírea importante de pesquisa médica na qual a cronagem gênica vem tendo um grande impacto é na identificação-e nô isolamenÌo de glnes r"rpoírau"i, por doenças huma_ nas. uma doença genética ou h_ereditária é aquela cauJada pr, il;;;ro em um gene espe_ cífico (Tabela r4.3), com os indivíduos portaàores dogeneìefe"ri* upr"r"ntando predispo_ sição ao desenvolvimento da doença utguÀ estágú de suas vidasim algumas doenças hereditrírias, como a hemofilia, o g"n" "fr"r"nt" no cromossomo X, de modo que homens "tta
310
T. A. Bnowr.r
quanto as do€q cam a segundar pecialmente e4 que seu início s Posição 4 teis d
Tâbela 14.2 Alguns dos genes exógenos que foram expressados em vírus de vacínia recombinantes Gene
Antígeno de superfiçier\ Plasmodiumfalciparum (o parasito da malária)
cuidadosa reaÀ sencadeameúo As doenças tância das mesr vacinação, c a
Proteínas de capsídeo do |írus da gripe Proteína G do vírus daíaiva
Antígeno de superficie principal da hepatite B Glicoproteínas do herpes simples
doenças infecci
Poteínas de envoltório do vírus da imunodeficiência humana (HIV)
alta mortalidad lação morre agt nifestação taü pesquisa médic
Proteínas de capsídeo do vírus da estomatite vesicular Proteínas do vírus Sindbis
igualmente exí Existem inÉ
Tabela 14.3 Algumas das doenças genéticas mais comuns no Reino Unido
doenças
Freqüência (nascimentos por ano)
Doença
Sintomas
Câncer de mama hereditiírio
Câncer
Fibrose cística
Doença pulmonar
I a cada 300 mulheres I em 2.000
Coréia de Huntington
Neurodegeneração
1
Distrofia muscular de
Fraqaeza muscular progressiva
I em 3.000 homens
HemofiliaA
Hemopatia
I
Anemia falciforme
Hemopatia
Fenilcetonúria
Retardo mental
l em 10.000 l em 12.000
B-talassemia
Hemopatia
1
Retinoblastoma
Câncer ocular
Hemofilia B
Hemopatia
Doença de Tay-Sachs
Cegueira, perda de
I em 20.000 I em 25.000 homens I em 200.000
Duchenne
(1)
permitid nejaruml
diúôtm1
ber acoog
.
ncaçãog a doença
em 4.000 homens
controle motor
(3)
ção clínto
A id€ntifi
14.2.1 Como iden
NãO existe ÌÌÍÍE
lhor abordagen preender oa pri
difícil. Esse co mas pessoas so
dem portadores do gene expressam os sintomas da doença; mulheres com um gene defectivo e um gene correto são saudáveis, mas podem transmitir a doença para a sua progênie do sexo masculino. Genes de outras doenças estão presentes em autossomos e, na maioria dos casos, são recessivos, de modo que ambos os cromossomos do par devem portar a versão defectiva para a ocorrência da doença; algumas poucas doenças, inclusive a coréia de Huntington, são autossômicas dominantes, de forma que uma única cópia do gene defectivo é suficiente para provocar a manifestação da doença. Em algumas doenças genéticas, os sintomas manifestam-se precocemente durante a vida do indivíduo afetado. Em outras, os sintomas podem não ser expressados antes que o indivíduo atinja a meia-idade ou a velhice. A fibrose cística é um exemplo do primeiro caso, en-
A identifi
(2) Aidentif
em 2.000
em 20.000
genâ
levaràla
Localizandr Se não háinfu do genoma hu
para que possa
no. O mapeam
comparação & cos cujas pos( estar muito prÍ recombinação
Ct-oruaoeu GÊNrcA E Ar.rÁlrse oe
DNA
31
1
quanto as doenças neurodegenerativas, como as de Alzheimer e a de Huntington, exemplificam a segunda situação. Em diversas patologias que parecem ter componentes genéticos, especialmente em cânceres, a síndrome global é complexa e a doença perÍnanece dormente até que seu início seja desencadeado por algum estímulo metabólico ou ambiental. Se a predisposição a tais doenças pudesse ser diagnosticada, seria possível reduzir o fator de risco pela cuidadosa readequação do estilo de vida do paciente, de modo a minimizar as chances de desencadeamento do processo patológico. As doenças genéticas sempre estiveram presentes nas populações humanas, mas a importância das mesmas vem crescendo em décadas recentes. Isso ocorre porque os programas de vacinação, os antibiótiços e a melhoria das condições sanitiírias reduziram a prevalência de doenças infecciosas, como a varíola, a tuberculose e a cólera, que erÍÌm responsáveis por uma alta mortalidade no início do século XX. O resultado disso é que uma maior parcela da população morre agora de doenças que têm componentes genéticos, especialmente aquelas de manifestação tardia, que agora são mais comuns devido ao aumento da expectativa de vida. A pesquisa médica foi bem-sucedida no controle de muitas doenças infecciosas; poderá ela ser igualmente exitosa no controle de doenças genéticas? Existem inúmeras razões que tornam importante a identificação de genes responsáveis por doenças genéticas.
por ano)
(1)
cada 300 mulheres
(2)
2.000
2.000 3.000 homens 4.000 homens
(3)
10.000
A identificação do gene pode fornecer uma indicação
da base bioquímica da doença, permitindo a elaboração de estratégias terapêuticas. A identificação da mutação presente em um gene defectivo pode ser utilizada para planejar um programa de triagem, de modo a identificar a presença do gene mutante em indivíduos poÍadores que ainda não desenvolveram a doença. Os portadores podem receber aconselhamento a respeito das chances de seus filhos herdarem a doença. A identificação precoce da forma mutante do gene em indivíduos que ainda não desenvolveram a doença permite que sejam adotadas precauções para reduzir o risco de sua manifestação clínica. A identificação do gene é um pré-requisito para a terapia gênica (p. 31a).
12.000
14.2.1 Como identiÍicar um gene responsável por uma doença genética
20.000 20.000 25.000 homens 200.000
um gene defectivo eum progênie do sexo masmaioria dos casos, são a versão defectiva Pan
Huntington, são autoeé suficiente para PÍr> durante a vide $aOos antes que o
indiú-
plo do primeiro caso, eÍF
Não existe uma estratégia única para a identificação de genes que causÍÌm doenças, pois a melhor abordagem depende das informações disponíveis a respeito de cada patologia. Para compreender os princípios desse tipo de trabalho, será considerado o cenário mais comum e mais difícil. Esse ceniário ocoffe quando tudo o que sabemos a respeito de uma doença é que algumas pessoas sofrem dela. Mesmo com um ponto de partida tão vago, as técnicas de DNA podem levar à localização do gene relevante.
Localizando a posição aproximada do gene no genoma humano informação a respeito do gene desejado, como ele pode ser localizado naseqüência do genoma humano? A resposta a essa questão é o retorno aos princípios genéticos básicos, para que possa ser determinada aproximadamente a posição do gene no mapa genético humano. O mapeamento genético é geralmente executado por análise de ligação, que envolve a comparação do padrão de herança do gene-alvo com os padrões de herança de lócus genéticos cujas posições no mapajá são conhecidas. Se dois lócus são herdadosjuntos, eles devem estar muito próximos um ao outro no mesmo cromossomo: se esse não é o caso, eventos de recombinação e a segregação aleatória dos cromossomos durante a meiose resultarão em lóSe não há
312
T. A. Bnowru
cus que apresentÍìm diferentes padrões de herança (Figura 14.9). A demonstração de ligação com um ou mais lócus genéticos mapeados é, portanto, a base para a determinação da posição cromossômica de um gene não-mapeado. Com a espécie huma2a-n(o é possível a realização de programas de cruzamentos dirigidos, visando à determiíação $h posiÇão de mapa de um gene desejado. Em vez disso, o mapeamento de genes associadós a doenças deve utilizar os dados disponíveis a partir de análises depedigree, nas quais a herança do geneé examinada em famílias com uma alta inci-
dência da doença que está sendo estudada. E importante que seja viável amostras de DNA de pelo menos três gerações de cada família - e quanto maior for o número de membros de uma famflia estudados a cada geração, melhor. Via de regra, é possível encontrar pedigrees adequados, a menos que a doença seja muito incomum. A ligação entre a presença/ausência da doença e a herança de outros genes pode ser estudada, mas, a obtenção de
sendo possível marcadores de
Para ilustra nes relacionad ocorreu em 19
fragmentos&
Berkeley. O es mero significa
chamadaDITS mo 17 (Figura no braço longo
tremamente im ne do câncer dl to, acredita-se Portanto, o pró nar BRCAI
lÊ âl
(b) Os genes estão em
cromossomos diÍerentes
ollo
"llo ollo "ll,
ât
w
Isso foi cor petições cuÍtas la mais precisa alelos possívei em um mesmo mapeamento d BRCAI de 20 I um gene é deo
(a) Os genes estão ligados
Figura 14.9 l3
(c) Os genes estão no mesmo cÍomossomo, mas distantes um do outro
ât l;
olo
Produto de recombinação
t;
Padrões de herança para genes ligados e não-ligados. Três ÍamÊ lias são mostradas, com os círculos representando indivíduos do sexo Íeminino e os quadrados representando indivíduos do sexo masculino. (a) Dois genes com ligação estreita são quase sempre herdados em conjunto. (b) Dois genes em diÍerentes cromossomos apresentam segregação aleatória. (c) Dois genes em um mesmo cromossomo, mas distantes um do outro, são Íreqüentemente herdados juntos, mas eventos de recombinação podem separá-los.
Mapeamento do gen mama. lnicialmente, o g do em um segmento de mossomo 17 (região real nho à esquerda). Experil peamento adicionais res segmento a uma região r queada por dois lócus pn peados, D1751321 e D|, nho central). Após o r qüências expressadas, um Íorte candidato a ser
Cloruroeu GÊNrcA
pnstração de ligação bterminação da posiÈcruzamentos dirigi,Em vez disso, o maúveis a partir de anáìs com uma alta inci-
riável a obtenção de tanto maior for o núVia de regra, é possí-
,incomum. A ligação
le ser estudada, mas,
lura
E ANÁLtsE
oe
DNA
sendo possível a análise de amostras de DNA, é geralmente preferida a análise de ligação a marcadores de DNA (p.262). Para ilustrar como a aniílise de ligação éatilizada, será visto brevemente como um dos genes relacionados ao câncer de mama humano foi mapeado. O primeiro avanço desse projeto ocorreu em 1990, como resultado de análises de ligação de polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP) executadas por um grupo da Universidade da Califórnia em Berkeley. O estudo mostrou que, em famflias com alta incidência de câncer de mama, um número significativo de mulheres que sofriam da doença possuía a mesma versão de uma RFLP, chamada Dl7574.Essa RFLP havia sido previamente mapeada no braço longo do cromossomo 17 (Figura 14.10): o gene buscado - BRCAL - deveria, portanto, também estar localizado no braço longo do cromossomo 17. Esse resultado inicial da análise de ligação mostrou-se extremamente importante, pois indicou em qual região do genoma poderia ser encontrado o gene do câncer de mama, embora ainda estivesse longe de indicar a sua localização exata. De fato, acredita-se que mais de 1.000 genes estejam nessa porção de 20 Mb do cromossomo 17. Portanto, o próximo objetivo era arealização de mais estudos de ligação para tentar posicionar BRCA| com maior precisão. Isso foi conseguido inicialmente pelo exame da região contendo BRCAI em busca de repetições curtas em tandem (STRs) (p.262).As STRs são úteis para o mapeÍÌmento em escala mais precisa porque muitas delas existem em três ou mais formas alélicas, em vez dos dois alelos possíveis para uma RFLP. Portanto, vários alelos de uma STR podem estar presentes em um mesmo pedigree, o q\e viabiliza a execução de um mapeamento mais detalhado. O mapeamento de ligações de repetições curtas em tandem reduziu o tamanho da região de BRCAI de 20 Mb para apenas 600 kb (Figura 14.10). Essa abordagem para a localização de um gene é denominada clonagem posicional.
14.9
hrões de herança hÍa genes ligados e lo-ligados. Três famÊ b são mostradas, iln os círculos reprebntando indivíduos do Ero Íeminino e os padrados represenlrdo indivíduos do seb masculino. (a) Dois pres com ligação esEita são quase semire herdados em connto. (b) Dois genes ;n diÍerentes cromosDÍÍìos apresentam sepegação aleatória. (c) lois genes em um nesmo cromossomo, ms distantes um do [tro, são Íreqüentenente herdados junDS, mas eventos de reDÍnbinação podem s+
nrá-los.
313
I Figura 14.10 Mapeamento do gene do câncer de mama. lnicialmente, o gene Íoi mapeado em um segmento de 20 Mb do cromossomo 17 (região realçada no desenho à esquerda). Experimentos de mapeamento adicionais restringiram esse segmento a uma região de 600 kb Ílanqueada por dois lócus previamente mapeados, D1751321 e D1751325(desenho central). Após o exame das seqüências expressadas, foi identiÍicado um forte candidato a ser BBCÁí (desenho à direita).
D17s74-[,..
I I Cromossomo 17 (80 Mb)
|""",
314
T. A. Bnowr,r
ldentificação de candidatos a genes responsáveis por doenças
reta do
u^atÀtdeterminada a posição do gene no mapa, poderia-se imaginar que a próxima
de qualq
etapa
seria simplesmente analisar a seqüência do genoma para identificar o gene procurado. Infelizmente, ainda resta uma grande quantidade de trabalho a ser feita, pois o mapeamento genético' mesmo na sua forma mais precisa, dá apenas uma indicação aproximadaãa localização do gene. No projeto câncer de mama, os pesquisadores tiveram sorte de conseguir reduzir-aárea de busca para apenas 600 kb; freqüentemente, uma extensão de l0 Mb ou mais de seqüência de DNA deve ser examinada. Esses longos segmentos de DNA podem conter muitos genes: os 600 kb da região do câncer de mama contêm mais de 60 genei e qualquer um deles pode-
rjaser BRCAI. Viírias abordagens podem ser empregadas pa.ra identificar qual dos genes da região ma-
peadaé responsável pela doença.
(1)
(2)
(3)
Os perhs de expressão dos genes-candidato podem ser examinados por análise de hibridização ou por transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase 6r-ecn; (p. 230) de RNA de diferentes tecidos. poderia-se esperar que BRCAI, por exemplo, hibridizasse com RNA preparado a paftir de tecido mamiírio e também com RNA de tecido ovariano, pois câncer de oviírio freqüentemente está associado a câncer de mama.
uma análise por hibridização de Southem (p. 206) pode ser executada com DNA de di_ ferentes espécies (os chamados zoo blots). A base disso é que um gene humano impor-
tante quase que certamente terá homólogos em outros mamíferos e esses homólogos, embora tendo seqüências um pouco diferentes da versão humana, serão detectáveis por hibridização com uma sonda adequada. As seqüências dos genes podem ser examinadas em indivíduos com e sem a doença, para verificar se os genes de indivíduos afetados contêm mutações capues de explicar
ior
(4)
que eles têm a doença. Para confirmar a identidade de um gene-candidato, pode ser possível preparar-se um camundongo-nocaute (p.269), que possui uma versão inativa do gene correspondente. se o camundongo-nocaute apresentar sintomas compatíveis com a doença humana, então o gene-candidato é quase que certamente o correto.
Quando aplicado à região do câncer de mama, esse tipo de análise resultou na identificação de um gene de aproximadamente 100 kb, que é um iorte candidato a ser BRCÁ1. Ele é formado pot 22 óxons e codifica uma proteína de 1.863 aminoácidos. Transcritos do gene foram detectados em tecidos mamiírio e ovariano e genes homólogos a ele estão pr"rJnt", camundongos, ratos, coelhos, ovelhas e porcos, mas não em galinhas. E, mais iÀportante, "* os genes de cinco famflias suscetíveis continham mutações (como mutações de muáança de fase ou sem sentido), que provavelmente levam a uma proteína não-funcional. Embora circunstanciais, as evidências em suporte do candidato foram suficientemente convincentes paÍa que esse gene fosse identificado como sendo BRCÁ1.
g
examina
cas envo
14.3.1 Terapii Existem
terapia d uma cóp for bemresultant célula-or hereditrár
A ter
las que p po. Essa
talassem
dula
óssr
consiste tar essas
qüente n sente en viral é q
permite o novo
A
r
I
ter
monares do
emli;
dução nr
apenas d
eficiente Para
dificar u
remoção genética quadm p
mas tam
que pror
modo qr
uma técl
aplicaçã
14.3 Terapia gênica A aplicação final da tecnologia de DNA recombinante na medicina que será aqui considerada é a terapia gênica. Esse é o nome que foi originalmente dado uìétodo, que têm por
objetivo a cura de uma doença hereditária pela introdução, no paciente, de umã cópia cor-
14.3.2 Terapi A utiliza Já foram
fecção d sa mais i
) Cr-orecev GÊr'ircn e ANÁLtsE oe
[oenças Ique a próxima etapa
I
procurado. InfelizImapeamento genétihda da localizacão do
fsegui, reduzir
a rírea
bu mais de. seqüência ponter murtos genes: Suer um deles podeI
da região ma-
Is"n", I
ir por análise de
hibri-
knr-pcn) (p.230) de [emplo, hibridizasse [A de tecido ovariano,
h*u.
hdu.o-
DNA de di-
humano impor[gene e esses homólogos, I detectáveis por
frão
,"*
in
" pzes
a doença, pade explicar por
I
lr"p*ar-se um cacorrespondente. Se fe humana, então Snça fel
i r
huttou
na identifica-
I ,", BRCA\.Ele u
é
pnscritos do gene foestão presentes em mais importaxte, os I de mudança de faS Je
hd. Embora circunsfonvincentes para que t
l t
f" *.u
aqui consideptodos que têm por l, de uma cópia cor-
DNA
315
reta do gene defectivo. O conceito de terapia gênica foi agora estendido para incluir a cura de qualquer doença pela introdução de um gene clonado no paciente. Primeiramente, serão examinadas as técnicas utilizadas na terapia gênica e depois serão tratadas as questões éticas envolvidas.
14.3.1 Terapia gênica para doenças hereditárias Existem duas abordagens básicas para a terapia gênica: a terapia de linhagens germinais e a terapia de células somáticas. Na terapia de linhagens germinais, um óvulofecundudo recebe uma cópia da versão correta do gene relevante e é reiLptantado na mãe. Se o procedimento for bem-sucedido, o gene estará presente e será expressado em todas as células do indivíduo resultante. A terapia de linhagens germinais é geralmente feita pela microinjeção de DNA na célula-ovo isolada (p. 11 1) e, teoricamente, poderia ser utilizada para ftatar qualquer doença hereditária. A terapia de células somáticas envolve a manipulação de células comuns, em geral aquelas que podem ser removidas do organismo, transfectadas e depois colocadas de volta no corpo. Essa técnica é mais promissora para hemopatias hereditiírias (por exemplo, hemofilias e talassemias), com o tratamento sendo feito pela introdução de genes em células-tronco da medula óssea, que dão origem a todos os tipos celulares especializados no sangue. A estratégia consiste em preprÌrar um extrato de medula óssea contendo viírios bilhões de células, transfectar essas células com um vetor de tipo retroviral e depois reimplantáJas no paciente. A subseqüente replicação e diferenciação de transfectantes faz com que o gene adicionado esteja presente em todas as células sangüíneas maduras (Figura 14. I 1). A vantagem de um vetor retroviral é que tal tipo de veículo tem uma freqüência de transfecção extremamente alta, o que permite que uma grande proporção das células-tronco em um extrato de medula óssea receba o novo gene. A terapia de células somáticas também tem potencial para o tratamento de doenças pulmonares, como a fibrose cística, pois DNA clonado em vetores adenovirais (p. 160) ou contido em lipossomos (p. 155) pode ser incorporado por células epiteliais pulmonares após introdução no trato respiratório por meio de um inalador. Entretanto, a expressão do gene ocorre apenas durante poucas semanas e, até agora, essa estratégia ainda não é considerada um meio eficiente para o tratrÌmento da fibrose cística. Para aquelas doenças genéticas cuja patologia surge em função de o gene mutado não codificar uma proteína funcional, é necessiírio fornecer à célula uma versão correta do gene: a remoção dos genes defectivos não é necessária. A situação é mais complicada para doenças genéticas dominantes (p. 31 l), pois, nelas, é o produto do gene defectivo que rãsponde pelo quadro patológico, de modo que a terapia deve incluir não somente a adição do gene correto, mas também a remoção da versão defectiva. Isso requer um sistema de transferência do gene que promova a recombinação entre a cópia fornecida pelo vetor e a cópia cromossômica, de modo que a cópia cromossômica defectiva seja substituída pelo g"n" do vetor. Trata-se de uma técnica complexa e inconfiável, não tendo ainda sido desenvolvidos procedimentos de aplicação mais amplos para ela.
14.3.2 Terapia gênica e câncer A utilização clínica da terapia gênica não está limitada ao tratamento de doenças hereditiírias. foram feitas tentativas de utilização da clonagem gênica para a interrupçãode ciclos de infecção de patógenos humanos, como o vírus da AIDS. Contudo, atualmente, a fuea depesquiJá
sa mais intensiva na terapia gênica está relacionada à sua
utilização no tratamento do câncer.
316
T. A. Bnowlr
desenvolvim
Célula-tronco isolada
Novo gene
o 'ì
do seja incorl
Uma nova matasse seleti
eficiente pa compreensão e
da. São
TransÍecção
conh
em um tunx)Í O aspecto bás às células ca um sistema ú
expressado 4r
@ Reimplante
@
motor que é a Umaoumr
"u,,,",
temaimuneú
nos teoricam fortes, que sã muitas outras ta contra o câ
aasoriro
/..3
\.t/
Eosinórito
14.3.3 As questõ
NeutróÍilo
Figura 14.11 Monócito
Todas as células maduras contêm o novo gene
A diferenciação de uma célula-tronco transfectada faz com que o novo gene esteja presente em todas as células sangüÊ neas maduras.
A terapia g€ni tões éticas, es jeção justificá
ne da fibrme I
dula são aceiti mopatias porl rível que a rc
criticável com Por outro I
quesüio. O prr doenças hered
A maioria dos cânceres resulta da ativação de um oncogene que leva à formação de um tu-
mor ou à inativação de um gene que normalmente suprime u roà fo.-ução. Em ambos os casos, pode-se considerar a terapia gênica para o tratamento do câncer. A introdução de um gene que codifica uma cópia de RNA anti-senso (p.32D de um oncogene poderia, po. plo, reduzir ou impedir a expressão do oncogene e reverter a sua atividadã "*Ã_ tumorogênica. Se o câncer é causado pela inativação de um gene supressor de tumor, a terapia gênica iria envolver a introdução de uma versão ativa daquele gene. O maior obstáculo no momento não é a identificação dos genes apropriados parautilização na terapia gênica do câncer, mas, sim, o
ção, nessas
m
senvolvimenta nética" mas, si
plo, alteraçõe pulação, no
ç
hereditiíri4 é dificil amaniF e
solucionafuso dzds dg sansãr
r
Cr-oruacev GÊuca e ANÁLtsE oe
DNA
317
desenvolvimento de métodos de administração adequados, que assegurem que o gene clonado seja incorporado pelas células cancerosas. Uma nova aplicação da terapia gênica para o câncer seria a introdução de um gene que matasse seletivamente células cancerosas. Essa abordagem é considerada como a mais geral e eficiente para o tratamento de muitos tipos de câncer, principalmente porque não requer uma compreensão detalhada das bases genéticas da doença que está sendo especificamente tratada. São conhecidos muitos genes que codificam proteínas tóxicas e a introdução de um deles em um tumor deveria resultar na morte das células cancerosas e na recuperação do paciente. O aspecto básico dessa estratégia é que o gene clonado deve ser direcionado especificamente às células cancerosas, para que células saudáveis não sejam atingidas e mortas. Isso exigiria um sistema de administração bastante acurado ou algum meio de assegurÍÌr que o gene fosse expressado apenas nas células cancerosas, por exemplo, colocando-o sob controle de um promotor que é ativo apenas naquelas células. Uma outra abordagem utllizaaterapia gênica para aumentar a eficiência com a qual o sistema imune do paciente naturalmente mata as células cancerosas. Isso pode ser feito, pelo menos teoricamente, com um gene que faça com que as células tumorais sintetizem antígenos fortes, que são eficientemente reconhecidos pelo sistema imune. Todas essas abordagens e muitas outras que não são baseadas em terapia gênica estão sendo atualmente testadas na luta contra o câncer.
14.3.3 As questões éticas provocadas pela terapia gênica
: (
Fgura 14.11
I
diÍerenciação de
Lna célula-tronco hansÍectada Íaz bm que o novo fene esteia prebnte em todas as lélulas sangüÊ bas maduras. !
i fonnaçao de um tuL Em ambos os capdução de um ge-
poderia, por exemI tumorogênica. Se
:^.
lgenlca rna envolmomento não é a Éncer, mas, sim, o D
li'
r
t
t
A terapia gênica deve
ser utilizada na cura de doenças humanas? Como muitas outras questões éticas, essa pergunta não tem uma resposta simples. Certamente não haveria qualquer objeção justif,rcável à rotina de aplicação, via um inalador respiratório, de versões corretas do gene da fibrose cística para tratamento dessa doença. Da mesma forma, se transplantes de me-
dula são aceitáveis, fica dificil argumentar contra terapias gênicas destinadas à correção de hemopatias por meio de transfecção de células-tronco. Ademais, o câncer é uma doença tão terrível que a recusa de métodos de tratamento eficientes por motivos morais seria ela mesma criticável como imoral. Por outro lado, a terapia de linhagens germinativas representa um aspecto mais difícil da questão' O problema é que as técnicas utilizadas para a coffeção, em linhagens germinais, de doenças hereditiárias são exatamente as mesmas que poderiam ser utilizadas parã a manipulação, nessas mesmas linhagens, de quaisquer outras características hereditiárias. De fato, o desenvolvimento dessa técnica para animais não foi feito visando à cura de qualquer doença genética, mas, sim, com o objetivo de "melhorar" animais domésticos, proàuzindo, por exemplo, alterações genéticas que resultem em um menor conteúdo de gordura. Tal tipó de manipulação, no qual a constituição genética de um organismo é alterada de uma -unãi.a dirigida e hereditária, é claramente inaceitável para humanos. Atualmente, problemas técnicos tornam difícil a manipulação de linhagens germinais humanas. Antes de problemas como esses serem solucionados, deveríamos nos assegurar de que o desejo de fazer o bem não trará a possibilidade de causar um mal muito maior.
Cnpírulo 15 coli of
a
Clonagem Gênica e Análise de DNA na Agricultura
DNA sequence
l synthesized genes
synthesized gene for
üe
atual do desenvolvimenovarian cancer suscepti-
factorVIII in milkOxford. [Contém gênica.l (Publicado em A estratégia de adição de um gene na engenharia genética vegetal, 320
Problemas com vegetais geneticamente modifi cados,
330
A subtração de genes, 324
A agriculhrra, ou, mais especificamente, o cultivo de plantas, é a mais antiga biotecnologia do mundo, com uma história conúnua que se estende para mais de 10.000 anos. Durante todo esse período, os homens têm constantemente procurado melhorar as variedades de suas culturas: variedades com melhores qualidades nutricionais, maior rendimento, ou características que auxiliam no seu cultivo e colheira. Durante os primeiros milênios, as melhorias nas lavouras ocoÍrerÍìm de uma maneira esporádica, mas, nos últimos séculos, novas variedades foram obtidas por meio de programas de cruzamento cada vez mais sofisticados. No entanto, o programa de cruzamento mais sofisticado ainda retém o elemento do acaso, dependendo dele para que ocorra a união aleatória das caracteísticas parentais na descendência híbrida que é produzida. O desenvolvimento de uma nova variedade de cultura, apresentando uma combinação precisa das características desejadas, é um processo longo e difícil. A clonagem gênica fornece uma nova dimensão para os cruzamentos na agricultura, por possibilitar que modificações direcionadas sejam realizadas no genótipo da planta, enganando o processo aleatório, inerente dos cruzamentos convencionais. Duas estratégias gerais são utilizadas:
(1)
A adição de um gene, na qual a clonagem é utilizada para alterar as características
(2)
uma planta por fornecer a ela um ou mais genes. A subtração de um gene, na qual técnicas de engenharia genética são utilizadas para inativar um ou mais genes existentes na planta.
de
Inúmeros projetos estão sendo realizados em todo o mundo, muitos por companhias biotecnológicas, objetivando a exploração do potencial da adição ou da subtração gênica na melhoria das culturas. Neste capítulo, será investigada uma seleção representativa desses projetos, bem como analisados alguns dos problemas que devem ser resolvidos, caso a engenharia genética vegetal seja amplamente aceita na agricultura.
32O
T. A. Bnowlr
15.1 A estratégia de adição de um gene na engenharia genética vegetal A adição de um gene envolve
a utilização de técnicas de clonagem para introduzir em uma planta um ou mais genes novos, que codificam características úteis que a planta não possui. Um bom exemplo da técnica é fomecido pelo desenvolvimento de plantas que resisrcmão a12que de insetos por meio da síntese de inseticidas codificados pelos genes clonados.
15.1.1 Plantas que produzem os seus próprios inseticidas As plantas estão sujeitas à predação por praticamente todos os demais tipos de organismos vírus, bactérias, fungos e animais -, mas, em termos de agricultura, os maiores prúlemas são causados por insetos. Para reduzir as perdas, as culturas são regularmente vaporizadas com inseticidas. A maioria dos inseticidas convencionais (p. ex., piretróides e organofosfatos) é um veneno relativamente não-específico, que mata uma ampla variedade de insetos, não apenas aqueles que devoram as lavouras. Devido à sua elevada toxicidade, viírios desses inseticidas também possuem efeitos colaterias extremamente perigosos pÍÌra os outros membros da biosfera local, incluindo, em alguns casos, o homem. Tais problemas são intensificados pela necessidade de aplicação de inseticidas convencionais nas superfícies das plantas por intermédio de vaporização, o que significa que os deslocamentos subseqüentes dos proãutos químicos no ecossistema não podem ser controlados. Além disso, insetos que vivem dentio das plantas, ou nas partes de baixo das folhas, podem, algumas vezes, escapa.r totalmente dos efeitos tóxicos. Quais as características que um inseticida ideal deveria apresentar? Certamente ele deverá ser tóxico aos insetos contra os quais é direcionado, mas, se possível, essa toxicidade deveria ser altamente seletiva, de forma que o inseticida fosse inofensivo para os demais insetos e não venenoso aos animais e aos homens. O inseticida deveria ser biodegradável, de forma que qualquer resíduo que pennanecesse após a colheita da cultura, ou que fosse arrastado para longe da plantação pela chuva, não permanecesse por um longo período para não prejudicar o meio ambiente. Além disso, deveria ser possível aplicar o inseticida de tal maneiru qu" todas as partes da planta, não somente suas superfícies superiores, fossem protegidas contra o ataque dos insetos. O inseticida ideal não foi ainda descoberto. O mais próximo que se tem são as õ-endotoxinas produzidas pela bactéria do solo Bacillus thuringiensis.
As ô-endotoxinas de Baciilus thuringiensis Os insetos não comem apenas plantas: as bactérias também constituem uma parte ocasional da sua dieta. Em resposta, vírios tipos de bactérias desenvolveram mecanismos de defesa contra a predação dos insetos, um exemplo sendo B. thuringiensis, a qual, durante a esporulação,
forma corpos cristalinos intracelulares que contêm uma proteína inseticida chamaàa ô-enOotoxina' A proteína ativada é altamente venenosa aos insetos, algo 80.000 vezes mais tóxico
que os inseticidas organofosfatos, e é relativamente seletiva. Diferentes linhagens de bactéria sintetizam proteínas efetivas contra as larvas de diferentes grupos de insetos (Tabela 15.1). A proteína ô-endotoxina que se acumula na bactéria é um piecursor inativo. Após a ingestão pelo inseto, essa pró-toxina é clivada por proteases, resultando em versões mais curtas da proteína que apresentam a atividade tóxica, ligando-se na parte interna do intestino do inseto
Tabela 15.1
I
B. thuringiensi
Tipo de &endr
CryI
CrytI CTyIII
CryIV CryV
CryVI
e
danificando
a
qüentemente, r em diferentes 1 dades apresenr
As toxinas, ra a sua
utilizr
ocorreram vári mas suas biode veriam ser rci{ custos do agric tem de reaplic 247), modifica abordagem é
n
Clonando u
O milho consti
convencionais. dentro da plant escapando dos tenção dessa g realizada pelos Eles trabalhara da serumapml
to situado entrr ba-Geigy cons
síntese gênica a ra melhorar a s
artificial foram
pares GC do ge
são bacteriana I
(p 285), entre
!
Ct-onnceu GÊr.rrcr e ANÁLtsE
haria
que resistem ao ata-
i
clonados.
5 foos de organismos piores problemas são ivaporizadas com inbrganofosfatos) é um b insetos, não apenas bs desses inseticidas membros da biosios tsnsificados pela ne-
Íplantas por intermé-
ldos produtos químifue vivem dentro des totalmente dos efei-
:
Frrtamente ele deveessa toxicidade devea os demais insetos e
adável, de forma que fosse arrastado para l para não prejudicar b tal maneira que ton protegidas contra o fuem sao as ô-endotoI i ! I:
i
I uma pane ocasional hismos de defesa con-
hrante a esporulação chamada ô-ende iida I l)0 vezes mais tóxico
iiot ug"n,
de bactéria betos (Tabela 15.1).
ingeslnrsões mais curtas da fo intestino do inseto : I
321
Tabela 15.1 A abrangência de insetos envenenados pelos viírios tipos de ô-endotoxinas de
b
foativo. Após
DNA
B. thuringiensis
F introduzir em uma I a planta não possui.
f
DE
a
Tipo de ô-endotoxina
Efetiva contra
CryI CryII CryIII CryIV CryV CryVI
Larvas de lepidópteros (traça e borboleta) Larvas de lepidópteros e dípteros (mosca de duas asas) Larvas de lepidópteros Larvas de dípteros Vermes nematódeos Vermes nematódeos
e danificando a superficie epitelial, de forma que o inseto é incapaz de alimentar-se e, conseqüentemente, molre de fome (Figura 15.1). A variação na estrutura desses sítios de ligação, em diferentes grupos de insetos, é, provavelmente, a principal causa das elevadas especificidades apresentadas pelos diferentes tipos de ô-endotoxinas. As toxinas de B. thuringíensis não são descobertas recentes, sendo a primeira patente para a sua utilização na proteção de lavouras sido concedida em 1904. Com o passar dos anos,
ocoÍïeram várias tentativas de transformá-las em inseticidas inofensivos ao meio ambiente, mas suas biodegrabilidades atuaram como uma desvantagem, pois isso implicava que elas deveriam ser reaplicadas em intervalos regulares durante o período de cultivo, aumentando os custos do agricultor. As pesquisas atuais visam à obtenção de ô-endotoxinas que não necessitem de reaplicações regulares. Uma abordagem é por meio da engenharia de proteínas (p. 247), modifrcando-se a estrututra da toxina, de forma a torná-la mais estável. Uma segunda abordagem é modificar a cultura, para que ela própria sintetize a toxina.
Clonando um gene de ô-endotoxina no milho O milho constitui-se em um exemplo de lavoura que não é bem protegida pelos inseticidas convencionais. A maior peste é a broca do milho (Ostrinia nubilialis), a qual forma um túnel dentro da planta, a partir de ovos depositados nas superfícies internas das folhas, e, portanto, escapando dos efeitos dos inseticidas aplicados por vaporização. A primeira tentativa de contenção dessa peste foi a modificação de plantas de milho para a produção de ô-endotoxinas, realizada pelos biotecnologistas vegetais do laboratório da Ciba-Geigy, na Carolina do Norte. Eles trabalharam com a versão CryIA(b) da toxina, a qual havia sido previamente demonstrada ser uma proteína de I . 155 aminoácidos, com a atividade tóxica localizada em um segmento situado entre os aminoácidos 29 a6OT.Emvezde isolarem o gene natural, o grupo da Giba-Geigy construiu uma versão mais curta, contendo os primeiros 648 códons, por meio de síntese gênica artificial. Essa estratégia possibilitou a introdução de modificações no gene para melhorar a sua expressão nas plantas de milho. Por exemplo, os códons utilizados no gene artificial foram aqueles que se sabia serem os preferidos pelo milho, tendo o conteúdo total de pares GC do gene sido ajustado para65Vo, comparado com o conteúdo de GC de387o da versão bacteriana nativa do gene (Figura 15.2a). O gene artificial foi ligado em um vetor-cassete (p 285), entre um promotor e um sinal de poliadenilação do vírus do mosaico da couve-flor
322
T. A. Bnowr.r
Gene da &endotoxina
Expressão
bactéria
-
na
-
Toxina ativa
Danos às células epiteliais do intestino
Figura 15.1 Modo de ação de uma ô-endotoxina.
(Figura 15.2b), e introduzido em embriões de milho, pelo bombardeamento de microprojéteis cobertos com DNA (p. 111). Os embriões desenvolveram-se em plantas maduras, e os transformantes foram identificados pela aniílise dos DNAs extraídos pela reação de polimerização em cadeia (PCR), utilizando-se iniciadores específicos para um segmento do gene artificial (Figura 15.2c). A etapa seguinte foi utilizar um teste imunológico para determinÍÌr se a õ-endotoxina estava sendo sintetizada pelas plantas transformadas. Os resultados demonstraram que o gene artificial era ativo, mas as quantidades de õ-endotoxina produzidas variavam de uma planta para outra, desde aproximadamente 250 a 1.750 ng de toxina por miligrama de proteína total. Tais diferenças eram, provavelmente, devidas aos efeitos de posição; o nível de expressão de um gene clonado em uma planta (ou animal) freqüentemente é influenciado pela localização exata do gene nos cromossomos do hospedeiro (Figura 15.3). As plantas transformadas eram capazes de resistir aos ataques da broca do milho? Isso foi testado em trabalhos de campo, nos quais plantas de milho transformadas e normais foram artificialmente infestadas com larvas e os efeitos da predação, medidos durante um peúodo de seis semanas. Dois critérios foram utilizados: (l) a quantidade de perdas apresentada pela folhagem das plantas infestadas e (2) a extensão dos úneis produzidos pelas larvas que penetraram nas plantas. Em ambos os aspectos, as plantas transformadas apresentaram melhores re-
{a il,:
I'
t" E*
ê* b ft F
Ë E E b P
b. F.
Figura 15ú Etapas importantes n procedimento utilizad para a obtenção ú plantas de milho gene ticamente modifica das, expressando un gene de ô-endotoÍni artificial
Figura 153 EÍeitos de posição.
Crorueeeu GÊrurcn
(a) Síntese de um gêne de õ-endotoxina
E ANÁLtsE
oe
DNA
323
artiÍicial
1
1155
Gene de B. thuringiensis
Gene artificial
29
607 Códons preferenciais e conteúdos de GC apropriados ao milho
(b) Ligação de um promotor e sinal de poliadenilação
-
Seqüência promotora
Seqüência de poliadenilação
(c) Análise por PCR das plantas maduras
-
123
t--------1 t----------, t-------7 1. Marcadores de tamanho de DNA
:
de ação de urrar
de microprojércir
maduras, e os tranÍF de
polimeri"afr
do gene artificiCl a
2. Resultado da PCR com DNA de uma planta transÍormada
Figura 15.2 Etapas importantes no procedimento utilizado para a obtenção de plantas de milho geneticamente modiÍicadas, expressando um gene de ô-endotoxina artiÍicial.
3. Resultado da PCR com DNA de uma planta não-transformada
ô-endotoxina*
de uma plante de proteína totalúvel de expressão dc
iado pela localização
\----..-...- Gene inserido na posição A
fracamente expressado
do milho? Isso
fci
foram
r-
e normais
te um período de apresentada pela folarvas que penetra-
melhores re-
Cromossomo
Figura 15.3 EÍeitos de posição.
\
o"n"
inserido na posição B altamente expressado
-
324
T. A. Bnowr.r
sultados dos que as normais. Em especial, o comprimento médio dos túneis das larvas foi reduzido de 40,7 cm nos controles para apenas 6,3 cm nas plantas modificadas. Em termos reais, esse é um nível de resistência muito significativo.
15.1.2 Outros proietos de adição de genes O milho não é a única planta que foi modificada para produzir a ô-endotoxina. Projetos semelhantes foram realizados com anoz, algodáo, batata, tomate e outras culturas. Tampouco a resistência a insetos é a única abordagem. Resultados igualmente bem-sucedidos foram obtidos com genes que codificam inibidores de proteinases, pequenos polipeptídeos que interrompem a atividade de enzimas no intestino do inseto, impedindo ou retardando o crescimento. Inibidores de proteinases são produzidos naturalmente por viírios tipos de plantas, principalmente legumes, tais como ervilhas e o feijão comum, e seus genes têm sido, de forma exitosa, transferidos para outras culturas, as quais normalmente não produzem quantidades significativas dessas proteínas. Os inibidores são eficientes sobretudo contra larvas de besouros que se alimentam de sementes e, assim, podem ser uma alternativa melhor do que as õ-endotoxinas para plantas, cujas sementes são estocadas por longos peíodos. Exemplos de outros projetos de adição de genes estão listados na Tabela l1.Z.Emmuitos casos, o objetivo é melhorar a capacidade da planta de resistir a pestes, tais como insetos, fungos, bactérias e vírus, ou de torná-lacapaz de resistir aos efeitos tóxicos dos herbicidas utilizados para controlar ervas daninhas. Outros projetos estão começando a explorar a utilização da modificação genética para melhorar a qualidade nutricional das plantas cultiváveis, por exemplo, pelo aumento do conteúdo de aminoácidos essenciais e pela alteração da bioquímica da planta, de forma que uma maior quantidade de nutrientes fique disponível para ser utilizada durante a digestão nos seres humanos ou animais.
15.2 A subtração de genes
Tabela 15.i
Gene de
ô-endotoxin Inibidores d Chitinase
Glucanase Proteína in"a
Omitinoca RNA-polim RNAs sarél Proteínas
d
2'-5'-oligoa Acetolacta!
Enolpiruvil
fosfatosi Glifosato-o
Nitrilase Fosfinorict Inibidor da ribonucle DNA-adeni
Proteína ri<
Aminocick ácido carì
S-Adenosil
A subtração de genes
é uma denominação imprópria, pois a modificação não envolve a remoreal de um gene, simplesmente a sua inativação. Existem várias maneiras pelas quais um ção único gene escolhido pode ser inativado em uma planta viva, a mais bem-sucedida até o momento, em termos práticos, vem sendo a utilização da tecnologia do anti-senso. O exemplo que será analisado é um dos mais importantes, uma vez que resultou emum dos primeiros gêneros alimentícios geneticamente modificados a ser aprovado para a venda ao público geral.
Monelina Taumatina Proteína
ú
gnpo Delta-12ì de
15.2.1 O princípio subjacente à tecnologia do anti-senso Em um experimento de anti-senso, o gene a ser clonado é ligado em um vetor na orientação inversa (Figura 15.4). Isso significa que quando o "gene" clonado é transcrito, o RNA que é sintetizado é o complemento reverso do RNA mensageiro (mRNA) produzido a partir da versão normal do gene. Esse complemento reverso será referido como um RNA anti-senso, algumas vezes abreviado com asRNA. Um RNA anti-senso pode impedir a síntese do produto do gene contra o qual ele é direcionado. O mecanismo de como isso ocorre não está totalmente esclarecido, mas é quase certo que envolve a hibridização entre as cópias anti-senso e senso do RNA (Figura 15.5). É possível que o bloqueio na expressão surja porque a molécula de RNA de fita dupla resultante é rapidamente degradada pelas ribonucleases celulares, ou a explicação pode ser que o RNA anti-senso simplesmente impede que os ribossomos se liguem à fita senso. Independentemente
it c
t Ë.
b
de qual se uma IIüme
15.2.2 O RNA t em Íruti Até o
merr
mente mll tados até c o processi(
Crorunesu GÊNtcA
flqnmfuire
E ANÁLtsE oe
DNA
gàs
Thbela 15.2 Exemplos de projetos de adição de genes em plantas
F:mrm,
mrrotmmrwr. ffima@olüfu
Organismo de origem
à
ô-endotoxina Inibidores de proteases Chitinase
B. thurtngiensis
Resistência Resistência Resistência Resistência Resistência Resistência Resistência
a
Resistência Resistência Resistência Resistência Resistência
vírus vírus a vírus a herbicidas a herbicidas
Glucanase Proteína inativadora de ribossomos
úffimsqltu
m#.
Característica conferida
Gene de
Ornitino-carbomil-transferase RNA-polimerase, helicase
Vários legumes
Arroz Alfafa Cevada Pseudomonas syringae
Luteovírus da folha
planta modihcada a insetos a insetos
fungos fungos a fungos a a
a bactérias
vírus
enrolada da batata
Ugmnm;m
pmd[.
RNAs satélites Proteínas do capsídeo viral
mmnün
2'-5'-oligoadenilato-sintetase Acetolactato-sintase Enolpiruvilchiquimato- 3fosfato-sintase Glifosato-oxido-redutase
olrw-*'*hr-
mm
mmmür-
Ochrobactrum anthropi Klebsiella ozaenae
Fosfinotricino-acetil-transferase
Streptomyces spp.
Inibidor da barnase-
B acíllus
ribonuclease DNA-adenino-metilase Proteína rica em metionina
Esterilidade do macho
E. coli
Aminociclopropanoácido carboxílico-deaminase .l-Adenosilmetionino-hidrolase
Orqp
Agrobacterium spp.
a
a
Resistência a herbicidas Resistência a herbicidas Resistência a herbicidas
Nitrilase
omtífrc+tu
Viírios vírus Viírios vírus Rato Nicotiana tabacum
amyloliquefaciens
Nozes brasileiras
Esterilidade do macho Conteúdo de enxofre aumentado
Vários
Monelina
Thaumatococc
Taumatina
T.
Proteína tioesterase portadora de grupos acila Delta- I 2-desafurase
danielli Umbellularia califurnica
Amadurecimento de frutas modificado Amadurecimento de frutas modificado Doçura Doçura Conteúdo de gordura/ óleo modificado
Glycine max
Conteúdo de gordura./
Bacteriófago T3 u
s dan ie ll i
óleo modificado
de qual seja o mecanismo, a síntese de um RNA anti-senso em uma planta transformada é uma maneira eficiente de realizar_se a subtração de um gene.
15.2.2
o RNA anta-senso e a modificação do amadurecimento em Írutas e no tomate Até o momento, os tomates comercialmente cultivados e as frutas mais frágeis são normalmente colhidos antes de seu amadurecimento completo, a fim de garantir que sejam transpor-
tados até os superrnercados antes de estarem totalmente estragadãs. Isso é essencial para que o processo seja economicamente viável, mas existe probleria o de que a maioria das frutas e
326
T.A.Bnowru
dos tomales i
Gene na orientação correta
esE freqüentem antes de
Duas compa
do - utilizra de tomateq d ao produtrd
no qual o sd transpoÍte e r
mRNA
O papel dr O espaçodel
Gene na orientação
semanas4ú
inversa
iníci
o-_
desde o
I
merodeger le que codifi
o amaúuecir
Promotor
poligalacnrú amolecimen
\',," #
rnúto teryo A inativr
RNAanti-senso (complemento reverso do mRNA)
senvolviffi Figura 15.4 RNA anti-senso.
hzadzpaal-
A clonag: Oexperiro tas daICIS.
décadade lg
dapotigala
""-"
dora (Figura co da cmrs
RNA anti-senso
ì-"''"'*
s;.."""
Ribossomos não podem se ligar?
Degradado por ribonucleases?
Figura 15.5 Possíveis mecanismos para a inibição da expressão gênica por meio do RNA anti-senso.
Fqlr
A elevação da erçresd gene da poligalacün vista durante os esüí(i nais do amadurecinsr
E
Croruaeeu GÊwrcn e ANÁLrsE oe
DNA
327
dos tomates imaturos não desenvolve totalmente seu sabor, caso sejam removidos da planta antes de estarem totalmente amadurecidos. O resultado é que a produção massiva de tomates freqüentemente possui um sabor brando, o que os torna menos atraentes aos consumidores. Duas companhias biotecnológicas - Calgene, nos Estados Unidos, e ICI Seeds no Reino Unido - utilizaram a tecnologia do anti-senso como forma de modificar geneticamente as plantas de tomates, de maneira que o seu processo de amadurecimento foi retardado. Isso possibilita ao produtor deixar as frutas na planta para que elas amadureçam até um determinado esúgio, no qual o sabor tenha sido completamente desenvolvido, com tempo ainda suf,rciente para o transporte e a comercialização da cultura antes que ela se estrague.
O papel do gene da poligalacturonase no amadurecimento do tomate O espaço de tempo para o desenvolvimento de uma fruta é medido como o número de dias ou semanas após o florescimento. No tomate, esse processo leva aproximadamente oito semanas, desde o início até o seu término, com as modificações na coloração e no sabor associadas com o amadurecimento iniciado após cerca de seis semanas. Nesse período, um determinado número de genes envolvidos nos estágios finais do amadurecimento é induzido, incluindo aquele que codifica a enzima poligalacturonase (Figura 15.6), a qual degrada lentamente o ácido poligalacturônico, componente da parede celular do pericarpo das frutas, resultando em um amolecimento gradual. O amolecimento torna o fruto palatável, mas se ele se prolonga por muito tempo, o resultado é um tomate amassado e estragado, pouco atraente. A inativação parcial do gene da poligalacturonase deveria aumentar o período entre o desenvolvimento do sabor e o estrago da fruta. Como a tecnologia do anti-senso poderia ser utilizadapar:a a obtenção desse resultado?
A clonagem do "gene" anti-senso da poligalacturonase O experimento que será analisado foi realizado pelo Departamento de Biotecnologia de Plantas da ICI Seeds, juntamente com cientistas da Universidade de Nottingham, em meados da década de 1980. Um fragmento de restrição de 730 pb foi obtido a partir da região 5' do gene da poligalacturonase normal, representando apenas menos da metade da seqüência codificadora (Figura 15.7). A orientação do fragmento foi revertida e um promotor do vírus do mosaico da couve-flor foi ligado no início dessa seqüência, além de um sinal de poliadenilação de
oo (ú
'ãg
E.6
s3 Éo (ú ì(ú
-Eo c6)
(Ú:
õõ lura
15.5 hsíveis mecanispara a inibição gêniexpressão I I por meio do RNA
$
ili-senso.
F
i Ë
F
F
Figura 15.6 A elevação da expressão do gene da poligalacturonase vista durante os estágios Íinais do amadurecimento do tomate.
50
Expressão do gene da poligalacturonase
328
T. A. Bnowr.r
calos, co crescime que confi ficados e Os re
Gene da poligalacturonase
Clivagem, ligação a seqüências controladoras na orientação inversa
(1)
A1 me
(2)
Ar
(p. RÀ
promotor
\/
Sinal de poliadenilação \
-=-
(3)
Ot
nÍu
t
col
Figura Í5.7
"Gene" anti-senso da poligalacturonase
Tai
Construção de um "gêne" anti-senso da poligalacturonase. R = sítio de restrição.
-
m2
pla
(4)
As
pla
ap da
plantas tendo sido ligado no seu final. A construção foi, então, inserida no vetor plasmidial Ti binário, pBINl9 (p. 152). Uma vez dentro da planta, a transcrição a partir do promotor do vírus do mosaico da couve-flor deveria resultar na síntese de um RNA anti-senso, complementar à primeira metade do mRNA do gene da poligalacturonase. Experimentos anteriores com RNA anti-senso haviam sugerido que isso deveria ser o suficiente para reduzir, ou mesmo impedir, a tradução do mRNA-alvo. A transformação foi realizada por intermédio da introdução das moléculas de pBINl9 recombinantes na bactéria Á grobacterium tumefaciens e, depois, permitindo que a bactéria infectasse segmentos do caule do tomate (Figura 15.8). Quantidades pequenas de material dos
sesmentodocaure
rat gu
Mait
dual, po rem. Iss
galacnr ra Íetart
í;t'íff5tffi3iïïli,lïlt"
do tomate
-----'--<---ì -"3'z"o -l------- : | .
tl- -'t' '' ,.,/i :.\-)i:' ./.-)-2 zZ .
---.//,/7'z
'
\
lncubação
Porváriosdias
Meio ágar
Calos crescidos
----")
..ir,l
./7
,r/ ,z z')
Teste para resistência à canamicina
Figura 15.8 Obtendo plantas transÍormadas por meio da inÍecção de segmentos do caule com A. tumefaciens recombinantes.
As diÍerenças
n
poligalacturona
normais e em frú do o "gene" anti.
!
_
--_
Cloruneeu GÊrurcn e ANÁLtsE oe
DNA
329
calos, coletadas das superfícies desses segmentos; foram testadas para a sua capacidade de crescimento em meio ágar contendo canamicina (lembre-se de que pBINl9 contém um gene que confere resistência à canamicina; Figura 7.14). Transformantes resistentes foram identificados e deixados para se desenvolverem em plantas maduras. Os resultados do experimento foram analisados das seguintes maneiras:
(1)
A presença do "gene" anti-senso no DNA das plantas transformadas foi verificada por meio de hibridização de Souúern (p.206).
(2)
A expressão do gene anti-senso foi medida de acordo com
(3)
(p.230), com uma sonda de DNA de fita simples que deveria hibridizar somente com o RNA anti-senso. O efeito da síntese do RNA anti-senso sobre a quantidade de mRNA de poligalacturonase nas células de frutas amadurecidas
de um "gene" da poligalacturosítio de restrição.
vetor plasmidial Ti promotor do vícomplemenanteriores com ,
(4)
de
pBINl9 re-
de material dos
Mais importante, as frutas transformadas, embora apresentassem um amolecimento gradual, poderiam ser estocadas por um peíodo de tempo mais prolongado, antes de se estragarem. Isso indicava que o RNA anti-senso não havia inativado completamente o gene da poligalacturonase, mas, apesar de tudo, produzido uma redução suficiente na expressão gênica para retardar o processo de amadurecimento, conforme desejado.
(ú
c
I
oE :E y9.50 =9' EË gofura 1s.8 fendo plantas fsiormadas por fo Ca intecçao pegmentos do
Ie com A. tumeFrs recombiI
i
5. I
E
r' il e:
iD Ë
E
de northern,
As quantidades de enzima poligalacturonase produzidas nas frutas amadurecidas de plantas transformadas foram estimadas, a partir da intensidade das bandas relevantes, após a separação das proteínas da fruta por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida, e da medição direta das atividades enzimáticas nas frutas. Os resultados demonstrarÍrm que uma menor quantidade de enzima foi sintetizada nas frutas transformadas (Figura 15.9).
o a
I
foi determinado por hibridização
com uma segunda sonda de DNA de fita simples, essa específica para o mRNA senso. Tais experimentos mostraram que as frutas amadurecidas, a partir das plantas transformadas, continham menos mRNA de poligalacturonase do que as frutas originadas de plantas normais.
oumesmo im-
que a bactéria in-
ps.
a hibridização de northern
€€ (Ú0) Figura 15.9 As diÍerenças na atividade da poligalacturonase em tomates normais e em Írutas expressando o "gene" anti-senso da poligalacturonase.
ttE Eõ
EË
oË
0
330
T. A. Bnowr.r
15.2.3 outros exemplos da utilização do RNA anti-senso na engenharia genética vegetal Em termos gerais, as aplicações da subtração de genes na engenharia genética vegetal são provavelmente menos amplas do que aquelas da adição de genes. É muito mais fácil pensar nas caracteísticas úteis que uma planta não possui e quais poderiam ser introduzidas pela adição de genes, do que identificar características desvantajosas que a plantajá possua e quais poderiam ser removidas pela subtração de genes. No entanto, existe um número crescente de projetos de biotecnologia vegetal baseados na subtração de genes (Tabela 15.3) e a abordagem irá, provavelmente, aumentar em importância, à medida que as incertezas que circundam os princípios que fundamentam a tecnologia do anti-senso forem gradualmente resolvidas.
cópia do das sejan
nptll,ten seu prodr
que a ne( animais-r
(1)
Po<
do
(2)
bió
Po<
resr
15.3 Problemas com vegetais geneticamente modificados
Nenì
atual. Po Tomates com o amadurecimento retardado, produzidos pela subtração de genes, foram os primeiros gêneros alimentícios geneticamente modificados aprovados totalmente para a comercialização. Em parte devido a isso, a engenharia genética vegetal tem servido de campo de batalha, no qual biotecnologistas e outras partes interessadas têm discutido em relação à segurança e às questões éticas que surgem, a partir da capacidade de alterar-se a constituição genética dos organismos vivos. Inúmeras das questões mais importantes não dizem respeito diretamente aos genes e tampouco os conhecimentos necessários para respondê-las serão encontrados neste livro. Não podemos discutir de uma maneira confiável o possível impacto, bom ou mau, que as culturas geneticamente modificadas possam causar nas práticas agúcolas locais nos países em desenvolvimento. Tampouco podemos comentar os motivos subjacentes ao desenvolvimento de plantas resistentes a herbicidas por companhias que também comercializam o herbicida que os agricultores deverão utilizar com a cultura modificada. No entanto, podemos - e devemos - examinar os aspectos biológicos.
15.3.1 A segurança em relação às marcas de seleção Um dos principais pontos de preocupação a surgir, a partir do debate sobre os tomates geneticamente modificados, foram os possíveis efeitos danosos das marcas de seleção genética utilizadas com os vetores de clonagem em plantas. A maioria dos vetores de plantas possui uma
de um al
riana do
transfeú De form;
modifica COmUnS
r
cial não
Osn
do os bir
após a o,
mado h sa
fragn
(Figura nageÍn
I
de seleç Cre. Ap
DNA
da
Thbela 15.3 Exemplos de projetos de subtração de genes em plantas Gene-alvo Poligalacturonase
Aminociclopropano-ácido carboxflico-sintase Polifenol-oxidase Sintase de amido Delta- 12-desaturase Chalcono-sintase
Caracteística modifi cada Retardamento do estrago em tomates Modificação no amadurecimento do tomate Inibição do descoloramento em frutas e vegetais Redução do conteúdo de amido em vegetais Conteúdo elevado de ácido oléico em soja Modificação da coloração da flor em viárias plantas decorativas
I
Excisão de DNÁ enzima recor
Clouoera
engenharia vegetal são prois fácil pensar nas
uzidas pela adição
GÊrurce e ANÁLrsE oe
DNA
331
cópia do gene que confere resistência à canamicina, possibilitando que as plantas transformadas sejam identificadas durante o processo de clonagem. O gene kanR, tambémchamado de nptll,temorigem bacteriana e codifica a enzima neomicina-fosfotransferase IL Esse gene e o seu produto enzimático estão presentes em todas as células da planta modificada. O receio de que a neomicina-fosfotransferase pudesse ser tóxica ao homem foi abrandado por testes com animais-modelo, mas duas outras questões de segurança peÍnanecem:
possua e quais pode-
crescente de pro15.3) e a abordagem que circundam os resolvidas.
os genes, foram os pri-
para a comerde campo de baem relação à segua constituição gedizem respeito di-
las serão eno possível impacto, nas práticas agrícoos motivos subjaque também
modificada. No
os tomates geneseleção genética uti-
(1) (2)
Poderia o gene kanR presenteem um alimento geneticamente modificado ser transmitido para bactérias do intestino humano, tornando-as resistentes à canamicina e aos antibióticos relacionados? Poderia o gene knn* ser transmitido para outros organismos do meio ambiente, podendo resultar em prejuízo ao ecossistema?
Nenhuma dessas questões pode ser totalmente respondida com o nosso conhecimento atual. Pode ser argumentado que o processo de digestÍio poderia destruir todos os genes kan* de um alimento geneticamente modificado antes de que esse pudesse alcançar a flora bacteriana do intestino, e que, mesmo se um gene escapasse da destruição, as chances de ele ser transferido para uma bactéria seriam muito pequenas. No entanto, o fator de risco não é zero. De forma semelhante, embora experimentos sugiram que o cultivo de plantas geneticamente modificadas teria um efeito insigniÍicante no meio ambiente, uma vez que genes kanR já são comuns em ecossistemas naturais, a futura ocorrência de algum evento indesejado e prejudiÇial não pode ser considerada uma impossibilidade absoluta. Os receios que cercam a utilização de kanR e de outros genes marcadores têm estimulado os biotecnologistas a desenvolver maneiras de remover tais genes do DNA das plantas, após a ocorrência do evento de transformação. Uma dessas estratégias faz uso de uma enzima do bacteriófago Pl, chamada Cre, a qual catalisa um evento de recombinação que excisa fragmentos de DNA flanqueados por seqüências de reconhecimento de 34 pb específicas (Figura 15.10). Para utilizar esse sistema, a planta é transformada com dois vetores de clonagem, o primeiro contendo o gene a ser adicionado à planta, juntamente com a sua marca de seleção kanR, flanqueada pelas seqüências-alvo de Cre, e o segundo contendo o gene Cre. Após a transformação, a expressão do gene Cre resulta na excisão do gene kan* do
DNA
da planta.
plantas possui uma
Seqüências-alvo para Cre
/\
--.
Molécula de DNA
Recombinação
catalisada por Cre
fe
vegetais
-_______________I___
Ftals FOJA
lias plantas decorativas
F
:
ç
Figura 15.10 Excisão de DNA por meio da enzima recombinase Cre.
Fragmento flanqueado pelas seqüências-alvo é excisado
332
T. A. Bnowlr
Leituras adicit
E se o próprio gene Cre for de alguma forma prejudicial? Isso é impossível, uma vez que os dois vetores utilizados na transformação provavelmente irão integrar seus fragmentos de DNA em cromossomos diferentes, de forma que a segregação aleatória durante a reprodução sexual irá resultar em uma primeira geração de plantas que contém um dos fragmentos de DNA integrado, mas não o outro. A planta que não contenha nem o gene Cre e nem a marca de seleção kan*, mas que contenha o gene de interesse, que se deseja adicionar no genoma da planta, poderá, assim, ser obtida.
Bachem,
C.WJ
genqs inlÌih
Courtney4rm
cation offl genetics. B Feitelson J-S-I talhes de
15.3.2 A possibilidade de eÍeitos preiudiciais ao meio ambiente
&
Fischhoff, D-A807-13. [A
Uma segunda área de preocupação, em relação às plantas geneticÍìmente modificadas, é que as suas novas combinações genéticas possam prejudicar o meio ambiente de alguma maneira. Determinados problemas foram destacados com respeito às plantas modificadas serem resistentes à infecção viral. Uma estratégia aqui é transforïnar a planta com os genes que codificam as proteínas do capsídeo de um vírus patogênico. A expressão desses genes não resulta em sintomas de doença, mas fornece à planta um grau de proteção contra a infecção pelo vírus intacto. Um receio é que a planta que está sintetizando proteínas do capsídeo de um vírus patogênico pode ser atacada por um segundo tipo de vírus, cuja replicação poderia originar uma progênie híbrida, contendo genomas de vírus infecciosos, empacotados nas proteínas do capsídeo sintetizadas pela planta. Tais híbridos poderiam apresentarpropriedades inesperadas e danosas, por exemplo, as novas proteínas do capsídeo poderiam ampliar a faixa de hospedeiro do segundo vírus, capacitando-o a infectar novas plantas, que norÍnalmente eram resis-
Flavell, R-B-
D
l4l4-l neticam 10,
Koziel, M-Gan
X
insecrii
Shade, R.E- Sc
commmh
resisenrcs Smith, CJS- \
uansgsnb Tepfer, M" (19!
lr2r3z I Truve,E-Aq lat€ sYÍÍrÉ
tentes, resultando em doenças.
tUanipür Yoder, J.I. lk
Há também a questão de se um novo gene, introduzido em uma planta geneticamente modificada, poderia "escapar" e colonizar plantas selvagens e, caso isso acontecesse, qual o impacto que teria no meio ambiente. Pesquisas com plantas nativas e geneticamente modificadas estão gradualmente acumulando dados, a partir dos quais essas questões serão respondidas. Porém, é importante perceber que a determinação do efeito que plantas geneticamente modificadas podem ter sobre o meio ambiente será possível somente se experimentos adequados forem realizados, em sistemas-modelos, antes que a liberação em larga escala das plantas seja permitida. Tais experimentos serão incompletos se não envolverem testes com plantas geneticamente modificadas cultivadas sob condições rigorosamente controladas no ambiente natural. Se não for possível realizar esses testes corretamente, então efeitos prejudiciais poderão ser perdidos.
C
tecffig
^
CnpÍrulo 16 Clonagem Gênica e Análise de DNA na Ciência Forense i
Í
l
Análise do DNA na identificação de suspeitos
criminais, 335
Identificação do sexo por meio da análise do DNA, 340
Estudando o parentesco por meio do perfil do DNA, 339
A ciência forense
é a última área da biotecnologia que será considerada neste volume. Dificilmente uma semana termina sem uma reportagem na imprensa sobre mais um crime hediondo que tenha sido solucionado graças à aniílise do DNA. As aplicações da biologia molecular no laboratório criminal centralizam-se, em grande parte, na capacidade da análise do DNA em identificar um indivíduo a partir de cabelos, manchas de sangue e outros itens recuperados do local do crime. Nos meios de comunicação populares, essas técnicas são conhecidas como datiloscopia genética (genetic fingerprinting), embora o termo mais preciso paÍa os procedimentos utilizados hoje em dia seja perfil do DNA. Este capítulo inicia com um exame dos métodos utilizados na datiloscopia genética e no perfil do DNA, incluindo suas utilizações, tanto na identificação de indivíduos quanto na confirmação se indivíduos são membros de uma mesma famflia, o que nos levará a uma exploração das maneiras pelas quais as técnicas genéticas estão sendo usadas em iíreas de criminalística e em outras, além da investigação policial, como a arqueologia.
16.1 Análise do DNA na identificação de suspeitos criminais É provavelmente impossível alguém cometer um crime sem deixar um rastro de seu DNA. Cabelos, sangue e mesmo impressões digitais convencionais contêm traços de DNA suficientes para serem estudados por meio da reação de polimerização em cadeia (PCR). A aniílise não necessita ser realizada imediatamente. Nos últimos anos, um certo número de crimes do passado foi solucionado e o criminoso levado à Justiça, graças ao teste de DNA realizado com material arquivado. Assim sendo, como tais métodos poderosos funcionam? A base da datiloscopia genética e do perfil do DNA é que os gêmeos idênticos são os únicos indivíduos que possuem cópias idênticas do genoma humano. É claro, o genoma humano é mais ou menos o mesmo em todas as pessoas - os mesmos genes estarão na mesma ordem
'ij L'
E.
l-
i;.
L
h
336
T.A. Bnowru
com as mesmas seqüências de DNA de regiões intergênicas entre eles. Mas o genoma humano, bem como o dos demais organismos, contém muitos polimorfismos, posições onde a se-
qüência de nucleotídeos não é a mesma em cada membro da população. Já havia sido destacada a principal importância desses sítios polimórficos anteriormente, pois as seqüências variáveis são aquelas mesmas utilizadas como marcadores de DNA no .rrup"u-"nio genômico
(p.262). Elas incluem polimorfismos de comprimento de fragmentos dó restriçaolRFlps), repetições curtas em tandem (STRs) e polimorfismos de nucleotídeos individuaii (SNpO. 1'odas essas três podem ocoffer dentro de genes, e em regiões intergênicas, existindo, no total, vários milhares desses sítios polimórficos no genoma humano, destacando-se os SNps como os mais comuns.
16.1.1 A datiloscopia genética por meio da sondagem por hibridização O primeiro método de utilização da análise do DNA para identificar indivíduos foi desenvolvido em meados da década de 1980 por SirAlec Jeffreys, da Universidade Leicester. Essa técnica não se baseou em qualquer um dos tipos de polimorfismos recém-listados, mas em um tipo de variação no genoma humano chamada de seqüência repetitiva dispersa hipervariável. Como o nome indica, trata-se de uma seqüência repetida que ocoÍïe em vários lugares ("dispersa") do genoma humano. A característica fundamental dessas seqüências é que suas posições genômicas são variáveis: elas estão localizadas em diferentes posições nos genomas de diferentes pessoas (Figura 16.1a). A repetição específica que foi inicialmente utilizada na datiloscopia genética contém a seqüência GGGCAGGANG (onde N é qualquer nucleotídeo). Para preparar uma datiloscopia, uma amostra de DNA é clivada com uma endonuclease de restrição, os fragmentos são separados por eletroforese em gel de agarose e é realizado um experimento de South em (p.207). A hibridização da membrana com uma sonda marcada contendo a seqüência repetida revela uma série de bandas, cada uma representando um fragmento de restrição que contém a repetição (Figura 16.1b). Uma vez que os sítios de inserção da seqüência repetiãa são variáveis, o mesmo procedimento, realizado com uma amostra de DNA de uma segunda pessoa, irá fornecer um padrão diferente de bandas, as quais são datiloscopias genéticas para aqueles indivíduos.
16.1.2 O perfil do DNA por meio da pCR de repetições curtas em tandem Estritamente falando, a datiloscopi a genética refere-se somente às análises de hibridização das seqüências repetidas dispersas. Essa técnica, embora valiosa no trabalho criminalista, foi penalizada por três limitações:
(1) (2)
(3)
Uma quantidade relativamente grande de DNA é necessária, pois a técnica depende da análise por hibridização. A datiloscopia não pode ser úilizadacom as quantidades ínfi-
mas de DNA de cabelos e manchas de sangue. da datiloscopia pode ser difícil, em decorrência de variações nas intensidades dos sinais de hibridização. Em um processo judicial, pequenas diferenças na in_ tensidade das bandas entre uma datiloscopia-teste e outra realizadade um suspeito podem ser suficientes para que este seja inocentado. Embora os sítios de inserção das seqüências repetidas sejam hipervariáveis, existe um limite dessa variabilidade e, portanto, uma pequena chance á" qu" dois indivíduos não-relacionados possam ter as mesmas, ou pelo menos muito semelhantes, datilos_ copias. Novamente, essa consideração pode levar à absolvição, quando um caso é le-
A interpretação
vado ao tribunal.
A técn cias polim cia curta,
r
seqüencia lCAl,, na
O nún
adicionad; ção do Dì de uma de petições. Ì
terminado meio de P
uma repet gel de agz na ÍÌmosuì uma única mossomo
Umarr
de resulta
tados são cia em uu
1
Figura 16.1 A datiloscopia genética. (a) As por*ções das repeti@es polimórÍicas, tais como as seqüêc" cias repetitivas dispersas hipervariáveis, nos genoÍÌÌaÍ; de dois indivíduos. Nos segmentos cK> mossômicos mostrados, a segunda pessoa possui urna seqüência repetida adicional. (b) Uma auto-radiograÍia eÍbe as datiloscopias genéticas de dois indivíduos.
Croueeu o genomahumaições onde a sehavia sido destaseqüências va-
genômico (RFLPs), is (SNPs). To. istindo, no total, os SNPs como
foi desenvolEssa técmâs em um
hipervariárários lugares ias é gue suas EOS
genoüras
contém a se-
GÊrurcn e ANÁusE oe
DNA
A técnica mais poderosa do perfil do DNA evita tais problemas. perfis utilizam seqüên-
cias polimórficas chamadas STRs. Conforme descrito na página 262,umaSTR é uma ,"qticncia curta, de 1 a 13 nucleotídeos de comprimento, que é repetida várias vezes
em um arranjo seqüencial. No genoma humano, o tipo mais comum ae SfR é a repetição dinucleotídica [cA],, na qual "n", o número de repetições, está normalmente entre s Ë zo 6igur a 16.2a). O número de repetições em uma determinada STR é variável, pois repetições podem ser adicionadas ou, menos freqüentemente, removidas por erros qu" o"orr"- durante a replicação do DNA. Na população como um todo, devem existir emiorno de l0 versões diferentes de uma determinada STR, cada um dos alelos caracterizados por um número diferente de repetições. No perfil do DNA, os alelos de um número selecionado de STRs diferentes são determinados. Isso pode ser rapidamente obtido e com quantidades muito pequenas de DNA por meio de PCRs com iniciadores que se anelam às seqüências de DNA Ëm ambos os lados de uma repetição (Figura l2.ll). Após a PCR, os produtos são examinados por eletroforese em gel de agarose' com o tamanho da banda ou bandas indicando o alelo ou os alelos presentes na amostra de DNA testada (Figura 16.2b). Dois alelos de uma STR podem estar presentes em uma única amostra de DNA, visto que existem duas cópias Oe caAa StR, uma vinda do cro-
mossomo herdado da mãe e a outra, do cromossomo herdado do pai. Uma vez que a PCR éutllizada, o perfil do DNA é muito sensível e possibilita a obtenção de resultados com cabelos e outros materiais que contenham apenas traços de DNA. Os resultados são precisos e uma identidade entre perfis de DNA é normalmente aceita como evidência em um julgamento. É importante destacar que o perfil do DNA, quando
conduzido com
datiloscqia são s€p&
$.w7). repetida revela
çmfuaÍEpe-
(a) Seqüências repetidas polimórficas no genoma humano
sfro vui:f;veis, o
Íiìsqsm, irá
fü-
Primeira Pessoa
eryeles iudiDNAs cromossômicos
---------Figura 16.1
dlFìCrríL df
G
rf ingrnil[F surycimpo. FriflürìUr
hffim ffiecesoéh-
;
e
f-
h
ggz
A datiloscopia genética. (a) As posições das repetições polimórficas, tais como as seqüências repetitivas dispersas hipervariáveis, nos genomas de dois indivíduos. Nos segmentos cromossômicos mostrados, a segunda pessoa possui uma seqüência repetida adicionat. (b) Uma auto-radiograÍia exibe as datiloscopias genéticas de dois indivíduos.
o
Segunda pessoa
-----
posições das seqüências repetidas
(b) Duas datiloscopias genéticas Linhas 1 e 2: 1
DNA de dois indivíduos
338
T. A. Bnowrir
STRs com um grande número de alelos, fornece uma probabilidade estatística elevada de que uma identidade entre um perfil-teste e o de um suspeito seja significativa e não devida a um acaso de similaridade entre duas pessoas diferentes. É possível alcançar o grau necessiírio de ceÍteza pela análise de um painel de nove STRs, que pode ser estabelecido em uma única PCR multiplex, na qual um conjunto de pares de iniciadores é utilizado em uma única reação. Os resultados podem ser interpretados, porque as PCRs são projetadas de tal maneira que
os prod
empmi são mer
da dos I
16.2 Estud Assimr ra infer
(a) Os dois alelos de uma STR
doéch
....CACACACACA..
n=5
....cAcAcAcAcAcA
n=6
dade.
16.2.1 lndiví O
peÍfl
sua
(b) Os resultados da PCR
mã
apaÍent
@guÍa
petiçft
criança alelo 1. DNA marcador de tamanho
2, 3. PCRs de uma única STR em dois indivíduos
:2
4. PCR multiplex de três STRs (1-3)
ú
ceíe72 víduo's,
urnaI'Íl
16.2.2 O per Umex
cido pe memhr ção Ru Apos,
c
dadoo (c) Análise dos resultados de uma PCR multiplex em um seqüenciador de DNA automático
Í00
150
2OO
Tamanho (pb)
Figura 16.2 O perfit do DNA. (a) O perfil do DNA Íaz uso de STRs, as quais possuem unidades repetidas variáveis. (b) Um gel obtido após o perfil do DNA. Nas linhas 2 e 3 a mesma STR foi examinada em dois indivÊ duos. Essas duas pessoas possuem perfis diÍerentes, mas uma banda em comum. A linha 4 mostra o resultado de uma PCR multiplex, na qual três STRs Íoram determinadas em uma única PCR. (c) Um seqüenciador de DNA automático pode ser utilizado para determinar o tamanho dos produtos da PCR.
Figura 163 Padrão de he' rança de alelos de STRs em uma Íamília
Cloruneeu GÊrurcn e ANÁLtsE oe
elevada de qrre não deüda a rrm messário de
em umâ unlca uma rrntca IEa_ tal maneiraqre
DNA
339
os produtos obtidos, a partir de cada STR, possuem tamanhos diferentes e, assim, aparecem em posições diferentes no gel de agarose (Figura 16.2b).Alternativamente, se os iniciadores são marcados com fluorocromos diferentes, os resultados podem ser visualizados pela corrida dos produtos em um seqüenciador de DNA automático (Figura 16.2c).
16.2 Estudando o parentesco por meio do perfil do DNA Assim como na identificação de criminosos, o perfil do DNA pode também ser utilizado para inferir se dois ou mais indivíduos são membros de uma mesma famflia. Esse tipo de estudo é chamado de análise do parentesco e a sua aplicação dirária dá-se nos testes de paternidade.
16.2.1 lndivíduos relacionados possuem perfis de DNA semelhantes O perfil do seu DNA, assim como outros aspectos do seu genoma, é parcialmente herdado de sua mãe e parcialmente de seu pai. Proximidades dentro de uma famflia, portanto, tornam-se aparentes quando os alelos de uma determinada STR são destacados emum pedigree familiar
(Figura 16.3). Nesse exemplo, vemos que três de quatro crianças herdaram o alelo de 12 repetições de seu pai. Essa observação, por si só, não é suficiente para se deduzir que essas três crianças são irmãs, embora a probabilidade estatística pudesse ser bastante elevada, caso o alelo de 12 repetições fosse incomum na população como um todo. Para aumentar o grau de certeza, mais STRs deveriam ser determinadas, mas, assim como com a identificação de indivíduos, as análises não necessitam ser infinitas, pois uma comparação de nove STRs fornece uma probabilidade aceitável de que as identidades observadas sejam reais.
16.2.2 O perfil do DNA e os resquícios dos Romanov Um exemplo interessante da utilização do perfìl do DNA em um estudo de parentesco é fornecido pelo trabalho realizado durante a décadade 1990 com os ossos dos Romanov, os últimos membros da famíia dominadora da Rússia. O Tsar Nicholas II foi deposto durante a Revolução Russa e, juntamente com sua esposa, a Tsarina Alexandra, e seus cinco filhos, foi preso. Após, os sete foram mortos, além de seu médico e de viírios empregados. Em 1991, após ã queda do comunismo, os co{pos foram recuperados de suas covas na margem de uma estrada.
O uutn",. I Homem lf famanfro das repetições das STRs ìranaYs-
ütisindìrí4
ÍnÉao
FCR(c) tlm
daFCR
Figura 16.3 Padrão de herança de alelos de STRs em uma Íamília.
340
T. A. Bnowr.r
A análise de STR dos ossos dos Romanov Os corpos recuperados erÍìm um pouco mais do que uma coleção de ossos, de adultos e de crianças, misturados, com nenhuma indicação de quais pertenceriam aos Romanov e quais ao seu médico e aos empregados. No entanto, os únicos ossosjuvenis, dentro da coleção, deveriam pertencer às crianças do tsar e da tsarina. Isso significava que os ossos do tsar e da tsarina poderiam ser identificados por meio do estabelecimento de quais adultos poderiam ser os pais das crianças. O DNA foi extraído dos ossos de cada indivíduo e cinco STRs foram determinadas por PCR. De fato, apenas duas dessas STRs forneceram informações suficientes pam que o pai e a mãe das crianças fossem identificados com precisão (Figura 16.4). Mas seriam esses mesmos os ossos dos Romanov ou poderiam ser os resquícios de algum outro grupo de pessoas desafortunadas? Para resolver esse problema, o DNA dos ossos foi comparado com amostras de DNA de parentes vivos dos Romanov. Esse trabalho incluiu estudos do DNA mitocondrial, um pequeno DNA circular de 16 kb contido nas mitocôndrias geradoras de energia das células. O DNA mitocondrial contém polimorfismos que podem ser utilizados para inferir parentescos entre indivíduos, mas o grau de variabilidade não é tão grande quanto aquele apresentado pelas STRs, de forma que o DNA mitocondrial raramente é utilizado para estudos de parentesco entre indivíduos extremamente relacionados, tais como aqueles de uma mesma família. Mas o DNA mitocondrial possui a propriedade importante de ser herdado somente da linhagem feminina, com o DNA mitocondrial do pai sendo perdido durante a fecundação e não contribuindo para o conteúdo de DNA do filho ou da hlha. Esse padrão de herança materna torna mais fácil a determinação de parentesco, quando os indivíduos que estão sendo comparados são mais distantemente relacionados, como foi o caso com os parentes vivos dos Romanov. Tais estudos do DNA mitocondrial mostraram que os ossos eram com certeza os do Tsar Nicholas, da Tsarina Alexandra e de três de suas filhas.
As crianças perdidas Somente três crianças foram encontradas no túmulo dos Romanov. Alexei, o único menino, e uma das quatro meninas estavÍÌm faltando. Na metade do século XX, vrírias mulheres reivindicavam ser a princesa Romanov, porque, mesmo antes de os ossos serem descobertos, havia boatos de que uma das meninas, Anastásia, teria escapado da crueldade dos bolchevistas e fugido para o ocidente. Lamentavelmente, testes de DNA mostraram que nenhuma dessas requerentes poderia ter sido a filha do tsar e da tsarina e a história de Anastásia é, provavelmente, apenas um romance. A explicação mais provável para a aparente ausência das duas crianças na sepultura é que seus ossos estavam extremamente degradados para serem recuperados, ou que elas foram enterradas em locais diferentes. De fato, os resquícios de um menino e de uma menina, a última com jóias semelhantes àquelas usadas por Maria, foram recentemente encontrados.
Fig
Aa
ca(
16.3 ldentificação do sexo por meio da análise do DNA A análise do DNA também pode
mel
osi adt
utilizada para identificar o sexo de um indivíduo. A diferença genética entre os sexos é a presença de um cromossomo Y nos indivíduos do sexo masculino, de forma que a detecção de DNA específico do cromossomo Y deve possibilitar que homens e mulheres sejam distinguidos. Os cientistas criminalistas ocasionalmente têm que tratar com corpos que estão de tal forma gravemente danificados, que a análise do DNA é a única maneira de determinar o sexo. ser
nhr tr€s
@n
qu€
me
de'
l l
Clorunoeu GÊuca e ANÁLtsE oe
adultos e de
DNA
341
(a) A árvore genealógica da Íamília Romanov
e quars ao
devetsar e da tsariTsarina Alexandra
por que o pal e esses mesde pessoas
amostras
nitoconenergia das Anastásia
inferirpaaqnele apreesndos de
mafa-
mi{mte da
(b) A análise de STR
e
humçana-
STRs
emÍo $€ndo
ryirudm crdo
m,c IEflID'
THOl Criança
8,10
15,16
Criança 2
7,8
15,16
Criança 3
8,10
15,16
1
Mulher adulta
1
8,8
1s,16
Mulher adulta 2
o,o
16,17
Homem adulto
hlsir
cfr-
VWN?l
1
9,10
14,20
Homem adulto 2
6,10
17,17
Homem adulto 3
7,10
15,16
Homem adulto 4
6,9
15,17
Figura 16.4 A análise de repetições curtas em tandem dos ossos dos Romanov. (a) A árvore genealógica da Íamília Romanov. (b) Os resultados das análises de STR. THO| e VWA/gl são os nomes dos dois lócus de srR. os números nas colunas (8, 10, etc.) são os de repetições para os alelos determinados em cada indivíduo. O resultado com THOI mostra que a mulher adulta 2 não pode ser a mãe das crianças, porque ela possui somente o alelo 6, o qual nenhuma das crianças possui. A mulher adulta 1, no entanto, possui o alelo g, o qual todas as três crianças aprêsentam, e, dessa maneira, ela é identiÍicada como a tsarina. O resultado com THol exclui o homem adulto 4 de ser o possível pai das crianças, mas não permite que os outros três homens adultos sejam distinguidos todos poderiam ser o pai de pelo menos duas crianças. Entretanto, o resultado com VWNS| exclui os homens adultos 1 e 2, de Íorma que o homem adulto 3 é identiÍicado como o tsar.
U2
T.A. Bnowr.r
Testes de DNA também podem ser utilizados para a identificação do sexo de uma criança que ainda não nasceu. A descoberta de que um feto é um menino óu uma meninu Jg".ut-"nte retardada até que as diferenças anatômicas tenham se desenvolvido e o sexo possí ser iden-
tificado por meio de uma ecografia, mas, sob determinadas circunstânciar,
u-u
indicação
mais precoce do sexo é desejável. Um exemplo é quando pedigreeda o família indica que um menino ainda não-nascido poderá apresentar u-á do"nçu -tr"r"áitá.iu e os pais gostariam de decidir com antecedência a respeito de continuar ou não a gestação. uma terceira aplicação da identificação do sexo com bãse no DNA - e que tem sido responsável por muito do desenvolvimento nesse campo é a análise de espécirnes arqueológicos' Esqueletos de homens e mulheres podem ser diìtinguidos se os seus ossos-chave, tais como o crânio ou a pélvis, estiverem intactos, mas com cadáveres incompletos, ou cadáveres de criançasjovens, não existem diferenças anatômicas sexuais específicãs suficientes para que uma identificação precisa seja realizada. Se DNA antigo estiver presente nos ossos, um método com base no DNA poderá informar aos arqueologistas se eles estão tratando com um homem ou com uma mulher.
16.3.1 PCRs direcionadas a seqüências especíÍicas do cromossomoy
16.3.2 PCF
Aca
cias t
cador
para. que a
c
dos p te târ
quan onde outra
um
ir
rente
pois
A maneira mais simples
de utilizar a análise do DNA para determina.r o sexo é planejar uma PCR específicapata uma região do cromossomo Y. A PCR deve ser planejada com cuidado, pois os cromossomos X e Y não são completamente diferentes, ãlgun, segmentos sendo compartilhados entre ambos. Porém, há muitas regiões únicas "oy. Em dentro Jo especial, existem viírias seqüências repetidas qu" Ãtao localizadas apenas"ro--orromo no cromossomo y, as quais atuam como alvos múltiplos para a PCR e, portanto, fornecãm uma maior sensibilidade, uma consideração importante, caso se esteja tràtando com um corpo extremamente danificado ou com um osso muito antigo. A PcR direcionada a seqüências específicas do cromossomoy poderá fornecer um produto com o DNA de homem, mas nenhuma banda, caso a amostra u"nhu d. u-u -uitr..ÌFigura 16'5)' Essa é uma distinção clara entre as duas alternativas e, portanto, um sistema perfeitamente satisfatório para a maioria das aplicações. Mas, e se a amostra não conúver qualquer DNA ou se o estiver muito degradado para se trabalhar em uma pcR, ou se a amostra fNA também possuir da DNA-poli-"rui" de Taq,de maneira que a pcR não funcione? il|igores Todas essas possibilidades podem ocorrer com espécimes arqueológicos, especialmente aqueles que foram enterrados no solo e tornaram-se contaminados com ácidos húmicos e outros compostos conhecidos por inibirem a maioria das enzimas utilizadas na pesquisa em biologia molecular' Nesse momento, o teste torna-se incerto, porque um espécime qu" é in"upuz de fornecer um produto de PCR por uma ou mais razões poderia ser enoneÍÌmente identificado como uma mulher. o resultado seria exatamente o mesmo: nenhuma banda no gel.
(r
Figura 16.5
-
1. DNAs marcadores
-
2. DNA de homem 3. DNA de mulher 4. PCR fracassada
A identiÍicação do sexo por meio da PCR de uma seqüência de DNA especíÍica do cromossomo y. O DNA de homem origina um produto de PCR (linha 2), mas o DNA de muther, não (tinha 3). O problema é que uma PCR Íracassada (linha 4) origina o mesmo resultado que o DNA de mulher.
Figr
A idr gen(
origi Gae
PCF
pos
Ct-orunoeu GÊNrcA E ANÁLrsE oe
macriança irnnégeÍalnen-
gmraseridenmml indicação
iúcaqueum
gMiam
de
rcm sido res-
uçeológitais co. mcadáveres de paÍa qu€ um mé-
moq
oornum
[g-
é planejar rtma
DNA
343
16.3.2 PCR do gene da amelogenina A carência
na discriminação entre "mulher" e "PCR fracassada" que ocorre quando seqüências específicas do Y são estudadas levou ao desenvolvimento de testes de DNA mais sofisticados para a identificação do sexo, alguns dos quais fornecem resultados inequívocos, tanto para homens quanto para mulheres. O mais amplamente utilizado desses testes envolve PCRs que amplificam o gene da amelogenina. O gene da amelogenina codifica uma proteína encontrada no esmalte do dente. Ele é um dos poucos genes que estão presentes no cromossomoY e, como a maioria desses genes, existe tambóm uma cópia no cromossomo X. Porém, as duas cópias são bastante idênticas, e, quando as seqüências de nucleotídeos são alinhadas, um grande número deindels, posições onde um segmento de DNA pode ter sido tanto inserido em uma seqüência como deletado de outra, é identificado (Figura 16.6a). Se os iniciadores de uma PCR anelarem nos dois lados de um indel, os produtos obtidos a partir dos cromossomos X e Y apresentarão tamanhos diferentes. O DNA da mulher fornecerá uma única banda quando os produtos forem examinados, pois as mulheres têm apenas o cromossomo X, enquanto os homens irão apresentar duas ban-
(a) Parte do gene da amelogenina
com cuidado, sendo Y. Em
Cromossomo Y
cromossomoY, maior sensibili-
Cromossomo X
\
da-
umprodumulher (Figrrra sistema perfeitaiver qualquer
ür
Deleção de 6 pb na seqüência do cromossomo X
(b) Resultados das PCRs
se a âmostra
não funcione? aquehinicos e outros isa em biologia é incapazde foridenti-ficado cogel.
:_-_ 1. DNAs marcadores
2. DNA de homem 3. DNA de mulher 4. PCR fracassada
clo sexo por de uma seDNA especíÍica Y. O DNA de
um produto 2), mas o não (linha é que uma (linha 4) oriresultado que
L
F'
t
Figura 16.6 A identiÍicação do sexo por meio da PCR de parte do gene da amelogenina. (a) Um indelno gene da amelogenina. (b) Os resultados das PCRs transpondo o indel. O DNA de homem origina dois produtos de PCR, de 106 e 112 pb, no sistema-padrão utilizado em criminalística e na arqueologia biomolecular. O DNA de mulher origina apenas o produto menor. Uma PCR Íracassada não origina nênhum produto e, assim, é claramente distinguível dos dois tipos de resultados positivos.
344
T.A.Bnowx
das, uma do cromossomo X e a outra do cromossomoY (Figura 16.6b). Se a amostra não contiver DNA ou se a PCR fracassou por alguma oatÍarazão, nenhuma banda será obtida: não
existe a confusão entre o fracasso e um resultado de homem ou mulher. O desenvolvimento do sistema da amelogenina para a identificação do sexo está tendo um impacto importante na arqueologia. Não é mais necessário determinar o sexo de ossos enterrados com base nas diferenças sutis das estruturas dos mesmos. A grande confiabilidade que o teste do sexo baseado no DNA fornece esú resultando em algumas descoberias inesperadas. Em especial, os arqueologistas estão agora revendo suas opiniões prévias sobre o significado dos objetos enterrados em uma sepulturajunto com os cotpos. Imaginava-se que se um co{po estava acompanhado por uma espada, então ele deveria ter sido de um homem, ou se a sepultura contivesse colares, então o corpo era de uma mulher. O teste de DNA mostrou que esses estereótipos não estão sempre corretos e que os arqueologistas devem possuir uma visão mais ampla a respeito da conexão entre pertences na sepultura e sexo. De todos os resultados da revolução do DNA recombinante, esse foi, provavelmente, o menos esperado quando a clonagem gênica foi inventada no início da décadade 1970.
Leituras adi
Brown, K-rl
Gill, P- Ívr
sirr&
Jefteyr.f. tDúÌo Kravczet"
NaLahLì X-YL
