REBIOL 2012; 2012; 32(2):56-61 (julio-diciembre 2012) Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú
Aislamiento de hongos fitopatógenos en lesiones de hoja y tallo de cultivos de vid, Vitis vid, Vitis vitícola, de vitícola, de Cascas, La Libertad (Perú). 2012 Isolation of fungal pathogens in leaf and stem lesions of grapevine, Vitis viticola, crops from Cascas, La Libertad (Peru). 2012 Juan Wilson Krugg y Hugo Requejo Valdivieso Laboratorio de Fitopatología, Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú
RESUMEN Se aislaron u observaron hongos fitopatógenos en lesiones de hoja y tallo de Vitis vinifera “vid” vinifera “vid” procedentes del distrito de Cascas, La Libertad, en el 2012. Para esto, durante los meses de Enero Enero a Agosto del 2012 se recolectaron muestras de hojas, tallos y fruto de plantas con síntomas o signos sospechosas de ser producidas por hongos, los que fueron observados macro y microscópicamente, para esto último se realizaron cortes histológicos los que fueron colocados en una solución de KOH al 10%. Para realizar el aislamiento a partir de las muestras con síntomas se procedió procedió a cortar del borde de las lesiones y que contengan parte enferma y parte sana del tejido, pequeñas muestras en forma de cuadrado, las que fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio al 2% durante 3 minutos y posteriormente lavados por tres veces con agua destilada estéril para finalmente colocar los cortes en placas de petri conteniendo agar papa sacarosa, incubándose a temperatura ambiente hasta la aparición de colonias, las que fueron resembradas en tubos de ensayo conteniendo agar papa sacarosa, Para la determinación de los hongos aislados se realizaron microcultivos a partir de las colonias que crecieron. Se encontró a Alternaria sp , Botrytis cinérea y Plasmopara viticola en viticola en hojas y a Uncinula a Uncinula necator , en hojas y tallos.
Palabras clave: Hongos fitopatógenos, Vitis vinifera, Cascas (Perú)
ABSTRACT Plant Pathogenic fungi in injuries of leaf and stem of Vitis vinifera “grapevine” vinifera “grapevine” were observed coming from the Cascas district, La Libertad, in the 2012. For this, during the months months of January to August of the 2012 samples of leaves and stems of plants with symptoms symptoms were were collected or suspicious signs of being produced by fungi, those that were observed observed macro and microscopically, microscopically, for this We complete were were made histological cuts those that were placed in in a KOH solution to 10%. 10%. In order to make make the isolation from the samples samples with symptoms it was come to cut off the edge of the injuries and that contains ill part and healthy part of the weave, small samples in form of square, those that they were disinfected with hypoclorhyte of sodium to 2% during 3 minutes and later washed by three times with distilled water sterile finally to place the cuts in plates of petri containing to agar potato saccharose, incubating themselves to room temperature until the appearance of colonies, those that they were reseeding in test tubes containing to agar potato saccharose, For the determination of the isolated fungi were made made microcultures from from the colonies that grew. grew. It was found Alternaria sp , Botrytis cinerea, and Plasmopara viticola in stem, while, Uncinula necator Uncinula necator in both: leaves and stems.
Keywords: Pathogenic fungi, Vitis vinifera, Cascas (Peru)
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INTRODUCCION Las pérdidas ocasionadas por las enfermedades causadas por hongos y virus son muy limitantes en el cultivo de la vid, porque disminuye hasta un 80% de cada cosecha, reducen la calidad, incrementan los costos de producción y reducen el vigor y longevidad de los viñedos, existiendo enfermedades causadas por hongos que son endémicas, esto es, son prevalentes y están bien establecidas. Además, las condiciones climáticas son favorables para el desarrollo de epidemias causadas por las enfermedades de origen fungoso 17,19,21,22, Causado por Plasmopara vitícola, el llamado mildiu es una de las principales enfermedades que disminuyen la producción de vid. Se considera que esta enfermedad es el principal problema de la producción de vid, especialmente en las variedades que pertenecen a Vitis vinifera . Es el principal limitante de la producción de uva para vino a nivel mundial, debido a que ataca todas las partes verdes de la planta, principalmente las hojas, donde se presentan manchas amarillentas de apariencia aceitosa. La producción de las esporas del hongo ocurre en el envés de lo hoja, tejido que se torna de consistencia algodonosa y de color blanco. Las lesiones de las hojas son importantes como fuente de inóculo para la infección de inflorescencias y racimos y como órgano donde se efectúa la sobrevivencia del hongo entre los ciclos de producción. 17,19,21,22 El Oidium, conocido también como “cenicilla”, causado por el hongo Uncinula necátor, es otra fungosis importante en los cultivos de vid. Ataca todos los tejidos verdes y penetra sólo las células epidermales, pero afecta también las células vecinas, dando una apariencia polvosa de color gris blanquecino a los órganos atacados. El haz y el envés son igualmente susceptibles a la infección en cualquier edad de la hoja, las que se deforman y detienen su crecimiento. Los peciolos y el raquis del racimo son susceptibles a la infección durante todo el ciclo de crecimiento tornándose quebradizos.1,2,5,13,14. Causada por el hongo Botrytis cinérea, la llamada “pudrición gris” ocasiona una considerable pérdida en la calidad y rendimiento de la cosecha. El hongo invade la inflorescencia antes de la caída de las cubiertas florales. Desde estos tejidos ataca el pedicelo y el raquis del racimo, formando pequeñas lesiones de color café, que luego se tornan oscuras, casi negras. Hacia la época de cosecha estas lesiones rodean el pedicelo y el raquis y las porciones del racimo por debajo de la lesión se secan.4,9,15,16,19 La roya, causada por el hongo Phakopsora uva, también aparece entre las enfermedades más comunes de la vid. Es muy destructiva cuando no se controla oportunamente. Los primeros síntomas aparecen en forma de pequeñas manchas esparcidas o densamente distribuidas de color amarillo en el envés de las hojas y ocasionalmente aparece en los peciolos, brotes jóvenes y raquis. Más tarde, en el haz aparecen manchas de tejido muerto. Generalmente, las primeras lesiones aparecen sobre las hojas maduras, aproximadamente, unos 60-70 días después de la poda. Las infecciones severas de roya causan una defoliación prematura de la planta que ocasionan deficiencias en el llenado y madurez de los frutos. La defoliación prematura, también ocasiona la brotación de las yemas durante el periodo de descanso, que es muy detrimental para la cosecha siguiente, al utilizar la planta las reservas que utilizará para la brotación y la formación inicial de los racimos. 12,15,16 Desde hace unos seis años se detectó en Colombia la presencia del daño causado por Phomopsis vitícola , agente causal de manchas en hojas y sarmientos de la vid. El hongo causa pequeñas lesiones necróticas en hojas, brotes, raquis del racimo, racimos y sarmientos, el hongo reduce el número de racimos y el rendimiento. Los brotes afectados son muy débiles, afectando el desarrollo de la siguiente cosecha. La infección de los racimos ocurre durante periodos de lluvia, que posteriormente ocasiona problemas de post – cosecha. Los primeros síntomas aparecen en la lámina foliar y en las venas como pequeñas manchas de color oscuro con borde amarillo. Estas manchas coalescen y destruyen porciones del área foliar. 4,6,9 El distrito de Cascas es una zona que presenta grandes extensiones de suelos cultivados con vid, los que son mayormente exportados; estas plantas son afectadas por diversas enfermedades bióticas, principalmente de origen fúngico, las que actúan en detrimento del fruto, lo que conlleva a pérdidas económicas entre los agricultores. No existen antecedentes precisos que indiquen qué tipo de hongos son los que se encuentran afectando principalmente a estos cultivares, información que se hace necesaria para realizar un mejor control fitosanitario de dichas enfermedades y así disminuir las pérdidas económicas. Por tal razón el presente trabajo tiene como objetivo conocer a las especies de
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hongos fitopatógenos que se encuentran en lesiones en hoja, tallo y fruto de cultivos de vid, Vitis vitícola, procedentes del distrito de Cascas, La Libertad, en el 2012
MATERIAL Y METODOS Material de estudio: Hojas, tallos y frutos de diversos vegetales de Vitis vinifera “vid”, con signos o lesiones sospechosas de ser causadas por hongos fitopatógenos. La Zona de muestreo , estuvo constituida por todos los cultivares de V. vinífera del distrito de Cascas, provincia de Gran Chimú, Región La Libertad y la recolección de muestras se llevo a cabo durante los meses de Enero a Setiembre del 2012 y estuvo dirigida hacia aquellas plantas que presentaban síntomas o signos. No fue necesario que la muestra fuera representativa y adecuada, por lo dependiendo del tamaño del campo a muestrear se colectaron entre 4 a 8 muestras por campo de muestreo. A cada una de las muestras colectadas se les etiqueto y colocó en bolsas de papel de primer uso para ser transportadas al laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Trujillo.
Procesamiento de hoja y flor1, 27-30 De las lesiones presentes en hoja se realizaron observaciones macroscópicas y microscópicas para determinar las manifestaciones externas y presencia de hifas y/o esporas del posible patógeno, para esto último los cortes histológicos realizados fueron colocados en una solución de KOH al 10% previamente a la observación microscópica. Para realizar el aislamiento del posible patógeno se procedió a hacer cortes en cuadrados de aproximadamente 0.5cm. de lado a partir del borde de la lesión que contengan tanto tejido sano como enfermo. Estos cortes fueron tratados durante aproximadamente 3 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 2%, para luego ser lavados en agua destilada estéril por tres veces y finalmente ser colocados en placas de petri conteniendo agar papa sacarosa (APS) con estreptomicina, e incubadas a temperatura ambiente por 3 a 5 días. De cada una de las colonias que desarrollaron en las placas con APS se realizaron observaciones microscópicas con azul de lactofenol y paralelamente se sembraron en tubos conteniendo APS con estreptomicina a fin de obtener cultivos puros a partir de los que se realizo el microcultivo correspondiente.
Procesamiento de tallo1, 27-30, Las muestras de tallo fueron lavadas en agua de caño primero y en agua destilada estéril después para eliminar residuos de tierra. Previa observación macroscópicas de las lesiones presentes y trabajando en condiciones de asepsia, el lugar donde se localizaban estas lesiones fueron desinfectadas externamente con alcohol y luego se flamearon ligeramente al mechero, para después hace un corte longitudinal a este nivel. De la zona de la lesión expuesta, se tomaron muestras para observación microscópicas con KOH al 10% y para ser sembradas en placas de Petri con APS más estreptomicina, dejando en incubación a temperatura ambiente por un periodo de 3 a 5 días. Las colonias que desarrollaron en las placas de petri con APS fueron resembradas en tubos conteniendo APS con estreptomicina para obtener los cultivos puros y a partir de estos realizar el microcultivo correspondiente
Determinación30-32 Se realizaran en base a las características macroscópicas de las colonias, a las características morfológicas microscópicas de los microcultivos y, haciendo uso de las claves de identificación correspondientes.
RESULTADOS En la Tabla 1 se observa que el órgano vegetal más afectado en las plantas analizadas fue la hoja, donde se aisló a Alternaria sp, Botrytis cinerea, Plasmopara vitícola y Uncinula necátor .
DISCUSIÓN En relación a los hongos fitopatógenos aislados en cultivos de vid procedentes del distrito de Cascas, en la Tabla 1 se observa que en hoja se aisló a Alternaria sp. . Este hongo es considerado principalmente un oportunista y se le reporta como causante de enfermedades foliares en plantas que
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están en estado de senescencia o son jóvenes. Alternaria está clasificado como perteneciente a la familia dematiaceae, y se caracteriza por presentar hifas y conidias de color oscuro, siendo esta la característica de la colonia 1,2,3,7,15,25,33, como se observa en la tabla 1.
Tabla 1: Género y/o especies de hongos encontrados en hoja y tallo deVitis viticola “vid” procedentes del distrito de Cascas, La Libertad, en el 2012.
Especie
signo
Características de la colonia
Características microscópicas*
Organo afectado
Alternaria sp
Mancha foliar
Algodonosas, de color gris en el anverso y oscuro en el reverso Algodonosa, gris oscuro en el anverso No crece en medio de cultivo
Macroconidias claviformes, pluricelulares
hoja
Botrytis cinerea
Micelio gris
Plasmopara viticola
Micelio blancogris
Uncinula necator
Micelio blanco
No crece en medio de cultivo
Macroconidias piriformes, unicelulares Esporangios globosos, esporangióforo ramificado en ángulo de 90°, hifas cenocíticas Esporangios piriformes, esporangióforo simple y alargado, hifas cinocíticas
hoja hoja
Hoja y tallo
Alternaria sp tiene un micelio oscuro y en los tejidos viejos infectados así como cuando se desarrolla como saprófito, produce conidióforos cortos con conidios con forma de mazo o claviformes, grandes, oscuros y pluricelulares. Estos conidios se desprenden con facilidad y son diseminados por las corrientes de aire. Debido a que son polífagos tienen la capacidad de infectar a un amplio rango de vegetales en todo el mundo. Muchas de las especies de Alternaria son principalmente saprófitas, es decir, no pueden infectar a los tejidos vivos de las plantas y solo se desarrollan sobre tejidos vegetales muertos o en proceso de descomposición y, a lo más, sobre tejidos viejos o senescentes como hojas, radicando allí la dificultad en decidir si al aislarse un hongo del género Alternaria sobre un tejido vegetal enfermo, está en calidad de agente causal primaria de la misma o de un hongo oportunista; por esta razón es probable que su presencia en las hojas de vid ocurra porque las plantas muestreadas estén débiles por otros factores bióticos o abióticos que las estaban afectando en el momento del muestreo1,2,3,7,15,25,33. En la misma Tabla también observamos la presencia de Botrytis cinerea , hongo que es reportado como causante de la enfermedad conocida como podredumbre gris y que ha sido aislado en todas las zona viñeras del mundo, Los climas húmedos y templados existentes en la localidad de Cascas favorecen la presencia de este patógeno, que reduce seriamente la calidad y calidad de la cosecha; sin embargo su principal daño no es en hoja sino en fruto, en el cuál ocasiona caída prematura de racimos de los pámpanos o pérdida de jugo de las bayas o frutos. Sin embargo en algunos cultivares y especialmente en determinadas condiciones climáticas en el período de sobremaduración, la infección de Botrytis en los racimos toma el nombre particular de “podredumbre noble”, ya que se considera beneficiosa al contribuir a la producción de un vino blanco dulce excepcional, al desecar en forma deseada a la baya durante su infección 1,2,3,7,15,25,33. B. cinerea se caracteriza por ser un Monilial con hifas tabicadas y ligeramente pigmentadas. Sus macroconidias son piriformes, unicelulares y se disponen a manera de racimo sobre un conidióforo simple dilatado en su extremo anterior. Su colonia es gris, ligeramente levantada y al igual que Alternaria sp es un hongo saprófito y polífago, aunque es un patógeno no solo secundario, sino principalmente primario, siendo el principal causante de enfermedades relacionadas con pudrición en diversos frutales,y hortalizas, así como en plantas silvestres; siendo sus conidias diseminadas principalmente por el viento y la lluvia1,2,3,7,15,25,33. Plasmopara vitícola es un hongo parásito obligado o biotrofo, razón por la cuál no fue posible aislarlo en medio de cultivo. Produce la enfermedad conocida como “mildiu de la vid” y se encuentra presente en regiones con clima cálido a templado, que es el clima que predomina en Cascas. Este hongo se caracteriza por presentar hifas cenocíticas, con esporangióforos que se ramifican en ángulo de 90° y en cuyo extremo se disponen en forma individual esporangios globosos que fácilmente se desprenden y son arrastrados por el viendo hacia otras plantas sanas 1,2,3,7,15,25,33.
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P. vitícola es capaz de afectar a cualquier órgano verde de la vid, pero en particular a las hojas. En función del período de incubación y de la edad de la hoja, las lesiones son de color amarillento y aceitoso, a pardo rojizo y limitadas a por las nervaduras, Este es un hongo biotrofo que forma la mayor parte de su micelio sobre la superficie de su hospedante, razón por la cuál se observa como un signo. Sus ataques más graves se producen cuando a un invierno húmedo le siguen una primavera húmeda y un verano caliente con temporales intermitentes de lluvia cada 8 a 15 días, ya que el desarrollo de la enfermedad se ve favorecido por todos aquellos factores que aumenten el contenido de humedad del suelo, aire y de la planta huésped 1,2,3,7,15,25,33. Uncinula necátor , al igual que P. vitícola, también es un parásito obligado y, ocasiona la enfermedad conocida como “oidium de la vid”. A diferencia de los mildius presenta hifas tabicadas y su conidióforo es simple en cuyo extremo se ubican en forma individual conidios hialinos de piriformes. Asimismo es capaz de producir cuerpos fructiferos sexuales llamados cleistotecios que se encuentran entre mezclados con las hifas. Actualmente a este hongo puede encontrársele en la mayoría de las áreas vitícolas del mundo, incluso en los trópicos, pudiendo reducir notoriamente el crecimiento y la cosecha de la vid, afectando a la calidad y a la resistencia al frío inverna 1,2,3,7,15,25,33l. U. necátor puede afectar a todos los tejidos verdes de la vid, siendo su órganos de preferencia la hoja. Penetra solo en los tejidos epidérmicos del órgano que afecta, introduciendo a sus haustorios dentro de ellos a fin de poder obtener los nutrientes de estas células, lo que ocasiona necrosamiento de las hojas o del órgano penetrado. Posteriormente produce el resto de sus estructuras vegetativas sobre la superficie de la hoja, lo que hace que se manifieste como un signo, observándose su micelio desde un color blanco a gris conforme va envejeciendo 1,2,3,7,15,25,33.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Agrios, G. Plant pathology. 5th ed. Elsevier Academic Press. USA. 2004 2. Bazán, C. Enfermedades de cultivos frutícolas y hortícolas. Edit. Jurídica. Lima. Perú. 1975. 3. Diaz, A. Enfermedades infecciosas de los cultivos. Ed. Trillas. México, México. 1993. 4. Dickinson, C. y J. Lucas. Fundamentos de patología vegetal y patógena de plantas. 1987. 5. Gonzáles, L. Introducción a la fitopatología. IICA. San José, Costa Rica. 1985. 6. Vidhayasekaran, P. Concise Enciclopedia of Plant Pathology. The Haworth Press Inc. USA. 2004. 7. Bazán, C. Enfermedades de cultivos tropicales y subtropicales. Ed. Jurídico. Lima, Perú. 1995. 8. De la Isla, L. Fitopatología. Ed. Limusa. México, México. 1994. 9. Manners, J. Introducción a la fitopatología. Ed. Limusa. México, México. 1986. 10. Urquijo,P. Patología vegetal agrícola. 2da. ed. Edit. Mundiprensa. Madrid, España. 1970. 11. Anculle, A. y R. Rozas. Evaluación de las enfermedades de las plantas. SENASA. Arequipa. 2002. 12. Roberts, D. y C. Boorthroyd. Fundamentos de patología vegetal. Ed. Acribia. Zaragoza, España. 1975. 13. Fernández-Northcote, E; R.Mont y C. Fribourg. Fitopatología agrícola. Universidad Agraria La Molina. Lima, Perú. 1973. 14. Del Moral, J. La sanidad de los vegetales cultivados. Caja Rural de Extremadura. España. 2006. 15. La Torre.B. Enfermedades de las plantas cultivadas. 5ta. ed. Alfa Omega. Chile. 1990. 16. Waller.J.J.Lenné and S. Waller. Plant pathologist’s pocketbook. CABI. 2002. International Wallinford. UK. 17. French, E. y T. Hebert. Métodos de investigación fitopatológica. IICA. San José, Costa Rica. 1982. 18. Mont, R. Principios del control de las enfermedades de las plantas. UNALM. Lima, Perú. 1979. 19. Walkers, J. Patología vegetal. 3ra edic. Edit. Mc. Graw Hill. New York. 1975. 20. Fribourg, C. Enfermedades causadas por virus, tiroides y micoplasmas. UNALM. Lima, Perú. 1979. 21. Sarasola, A. y M. Sarasola. 1975. Fitopatología: Micología. Ed. Hemisferios sur Bs. As. Argentina. 22. Deacon, J. Introducción a la micología moderna. 2da. ed. Edit. Limusa. México, México. 1990. 23. Moore-Landecker, E. Fundamental of the fungi. 3rd ed. Edit. Prentice May. New Jersey, USA. 1990. 24. Junta del Acuerdo de Cartagena. Manual de Identificación de plagas y enfermedades exóticas a los cultivos en la subregión andina. SENASA. Lima, Perú. 1986. 25. Finch, H. y A. Finch. Los hongos comunes que atacan a cultivos de América Latina. Edit. Trillas. México D.F. México. 1983. 26. Cisneros, f. Control de plagas agrícolas. 2da. ed. Univ. Agraria La Molina. Lima, Perú. 1995. 27. Fernández, H. Diagnóstico y evaluación de plagas. Curso taller. SENASA. Lima, Perú. 2004. 28. Echandi, E. Manual de laboratorio para fitopatología general. Ed. ACA. Lima, Perú. 1967. 29. Sarasola, A. y M. Sarasola. Fitopatología General. Control. Ed. Hemisferio sur. Bs. As, Argentina. 1975. 30. Zapater, R. Atlas de diagnóstico micológico. Librería El Ateneo. Bs. As, Argentina. 1965.
Pag. 60
31. Barnett, H. Illustrated genera of imperfect fungi. 2da. Ed. Burges Publishing Company. Minneapolis, USA. 1998. 32. Gilman, J. Manual de hongos del suelo. Edit. Continental. México DF. México. 1963. 33. Pearson,R. Goheen A. Plagas y enfermedades de la vid. Edic. Mundi Prensa. Madrid, España. 1986
Pag. 61
