ACTIVIDAD ENZIMATICA
OBJETIVOS:
Comprobar la acción de la temperatura, el pH y sustancias inhibidoras sobre la actividad enzimática. Determinar la especificidad enzimática.
I.- FUNDAMENTO TEORICO Los enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas. Como catalizadores, catalizadores, los enzimas enzimas actan en peque!a peque!a cantidad cantidad y se recuperan recuperan indefinidamente. indefinidamente. "o llevan a cabo reacciones que sean ener#$ticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibri equilibrios os químic químicos, os, sino sino que aceleran aceleran su consecu consecució ción. n. %llo %llo hace hace posibl posiblee que en condiciones fisioló#icas ten#an lu#ar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones e&tremas de presión, temperatura o pH. Las enzimas están formadas por dos tipos de aminoácidos' aminoácidos'
aminoácidos es!"c"!a#es
(forma (forman n la mayor parte de la enzima y le confieren confieren su estructur estructuraa terciar terciaria) ia) y
aminoácidos
caa#$icos (conforman (conforman el centro activo de la enzima, enzima, donde se une el sustrato covalentemente covalentemente para comenzar la reacción enzimática). *ráct *ráctica icame mente nte toda todass las las reacc reaccio ione ness quím químic icas as que que tien tienen en lu#a lu#arr en los los sere seress vivo vivoss están están
caa#i%ado!es catalizadas por enzimas. Los enzimas son caa#i%ado!es
es&ec$'icos' cada enzima cataliza un
solo tipo de reacción, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un #rupo muy reducido de ellos. %n una reacción catalizada por un enzima' + La sustancia sobre la que acta el enzima se llama s"s!ao. + %l sustrato se une a una re#ión concreta del enzima, llamado
activo cen!o aci(o. %l centro activo
comprende comprende () un sitio de unión formado formado por los aminoácidos aminoácidos que están en contacto contacto directo con el sustrato sustrato y (-) un sitio catalítico, catalítico, formado formado por los aminoácidos aminoácidos directamente directamente implicados implicados en el mecanismo de la reacción + na vez formados los
&!od"cos el enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción.
1
./ %l enzima y su sustrato
-./ nión al centro activo
0./ 1ormación de productos
Ciclo de reacción de las enzimas
Los enzimas, a diferencia de los catalizadores inor#ánicos catalizan reacciones específicas. 2in embar#o hay
disinos )!ados de es&eci'icidad . %l enzima sacarasa es m"*
es&ec$'ico' rompe el enlace b/#lucosídico de la sacarosa o de compuestos muy similares. 3sí, para el enzima sacarasa, la sacarosa es su
s"s!ao na"!a# , mientras que la maltosa y la
isomaltosa son s"s!aos aná#o)os . %l enzima acta con má&ima eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre los sustratos análo#os. %ntre los en%imas &oco es&ec$'icos están las proteasas di#estivas como la quimotripsina, que rompe los enlaces amida de proteínas y p$ptidos de muy diverso tipo.
+. C,ASIFICACION %l Comit$ de %nzimas (%C) de la nión 4nternacional de 5ioquímica y 5iolo#ía 6olecular clasifica a las enzimas en 7 clases, de acuerdo con del tipo de reacción que catalizan' + Oido!!ed"casas: 3celeran las reacciones de o&idación/reducción. + T!ans'e!asas: *articipan en la transferencia de #rupos (amino o fosfato, por e8emplo). + id!o#asas: %stas aceleran las reacciones en las que una sustancia se rompe en componentes más peque!os por reacción con mol$culas de a#ua. + ,iasas: 9eneran o hacen desaparecer dobles enlaces en forma no o&idativa. + Isome!asas: 3celeran reacciones de cambio de posición de átomos. +
,i)asas o sineasas: Catalizan reacciones de formación de enlaces dependientes del
rompimiento de enlaces de alta ener#ía.
/. 0RO0IEDADES. 2
2on altamente específicas para sus sustratos y para una reacción. *ueden estar su8etas a re#ulación en su actividad. *or e8emplo, la re#ulación alost$rica. 2on eficientes en peque!as cantidades' la enzima no sufre cambios al catalizar las
reacciones químicas, de manera que una peque!a cantidad de enzima puede catalizar repetidas
veces una reacción. 3celeran las reacciones químicas sin sufrir modificación. "o alteran las concentraciones de equilibrio de la reacción. 2ólo hacen que este
equilibrio se alcance más rápidamente, cambiando el mecanismo de reacción. "o modifican el carácter e&ot$rmico o endot$rmico de la reacción
1. FACTORES 2UE INF,U3EN EN ,A ACTIVIDAD ENZIMATICA: Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de un enzima son'
1.+. E# & Los enzimas poseen #rupos químicos ionizables (carbo&ilos /C::H; amino /"H-; tiol /2H; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. 2e#n el pH del medio, estos #rupos pueden tener car#a el$ctrica positiva, ne#ativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus car#as el$ctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. %ste es el llamado & 4&imo. La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas d$cimas por encima o por deba8o del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. 3sí, la pepsina #ástrica tiene un pH óptimo de -, la ureasa lo tiene a pH < y la ar#inasa lo tiene a pH =. Como li#eros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos comple8os para mantener estable el ph intracelular' Los amo!i)"ado!es 'isio#4)icos .
%fectos del pH sobre la actividad enzimática
1./. ,A TEM0ERATURA 3
%n #eneral, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas' por cada =>C de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas si#uen esta ley #eneral. 2in embar#o, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es má&ima se llama
em&e!a"!a 4&ima *or encima de esta temperatura, el aumento de
velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la p$rdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización t$rmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.
%fectos de la temperatura sobre la actividad enzimática
1.1. ,OS INIBIDORES %l efecto que ocasionan los inhibidores sobre la actividad enzimática puede ser'
Re(e!si5#e:
Com&eii(a: el S y el I compiten por el sitio activo de la enzima. %l resultado de la competencia depende de cuántas mol$culas de cada tipo hay.
Acom&eii(a: el I se combina con el comple8o enzimasustrato
para formar un comple8o inactivo enzima/sustratoinhibidor, el cual no
e&perimenta su transformación posterior en producto.
No com&eii(a: %l I se fi8a a la enzima en un sitio de la mol$cula
que no es el activo. *uede combinarse con la enzima libre o con el comple8o enzima/sustrato. %s reversible, pero no por la cantidad de sustrato. I!!e(e!si5#e: Ciertas sustancias inhiben a las enzimas en forma irreversible, sea fi8ándose permanentemente de manera covalente o desnaturalizándolas. %ntre estos están ciertos metales como el plomo, mercurio y ars$nico inhiben enzimas que tienen en su centro activo #rupos ? 2H libres.
4
4nhibidor no competitivo
4nhibidor competitivo
%fecto de los inhibidores sobre la actividad enzimática
1.6. ,OS COFACTORES 3 veces, un enzima requiere para su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis' los
co'aco!es . %stos son resistentes al calor mientras que las
proteínas #eneralmente no lo son. Los cofactores pueden ser iones inor#ánicos como el 1e@@, 6#@@, 6n@@, An@@,1e-@, 1e0@,Cu-@,Ca-@,B@,Co , etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una mol$cula or#ánica se llama
coen%ima. 6uchos de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman
)!"&os
&!os7icos. La forma catalíticamente activa del enzima, es decir, el enzima unido a su #rupo prost$tico, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima.
1.8. ,A ES0ECIFICIDAD ENZIMATICA. Dos características estructurales determinan la especificidad de una enzima por su substrato' a) %l substrato debe poseer el enlace químico específico o unión, que puede ser atacado por la enzima. b) %l substrato debe tener habitualmente al#n otro #rupo funcional, un #rupo de unión, que se une a la enzima y ubica en posición a la mol$cula de substrato de modo que el enlace susceptible se dispon#a apropiadamente en relación al sitio activo de la enzima.
La estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus isómeros) es lo que determina la especificidad de las 5
enzimas. %l acoplamiento es tal que %. 1isher (E) enunció' Fel sustrato se adapta al centro activo o catalítico de una enzima como una llave a una cerraduraF Las enzimas son esenciales para la vida ya que, de otra forma, las reacciones en las c$lulas se darían con poca rapidez. na mal función en una enzima, provocada por una sobreproducción o subproducción, mutación, deleción, etc., puede provocar enfermedades como la fenilcetonuria. Con participación de las enzimas se verifican numerosos procesos químicos, el con8unto de los cuales constituyen la esencia del metabolismo. 4nfluyendo en la velocidad de las reacciones metabólicas, los enzimas son capaces de re#ular efectivamente los procesos de vitalidad.
%specificidad enzimática
II. FUNDAMENTOS 2UIMICOS:
6
+. INF,UENCIA DE, CAMBIO DE TEM0ERATURA SOBRE ,A ACTIVIDAD ENZIMATICA' La estructura terciaria de una proteína es muy sensible a los cambios de temperatura, se mantiene #racias a fuerzas no covalentes. La temperatura óptima para la acción de enzimas es la temperatura del cuerpo de los animales que oscilan en el intervalo de 07 a E GC. Con cierto aumento de la temperatura del medio ocurre aceleración de la reacción a consecuencia de la activación de las mol$culas de sustrato. n peque!o aumento de la temperatura conduce al debilitamiento de los enlaces que mantienen la conformación de la mol$cula de una enzima, necesaria para la manifestación de su actividad catalítica. 6ientras que si ba8a la temperatura en la enzima solo se inactiva su actividad catalítica.
/. INF,UENCIA DE, & SOBRE ,A ACTIVIDAD ENZIMATICA *ara cada enzima e&iste un pH óptimo, en donde están dadas las condiciones favorables para el mantenimiento de la conformación funcionalmente activa de la mol$cula. Los #rupos amino y carbo&ilo de los resto de aminoácidos, ionizados a una ma#nitud de pH determinada, participan en el mantenimiento de la conformación de la mol$cula proteínica necesaria para la formación de los centros catalíticos del enzima y favorecen tambi$n a su combinación con el sustrato. 3 un pH distinto se altera la ionización de los #rupos correspondiente, y como resultado se rompen los enlaces que ase#uran la formación de los centros catalíticos, y el enzima se inactiva. 3 los valores de pH e&tremo los enzimas se desnaturalizan.
1. ES0ECIFICIDAD ENZIMATICA ' La acción enzimática se caracteriza por la formación de un comple8o que representa el estado de transición. %@2
%2
%@*
%l sustrato se une al enzima a trav$s de numerosas interacciones d$biles como son' puentes de hidró#eno, electrostáticos, hidrófobos, etc, en un lu#ar específico, ( cen!o aci(o9 . %ste centro es una peque!a porción del enzima, constituida por una serie de
aminoácidos que
interaccionan con el sustrato.
3l#unas enzimas actan con la ayuda de estructuras no proteicas. %n función de su naturaleza se denominan' . Co'aco!. Cuando se trata de iones o mol$culas inor#ánicas. 7
-.
Coen%ima. Cuando es una mol$cula or#ánica, se puede se!alar que muchas vitaminas
funcionan como coenzimas; y realmente las deficiencias producidas por la falta de vitaminas responde más bien a que no se puede sintetizar un determinado enzima en el que la vitamina es el coenzima.
A
B
Coenzimas (3)
Cofactores (5)
6. INF,UENCIA DE ,OS INIBIDORES SOBRE ,A ACTIVIDAD ENZIMATICA ' Determinadas sustancias se comportan como inhibidores enzimáticos porque disminuyen e incluso anulan la velocidad de la reacción catalizada. Los inhibidores son de dos tipos'
I!!e(e!si5#es (venenos)' son compuestos que se unen de forma permanente (irreversiblemente) a determinados #rupos del centro activo de un enzima y anulan su capacidad catalítica.
Re(e!si5#es: la unión de la enzima y el inhibidor es temporal. 4mpide el normal funcionamiento de la enzima, solo mientras dura. 3 su vez estos inhibidores pueden ser de dos tipos'
o
inhibidores competitivos' se unen a la enzima en su centro activo. 3l estar ocupado el centro activo, la enzima no puede actuar.
o
4nhibidores no competitivos' se unen a la enzima por un lu#ar distinto al centro activo y provocan cambios en este que le impiden e8ercer su acción sobre el sustrato.
8
III. 0RE0ARACION DE REACTIVOS ' +. SA,IVA DI,UIDA Ami#asa9 ' 2e en8ua#a la boca con - ml de a#ua destilada medidos en un cilindro #raduado y se trasvasa a un beacIer.
/. A,MID;N A, /< DI,UIDO EN C,ORURO DE SODIO A, =>1< ' *esar =,0 # de Cloruro de sodio y diluir en == ml de a#ua destilada. %n esta solución diluir - # de almidón soluble.
1.- A,MIDON A, /< EN A?UA DESTI,ADA: *esar - # de 3lmidón y diluir en == ml de a#ua destilada
6.- ,EVADURA DE ACER 0AN Saca!asa9 ' *esar = # de Levadura #ranulada de hacer pan y diluir en == ml de a#ua destilada.
8.- SACAROSA A, /<' *esar - # de 2acarosa y diluir en == ml de a#ua destilada @. REACTIVO DE ,U?O, ' %n == ml de a#ua destilada se disuelven -= # de Joduro de *otasio y = # de Jodo.
.- C,ORURO DE SODIO A, +< ' *esar # de Cloruro de 2odio y diluir en == ml de a#ua destilada
.- SU,FATO CU0RICO +< ' *esar # de 2ulfato Cuprico y diluir en == ml de a#ua destilada.
. CARBONATO DE SODIO =>/ M SO,UCI;N A9 +=. ACIDO CITRICO =>+ M SO,UCI;N B9. ++. SO,UCI;N AMORTI?UADORA & 6 ' 2e mezclan -= ml de 2olución 3 con = ml de 2olución 5.
+/. SO,UCI;N AMORTI?UADORA & ' 2e mezclan = ml de 2olución 3 con = ml de 2olución 5.
+1. SO,UCI;N AMORTI?UADORA & ' 2e mezclan = ml de 2olución 3 con -= ml de 2olución 5.
+6. SO,UCI;N DE FE,IN? A ' Disuelva 0E,7 # de 2ulfato de Cobre pentahidratado en a#ua destilada y diluya a == ml.
+8. SO,UCI;N DE FE,IN? B ' Disuelva <0 # de Kartrato de 2odio y *otasio (sal de ochelle, B"aCEHE:7) y = # de Hidró&ido de 2odio ( "a:H ) en a#ua destilada y diluya a == ml.
9
IV. MATERIA,ES> REACTIVOS 3 E2UI0OS MATERIA,ES
Kubos
de
REACTIVOS
ensayo
cMtapa y sMtapa 9radilla %spátula *ropipeta *ipetas #raduadas de
- y ml *isetas Cilindro #raduado de
anhidro Cloruro de sodio 3lmidón Jodo Joduro de *otasio Carbonato de 2odio
3nhidro 3cido Cítrico 2olución
amorti#uadora pH E 2olución
amorti#uadora pH < 2olución
- y == ml 5eacIer de == ml
3#ua destilada 2ulfato Cprico
E2UI0OS
3#itador de tubos de ensayo Campana de e&tracción. 5a!o de maría 5alanza 3nalítica %stufa
amorti#uadora pH 2acarosa (3zcar) Levadura (2acarasa) 2ulfato de cobre *entahidratado Kartrato de 2odio y *otasio Hidró&ido de 2odio
V. 0ARTE E0ERIMENTA, I 9 0RUEBAS ,ABI,IDAD TERMICA:
0ROCEDIMIENTO Kome cuatro tubos de ensayo'
Comprobar la influencia del
%n los tubos -, 0 y E a#re#ue' 2ustancia
cambio de temperatura sobre problema' 2aliva diluida (3milasa o ptialina) 10
VO,UMEN 0 ml
la actividad enzimática.
La saliva en el Kubo - se hierve durante min y el tubo E se lleva al con#elador durante el mismo tiempo Coloque en todos los tubos 2olución de almidón al -N en cloruro de sodio al =,0N Los tubos , - y 0 se llevan a la estufa a 0<>C
ml
durante -=O y el E se sumer#e en hielo durante el mismo tiempo. Kranscurrido los -=O, a#re#ar a todos los
INF,UENCIA DE, &:
tubos eactivo de Lu#ol. "o a#ite :bservar y reportar. Kome cuatro tubos de ensayo'
Comprobar la influencia del
3l tubo a#re#ue a#ua 3l tubo - a#re#ue
pH
2olución amorti#uadora pH E.
sobre
la
actividad
enzimática.
3l tubo 0 a#re#ue 2olución amorti#uadora
#ota
0 ml
pH <. 3l tubo E a#re#ue 2olución amorti#uadora pH . 3 todos los tubos a#re#ue 2aliva diluida. 3 todos los tubos a#re#ue 3lmidón al -N. 6ezcle y lleve a la estufa a 0<>C durante -=O. Kranscurrido los -=O, a#re#ar a todos los
0 ml ml #ota
tubos eactivo de Lu#ol. :bservar y reportar.
*3K% %P*%46%"K3L ( 44 )
0RUEBAS ES0ECIFICIDAD ENZIMATICA: Determinar la influencia de la enzima amilasa
y sacarasa
sobre diferentes sustratos.
0ROCEDIMIENTO
VO,UMEN
Kome cinco tubos de ensayo'
ml
3 los tubos y - a#re#ue 3lmidón -N 3 los tubos 0 y E a#re#ue 2acarosa -N 3l tubo a#re#ue 3lmidón -N o 2acarosa
ml ml
-N 3 los tubos y 0 a#re#ue 2aliva diluida. 3 los tubos - y E a#re#ue 2acarasa 6ezcle y lleve a la estufa a 0<>C durante -=O. Kranscurrido los -=O, a#re#ar a los tubos que
11
0 ml 0 ml #ota
SUSTANCIAS
contienen 3lmidón eactivo de Lu#ol. 3 los tubos que contienen sacarosa a#re#ue
- ml cMu
1ehlin# 3 y 5. Llevar a ba!o de 6aría por O. :bservar y reportar. Kome tres tubos de ensayo'
ml
INIBIDORAS:
3#re#ue a todos los tubos 3lmidón -N 3l tubo a#re#ue Cloruro de 2odio N Comprobar la influencia de 3l tubo - a#re#ue 2ulfato de Cobre N los inhibidores sobre la 3l tubo 0 a#re#ue 3#ua destilada 3 todos los tubos a#re#ue 2aliva diluida actividad enzimática 6ezcle y lleve a la estufa a 0<>C durante -=O. Kranscurrido los -=O, a#re#ar a todos los
- ml - ml - ml - ml #ota
tubos eactivo de Lu#ol. :bservar y reportar.
V. RESU,TADOS. Kabla ./ 4nfluencia de la temperatura sobre la actividad enzimática
TUBO
ENZIMA CONDICIONES SUSTRATO INCUBACI;N CO,ORACI;N
N +
////////
2in amilasa
3lmidón
0< >C & -=O
/
3milasa
%nzima
3lmidón
0< >C & -=O
3lmidón
0< >C & -=O
desnaturalizada
1
3milasa
%nzima 3ctiva
12
6
3milasa
%nzima 3ctiva
3lmidón
= >C & -=O
Kabla -./ 4nfluencia del pH sobre la actividad enzimática
TUBO
ENZIMA
CONDICIONES
SUSTRATO
INCUBACI;N
+
3milasa
3#ua destilada
3lmidón
0< >C & -=O
/
3milasa
pH E
3lmidón
0< >C & -=O
1
3milasa
pH <
3lmidón
0< >C & -=O
6
3milasa
pH
3lmidón
0< >C & -=O
CO,ORACI;N
N
Kabla 0./ %specificidad enzimática
TUBO N
ENZIMA
SUSTRATO
INCUBACI;N
+
3milasa
3lmidón
0< >C & -=O
/
2acarasa
3lmidón
0< >C & -=O
1
3milasa
2acarosa
0< >C & -=O
6
2acarasa
2acarosa
0< >C & -=O
13
CO,ORACI;N
8
3lmidón o
0< >C & -=O
2acarosa
Kabla E./ 4nfluencia de los inhibidores sobre la actividad enzimática
TUBO ENZIMA A?ENTE SUSTRATO INCUBACI;N CO,ORACI;N N +
3milasa
Cloruro de
3lmidón
0< >C & -=O
3lmidón
0< >C & -=O
3lmidón
0< >C & -=O
2odio N
/
3milasa
2ulfato de Cobre N
1
3milasa
3#ua Destilada
14
