Universitatea Tehnică “Gheorghe Asachi” din Iași Facultatea de Inginerie Chimică și Protecția Mediului Departamentul de Inginerie Organică, Biochimică şi Alimentară Specializarea Controlul și Procesarea Alimentelor
Proiect MCTM
Coordonator științific: Prof. dr. ing. Teodor Măluţan
Student: Digori Gheorghe
Iași 2015
Temă: Determinarea îndulcitorilor artificiali din băuturile răcoritoare prin metoda HPLC
Cuprins I. INTRODUCERE..........................................................................................................................4 1.1 Cromatografia lichidă de performanţă înaltă cu fază inversă................................................6 1.2. Etapele analizei cromatografice............................................................................................8 II. Determinarea îndulcitorilor din băuturile răcoritoare prin metoda HPLC..................................9 2.1 Îndulcitorii..............................................................................................................................9 2.2 Metoda HPLC......................................................................................................................11 2.2.4
Instrumente.............................................................................................................13
2.2.5
Pregătirea probelor..................................................................................................13
2.2.6
Analiză HPLC-ELSD..............................................................................................13
2.2.7
Identificarea și cuantificarea îndulcitorilor.............................................................14
2.2.8
Optimizarea..............................................................................................................15
2.2.9
Validarea metodei.................................................................................................20
CONCLUZII..................................................................................................................................22 BIBLIOGRAFIE............................................................................................................................23
I. INTRODUCERE Cromatografia este o metodă fizico-chimică modernă, considerată nu doar o metodă de separare; în majoritatea variantelor ea prezintă o metodă analitică hibridă, care îmbină separarea cu identificarea ulterioară şi dozarea componenţilor depistaţi în amestecurile complexe. Conform aprecierii experţilor, cromatografia se consideră una din cele 20 descoperiri importante ale secolului XX, care au contribuit cel mai mult la reformarea ştiinţei, iar prin prisma ei se determină nivelul de dezvoltare al industriei şi tehnicii, civilizaţiei în întregime. Totodată, prezintă o ramură a analizei instrumentale cu un larg spectru aplicativ în majoritatea domeniilor şi nici o metodă analitică nu concurează cu cea cromatografică, la momentul dat, după aplicarea universală şi eficacitatea separării celor mai compuse amestecuri. Primele descrieri ale procesului de separare sunt întâlnite în lucrările chimistului german Runge de prin anul 1850 şi ale altor savanţi, dar în fine ei n-au reuşit să formeze o disciplină ştiinţifică . Fondatorul metodei cromatografice se consideră Mihail Ţvet, botanic şi chimist rus, datat cu anul 1903, care a efectuat primele încercări de separare în domeniul coloranţilor vegetali pe o coloană de oxid de aluminiu. În multe surse literare se întâlneşte anul 1906, unde pentru prima dată în articolul autorului M. Ţvet apare termenul “cromatografie”, în care se dezvăluie conceptul “experienţă cromatografică” . Etapă importantă în cercetare, în 1938, a devenit descrierea cromatografiei pe strat subţire de savanţii N. A. Izmailov şi M. S. Shraiber, metodă care astăzi are o răspândire universală, datorită unui cost redus, a vitezei mari de eluare şi a rezoluţiei bune. Bazându-se pe fenomenul deja cunoscut, descris în lucrările lui M. Ţvet, şi aplicându-l în cazul aminoacizilor, în 1941 savanţii englezi A. D. Martin şi R. Synge au elaborat metoda cromatografică de repartiţie, pentru care în 1952 au fost decernaţi cu premiul Nobel. În timpul cercetărilor, aceiaşi savanţi şi colegii lor Consden, Gordon au depistat că în afară de silicagel, apa este reţinută şi de celuloză. Astfel în 1944 a fost elaborată o nouă metodă cromatografică − pe hârtie, utilizându-se ca sorbent al fazei staţionare hârtia de filtru. Un mare succes al savantului Martin în colaborare cu E. T. James a urmat de asemenea în anul 1952 cu punerea bazelor cromatografiei de gaze (GC), apoi în 1959 savantul Golay a introdus noţiunea cromatografia de gaze pe coloane capilare. Metoda dată este larg răspândită şi până în prezent.
În timp cromatografia de lichide s-a dezvoltat datorită perfecţionării detectorilor, pompelor şi ca rezultat s-au construit cromatografe de lichide de performanţă înaltă (HPLC). Cu apariţia metodei HPLC (an. 1968) autorii Giddings şi Kirkland au propus utilizarea unor faze staţionare cu particule foarte mici, cu trecerea fazei mobile sub presiune. Un aport colosal la dezvoltarea cromatografiei au depus şi savanţii A. V. Kiseliov, A. A. Jucovski, C. I. Sacadînscki, destinşi cu medalia internaţională M. Ţvet “Pentru descoperirile distinse în domeniul cromatografiei” şi mulţi alţi specialişti în acest domeniu. Cromatografia ca metodă de separare se încadrează în grupul de procedee bazate pe migrarea diferenţiată a componenţilor din amestecul studiat dintre două faze, adică migrare diferenţiată a diferitor molecule. Ea cercetează starea termodinamică a sistemelor dintre două faze, studiază natura interacţiunii intramoleculare, cinetica proceselor interne şi schimbului de masă între faze, proceselor formatoare de complecşi, asociaţii şi multe altele. Datorită complexităţii proceselor de separare, subînţelegerii deosebit de multilaterale a termenului “cromatografie” este dificilă formularea unei definiţii generale. Însă se poate spune că toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o “fază staţionară” şi o “fază mobilă”, iar componenţii amestecului de analizat sunt antrenaţi în lungul coloanei de un flux de fază mobilă (gazoase sau lichide), cu viteze diferite, ceea ce constituie principiul fundamental al separării. Pe de altă parte, la baza majorităţii metodelor cromatografice de separare stau patru procese fundamentale: adsorbţia pe suporturi solide, repartiţia între faza staţionară şi aceea mobilă, schimbul ionic şi de excluziune. Astfel, principiul separării poate fi diferit, dar etapele analizei cromatografice sunt aceleaşi. Luând în consideraţie cele expuse, totodată şi numeroşii factori implicaţi în separare, în asigurarea selectivităţii şi rezoluţiei, precum şi caracteristicile detectorilor utilizaţi, respectiv de sensibilitatea lor, reproductibilitatea proceselor de separare, detecţie şi dozare, este greu de dat o clasificare atotcuprinzătoare. De aceea cromatografia se poate clasifica: -având în vedere natura fazelor staţionară şi a celei mobile (în fază gazoasă, lichidă şi fază supercritică); -în funcţie de procesele fizico-chimice care stau la baza separării (cromatografie de adsorbţie, de repartiţie, de schimb ionic, de excluziune, cu formare de perechi de ioni, de afinitate);
-în funcţie de modalitatea de imobilizare a fazei staţionare (cromatografie pe coloană şi planară); -în funcţie de starea fizică a celor două faze (cromatografie gaz-lichid, gaz-solid, lichidlichid, lichid-solid) Poziţia privilegiată a cromatografiei se datorează faptului că la baza migrării se găseşte repetarea echilibrului de repartiţie dintre două faze (staţionară şi mobilă), care pentru un singur proces se poate realiza extrem de rapid, de repetate ori într-un interval de timp scurt.
1.1 Cromatografia lichidă de performanţă înaltă cu fază inversă. În anii 70-80 ai secolului XX s-a accelerat dezvoltarea unei noi direcţii a cromatografiei – HPLC cu fază inversă. Sensibilitatea înaltă, precizia şi selectivitatea metodei i-a dat o prioritate considerabilă în studiu farmacocinetic pentru un număr mare de substanţe medicamentoase, iar rapiditatea analizei permite efectuarea în instituţiile medicale atât a investigărilor clinice imense cât şi a analizelor expres şi eficace în cazul diagnosticării urgente sau dozării preparatului. O altă cauză este şi preponderenţa metodei HPLC faţă de alte metode fizicochimice, inclusiv şi faţă de unele metode cromatografice, şi anume: • domeniul de aplicare s-a majorat cu dozarea compuşilor volatili, uşor oxidabili, termolabili fără aplicarea metodelor speciale; • metoda HPLC cu fază inversă permite analiza mostrelor apoase, simplificând prepararea probelor de material biologic şi reducând timpul unei analize; • majoritatea variantelor de detecţie în metoda HPLC nu distrug probele. Astfel, în caz de necesitate, permite cooperarea cromatografiei cu scop analitic (separarea, detecţia, determinarea cantitativă) şi cea cu scop preparativ, totodată este posibilă colectarea fracţiilor separate a substanţelor analizate pentru identificarea ulterioară şi/sau utilizarea altor metode fizico-chimice de analiză; • în majoritatea cazurilor se exclude necesitatea de a efectua derivatizarea; • metoda HPLC poate fi automatizată complet; • solvenţii organici (acetonitrilul, metanolul, parţial tetrahidrofuranul) şi apa utilizaţi în faza mobilă permit detecţia în UV-VIS într-un diapazon larg. Totodată aceşti solvenţi sau
amestecurile lor dizolvă practic toate grupele de compuşi aflaţi în organismul uman, în materialul biologic şi utilizaţi ca preparate medicamentoase ş. a.; • sorbenţii utilizaţi în HPLC cu fază inversă se echilibrează foarte repede cu noii solvenţi, ce permit de a realiza uşor cromatografia în gradient şi a trece de la o metodă la alta; • sorbenţii le acordă posibilitatea de a utiliza solvenţi cu proprietăţi într-un interval mai larg, la fel de a adăuga diferite tipuri de modificatori (săruri, acizi, baze, reactivi perechi de ioni, ş. a.). Metoda dată ca şi orice metodă analitică posedă şi unele dezavantaje: • metodele de detecţie existente, uneori, nu posedă o suficientă sensibilitate necesară pentru determinarea concentraţiile joase a analiţilor, îndeosebi în analiza farmacocinetică; • metoda HPLC necesită utilizarea cantităţilor mari de solvenţi organici de o puritate înaltă, care în majoritate sunt destul de costisitori şi toxici, în plus regenerarea acestora este dificilă; • utilajul cromatografic, piesele de schimb, coloanele cromatografice, accesorii, aparatura specifică pentru umplerea coloanelor cu sorbenţi sunt destul de costisitori, totodată complicaţi în deservire; • caracteristica retenţiei şi selectivităţii sorbenţilor cu faze inverse se schimbă nu numai trecând de la o firmă la alta, dar şi de la serie la serie a unui producător. Metoda HPLC presupune separarea componenţilor de analizat în fluxul fazei mobile (eluent, ce-i caracterizat de compoziţie, forţa ionică, pH şi alţi parametri) în baza diferitor interacţiuni cu sorbenţii. Complicarea mecanismului de separare şi majorarea numărului de parametri variabili ai procesului în îmbinare cu eficacitatea mai redusă a coloanei cromatografice, decât în GC, duc la ideea că alegerea şi optimizarea condiţiilor de separare în metoda HPLC este mult mai dificilă, iar rolul experienţei şi intuiţiei specialistului, în cazul dat, este mai importantă. Optimizarea - este căutarea condiţiilor optime la efectuarea analizelor. În dependenţă de situaţie, optimizarea poate fi îndreptată la îmbunătăţirea selectivităţii, sensibilităţii şi altor parametri, ce determină veridicitatea rezultatelor, precum şi îmbunătăţirea raportului cost/beneficiu, reducerea timpului de analiză, micşorarea numărului de operaţii manuale, dar fără pierderi de informaţie. Ea se referă la toate etapele de analiză.
Optim – este mai bine zis o categorie filozofică. În cromatografie, precum şi în alte domenii persistă un permanent compromis între calitatea rezultatului finit şi cheltuielile la realizarea lor (de materiale, de timp, de resurse umane). În ce priveşte cheltuielile pentru o analiză trebuie adunate neapărat şi cele la elaborare. În procesul optimizării ele cresc monoton, atunci când eficacitatea metodei se apropie asimptotic de o oarecare valoare maximă – limita fizică, determinată printr-un nivel modern de dezvoltare a tehnologiei analitice, şi într-un moment oarecare “datorită” optimizării excesive metoda devine nerentabilă. Astfel, în rezolvarea sarcinii concrete este destul de important determinarea preventivă a cheltuielilor posibile la elaborare şi aprecierea profunzimii în cercetare.
1.2. Etapele analizei cromatografice Analiza HPLC este un proces complicat, cu multe etape, rezultatul depinde de scrupulozitatea efectuării fiecărei etape în parte. Se pot evidenţia 3 etape de bază ale acestui proces: Prepararea probelor – toate operaţiile de preparare a mostrelor de analizat, care se finisează cu obţinerea probelor, injectate direct în coloana cromatografică, inclusiv şi derivatizarea precoloană, în caz de utilizare. Analiza cromatografică propriu zisă – din momentul injectării probei până la înregistrarea semnalului electric la ieşirea din detector, inclusiv şi derivatizarea pe coloană sau postcoloană, unde ea-i prezentă. Prelucrarea informaţiei cromatografice primare, rezultatul căreia constă în obţinerea mărimilor ce caracterizează componenţa calitativă şi cantitativă a probelor de analizat. Oricare din etapele enumerate are specificul său de realizare şi cere o tratare individuală de optimizare.
II. Determinarea îndulcitorilor din băuturile răcoritoare prin metoda HPLC 2.1 Îndulcitorii Aditivii alimentari sunt substanțe adăugate intenționat în produsele alimentare pentru a îndeplini anumite funcții tehnologice, de exemplu, pentru culoare, îndulcire sau conservare. În Uniunea Europeană (UE), Legislația privind aditivii alimentari este reglementată de Directiva Consiliului 89/107/CEE a Consiliului [1], și se bazează pe principiul că aditivii pot fi utiliza ți numai autorizat în fabricarea și prepararea produselor alimentare. Pot fi utilizați numai în cazul în care tehnologia de fabricare necesită utilizarea lor, ei nu induc eroare consumatorului și nu prezintă niciun pericol pentru sănătate. Îndulcitorii formează o categorie importantă de aditivi alimentari care sunt utilizați într-o gamă tot mai largă de produse alimentare și băuturi. Sunt utilizați pentru a da un gust dulce produselor alimentare. Directivele menționate mai sus stipulează că îndulcitorii pot fi puși la vânzare că atare sau pot și utilizați în producția de produse alimentare. Înainte de a primi autorizare, îndulcitorii sunt evaluați de către Autoritatea Europeană pentru Siguranță Alimentară (EFSA). Lista de îndulcitori autorizați este revizuită în mod regulat de către Comisia Europeană, în conformitate cu avizul EFSA, care ia în considerare cele mai recente progrese științifice în domeniu. În prezent, sunt utilizați 8 îndulcitori: acesulfam-K (ACS-K), aspartam (ASP), sare de aspartam-acesulfam, ciclamat (CYC), zaharină (SAC), sucraloza (ȘCL), neohesperidina dihidrocalcona (NHDC) și taumatina. Unele din ele sunt sintetice: ACS-K, ASP, sare de ASPACS, CYC, SAC, ȘCL sau semisintetice: NHDC, în timp ce taumatina apare în mod natural. Având în vedere discuțiile controversate cu privire la efectele lor asupra sănătății și pentru a asigură punerea adecvată în aplicare a legislației existențe pentru a garanta siguranță consumatorilor, statele membre ale UE sunt obligate să stabilească sisteme de anchetare regulată pentru a monitoriza consumul de îndulcitori. Pentru a obține această informație cantitativă, metodele de analiză sunt necesare pentru a măsură nivelul de îndulcitori într-o gamă largă de matrici alimentare.
Determinarea îndulcitorilor a determinat deja un mare interes. Cele mai multe metode au fost dezvoltate pentru îndulcitori individuali. Pentru a da un exemplu, metodele disponibile pentru determinare SAC din produsele alimentare includ spectrometrie, puls-polarografie diferențială, sublimare, potențiometrie, cromatografie capilară electrocinetică micelară și cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Câteva lucrări au demonstrat utilitatea electroforezei capilare pentru analiză îndulcitorilor artificiali diferiți. Deoarece metodele spectrometrice, gravimetrice sau electrochimice necesită un timp mai lung de lucru, metodă HPLC în combinație cu detecția UV este tot mai des aleasă pentru a determină îndulcitorii artificiali individuali cum ar fi SAC, ASP, ACS și NHDC. Lipsă cromoforului din ȘCL face că detecția prin absorbție UV directă să fie sensibilă și dificilă. Prin urmare, metodă analitică de determinare implică fie determinarea indicelui de refracție (RI), fie absorbantă la o lungime de undă de 200 nm care nu are specificitate. Alte metode, care au fost aplicate cu success, sunt cromatografia de înaltă performanță în strat subțire, cromatografia de înaltă performanță de schimb anionic cu detecție amperometrica sau electroforeză capilară indirectă cu absorbție UV. De asemenea, CYC nu se absoarbe în domeniul UV vizibil. Acest neajuns a fost rezolvat prin utilizarea fotometriei indirecte UV, extracția de ioni pereche, derivatizare, detecția conductivității. În zilele noastre, îndulcitorii artificiali nu sunt utilizați singuri, ci în combina ție. De aceea este nevoie de metode sigure care să poată acoperi cuantificarea acestora. Cu toate acestea au fost descrise puține metode de cuantificare pentru determinarea simultană a mai mulți îndulcitori. Astfel, determinarea simultană se face pentru ASP și ACS-K, SAC și ASP, SCÂ și ȘCL. Separarea și determinarea celor 4 îndulcitori: SAC, ASC-K, CYC și ASP se face prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu detecția conductivității sau prin cromatografie ionica. Lucrarea de față descrie dezvoltarea și validarea metodei de determinare a îndulcitorilor printr-o metodă HPLC combinată cu un detector evaporativ cu împrăștierea luminii, care îndeplinesc cerințele pentru a controla limitele legale ale îndulcitorilor sintetici și semi-sintetici prevăzute în legislația actuală a UE.
2.2 Metoda HPLC 2.2.1. Substanțe chimice, reactivi și soluții standard
Reactivii analitici, acid formic și trietilamina, au fost obținuți din Fluka (Germania), iar metanolul și acetonea din Merck (Germania). Apa ultrapură cu o rezistivitate > 1818MΩ și cu carbon organic total <5ngg-1 au fost obținute de la un sistem MilliQ Plus 185. Standardele individuale pentru fiecare îndulcitor au fost obținute din diferite surse. Au mai fost utilizate și următoarele substanțe: benzoat de sodiu, cafeină, acid sorbic, acid glutamic, acid fosforic, acid ascorbic, D (o)-sorbitol, acid malic, taurină, d(+)-glucuronolactonă, chinină, hemi-sulfat de sare, acid citric monohidrat, zaharoză, fructoză, glucoză și lactoză. O soluție tampon cu ph 4,5 a fost pregătită prin dizolvarea a 4 ml de acid formic în 5 l apa și ajustată la ph 4,5 cu cca. 12,5 ml trietilamina. Fază mobilă A a HPLC a fost pregătită prin amestecarea de 690 ml metanol cu 240 ml soluție tampon și 70 ml acetonă, iar fază mobilă B s-a obținut prin amestecarea a 110 ml metanol cu 820 ml soluție tampon și 70 ml acetonă. 2.2.2. Probele pentru testare
Probe de băuturi energizante (îndulcite cu zahăr), băuturi răcoritoare cu acid (îndulcite cu zahăr), băuturi răcoritoare fără acid ( îndulcite cu zahăr), conserve din fructe (cocktailuri de fructe și de pere îndulcite cu zahăr) și iaurturi naturale achiziționate de la magazine de vânzare cu amănuntul. Înainte de utilizare, pentru fiecare probă a fost verificată absența compușilor interesați pentru a fi folosite ca probe martor, pentru prepararea soluțiilor de calibrare și pentru pregătirea de materiale de testare fortificate.
2.2.3.
Prepararea și calibrarea soluțiilor
Standarde de calibrare în soluție tampon Pentru cuantificarea în timpul procesului de dezvoltare și optimizare a metodei a fost pregătită o soluție standard care conține toți cei nouă îndulcitori în soluția tampon. Concentrația fiecărui îndulcitor a fost de 500 µg ml -1, cu excepția DUL și NHDC care au avut o concentrație de 100 µg ml-1. O serie de 8 soluții de calibrare au fost preparate prin diluția soluției standard cu soluție tampon rezultând concentrații între 4-500 µg ml -1și de 0,8-100 µg ml-1 pentru DUL și NHDC. Pentru cunatificare, la finalul etapei de validare, a fost preparată o soluție standard care conține toți cei 9 îndulcitori, respectând limita admisă de 125 % din MUD. Pentru îndulcitorii neautorizați (ALI, DUL și NEO) au fost preluate MUD fictive de la cca. 150 µg ml -1. O serie de 8 soluții de calibrare au fost pregătite prin diluția soluției standard cu o soluție tampon care rezultă în intervale de concentrații potrivite cu limitele date.
Soluția de calibrare a matricei Soluția matrice standard a fost preparată folosind o băutură energizantă, un compot de fructe și un iaurt natural. Înainte de utilizare băutură energizantă a fost tratată cu ultrasunete, fructele din compot și iaurtul au fost omogenizate. O soluție stoc compusă din cei 9 îndulcitori a fost preparată prin cântărirea standardelor pure într-un flacon de 100 ml, adaugandu-se cca. 50g de probă omogenizată, conținutul obținut amestecându-se timp de 6 ore. O serie de 8 soluții de calibrare au fost preparate prin diluția soluției matrice standard cu probele de analizat, rezultând concentrații de 12,5-2000 µg g-1. Omogenizarea materialelor de testare Toate băuturile au fost tratate într-o baie cu ultrasunete timp de 15 min, unde fructele și iaurturile au fost omogenizate folosind un blender alimentar și un Ultraturrax. Fortificarea materialelor de testare
Pentru a compară fiecare tip de calibrare de la fiecare material testat s-au pregătit solu ții cu concentrații de cca. 2000, 400 și 80 µg g-1. Testul de stabilitate a fost efectuat folosind un material test cu o concentrație de cca. 250 µg g-1. Toate acestea au fost pregătite în același mod că la Secțiunea 1.3.2.
2.2.4 Instrumente Îndulcitorii au fost separați folosind coloane analitice. Măsuratorile cromatografice au fost efectuate folosind un sistem HPLC format dintr-o pompă cuaternară, un autosampler și o coloană termostată.
2.2.5
Pregătirea probelor Fiecare material de testat a fost tratat astfel: 5g de material de testat omogenizat a fost
cântărit într-un balon cotat de 50 ml și apoi se completează până la semn cu solu ție tampon. Se agită energic 5 minute, iar apoi conținutul balonului este transferat într-un tub de 50 ml și se centrifughează la 4000 rpm timp de 10 min. Coloanele SPE vidate au fost condi ționate cu 3 ml metanol, apoi 3 porțiuni a câte 2 ml soluție tampon și 2 porțiuni câte 5 ml supernatant. Pe parcursul întregului proces s-a utilizat un debit de 1-2 ml/min. După spălarea coloanei SPE cu 3 ml soluție tampon, îndulcitorii au fost colectați prin eluție cu 2 ml etanol, într-o eprubetă de 5 ml. Metanolul colectat a fost evaporat la cca. 3,5 ml la temperatură ambientală folosind un curent de azot și apoi se aduce la semn cu soluție tampon înainte de a se trece la analiză HPLC-ELSD.
2.2.6 Analiză HPLC-ELSD Separarea HPLC a îndulcitorilor a fost realizată cu ajutorul gradientului de profil cu un debit de 0,5 ml/min al fazei mobile. Volumul de injectare a fost de 8 µl, temperatură tubului a fost de 85°C, iar debitul de azot reglat la 2,5 l/min.
2.2.7 Identificarea și cuantificarea îndulcitorilor Identificarea fiecărui îndulcitor din materialele test a fost făcută prin comparația timpilor de retenție a îndulcitorilor observați în timpul analizei soluțiilor standard analizate din același lot de probe, cu timpii de retenție a compușilor eluati în timpul analizei materialelor de testare. Cuantificarea celor nouă îndulcitori a fost realizată prin analiză celor opt soluții de calibrare standard, folosind condițiile HPLC identice cu cele utilizate pentru materialele de testare. Determinarea cantitativă a îndulcitorilor din extractul din SPE (C 1i) a fost efectuat prin conversie în zonă de vârf I (Ri) obținut prin analiză extractului injectat în coloană SPE, utilizând rezultatul funcției de calibrare. Fracția de masă a îndulcitorilor din materialul de testare a fost calculată în conformitate cu ecuația (1.).
Unde: C1i= fractia de masă a îndulcitorilor din extractul SPE µg g -1 determinată folosind ecuația de calibrare stabilită. C2i= fracția de masă a îndulcitorilor din materialul test µg g-1 M1= masa materialului test luată pentru extractie, 5g V1= volumul total al probei, 50 ml V2= volumul de soluție de probă încarcat pe cartușul SPE, 10 ml V3= volumul final al extractului SPE, 4 ml. Experimentele sunt împartite in doua părți: optimizarea și validarea metodei.
2.2.8 Optimizarea 2.2.8.1
Separarea HPLC
Selectarea unei coloane analitice a fost prima etapa in dezvoltarea noii metode. In studiul de fata a fost selectata o coloana complet închisă la capate, oferind o separare in 25 de minute a celor noua indulcitori alesi: ACS-K, ASP, CYC, NHDC, SAC, SCL, ALI, NEO si DUL (Fig.1).
Fig. 1- Separarea HPLC-ELSD a unor mixturi cu 11 îndulcitori folosind Nucleodur C18 Pyramid column. În plus a fost posibil să se separe alți doi îndulcitori neautorizați, de exemplu, stevioside și rebaudioside A. Cu toate acestea, din cauza probelor limitate, acești doi compuși au fost excluși din experimente. Așa cum arată Fig.2, prin aplicarea acelorași condiții cromatografice, separarea îndulcitorilor a fost eficientă indiferent de brand-ul coloanei.
Fig. 2- Separarea HPLC-ELSD a unei mixturi cu 9 indulcitori folosind coloane diferite: (a) Zorbax Extend-C18; (b) Nucleodur C18 Pyramid; (c) Nucleodur C8 Gravity; (d) Purospher Star RP-18
În ceea ce privește faza mobilă și parametrii gradientului, trebuie luate în considerare mai multe aspecte. Înainte de toate, ELSD este limitată pentru utilizarea să în fazele mobile volatile. ELSD se bazează pe diferențele de volatilitate dintre solvent și probă. Principalul avantaj al ELSD este că se poate detectă orice analit fără a fi nevoie de cromofori sau fluorofori. Singură condiție este că analitul să fie mai puțin volatil ca faza mobilă. În al doilea rând, pentru a obține timpi de retenție stabili, este aleasă o fază mobilă tamponată, deoarece îndulcitorii formează molecule polare în faza mobilă, frecvent utilizate în cromatografia lichidă de fază inversă, și gradul de ionizare al unei molecule afectează interacțiunile sale cu faza staționară. În
cele din urmă, cea mai bună metodă de separare a tuturor celor 9 îndulcitori a fost cea care folosește o soluție tampon apoasă compusă din acid formic și trietilamina (pH=4,5) și o fază mobilă formată dintr-un amestec de metanol și acetonă. 2.2.8.2
Detecția ELSD
Un rezultat bun a fost obținut prin utilizarea unei temperaturi de 85°C și un debit de azot de 2,5 l/min. 2.2.8.3 Prepararea probei prin extracție pe fază solidă
Prepararea probelor cu succes, de exemplu, matricea de simplificare, au fost realizate prin adsorbția îndulcitorilor pe cartușe SPE, iar desorbtia posibilelor interferente ale matricei a fost posibilă prin spălarea cu soluție tampon și prin impregnarea îndulcitorilor cu metanol. Tipul cartușelor SPE a fost ales pentru a se potrivi cu fază staționara a coloanelelor de separare HPLC. Pentru a determina un amestec de 3 îndulcitori cu un timp de retenție foarte scurt, se dizolvă amestecul în apă acidifiată cu acid formic 0,1% sau în soluție tampon și apoi se folose ște vid într-un cartuș SPE condiționat. Fiecare porțiune de 5ml din cartuș au fost colectate și analizate prin HPLC. Cel mai mare volum de 30 ml a fost obținut pentru a fi folosit că solvent de spălare. În cele din urmă, cele mai bune rezultate au fost obținute prin limitarea volumului probei din cartuș la 10 ml și volumul solventului de spălare la 3 ml. 2.2.8.4 Calibrarea
În scopul alegerii tipului potrivit de calibrare, au fost efectuate mai multe experimente pentru a respecta limitele legale din actuala legislație a UE. Ca un exemplu, funcția de calibrare a ȘCL este dată în Fig. 3.
Figura 3.Funcția de calibrare. Prin urmare, cuantificarea a fost efectuată cu ajutorul conversiei logaritmice în baza 10 atât pentru concentrație cât și pentru aria picurilor. Deși această este o metodă comună de liniarizare, s-a constatat că pentru majoritatea îndulcitorilor răspunsul de transformare nu a fost complet linear pe un interval de lucru de 12,5-2000 µg g-1 (Fig. 4).
Figura 4. Conversie logaritmică. Chiar dacă coeficienții de corelație liniară R au fost în cea mai mare parte > 0,98, distribuirea reziduurilor (Fig. 5), a indicat că modelul nu este adecvat.
Figura 5. Distribuția reziduurilor. Raspunsul primit de ELSD a fost cel mai bine descris printr-o ecuație polinomială de gradul 3 (Fig. 6).
Figura 6. Ecuația polinomială. Următorul pas a fost de a compara rezultatele obținute de trei materialele test fortificate cu niveluri diferite de îndulcitori, cuantificate prin utilizarea matricei de calibrare sau etalonare obținută prin standardele dizolvate în soluție tampon. În cele mai multe cazuri, rezultatele obținute pe baza soluțiilor tampon de calibrare au fost mai aproape de valoarea reală decât cele calculate cu ajutorul curbelor de calibrare. Numai în cazul NHDC din iaurt, matricea de calibrare a dat rezultate relative mai bune, care ar putea fi din cauza degradării mai rapide a îndulcitorului în iaurt. Scopul final al studiului a fost de a oferi metodologie adecvată pentru a fi utilizată de către laboratoarele particulare sau de agenții pentru a pune în aplicare limitele legislative. Prin
urmare, întreagă abordare a fost în cele din urmă adaptată pentru a se potrivi cu limitele legale prevăzute. Nivelul superior al gamei de lucru a fost limitat la cca. 125 % din MUD pentru îndulcitorii autorizați. Niveluri de concentrație mai mică au fost stabilite cu ajutorul LOQ determinate. O comparație a abaterilor standard ale reziduurilor obținute prin ecuații polinomiale și liniare nu au arătat diferențe semnificative între cele două modele de calibrare pentru toți cei 9 îndulcitori.
2.2.9
Validarea metodei Metoda de validare este una dintre măsurile universal recunoscute ca fiind o parte
necesară a unui sistem global de asigurare a calității în chimia analitică. Validarea metodei de analiză poate fi considerată ca fiind un proces sistematic de verificare dacă o metodă de analiză este acceptată pentru scopul destinat. Validarea prezentată examinează parametrii de selectivitate, limită de detecție, limită de cuantificare, precizia și exactitatea metodei folosite pentru cei nouă îndulcitori. 2.2.9.1
Selectivitatea
Selectivitatea reprezintă capacitatea metodei de a determina cu exactitate analitul de interes, în prezența altor componente care pot fi prezente în aceeași probă. S-a stabilit prin compararea rezultatelor obținute pe o soluție standard de îndulcitori care conținea 16 substanțe diferite întâlnite în produse alimentare. Au fost testate următoarele substanțe: benzoat de sodiu, acid sorbic, acid citric, acid fosforic, acid malic, acid ascorbic, acid glutamic, zaharoză, glucoză, fructoză, lactoză, cafeină, chinină, taurină, D(+)-glucurono-lactonă și sorbitol. Singură pereche de compuși care a întâmpinat probleme a fost ALI-CHI. Mai mult, selectivitatea metodei a fost investigată prin analizarea tuturor probelor martor, materialelor test cum ar fi: băuturi energizante, băuturi carbogazoase, băuturi răcoritoare fără acid, conserve din fructe și iaurturi natural. Niciunul din materialele test nu a prezentat alte componente care ar fi putut interfera cu analiții de interes. 2.2.9.2 Domeniul de lucru Întreagă abordare a fost efectuată într-un interval de lucru de 25 µg g-1 la 125% din MUD-uri pentru îndulcitorii autorizați și 125% din 150 µg g-1 pentru îndulcitorii neautorizați.
2.2.9.3 Limită de detecție și de cuantificare Probele martor au fost utilizate pentru a determina nivelul mediu al timpului de retenție a analitilor de interes și matricea potrivită pentru soluțiile de calibrare pentru a estima limită de detecție (LOD) și limită de cuantificare (LOQ). LOD au fost determinate de reducerea succesivă a volumului de soluții de calibrare injectate ce conțin cele mai mici concentrații de îndulcitori. Volumul de injectare care a dat un semnal zgomotos de trei ori a fost utilizat pentru a estima LOD. LOQ pentru fiecare îndulcitor a fost stabilită în funcție de concentrația care a dat semnalul sonor. LOD și LOQ sunt prezentate în Tabelul 2. Tabel 2. Limita de detecție și limita de cuantificare pentru îndulcitorii analizați.
2.2.9.4 Precizia și autenticitatea metodei
Pentru a se respecta autenticitatea metodei în ceea ce privește concentra ția, repetabilitatea, exprimate prin deviația relativă standard a repetabilitații, au fost efectuate aceste etape pe 6 probe pentru trei matrici alimentare diferite, fortificate cu toti cei noua indulcitori la 4 niveluri diferite de concentratie.
CONCLUZII Având în vedere practica din zilele noastre de a folosi îndulcitori în combinație, este nevoie de metode de încredere care să poate recunoaște cât mai mulți îndulcitori. O metodă simplă și rapidă este analiza prin HPLC-ELSD deoarece permite separarea și cuantificarea simultană a nouă îndulcitori din produse alimentare diferite. Pentru a se asigură validarea metodei toate etapele s-au desfășurat într-un singur laborator. Liniaritatea metodei, autenticitatea, precizia, selectivitatea, au fost evaluate împreună cu limitele de detecție și de cuantificare într-o serie de experimente. Exactitatea metodei a fost satisfăcătoare având recuperările variind între 93-109% pentru nivelurile de concentrație în jurul MUD-urilor autorizate pentru îndulcitorii acceptați de legislație și 100-112% pentru compușii neautorizați (ALI, NEO, DUL). Metodă această oferă informații privind conformitatea etichetelor cu dispozițiile generale stabilite de lege. Este o cale potrivită de a examina rapid un număr mare de probe ce conțin 6 îndulcitori autorizați și 3 neautorizați.
BIBLIOGRAFIE 1. BALOESCU C., CUREA E. Controlul medicamentelor. Bucureşti. 1983 2. CASIAN Ana Contributii la optimizarea metodei cromatografice de lichide sub presiune pentru aplicarea in analiza farmacocinetica Chişinău, 2008 3. Yan Zhu, Andrzej Wasik, Josephine McCourt, Manuela Buchgraber – Journal of Chromatography A, 1157, pag. 187-196, 2007 4. Yingying Guo, Mingli Ye, Frits S. James – Journal of Chromatography A, 1085, pag. 143-146, 2005
