DETERMINACIÓN DE SAPONINA TOTAL EN QUINUA (Chenopodium quinua Willd) MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO. Monje C. Yarko A1, Raffaillac Jean Pierre2
[email protected] Documento presentado en:IV Congreso Nacional de la Asociación Boliviana de Protección Vegetal (ABPV) Barrientos, E., et.al. (eds.) 2006. Memoria IV Congreso Nacional de la Asociación Boliviana de Protección Vegetal. Oruro, 5 al 7 de abril de 2006. C.E.A.C. – Dpto. Fitotecnia-FCAPV-UTO. ABPV. Oruro, Bolivia. 217 P.
RESUMEN La quinua (Chenopodium quinua Willd) es un cultivo andino que en los últimos 15 años tomo una gran importancia comercial para Bolivia .Este cereal tiene una alta calidad nutricional gracias al balance de aminoácidos presentes. Uno de los inconvenientes es la presencia de un factor antinutricional que es la saponina. La determinación de la saponina se puede realizar por cromatografía de gases o espectroscopia de masas pero estas demandan equipos y técnicas que no se encuentran a libre disposición. El presente trabajo tiene por finalidad proponer una técnica nueva y sencilla para la determinación de la saponina total, de bajo costo que pueda ser aplicada por cualquier laboratorio. El fundamento de la técnica propuesta es la extracción de la saponina con una mezcla de etanol al 50% V/V, filtrado al vacío. La solución obtenida es diluida con el mismo etanol hasta que la concentración de la saponina total se encuentre dentro de la curva de calibración que se encuentra de 0 a 350 ppm. Para dar coloración a la solución de saponina total extraída se utiliza el reactivo de color que es una mezcla de anhídrido acético y ácido sulfúrico en una proporción de1:5 (16.7 %). La proporción de la muestra con el reactivo de color 1:3.5 (22.23%). La muestra será leída a una longitud de onda de 528 nm. La presente técnica no tiene interferencia con colores que pueda presentar la quinua y tiene la virtud de determinar el total de las saponinas presentes en el producto. INTRODUCCIÓN Las saponinas son sustancias con la capacidad de formar espuma cuando son extraídas con agua (Koziol 1991). Las saponinas se consideran una familia de metabolitos secundarios y se lograron identificar 4 subgrupos: el primero son las saponinas triterpénicas, las segundas son las saponinas esteroidales, las terceras saponinas esteroidales alcalinas y el último son
las saponinas de organismos marinos. Las saponinas del primer grupo se encuentran ampliamente distribuidas en el reino de las dicotiledones (Hostettmen and Marston, 1995). La saponina de la quinua tiene un papel de defensa contra plagas como los pájaros e insectos, a nivel de la maduración fisiológica de la planta. Actualmente la saponina forma parte de las sustancias que están siendo investigadas para el tratamiento alternativo de la leshmania. Jacobsen et al (1996) reportan que el contenido de saponina en la quinua es variable y esto depende aparentemente de un grupo de unos genes en la planta. Estimados del contenido de saponina por Wahli (1990) y Koziol (1992)m arroja un rango que va desde 0.00 hasta 1.2 %. Tellería et al. (1978) demostraron que las variedades de quinua Sajama (1.7 %) y blanca (1.9 %) presentan menor concentración de saponinas que las variedades amarilla (2.3 %) y colorada (2.8 %). Estos valores se obtuvieron después de lavar la quinua a temperatura 50ºC, donde se removió un 75 a 80 % de la saponina. Según Ruales and Fair (1992) las saponinas de la quinua son glucósidos triterpenoidales, localizadas en el pericarpio de las semillas y solubles en metanol y agua. Lock De Ugaz, O.,(1988) reporta reacción positiva al reactivo de Lieberman-Burchad, Salkowski. Según Zabaleta, citado por Bacigalupo y Tapia (1990), el nivel máximo aceptable de saponina en la quinua para consumo humano oscila entre 0.06 y 0.12%. Esto concuerda con los resultados de pruebas sensoriales realizadas en la Universidad de Ambato, Ecuador, en donde determinó que el límite máximo de aceptación del contenido de saponina en el grano cocido, fue de 0.1% (Nieto y Soria, 1991). MATERIAL Y EQUIPOS - Espectrofotómetro UV-VIS (Cintra 5) - Rota evaporador Re 210 (Yamato) - Material básico de laboratorio - Etanol al 50 % V/V - Ácido Sulfúrico Marca BIOPACK Pureza 95-98 % H2SO4 (D=1.84 g/cc) - Anhídrido Acético Marca CICARELLI Pureza > 97% (CH3-CO)2O - 10 variedades de quinuas del programa Proyecto quinua IRD- UR- CLIFA MÉTODO Determinación del solvente La bibliografía recomienda la extracción de saponina en agua, no obstante esta técnica presenta dificultades en el filtrado debido a la formación abundante de espuma, que
perjudica el pipeteo y aforado de la solución, llevando a determinaciones erróneas. Este problema fue subsanado con la adición paulatina de alcohol a diferentes concentraciones con la finalidad de romper la emulsión que se ha formado. La determinación de la mejor concentración, fue tomada de la quinua a la que se le extrajo la saponina a diferentes concentraciones 8, 23, 48, 52, 56, 60 y 80% V/V. El resultado se muestra en la figura 1.
Extracción del patrón de saponina Se utilizó polvo de saponina (polvillo escarificado purificado de grano) extraído del grano por un proceso mecánico abrasivo. A partir de este polvillo se realizó la extracción con etanol al 80% V/V y se filtro al vacío. Una vez obtenida la solución se llevó a un rota evaporador hasta que se redujo. Esta solución se evapora hasta eliminar el total de agua y conseguir peso constante de la muestra (ver Fig. 2).
Curva de calibración
A partir del extracto de saponina obtenida se preparó una solución estándar disolviendo en etanol al 80% V/V. De esta solución de concentración conocida se realizaron las diluciones para la curva de calibración (tabla 1).
De los datos obtenidos se forma la grafica y se observa la relación entre concentración y absorbancia de la solución
Fig. 3: Relación de saponina con la absorbancia determinada a 528 nm Antes de graficar se tiene que restar el blanco de los datos (ver Fig. 3) Con estos datos se determina la ecuación del sistema : Saponina = (Absorbancia + 0.001508) / 0.05164 Con coeficiente de correlación de r = 0.998 y un r2 = 0.996 Reactivo de color El reactivo color consiste en una mezcla de ácido sulfúrico y anhídrido acético en proporciones de 5:1 (16.66%) recientemente preparado. Esta mezcla tiene un color amarillo suave.
Fig. 4: Barrido de la longitud de onda La longitud de máxima absorción se determina mediante un barrido espectral entre 400 y 600 nm a una velocidad de 1 nm/seg. La máxima absorción se presentó a una longitud de 528 nm (color vino tinto diluido) (ver Fig. 4). El color de la muestra puede ser entendido como la suma de tres colores: Color leído = (color de la reacción de saponina) + (color de la muestra de quinua) + (color del reactivo de color) Extracción saponina
Se pesó 2.5 g de quinua y se disolvió en 25 ml de etanol al 50% V/V, esta preparación se dejó en contacto durante 30 min. Pasado el tiempo se filtró al vacío. La solución obtenida se afora a 25 ml con el mismo etanol. La relación muestra-reactivo de color es de 1:3.5 es decir al 22.22 %. La muestra tiene que ser leída entre 30 y 50 minutos después de la adición del reactivo de color ya que en este tiempo el color es estable y permanente.
Se tiene que tener cuidado al momento de mezclar el reactivo de color con la muestra ya que esta reacción es exotérmica. Otro punto a considerar es que la mezcla tiene una viscosidad alta y es necesario utilizar un bortex o algún equipo similar para realizar la mezcla antes de dejar el tiempo recomendado para que ocurra la reacción. Análisis de muestras Las muestras de quinua analizadas son de la red agronómica quinua del programa del IRDCLIFA en colaboración con la Facultad de Agronomía de La Paz (UMSA) y la Facultad de Agronomía de Oruro (FCAPV-UTO). Las muestras provienen de la Estación Experimental de Belén (cosecha en mayo 2004) la cual se encuentra en el departamento de La Paz – Bolivia con coordenadas geográfica: latitud 17° 10´, longitud 68° 25´. Estas muestras se las codificó con la numeración correlativa de 1 a 10 respectivamente. Las 10 variedades estudiadas presentan distintos colores tales como rojo, naranja, amarillo y crema (ver fig. 5). En esta figura se ve la diferencia de colores que tienen los granos antes y después de la extracción de la saponina.
En la tabla 2 se detalla algunas características morfológicas y fisiológicas de las variedades estudiadas.
De cada una de las muestras se analizó por triplicado y se determinó el contenido de saponina total promedio.
Fig. 6: Contenido porcentual de saponina total en las muestras analizadas Limite de cuantificación Debido a que las lecturas se realizaron a bajas concentraciones la misma curva puede utilizarse para determinar el límite de cuantificación de la técnica aplicando la siguiente formula: 3Xa/b Donde a = es el cruce de la recta con el eje y b = pendiente de la ecuación Con estos datos se calcula el límite de cuantificación y es de: 8.75 X 10-3 expresada en ppm RESULTADOS Y DISCUSION Se preparó un estándar de saponina total del cual se determinó su concentración Se logró determinar el etanol como solvente más apropiado para la extracción de la saponina en una concentración que puede variar desde 32 hasta el 58 % v/v. Con la presente técnica no se observó interferencia con los colores particulares de las muestras por que son restados antes de determinar el contenidos de saponina total. Los extractos de las quinuas con colores pierden su color en función del tiempo, esto podría ser que los pigmentos presentes en el pericarpio se descomponen en presencia de luz visible, Pero esto no afecta al contenido de saponina total de las muestra. Se logró determinar que la máxima absorción de la mezcla se presenta a los 528 nm. Se logró determinar concentraciones de saponina en las muestras analizadas las cuales van desde 0.18 % en la variedad 2 hasta 5.01 % en la variedad 8. Las 10 muestras analizadas dan como resultado niveles de saponina mucho más alto de lo que es aceptado por los consumidores. En las muestras analizadas se puede ver grupos de
variedades las cuales pueden se asociadas fácilmente en 3 grupos acudiendo al contenido de saponina. En la fotografía 2 se puede observa una interfase que se forma en medio de la solución. Al momento de realizar la extracción de la muestra y previa a la evaporación no se presentaba ninguna opalescencia la cual pueda llevar a pensar que contaminación de la muestra. La saponina es una mezcla de 3 estructuras principales las cuales se encuentran es distintas proporciones en el grano de quinua, es posible de que alguna des estas estructuras tenga una menor solubilidad en la solución frente a las otras dos y esta es interfase que se presenta en la solución patrón. De la misma forma se podría pensar que al momento de aumentar del porcentaje de etanol por encima de 58 % v/v las estructuras de la saponina toman una conformación la cual reduce la solubilidad de la saponina total. CONCLUSIONES Esta técnica puede ser usada sin ningún problema para determinar saponina en quinuas con distintos colores de pericarpio. La curva tiene una proporcionalidad adecuada entre el intervalo de 0 a 350 ppm. con un r = 0.9978 y un r2 = 0.9956 RECOMENDACIONES La presente técnica puede ser aplicada a otros alimentos que presentan una cierta concentración de saponinas como en el caso del tarwi o la avena. Se recomienda evaluar la interferencia que pueda causar las sustancias que no son saponinas pero pueden dar color a la longitud de onda de trabajo. Notas de pie 1 Programa de Maestría en Ciencias Biológicas y Biomédicas, UMSA, La Paz, INLASA Instituto de Laboratorios de Salud “Néstor Morales Villazon”, Laboratorio de Nutrición y Análisis Sensorial, IIFB Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas 2 Proyecto quinua IRD, UR-CLIFA, CP 9214, La Paz, Bolivia REFERENCIAS KOZIOL M.J., 1992. Chemical Composition and nutritional evaluation of quinoa (Chenopodium quinua Willd). J. Food Comp. Anal., 5, 35-68.
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