Deteksi Lipid

Deteksi Lipid Deteksi lipid dibagi menjadi 2 cara analisis, yakni analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Analisis kualitatif terbagi atas metode Bligh/Dyer, metode deteksi dengan HPLC, uji kelarutan, uji Salkowsi, dan uji reaksi. Analisis kuantitatif terbagi menjadi uji angka asam, uji angka sabun, uji angka Reichert-Meissl, uji angka Polenski, uji angka Iod, uji Liebermand-Burchard dan metode analisis dengan menggunakan ESI-MS. A. Analisis Kualitatif a. Metode Bligh Dyer Bligh/Dyer adalah metode ekstraksi dan purifikasi lipid yang didapatkan melalui studi dekomposisi lipid dari ikan yang telah dibekukan. Prosedur ini dapat dilakukan hanya dalam waktu singkat, sehingga sangat efisien, mudah untuk direproduksi, dan bebas dari manipulasi. Prinsip kerja metode ini adalah dengan menghomogenisasi jaringan basah dengan menggunakan campuran kloroform dan metanol, sehingga terbentuk sistem campuran yang homogen dengan air dalam jaringan. Pengenceran dengan kloroform dan air akan menyeparasikan jaringan yang telah terhomogenisasi tersebut menjadi dua lapisan, dimana lapisan kloroform akan mengandung semua lipid/lemak non polar, sementara lapisan metanol akan mengandung semua senyawa non-lemak atau senyawa lipid polar. b. Metode deteksi dengan HPLC Pada dasarnya HPLC adalah versi improvisasi dari Column Chromatography, dimana ketinggian kolom dikurangi, sehingga jumlah piringannya bertambah menjadi 100.000 piringan per meter (normal : 40.000 hingga 60.000 piringan per meter) dan ditambahkan tekanan pada proses penghantaran fase bergerak (mobile phase) melewati fase stasioner (stationary phase) yang rapat dengan kecepatan yang sesuai (tidak terlalu cepat dan tidak terlalu lambat, biasanya antara 0,5 hingga 4 mL/menit). Karena ketinggian kolom pada HPLC diperkecil, maka ukuran partikel yang terdapat pada kolom juga lebih kecil (3 - 5 µm). Ukuran partikel yang kecil ini memberikan luas kontak yang lebih besar, sehingga proses separasi yang terjadi lebih efisien daripada kromatografi kolom biasa. Selain itu, keuntungan lain dari penggunaan HPLC adalah menghemat penggunaan pelarut

pada

kolom.

Bagian-bagian dari HPLC :

1. Pompa Pompa yang digunakan adalah pompa piston 2 arah, pompa screw-driven syringe atau pompa pneumatic constant-pressure. Pompa-pompa tersebut haruslah mampu memompa dengan tekanan hingga 6000 psi. 2. Sample Injection System Kebanyakan sample injection system sudah dibuat otomatis, dengan sistem Loop. Sistem ini memungkinkan injeksi berkala sample dengan volume tertentu yang diinginkan 3. Kolom Dibedakan menjadi : a. Normal Phase Column Adalah kolom dengan fase stasioner berupa senyawa polar, menggunakan fase stasioner berupa silika. Cocok digunakan untuk mendeteksi kandungan senyawa non polar. Contoh senyawa yang umunya dideteksi oleh dengan menggunakan kolom ini adalah heksana, sikloheksana, karbon tetraklorida, kloroform, benzena dan toluena. b. Reverse Phase Column Kebalikan dari Normal Phase Column, fase stasioner yang digunakan pada kolom adalah senyawa non-polar, menggunakan fase stasioner berupa senyawa rantai karbon yang non-polar. Cocok digunakan untuk mendeteksi kandungan senyawa polar. Contoh senyawa yang

umumnya dideteksi dengan menggunakan kolom ini adalah air, methanol, asetonitril (CH3CN) dan larutan buffer asam asetat. c. Adsorption Column Isi kolomnya menggunakan silika atau alumunium oksida. Seperti namanya, kolom jenis ini memanfaatkan prinsip adsorpsi dalam memisahkan komponen-komponen dalam senyawa d. Ion Exchange dan Size Exclusion Column Ion Exchange Column menggunakan solid resin particles yang memiliki muatan positif atau negatif pada bagian permukaannya, dimana ion-ionnya bertukar dengan ion-ion pada fase bergerak. Cation Exchange Resin (SCX) memiliki sisi negatif sebagai merupakan tempat pertukaran kation, sementara Anion Exchange Resin memiliki sisi positif sebagai merupakan tempat pertukaran anion. Berikut adalah penentuan penggunaan kolom berdasarkan sifat komponen yang akan dianalisis :

4. Detektor Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, antara lain : a. UV Absorption Memanfaatkan prinsip absorpsi cahaya komponen. Absorbansi komponen

kemudian

dideteksi

oleh

kromatogram.

Walaupun

sensitivitasnya tinggi, detektor UV Absorption jarang digunakan

karena kekurangannya yakni, komponen yang dideteksi harus mampu menyerap cahaya (komponen harus memiliki warna) b. Diode Array (UV-Vis) Memanfaatkan cahaya yang didispersikan dengan grating, yang kemudian dideteksi oleh photodiodides. Sensitivitas dari detektor ini cukup tinggi, dan hasil deteksinya cukup akurat c. Fluorescence Detektor jenis ini mendeteksi intensitas fluorescence suatu komponen yang berelusi dari kolom d. Refractive Index Memanfaatkan prinsip refraksi cahaya oleh fluida. Alat detektor refraksinya dinamakan refractometer. Detektor ini banyak digunakan, walaupun kurang sensitif dan hasil deteksinya kurang akurat e. Elektrokimia Dibagi lagi menjadi: i. Detektor Konduktifitas (banyak digunakan untuk senyawasenyawa ionic) ii. Detektor Amperometrik (memanfaatkan prinsip oksidasireduksi elektrokimia) f. LC-MS dan LC-IR LC (Liquid Chromatography) yang dipadukan dengan MS (Mass Spectrometry) dan IR (Infra Red) mampu memberikan hasil deteksi yang lebih akurat dengan data fingerprint, berbeda dengan detektordetektor HPLC lainnya. Kombinasi dengan MS mampu memberikan data berupa berat molekul dari senyawa yang dideteksi. Prinsip pendeteksiannya secara sederhana : komponen yang telah mengion dipisahkan oleh mass analyzer kemudian di deteksi oleh ion detector c. Uji Salowski Uji Salkowski merupakan uji kualitatif yang dilakukan untuk mengidentifikasi keberadaan kolesterol. Jika sterol dengan konfigurasi tidak jenuh di dalam molekulnya direaksikan dengan asam kuat (biasanya asam sulfat pekat) dalam kondisi bebas air, maka akan memberikan warna yang khas. Reaksi positif yang menandakan adanya kolesterol untuk uji Salkowski yaitu timbul warna merah

dibagian kloroform sedangkan dibagian asam berwarna kuning. Kolesterol dilarutkan dengan kloroform anhidrat lalu dengan volume yang sama ditambahkan asam sulfat. Penambahan asam sulfat pekat berfungsi sebagai pemutus

ikatan

ester

lipid.

d. Uji Kelarutan Uji ini terdiri atas analisis kelarutan lipid maupun derivat lipid terhadap berbagai macam pelarut. Dalam uji ini kelarutan lipid ditentukan oleh sifat kepolaran pelarut. Sesuai dengan sifat laruttan, apabila larutan non-polar dilarutkan ke dalam larutan polar, maka kedua larutan tidak akan menyatu, apabila lipid dilarutkan ke dalam pelarut polar maka hasilnya tidak akan larut. Hal tersebut karena lipid memiliki sifat nonpolar sehingga hanya akan larut pada pelarut yang sama-sama nonpolar. Uji kelarutan lipid hampir semua jenis lipid, yaitu lemak dan minyak tidak larut dalam pelarut polar seperti air, namun larut dalam pelarut non polar seperti kloroform, eter, dan benzene. e. Uji Reaksi Uji reaksi pada prinsipnya menguji ada tidaknya kandungan minyak dengan reaksi-reaksi kimia, kemudian mengamati produk hasil reaksi yang terbentuk. Uji reaksi terdiri dari uji reaksi dengan oksidasi, ozonisasi dan hidrolisis. i. Oksidasi

Oksidasi asam lemak merupakan penambahan bilangan oksidasi. Lemaklemak di dalam tubuh akan dipecah menjadi asam lemak yang selanjutnya akan didegradasi melalui oksidasi α dan oksidasi β. Oksidasi α akan mendegradasi asam lemak menjadi molekul dengan 1 atom C, sedangkan oksidasi β mendegradasi asam lemak menjadi molekul dengan 2 atom C. ii. Ozonisasi

Ozonisasi merupakan reaksi ozon dan lipid tak jenuh menghasilkan lipid peroksida. Dimana lipid terdegradasi oleh ozon iii. Hidrolisis Hidrolisis merupakan reaksi pemecahan oleh air, lipid di pecah menjadi gliserol dan alcohol, dengan menggunakan panas, asam, alkali/ enzim. O CH2 O C R1

O R2

C O C H

Lipase or Acid

O CH2 O C R3

Triacylglycerol

3 H2O

H2C HO C H2C

OH H

O R1 C OH O

+ R C OH 2

OH

R3

O C OH

Glycerol Free fatty acids

B. Analisis Kuantitatif a. Uji Angka Asam Angka asam adalah jumlah mg KOH yang diperlukan untuk menetralkan asam lemak bebas yang terdapat dalam 1 g lemak/ minyak. Uji ini dilakukan dengan cara mentitrasi suatu larutan yang akan diuji dengan menggunakan KOH. Angka asam dapat dihitung dengan rumus :

AV = N = Normality of KOH

ml of KOH x N x 56 Weight of Sample

= mg of KOH

Dan persentase asam lemak bebas dapat dihitung dengan rumus : % Free Fatty Acid (FFA) = AV x 0.503 b. Uji Angka Sabun Angka Sabun adalah banyaknya mg KOH yang diperlukan untuk menetralkan asam bebas dan untuk mensapoifikasi ester dalam 1 g lemak/minyak. Uji ini dilakukan dengan menghidrolisis asam lemak meggunakan KOH. Mekanisme reaksi yang terjadi adalah :

H2 C

O

HC

O

H2 C

O

O C O C O C

R R

+

3 KOH

R

H2 C

OH

HC

OH

H2 C

OH

+ 3R

O C OK

Angka sabun dapat dihitung dengan rumus : 56.1 ( B−S ) x N HCl SP ¿= Gram of Sample Dengan : B : mL of HCl required by Blank S : mL of HCl required by Sample Jenis lemak yang berbeda akan memberikan angka sabun yang berbeda. Berikut beberapa jenis lemak dan angka sabunnya Fat or oil

Saponification Value

Milk fat

210-233

Coconut oil

250-264

Cotton seed oil

189-198

Soybean oil

189-195

lard

190-202

Butter fat and vegetable fats

∼ 220 – 250

c. Uji Angka Reichert-Meissl Angka Reichert Meissl adalah nilai dalam millimeter dari 0.1 N alkali yang dibutuhkan untuk menetralisasi larutan 5 gr asam lemak yang volatil dari minyak atau lemak. Digunakan untuk mengetahui komposisi lemak dan untuk mendeteksi pemalsuan lemak dengan rantai karbon lebih dari 10. Metode ini memanfaatkan keberadaan gliserida yang volatile dari asam terlarut dengan jumlah karbon sedikit dalam lemak butter. Metode ini kemudian dipadukan dengan teknik sapoifikasi dengan larutan NaOH. Metode ini dapat digunakan untuk mendeteksi pemalsuan butter. Butter biasanya mengandung asam volatile dengan 4 hingga 14 atom karbon, sedangkan coconut

oil mengandung asam dengan 6 hingga 14 atom karbon. d. Uji Angka Polenski Bilangan ini menentukan kadar asam lemak yang volatil, tetapi tidak larut dalam air, yaitu asam lemak C8 hingga C14. Bilangan polenski adalah jumlah milliliter (ml) 0,1 N larutan alkali yang dibutuhkan untuk menetralkan asam lemak C8C14 yang terdapat dalam 5 gram sampel. BP juga dapat digunakan untuk menguji pemalsuan terhadap mentega. Metode ini merupakan pengembangan dari metode Reichert-Meissl, dimana metode ini dapat mendeteksi asam volatil yang dapat larut dan yang tidak dapat larut dalam air. e. Uji Angka Iod Angka Iod mengukur derajat ketidakjenuhan dari asam lemak penyusun minyak dan lemak. Asam lemak tidak jenuh mampu mengikat Iod dan membentuk senyawaan yang jenuh. Banyaknya Iod yang diikat menunjukkan banyaknya ikatan rangkap. Angka Iod dinyatakan sebagai banyaknya gram Iod yang diikat oleh 100 gram minyak atau lemak. Semakin banyak angka iod yang terukur, maka semakin banyak pula kandungan asam lemak tak jenuh dalam minyak yang mengindikasikan bahwa semakin baik kualitas minyak tersebut. Drying oil ang banyak digunakan dalam produk cat memiliki angka iod yang tinggi (sekitar 190), Semidrying oil seperti minya kacang kedelai memiliki angka iod yang sedang (sekitar 130), sedangkan Nondrying oil seperti olive oil memiliki angka iod yang rendah (sekitar 80) Prinsip analisis bilangan iod adalah gliserida tak jenuh minyak mempunyai kemampuan mengadsorpsi sejumlah iod, khususnya apabila dibantu dengan iodinklorida atau iodin bromida membentuk senyawa yang jenuh. Jumlah iod yang teradsorpsi menunjukkan ketidakjenuhan minyak. Minyak dilarutkan dalam khloroform

kemudian

ditambahkan

larutan

iodin

bromide

(atau

iodin

monochloride). Akan terjadi pengikatan iodin oleh minyak pada ikatan rangkapnya. Iodin sisa dititrasi dengan Natrium tiosulfat 0,1 N menggunakan indikator amilum, akhir titrasi ditandai dengan hilangnya warna biru. Titrasi sampel misal x ml. Untuk mengetahui iodin mula-mula dalam reagen maka

dilakukan perlakuan blanko dengan jalan yang sama yaitu titrasi blanko misal y ml. f. Uji Angka Liebermand-Burchard Uji Lieberman Buchard selain dapat digunakan sebagai uji kualitatif juga dapat digunakan sebagai uji kuantitatif untuk kolesterol. Prinsip uji ini adalah mengidentifikasi adanya kolesterol dengan penambahan asam sulfat pekat ke dalam campuran kolesterol dalam kloroform dan sedikit asam asetat pekat. Mekanisme yang terjadi dalam uji ini adalah ketika asam sulfat ditambahkan ke dalam campuran yang berisi kolesterol, maka molekul air berpindah dari gugus C3 kolesterol, kolesterol kemudian teroksidasi membentuk 3,5-kolestadiena. Produk ini dikonversi menjadi polimer yang mengandung kromofor yang menghasilkan warna hijau. Warna hijau ini menandakan hasil yang positif. Reaksi positif uji ini ditandai dengan adanya perubahan warna dari terbentuknya warna pink kemudian menjadi biru-ungu dan akhirnya menjadi hijau tua. Reaksi yang terjadi pada uji Lieberman Buchard dapat dilihat pada gambar dibawah

Berdasarkan percobaan yang dilakukan bahan uji positif kolesterol dengan perubahan warna pada larutan menjadi hijau sesuai dengan literatur. Warna hijau yang terjadi sebanding dengan konsentrasi kolesterol. Percobaan dilakukan dengan menggunakan asam asetat pekat sedangkan secara teoritis pereaksi Lieberman Burchard merupakan campuran antara asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat. Asam asetat anhidrat berfungsi untuk membentuk turunan asetil dari steroid yang akan membentuk turunan asetil di dalam kloroform. Alasan penggunaan kloroform anhidrat sebagai pelarut karena kolesterol paling larut baik dalam pelarut ini dan yang paling mendasar adalah tidak mengandung molekul air. Jika dalam larutan uji terdapat molekul air maka asam asetat anhidrat akan berubah menjadi asam asetat sebelum reaksi berjalan dan turunan asetil tidak akan

terbentuk. Sehingga dengan digantinya asam asetat anhidrat dengan asam asetat pekat tidak akan memengaruhi hasil yang diinginkan selama larutan uji tersebut tidak mengandung air. g. Uji dengan ESI-MS ESI adalah metode ionisasi umum dalam MS untuk analisis lipid dari cairan tubuh, sel, bakteria, virus, dan jaringan. ESI-MS bergantung pada pembentukan ion gas dari molekul polar, labil secara termal dan non-volatil sehingga cocok untuk mendeteksi berbagai jenis lipid dengan akurat. ESI-MS memiliki sifat ionisasi halus yang tidak mengganggu sifat kimia dari analit sebelum dilakukannya MS. Berbagai macam metode ESI-MS telah dikembangkan untuk analisis berbagai kelas dan subkelas lipid dari ekstrak biologis. Keuntungan besar dari penggunaan ESI-MS adalah keakuratannya yang tinggi, sensitif, dapat direproduksi, dan aplikatif untuk larutan kompleks tanpa perlu derivatisasi. Dalam penerapannya, ESI-MS biasanya digabungkan dengan LC. Tujuannya, untuk melakukan pemisahan senyawa yang polar dan non-polar terlebih dahulu sebelum masuk ke ESI-MS. Penggunaan LC meminimalisir efek supresi ion. Selain itu, waktu retensi dalam kolom LC dapat juga digunakan sebagai parameter lain untuk identifikasi senyawa (selain dari sinyal MS). Prosedur ESI-MS dalam deteksi lipid secara singkat

i.

Sampel diekstrak terlebih

dahulu (dengan menggunakan berbagai metode ekstraksi yang ada, misalkan Bligh-Dyer) ii. Ekstrak diinjeksi ke dalam kolom LC (HPLC, dll) iii. Sampel akan bergerak ke dalam perangkat ESI untuk disemprotkan elektron, kemudian elektron akan diterima oleh detector untuk dibaca iv. Sampel kemudian akan bergerak ke spectrometer massa untuk kemudian dilihat hasil spektrumnya.

Referensi : •

Pratt Pandjiwidjaja. 1992. Teknologi Minyak dan Lemak I. Bogor: IPB Press.

•

Wirahadikusumah M. 1985. Biokomia: Metabolisme Energi, Karbohidrat, dan Lipid. Bandung: ITB Press.

•

Hawab HM. 2004. Pengantar Biokimia. Malang: Bayumedia.

•

Poedjiadi Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.

•

Bligh, E.G., dan W.J. Dyer. 1959. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology Vol. 37, No. 8: 911-917.

•

Dewi, Mega Twilana Indah, dan Nurul Hidajati. 2012. Peningkatan Mutu Minyak Goreng Curah Menggunakan Adsorben Bentonit Teraktivasi. UNESA Journal of Chemistry Vol. 1, No. 2: 47-53.

•

Sastrohamidjojo, Hardjono. 2009. Kimia Organik. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

•

vlab.amrita.edu,. (2011). Estimation of Saponification Value of Fats/Oils.. Retrieved 27 February 2016, from vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=63&sim=688&cnt=2

•

Kenkel, John. 2003. Analytical Chemistry for Technicians 3rd Ed. CRC Press LLC. USA

•

Skoog, Douglas A. , et.al. 2004. Analytical Chemistry 8th Ed. Thomson Inc. Canada

•

Clark, Jim. 2007. High Performance Liquid Chromatography – HPLC. [ONLINE] Available at http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html. Accessed on 18 February 2016.

•

Li, Lin, et al. Mass Spectrometry Methodology in Lipid Analysis. International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15, 10492-10507

•

Anonym. No Date. Iodine value. [ONLINE]. http://www.britannica.com/science/iodine-value. Accessed on 6 March 2016