CUANTIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO POR NANODROP Maura Fiallos Laboratorio de Ingeniería Genética, Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos, Universidad Técnica de Ambato
Resumen En la práctica se cuantic! por medio del "anodrop la cantidad de A#" gen!mico de levaduras presente en las muestras de e$tracci!n obtenidas mediante el método de %o&man' El e(uipo utili)ado midi! la concentraci!n de A#" en ng ng*+ *+ll co con n un una a rel elac aci! i!n n -.* .*/ /. . de
entr en tre e 0' 0'/ / 1 ' '. . pa para ra
especicar la pure)a de la muestra 1a (ue los ácido nucleico se leen a -.nm 1 las proteínas a /. nm' Los valores obtenidos oscilan entre .2'3 1 33/3'4 ng*+l (ue es una concentraci!n de e$celente calidad para (ue ese A#" pueda ser utili)ado en otros procedimientos de biología molecular'
Introducción Ensa1os biomoleculares se están desarrollando continuamente (ue el uso de cantidades cada ve) más pe(ue5os de material, (ue a menudo impide el uso us o
de cu cub beta tas s
conv co nve enc ncio iona nale les s
bas ba sado dos s
en
ins nsttrum umen enttos
parra pa
la
cuanti cua ntica caci! ci!n n de áci ácido dos s nuc nuclei leicos cos par para a a(u a(uell ellos os (ue pue pueden den re reali ali)ar )ar la cuanticaci!n microvolumen' microvolumen' 67altos, .08 9educir el volumen de muestra necesario para el análisis espectrosc!pico también :acilita la inclusi!n de nuevas medidas de control de calidad a lo largo de muc;os
lt >ltima ima ins instan tancia cia con conduc duce e a una ma ma1o 1orr con conan an)a )a en los re resu sulta ltados dos posteriores' 67gi?er, .0.8 El "ano#rop@ "#... es un espectro:ot!metro de espectro total 6. B.nm8 (ue mide concentraciones con 0 +l de muestra, con gran e$actitud 1 rep eprrod oduc ucti tibi bili lida dad' d' Ut Util ili) i)a a un una a nu nuev eva a te tecn cnol olog ogía ía (u (ue e us usa a la te tens nsi! i!n n supercial para mantener la muestra en su sitio 1 se eliminan las cubetas de mesura' Además, el "#... tiene la capacidad de medir muestras mu1 concentradas, sin necesidad de diluirlas 6acepta .D más de concentraci!n (ue las medidas estándares con cubetas8' Esta característica lo ;ace id!neo
para medir la concentraci!n de ácidos nucleicos 1 para determinar su cualidad' El so:tare calcula automáticamente la concentraci!n de los ácidos nucleicos siguiendo la relaci!n 0 A-.nm 0 H# #"A . +g*ml 0 A-.nm 0 H# 9"A 2. +g*ml 6#es=ardins, Con?lin, .0.8 #ebido a los anillos presentes en las bases nitrogenadas del A#", esta molécula tiene absorbancia má$ima a -. nm' La práctica tiene como ob=etivo cuanticar el A#" presente en la muestras de levaduras a través del espectro:ot!metro "A"H#9H' 67altos, .08
Material y mtodos
ara
•
"anodrop
•
A#" gen!mico
•
Agua ultrapura
la
práctica
se
utili)!
un
T;ermocientic
"anodrop
...
6spectrop;otometerU7A8, para iniciar se descongelaron las muestras de A#" gen!mico 1 se limpiaron
las supercies !pticas superiores e
in:eriores del sistema de espectro:ot!metro colocando primero agua destilada ultrapura invitrogen, se cerr! el bra)o de palanca, asegurándose (ue el pedestal superior entre en contacto con el agua destilada' 7e abri! el so:tare "ano#rop 1 se seleccion! la aplicaci!n de ácidos nucleicos' Con la pipeta calibrada en 0+l se coloc! agua para reali)ar una medici!n en blanco se ba=! el bra)o de palanca 1 se seleccion! JEn blancoJ en la aplicaci!n de ácido nucleico' Una ve) ;ec;a la medici!n en blanco se limpi! las supercies !pticas con un pa5o limpio, seco 1 sin pelusa 1 se eligi! la constante para la muestra (ue :ue A#" .' 7e empe)! a cuanticar colocando 0+l en el e(uipo 1 midiendo la concentraci!n de A#" con resultados inmediatos en el so:tare'
Resultados
Fi!ura"#$ E(uipo utili)ado Fuente laboratorio de Ingeniería Genética Ela%orado &or Kaura Fiallos
Tabla0 9esultados de concentraci!n 1 pure)a
Códi!o
Conc' (n!)*l+
,-.),/.
,-.),/.
CC.3/
.2'3
0'/3
0'4B
CC.3B
33/3'4
0'/4
0'24
B2
244'4
'.0
0'/4
CC.34
3333'.
0'B/
0' --
Fuente laboratorio de Ingeniería Genética Ela%orado &or Kaura Fiallos
La
concentraci!n
1
pure)a
del
A#"
:ue
obtenida
mediante
espectro:otometría, a una absorbancia de -. nm donde se encontraron valores altos de A#" como se observa en la tabla 0, lo (ue asegura una
e$tracci!n adecuada del mismo, conrmando la e:ectividad del método de %o&man 1a (ue se dice (ue una buena concentraci!n de A#" para ensa1os moleculares como C9 oscilan entre los ... 1 2... ng*+l en cuanto a la pure)a de la muestras se puede observar (ue los valores se encuentran entre el 0'/ 1 el (ue se e$ige para asegurar (ue lo (ue se está cuanticando es A#" puro, sin presencia de A9", proteínas o carbo;idratos, a e$cepci!n de la segunda relaci!n -.*/. en la muestras CC.3B 1 CC.34 (ue muestran contaminaci!n por proteínas o carbo;idratos pero la primera relaci!n están dentro del rango por lo (ue se generali)a diciendo (ue el A#" obtenido es de buena calidad, alta concentraci!n 1 pure)a'
Cuestionario #' Indi0ue otra manera de cuanti1car la concentración de ADN' Electro:oresis en gel de agarosa La calidad de las moléculas e$traídas se anali)a por electro:oresis en gel de agarosa' La agarosa es un polisacárido altamente puricado derivado del agar' 7e utili)a para separar macromoléculas tales como ácidos nucleicos 1 grandes comple=os proteicos' Tienen un menor poder de resoluci!n (ue la poliacrilamida pero una gran rango de separaci!n, tal (ue pueden ser separadas moléculas de A#" desde ..
pb
;asta
apro$imadamente
.'...
pb
6variando
las
concentraciones de agarosa8' El tama5o del poro del gel puede ser predeterminado a=ustando su concentraci!n en el gelM entonces a ma1or concentraci!n menor tama5o de poro' El rango de traba=o es apro$imadamente entre .,BN 1 N p*v' Con un gel .,BN se obtiene una buena separaci!n 6resoluci!n8 de grandes :ragmentos de A#" 6O 0.?b8 1 con uno N se resuelven me=or los :ragmentos pe(ue5os 6.'O0?b8' El A#" esta ;omogéneamente cargada de :orma negativa a p% neutro, por lo (ue la relaci!n carga masa es constante' 7u velocidad de migraci!n del A#" en la matri) de agarosa está determinada por varios parámetros propios de la molécula' 6Universidad "acional de Puilmes, .0.8
,' 23u indican los 4alores de &ure5a mayores y menores al ran!o ó&timo (#6/7,+8 Cual(uier valor considerablemente por deba=o de lo establecido es indicio de contaminaci!n por proteínas 1*o carbo;idratos mientras (ue en el caso contrario valores ma1ores a indican contaminaci!n por A9" 67altos, .08
9' 23u
indica
el
la
relación
entre
la
a%sor%ancia
a
,-.nm),9.nm8 El valor de la lectura a 3.nm 6longitud de onda mínima8 está in
Conclusión 7e reali)! la cuanticaci!n del A#" en el "anodrop donde se obtuvieron valores altos de concentraci!n de A#" de entre un rango de ... a 32.. ng*+l lo cual da la idea de una correcta e$tracci!n del material genético 1 eca) para reali)ar otros procesos moleculares como C9' En cuanto a la pure)a de las muestras se estableci! empleando los rangos -.*/. nm donde los valores de 0'/ a '. son considerados como A#" puro para el rango libre de proteína, carbo;idratos o A9"' En las muestras obtenidas solo mostraron en la segunda relaci!n valores menores a 0'/ lo (ue dio la idea de una ligera contaminaci!n por proteínas o carbo;idratos' En general la cuanticaci!n se encuentra entre los rangos esperados conclu1endo (ue se obtuvo A#" gen!mico de alta calidad'
:i%lio!ra;
Acosta 7, .03' RQiomasa e$traccion cuanticacion de acidos deo$1ribonucleicos 6adn8 totalesS disponible en ;ttp**'uprm'edu 7gi?er, .0.' Universidad del aís asco Ruricaci!n 1 cuanticaci!n de productos de C9S #isponible en ;ttp**'e;u'eus*documents #es=ardins , Con?lin #, .0.' R"ano#rop microvolumen cuanticaci!n de ácidos nucleicosS diponible en ;ttp**'=ove'com*
