Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología Hurtado García Angélica Laboratorio de Química Orgánica, Facultad de Ciencias, Universidad acional Aut!noma de "é#ico, Ciudad Universitaria, Circuito $#terior s%n, Co&oacán, Cd' Universitaria, ()*+( Ciudad de "é#ico, C"-'
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA !"GMENTO# CLOROFÍL"CO# $E LA E#!"NACA% Resultados .e disolvi! la sílice en /e#ano 0ara em0acar la columna con ella, 0rocurando ser lo más 0recisos 0ara así evitar las burbu1as 2ue el material con 3acilidad genera, 0or lo 2ue se tuvo 2ue dar 0e2ue4os gol0es 0ara 2ue el aire saliera en si totalidad & así no se 3racturara la columna también se agreg! /e#ano 56(7+(8 con la 3inalidad de evitar 2ue la columna secase' .e divi dividi di! ! la es0in s0inac aca a en 0orc 0orcio ione ness en las cua cuales les se iban iban agre agrega gand ndo, o, acom0a4adas acom0a4adas de elu&entes elu&entes 2ue en 3orma creciente con res0ecto res0ecto a su 0olaridad, 0olaridad, de 3orma 2ue las e#tracciones iban del menor 0olar al más 0olar' $lu&entes 5menos 0olar al más 0olar 89 89 • • • •
He#ano 0ro0orciones 6(7+( He#ano 0ro0orciones :(7;( He#ano 0ro0orciones *(7*( Acetona 0ro0orciones +((<
urante el uso de la columna 3ue inevitable 2ue el sílice se 3raccionara 0or la burbu1as de aire, lo 2ue im0idi! 2ue cuando era necesario ver donde comen=aba una banda no se 0ercibieran mu& bien, las banda no se 3ormaron 0are1as' .e lograron e#traer ) com0uestos cloro3ílicos de es0inaca9
la Ilustración 1 Spinacia oleracea
Ilustración 2 Compuesto clorofílico obtenido (clorola a), de tonalidades verde intenso, polar pero menos polar con respecto a la clorola b.
Ilustración 4 Compuesto obtenido ( antólas, con restos de Carortenos), de tonalidades amarillas verdosas, polar.
Ilustración # Compuesto clorofílico obtenido (clorola b), de tonalidades verdosas con un poco de amarillo, polar.
Ilustración ! Compuesto clorofílico obtenido (Carotenos), de tonalidades amarillas, de car"cter no polar.
$iscusión $n las 0lantas su0eriores, la 3otosíntesis es 0osible debido a la 0resencia en el cloro0lasto, concretamente en las membranas tilacoidales, de una serie de 0igmentos 2ue tienen ca0acidad 0ara ca0tar la lu=' $#isten dos ti0os básicos de 0igmentos 3otosintéticos9 Cloro3ilas' Com0uestas 0or una 0or3irina 2ue lleva incor0orado un átomo de magnesio en el centro del n>cleo tetra0irr!lico ' $l i!n "g;? está coordinado con los cuatro átomos de nitr!geno centrales, lo 2ue /ace de la cloro3ila un com0le1o e#traordinariamente estable' La @cabe=a@ 2ue acabamos de describir, está unida a una @cola@, el 3itol, 2ue es un alco/ol de ;( átomos de carbono' Cabe=a & cola se unen a través de un enlace éster en el 2ue intervienen el gru0o alco/!lico del 3itol & el gru0o carbo#ilo de un ácido 0ro0i!nico 2ue está unido al anillo del n>cleo tetra0irr!lico' $#isten varios ti0os de cloro3ilas, las más im0ortantes de las cuales son la @a@, & la @b@' La cloro3ila a tiene un gru0o 7CH en el anillo mientras 2ue la cloro3ila b tiene un gru0o 7CHO en esa misma 0osici!n' $n las 0lantas, la cloro3ila a es el 0igmento involucrado directamente en la trans3ormaci!n de la energía lumínica en energía 2uímica, las células 3otosintéticas casi siem0re contienen un segundo ti0o de cloro3ila, la cloro3ila b & otro gru0o de 0igmentos llamados carotenoides' Uno de los carotenoides 2ue se encuentran en las 0lantas es el D7carotenoE los carotenoides son 0igmentos ro1os,
anaran1ados o amarillos, 2ue en las /o1as verdes están enmascarados 0or las cloro3ilas, 2ue son más abundantesE sin embargo en algunos te1idos, como los del tomate maduro, 0redominan los colores re3le1ados 0or los carotenoides' Carotenoides' Act>an como 0igmentos accesorios en el 0roceso de la 3otosíntesis' $#isten dos ti0os de 0igmentos carotenoides9 carotenos & #anto3ilas' Los carotenos son /idrocarburos iso0renoides 2ue no contienen o#ígeno & están 3ormados 0or largas moléculas con un sistema de enlaces con1ugados alternantes, dobles & sencillos, rematados en cada e#tremo 0or un anillo de ciclo/e#ano insaturado7 tienen color amarillo7anaran1ado' Las #anto3ilas tienen una estructura mu& similar a la de los carotenos & su di3erencia estriba en la incor0oraci!n de o#ígeno en los e#tremos de la molécula' .eg>n el gru0o 2ue se incor0ore e#isten variedades dentro de las #anto3ilas' .on de color amarillo Las Cloro3ilas son com0uestos del ti0o tetra0irrol, al mismo gru0o 0ertenecen las 3icocianinas & las 3icoeritrinas 50igmentos accesorios en algas a=ules & ro1as8' Constan de cuatro anillos de 0irrol unidos 0or medio de 0uentes de metilo 577CH8 lo 2ue constitu&e una 0or3irina' $l tetra0irrol es el cuer0o básico de las 0or3irinas, dentro de las cuales se inclu&en además de las cloro3ilas, las /emoglobinas & los citocromos' La característica crom!3ora de la cloro3ila se debe 1ustamente al sistema de dobles enlaces con1ugados generados 0or la uni!n de los anillos de 0irrol mediante los gru0os metino' $n el centro del sistema de anillos 5re0resentado como un 0unto negro en la grá3ica8 se /alla un átomo metálico, 0ara las cloro3ilas es el magnesio' $l anillo de 0irrrol tiene una estructura isociclica adicional, el anillo de la ciclo0entanona' $l anillo esta esteri3icado con un alco/ol, el 3itol, 2ue re0resenta una cadena de ;( átomos de carbono con un doble enlace, esta @cola@ de 3itol le da a la cloro3ila 0ura una naturale=a cerosa 2ue e#0lica la insolubilidad del 0igmento en agua & su buena solubilidad en solventes orgánicos' Al res0ecto, la cloro3ila 0resenta un com0ortamiento doble, &a 2ue la cola de 3itol es insoluble en agua, /idr!3oba & el n>cleo de la 0or3irina tiene un carácter /idr!3ilo, es decir es a3ín al agua' $n la cromatogra3ía en columna, la &ase estacionaria utili=ada, es decir, el a'sor'ente (s)lice*, se coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual 3inali=a con una llave 0ara controlar el 0aso de sustancias al e#terior de la columna' La 3ase estacionaria se im0regna con el elu+ente o &ase móvil, .eguidamente la me=cla orgánica 2ue nos interesa se0arar la de0ositamos 0or la 0arte su0erior de la 3ase estacionaria, & así la 3ase m!vil 0odrá ir atravesando el sistema' Los com0uestos 2ue se encuentran disueltos en la &ase móvil, 0oco a 0oco saldrán de la columna cromatográ3ica, & se recogen en 3racciones' Las 3racciones menos 0olares, 2ue son 0or lo general las 2ue se retienen 0oco o nada en el absorbente, serán las 0rimeras en salir de la columna' $n cambio, las sustancias más 0olares, 2uedan retenidas 0or más tiem0o en el absorbente, & a menudo es
necesario el uso de di3erentes disolventes con la 3inalidad de incrementar su 0olaridad 0ara 2ue sean arrastradas 0or estos' $l tiem0o 2ue se necesita 0ara /acer 3luir un com0uesto 0or la columna, se conoce con el nombre de tiem0o de retenci!n' $l 0igmento 2ue 0rimero se 0udo obtener 3ue el CAO$O, al ser el o 0olar como lo indicado anteriormente, la retenci!n en la columna 3ue mu& 0oco 0or lo 2ue su e#tracci!n 3ue la más rá0ida, con este se utili=! el elu&ente menos 0olar 5/e#ano 6(7+(8' .iguiendo el orden de 0olaridad lo segundo obtenido 3ueron las -AIFLA., 2ue 0oseen tonalidades amarillentas 0ero también 0oseen tonalidades anaran1adas, al ser un com0uesto 0olar, el elu&ente 2ue se utili=! tenía una distinta 0olaridad 5/e#ano :(7;(8' La 0olaridad no indic! 2ue el siguiente 0igmento obtenido 3ue la cloro3ila a, del cual se logr! obtener la ma&or cantidad, usando un elu&ente de /e#ano 5*(7*(8' Jara lograr 2ue la cloro3ila b atravesase la columna se necesit! utili=ar un elu&ente con ma&or 0olaridad 5Acetona +((<8'
Conclusión La cromatogra3ía en columna es 2ui=ás el método más general, utili=ado 0ara la se0araci!n, a la ve= 2ue 0ara la 0uri3icaci!n, de di3erentes com0uestos orgánicos 2ue se encuentren en estado s!lido o lí2uido' La estructura de los 0igmentos vegetales, los /ace insolubles en agua, ra=!n 0or la cual se necesit! de disolventes orgánicos 5/e#ano & acetona8' La 0olaridad de los 0igmentos varía signi3icativamente en siendo los no 0olares los carotenos, continuando con una ma&or 0olaridad 2ue los carotenos la #anto3ilas, a continuaci!n más 0olar 2ue las #anto3ilas 0ero menos 2ue la cloro3ila b, tenemos a la cloro3ila a & de la cual se obtuvo la ma&or cantidad, la más 0olar, la cloro3ila b'
Cuestionario +'7 iscuta la im0ortancia de la 0olaridad & c!mo interviene este 3actor durante la se0araci!n 0or CC' La im0ortancia de la 0olaridad radica en 2ue /ace re3encia a la se0araci!n de cargas en una misma molécula, la 0olaridad de los elu&entes re0ercute en las velocidades relativas con las 2ue los 0igmentos cloro3ílicos se mueven a través de la columna tomando un 0a0el im0ortante la columna con gel de sílice, de carácter
0olar 50uede /aber com0uestos más 0olares8, al ser 0olar atraerá com0uestos de su misma naturale=a, reali=ando la se0araci!n delos com0onentes del menos 0olar al más 0olar' ;'7 iscuta la im0ortancia de com0lementar con CCF el 0roceso de se0araci!n 0or columna' $s im0ortante com0lementar con CCF 0or2ue en el momento de /acer el revelado de las columnas cromatográ3icas se 0ueden estudiar e identi3icar con ma&or 0recisi!n los 0igmentos 2ue se deseaban se0arar' '7 Analice las CCF de las 3racciones obtenidas & eval>e la se0araci!n en 3unci!n de la 0olaridad de los 0igmentos' Los 0igmentos 2ue se se0araron, Carotenos, -anto3ilas, Cloro3ila a & Cloro3ila b tienen carácter en su ma&oría 0olar, aun2ue su grado de 0olaridad varía en 3unci!n de su com0osici!n 2uímica' e esta 3orma, e#iste un gradiente de 0olaridad desde el más a0olar al 0olar' $sta 0ro0iedad 0ermite su se0araci!n, & su distinto color su identi3icaci!n'
)'7 denti3i2ue los di3erentes 0igmentos cloro3ílicos se0arados'
Ilustración $ %structura de Carotenos.
Ilustración & %structura Clorolas a ' b
*'7 Ilustración %structura antolas
e3ina los siguientes términos9
$lu&ente' .e /ace re3erencia a un disolvente 2ue le 0ermite la se0araci!n de com0onentes de una me=cla, el cual debe ser 0uro & volátil' Fase "!vil' A2uella 2ue atraviesa la 3ase estacionaria 5 en nuestro caso los elu&entes de di3erente 0olaridad8 el cual arrastr! los com0onentes de los 0igmentos' Fase $stacionaria' A2uella sustancia s!lida 5Gel de sílice sobre la columna8 2ue 0ermanece 3i1a sobre un so0orte, usualmente es el absorbente' Factor de .e0araci!n' $s un 0arámetro 2ue de3ine la ca0acidad de selectividad de la cromatogra3ía, en otras 0alabras, la ca0acidad de la columna 0ara se0arar los com0uestos' esoluci!n' $s una medida cuantitativa de una columna 0ara se0arar dos com0onentes a & b 2ue 0ermite evaluar la se0araci!n 2ue /a& entre dos bandas res0ecto al tama4o de cada una de ellasE la resoluci!n 0uede a3ectarse 0or el 3actor de selectividad & verse in3luenciada 0or el n>mero de 0latos 2ue 0osee la columna' Jlatos te!ricos en Cromatogra3ía' .on a2uellos 2ue sirven 0ara determinar de manera cuantitativa la e3iciencia de la columna cromatográ3ica & son e2uilibrios 5entre la distribuci!n del soluto, la 3ase m!vil & estacionaria8 2ue se alcan=a en varias 0artes de la columna, 0or lo 2ue la e3iciencia de la columna de0ende del n>mero de 0latos 2ue 0osea' K'7 nvestigue c!mo se detectan los com0uestos no coloridos' .i los com0uestos se0arados no son coloreados es necesario revelar la 0osici!n de dic/os com0uestos, 0ara ello e#isten dos ti0os de métodos9 ? "étodos 2uímicos' Consisten en reali=ar una reacci!n 2uímica entre un reactivo revelador & los com0onentes se0arados, 0ara ello se 0ulveri=a la 0laca con los reactivos reveladores con la a&uda de un 0ulveri=ador de vidrio & una 0era de goma, o mediante un dis0ositivo 2ue 0ro0orcione aire com0rimido' $s 0re3erible 0ulveri=ar con las 0lacas en 0osici!n /ori=ontal' .i el reactivo revelador es 0eligroso o mu& corrosivo, la 0ulveri=aci!n deberá reali=arse en una vitrina de gases bien ventilada' La 0ulveri=aci!n se reali=ará 0oco a 0oco' $n cromatogra3ía en ca0a 3ina no 0uede reali=arse el ba4ado del cromatograma 5en cromatogra3ía en 0a0el sí8' Generalmente se utili=a como reactivo revelador &odo, el cual 3orma com0le1os coloreados con los com0onentes orgánicos 5con tonos amarillo7marr!n8, 0ero las manc/as desa0arecen con el tiem0o con lo 2ue es conveniente se4alar las manc/as a0arecidas' Otro reactivo revelador bastante utili=ado es el ácido sul3>rico, 2ue reacciona con los com0onentes orgánicos 0roduciendo manc/as
negras' $l tama4o de las manc/as no está relacionado con la cantidad de com0onente se0arado' Además de estos reveladores generales, e#isten otros es0ecí3icos9 ;,) 7 dinitro3enil/idracina 50ara alde/idos & cetonas8' erde de bromocresol 50ara ácidos carbo#ílicos8' Jaradimetil aminoben=alde/ido 50ara aminas8' in/idrina 50ara aminoácidos8' ? "étodos 3ísicos' $l más com>n consiste en a4adir al adsorbente un indicador 3luorescente' e tal 3orma 2ue al colocar la 0laca ba1o una lám0ara ultravioleta, & de0endiendo del indicador & de la longitud de onda, a0arecen manc/as 3luorescentes en las =onas en las 2ue /a& com0onentes, o en otros casos a0arece toda la 0laca 3luorescente e#ce0to donde /a& com0onentes' Algunos com0uestos 0oseen cierta 3luorescencia 5aun2ue no es normal8 con lo 2ue 0ueden ser detectados directamente en una lám0ara de ultravioleta'
Re&erencias, •
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"at/eMs, C' NE an Holde, N' $' Bioquímica ;$' "adrid9 "c GraM Hill7 nteramericana, +66:' K*P7KK* L' ai=, $' eiger' Jlant J/&siolog&' .underland, "assac/ussets9 .inauer Associates nc', ;((;' alcarcel, "' +6::' écnicas analíticas de se0araci!n' $ditorial everté' $s0a4a' 00 *7K, *6P7K+' "c"urr& R' 5;((:8' Química Irgánica, P ma edici!n, Cengage Learning, "é#ico' J'0' ;(;7;(P
