Práctica: “Cromatografía en columna flash” Introducción
La cromatografía en columna se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lana de vidrio, para evitar que la sílica o la alúmina queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrasada hasta el nivel del soporte. A continuación se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo. Una columna de cromatografía es un tubo de vidrio relleno con una sustancia sólida de propiedades adsorbentes constituida por pequeñas partículas: gel de sílice y alúmina son las más usadas. Este relleno es lo que se conoce en cromatografía como la fase estacionaria. A través de la columna se hará pasar pasar una corriente corriente de un disolvente disolvente o mezcla mezcla de disolventes disolventes denominada eluyente y/o fase móvil . La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequeña cantidad de disolvente y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el mismo. A continuación se pasa un flujo de eluyente a través de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla son arrastrados por el eluyente a su paso, haciéndoles avanzar a lo largo de la columna. Sin embargo, no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad, y esta es precisamente la clave de la cromatografía. Algunos compuestos compuestos se ven más más fuertemente fuertemente retenidos retenidos por el adsorbente adsorbente (fase estacionaria) estacionaria) y por lo tanto avanzarán más despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarán a mayor velocidad. En general se dice que la separación en la cromatografía se basa en la afinidad diferencial de los distintos compuestos por la fase móvil o la fase estacionaria. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. La gran porosidad del gel de sílice, que le otorga alrededor de 800 m²/g de superficie específica, le convierte en un absorbente de agua. Por este motivo se utiliza para reducir la humedad en espacio. La cromatografía en columna se ocupa en la separación de colorantes, proteínas y en separaciones de componentes de plantas medicinales. Eter de petróleo. Eter dietílico. Ciclohexano. Acetato de etilo. Tetracloruro de carbono.* Piridina. Benceno.*
Etanol.
Cloroformo.* Metanol. Diclorometano. Agua. Ácido acético. acético.
La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad: *compuestos cancerígenos.
Para la elección del eluyente hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.
a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente. b) Aplicando un eluyente poco polar. c) Aplicando un eluyente más polar. Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares, hasta dar con el más apropiado. Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera más eficaz. Objetivos
a) Realizar la CC para la separación y aislamiento de los componentes clorofílicos de un extracto obtenido a partir de una muestra vegetal. b) Conocer las características de la CC y los factores que en ella intervienen. Material Procedimiento
-
-
-
-
-
Material
1 Columna Frascos de vidrio de Se colocó un pequeño trozo de fibra de vidrio cromatográfica. 20 a 25 mL. en el extremo inferior dentro de la columna 1 Matraz bola de 250 1 Cámara de desarrollo cromatográfica. mL. de CCF. Se sujetó la columna en posición vertical a un 6 Matraces Erlenmeyer 1 Soporte universal. soporte universal utilizando una pinza de tres de 50 mL. dedos. 1 Vaso de precipitado 1 Embudo. de 500 mL. Se colocó un matraz Erlenmeyer en la parte 1 Agitador. inferior de la columna y un embudo en la parte 1 Trozo de manguera. 1 Rotavapor. Placas superior. cromatográficas. En un vaso de precipitado el profesor preparó 2 Pinzas de 3 dedos Capilares. una suspensión de gel de sílica con el (Se sustituyó una por la eluyente, en este caso se utilizó un compuesto pinza Mohr) clorado (Hexano). 3 Pipetas Pasteur. Fibra de vidrio. Se añadió la suspensión preparada por la parte superior de la columna con ayuda del embudo, procurando que la mezcla permaneciera lo más homogéneamente posible.
-
-
Se dejó fluir el disolvente, permitiendo una sedimentación del adsobente para que éste se compacte adecuadamente, procurando que no se formaran burbujas y evitando que se secara el gel de sílice. Se dejó que el eluyente bajara hasta una altura sobre el adsobente de 2 a 4 mm y se cerró la manguera de la columna para que dejara de fluir. Con ayuda de la pipeta Pasteur y la varilla de vidrió, se añadió tinta de plumón procurando que esta bajara por las paredes. Se abrió la manguera y se continuó con la adición de eluyente por la parte superior para desarrollar la columna hasta colectar el primer color o banda formada por la separación. Se repitió el paso anterior hasta la obtención de 6 componentes clorofílicos.
Análisis de resultados
Para poder analizar de manera eficiente y correcta los resultados se tiene que realizar un revelado de placas para mostrar una buena separación de los pigmentos de la tinta de plumón podemos contribuir a que en la CC no se realizó de manera correcta,se debe tener especial cuidado diversos factores como un vaciado deficiente en la columna de la sílica gel, de manera homogénea, que no haya un exceso de eluyente al momento de colocar el extracto, esto factores entre otros pueden contribuir a una mala recolección de los componentes de la tinta de plumón al realizar el revelado de placas. Las fuerzas con las que los solutos interactúan con el adsorbente son el resultado de la polaridad de los mismos. Un eluyente muy polar tiene una fuerza de elución grande para compuestos de naturaleza polar; un compuesto análogo ocurre con especies no polares, esto se ve reflejado al momento de realizar el revelado de placas. Conclusiones
Cuando se realiza cualquier tipo de cromatografía, ya sé en columna o en capa fina es importante escoger el eluyente con la polaridad requerida para poder separar de manera eficiente los compuestos, en este caso pigmentos clorofílicos, que se desean obtener. Mucho de esto también va a depender de los grupos funcionales con los que se esté trabajando. La correcta preparación del adsorbente también es muy importante ya que este es el que va a reducir la humedad del medio dándonos oportunidad de recolectar los pigmentos deseados del extracto vegetal. Bibliografía
Mayo, D.W. 1991. Microscale Techniques for the organic laboratory. John Wiley & Sons, Inc. New York. Pp 138-142 http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina http://es.scribd.com/doc/14172697/6-Cromatografia-en-Columna
