Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química Grupo: 38 Química Orgánica Laboratorio Práctica 7: Cromatografía en columna. Integrantes: Pastrana Ortega Carlos Alberto. Pluma Ortiz Valeria Vania. Profesor: Agustín Palma de La Cruz
2016-1
Objetivos:
Comprender la técnica de cromatografía en columna, sus características y los factores que en ella intervienen. Emplear la técnica de cromatografía en columna para la separación de un compuesto orgánico. A través de cromatografía en capa fina controlar la cromatografía en columna.
Antecedentes: -Cromatografía en columna. Para que sirve y sus aplicaciones. Es el método más general para la separación y purificación de compuestos orgánicos, sólidos o líquidos a escala preparativa. Las aplicaciones prácticas de la cromatografía se encuentran por ejemplo en la producción, donde se usa la cromatografía para la limpieza y aislamiento de sustancias. Por otro lado, en la analítica química se usa la cromatografía para separar mezclas en compuestos homogéneos. -Cromatografía de adsorción, de partición o reparto. La cromatografía de partición, se carateriza por emplear una fase estacionaria líquida, anclada a un soporte sólido, y una fase móvil también líquida. Existen dos tipos de cromatografía de partición: normal o de fase inversa.
Cromatografía normal La fase estacionaria está constituida por un líquido de carácter polar. Como fase móvil se emplean mezclas de disolventes apolares (hexano o ciclohexano), con disolventes polares conocidos como modificadores polares. Generalmente se utiliza para la separación de mezclas de compuestos muy polares. La retención de un soluto se explica en base a la competición que se establece entre la afinidad del grupo polar (X) presente en la fase estacionaria por el modificador polar (P) presente en la mezcla hexano-P y por los solutos a separar (S); así como a la solvatación de estos últimos por el modificador polar (P) en la fase móvil. Por lo tanto, la retención de un soluto aumenta cuanto menor sea la proporción de modificador polar en la fase móvil. El orden de elución está gobernado por interacciones de tipo polar: los solutos más polares quedan más retenidos. Cromatografía en fase inversa La fase estacionaria está constituida por un líquido de carácter apolar. Como fase móvil se emplean mezclas de agua con disolventes polares miscibles.
Se emplea generalmente para la separación de mezclas de compuestos de polaridad baja y para la separación de compuestos de una misma serie homóloga. La retención de un soluto se explica en base a una adsorción preferencial del disolvente menos polar de la fase móvil a la superficie de las cadenas apolares que constituyen la fase estacionaria, de manera que se establece un mecanismo complejo que supone una combinación de equilibrios de solubilidad (partición de la mezcla que se cromatografía entre la fase líquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase móvil. Por otra parte, los solutos menos polares se ven más excluidos de la fase móvil (efecto hidrófobo) y se adsorben preferentemente a las cadenas hidrocarbonadas de la fase estacionaria. Los compuestos más polares estarán menos retenidos que los menos polares. -Factores que influyen en una separación por cromatografía en columna.
El diámetro de la columna La altura de la fase estacionaria en la columna está relacionada con la diferencia de los valores de R f de los componentes de la mezcla; además de estar relacionado con la cantidad de muestra a separar. Diámetro de la columna (cm) 1 2 3 4 5
Cantidad de la muestra ΔRf > 0.2 ΔRf < 0.2 100 40 400 160 900 360 1600 600 2500 1000
Fase estacionaria Se recomienda rellenar la columna a una altura entre 15-20 cm de gel de sílice. Para separaciones de mayor dificultad se recomienda incrementar la altura de relleno hasta 20-25 cm
-Selección de eluyentes y adsorbentes para la separación de compuestos por cromatografía en columna. Para elegir el disolvente, previamente se lleva a cabo una cromatografía en capa fina de la muestra a analizar. El disolvente tiene que conducir a una buena separación de los componentes de la mezcla en la placa (ΔR f >0) y situar el componente menos polar a un Rf aproximado de 0.3. La separación de una mezcla en una columna será poco eficaz si se utiliza un disolvente que sitúe los componentes a separar a un valor de R f superior a 0.3. Para columnas pequeñas es mejor utilizar un eluyente menos polar que el obtenido del resultado de la placa
Parte Experimental: -Material
1 Agitador de vidrio
1 Piseta de 125 mL con eluyente
1 Colector 1 Columna para cromatografía
1 Refrigerante para agua con mangueras 1 T de destilación
1 Embudo de vidrio
1 Tapón esmerilado
2 Frascos para cromatografía
1 Tubo capilar
8 Frascos viales
2 Vasos de precipitados de 100 mL
1 Matraz redondo de fondo plano de 50mL 1 Pipeta de 5 mL
1 Vidrio de reloj
4 Portaobjetos
2 Pinzas de tres dedos con nuez
1 Probeta de 25 mL
1 Parrilla con agitación mágnetica
1 Espátula
-Material adicional 1 Lámpara de luz UV onda larga y onda corta. 1 Cámara oscura para lámpara de luz UV
1 Cámara de yodo
-Sustancias y reactivos Gel de sílice para columna
Acetato de etilo
Gel de sílice para cromatografía en capa fina
Hexano
Yodo
1 Tableta de algún medicamento
Procedimiento. I. Purificación del principio activo de un medicamento. a) Se coloca la columna de cromatografía en un soporte con ayuda de unas pinzas de tres dedos, de tal forma que se encuentre totalmente vertical y con una altura al tamaño de los frascos viales. b) Para empacar la columna, se coloca la llave de la columna en posición de cerrado (si la llave es de vidrio, se deberá engrasar ligeramente). Se
c) d) e) f) g)
h)
introduce hasta el fondo un pequeño pedazo de algodón con ayuda de una varilla de vidrio o de metal y se agregan 5 mL del eluyente (AcOEt), se presiona suavemente el algodón para eliminar las burbujas. Se prepara una suspensión de sílica gel para columna, 6 g en 30 mL de eluyente y se agita la suspensión hasta que no se observen burbujas de aire. Con ayuda de un embudo de vidrio se vierte la suspensión en la columna lo más rápido posible y se golpea ligeramente la columna con los dedos para que el empaquetamiento sea uniforme. Abrir la llave para eliminar el exceso de disolvente cuidando de no dejar secar la silica gel, se debe mantener el eluyente aproximadante a 0.5 cm arriba de la sílica. Pulverizar la pastilla y pesar 100 g e introducirlos en la columna. Se abre la llave para colectar el eluyente y que se adsorba la muestra aplicada, se debe tener cuidado de que la columna no se seque. Marcar los frascos viales a 6 mL y colectar las fracciones (eluatos), verificar la separación realizando cromatoplacas (preparar las cromatoplacas y capilares previamente como la práctica anterior). En cada cromatoplaca aplicar 4 de sus fracciones y un testigo. Se eluyen las cromatoplacas en una mezcla del eluyente utilizado y se observa en cuales fracciones hay presencia del compuesto separado revelando con una cámara de UV o una cámara de yodo. En cada cromatoplaca se debe observar el cambio de coloración de la mancha del producto principal (a menor concentración menor intensidad de color). Manejo de residuos. D1. Capilares y cubreobjetos D5. Gel de sílice para la columna D2. Acetato de etilo D6. Metanol/acetona D3. Hexano-acetato de etilo D7. Papel filtro y muestra problema D4. Gel de sílice para placa -Tratamiento.
D1 y D7: Empacar cuidadosamente para incineración. D2, D3 y D6: Secar y destilar para recuperar. D4: Se puede recuperar para usarla nuevamente previo lavado y secado D5: Cernir, lavar y secar para usarla nuevamente, previo lavado y secado.
Resultados y discusión: Al momento de realizar la cromatografía de capa fina, se observó que el compuesto utilizado (ácido acetilsalicílico) no eluyó durante las primeras 16 fracciones (eluatos). Se realizaron 8 eluatos más cambiando el eluyente utilizado
anteriormente (AcOEt) en la columna de cromatografía por metanol, con lo que en las nuevas fracciones 2 y 3 se observó un pequeño desplazamiento de la fracción (figura 1 y 2), el cual, comparado con el testigo, se determinó que no se trataba del mismo compuesto y que las fracciones no llegaron a contener el ácido acetilsalicílico. Datos: Distancia del eluyente= 5.5 Distancia de las muestras=1 Rf (fracción 2 y 3)=
1 =0.18 5.5
Distancia del estándar = 3 3 Rf (estándar) = =0.54 5.5
Figura 1
Figura 2
Se sabe que el tiempo en el que eluye un compuesto es fuertemente influido por la polaridad del compuesto, como regla general, las moléculas que contienen grupos funcionales polares se adsorben más fuertemente y por tanto emigran con mayor lentitud por la fase estacionaria con respecto a las moléculas no polares. Al considerar la fórmula del ácido acetilsalicílico se puede ver que es una molécula muy polar, debido a la presencia de dos dobles enlaces con un oxígeno y de un OH. Al ser el acetato de etilo un compuesto con menor polaridad, no tiene la suficiente fuerza para desplazar al ácido acetilsalicílico, por lo que se requirió el uso de un compuesto más polar (metanol), el cuál, como se mencionó anteriormente, permitió observar un pequeño desplazamiento en dos de las cromatoplacas. El ácido acetilsalicílico se hidroliza fácilmente a ácido salicílico y anhídrido acético (compuestos de los cuales, en presencia de ácido sulfúrico como catalizador, se sintetiza el ácido acetilsalicílico), por lo que consideramos que lo mostrado en las cromatoplacas es alguno de estos dos compuestos y no el ácido acetilsalicílico como tal.
Ácido acetilsalicílico.
Acetato de Etilo.
Metanol.
Al momento de la destilación, se obtuvieron 8 mL de cuerpo y cola, mientras que, al tratar de obtener un sólido evaporando el líquido de la mezcla de las fracciones 2 y 3, no se logró observar sólido alguno, esto debido a que, el ácido acetilsalicílico se solubiliza muy fácilmente en alcohol, al igual que el ácido salicílico y el anhídrido acético, considerándolos como alguno de los productos en la cromatografía. Conclusión: Se logró relacionar ambas cromatografías y sobre todo ver la relación que existen entre estas, ya que sin la cromatografía de capa fina, la de columna no estaría completa, mientras que la de capa fina no requiere a la otra. Se reforzó el concepto de la relación que existe entre la polaridad y el desplazamiento visto en cada una de las cromatoplacas, además de que se aprendieron algunas de las
características del compuesto utilizado (ácido acetilsalicílico) así como su comportamiento con los distintos eluyentes. Se concluye que la cromatografía en columna requiere de mucha observación y de información previa acerca del compuesto que se quiere purificar, es un proceso fácil y rápido pero del cual se llegan a tener algunos problemas si no se lleva a cabo el procedimiento exacto. Cuestionario: 1. Indique algunas de las aplicaciones de la cromatografía de adsorción. Aplicaciones de la Cromatografía Líquida de Adsorción en Capa Fina -Es una técnica cualitativa que se utiliza para los siguientes fines: -Monitorización de una reacción, poniendo un punto en el cromatograma cada cierto tiempo. -Identificación de un compuesto, comparando el Rf del compuesto a investigar con el del compuesto conocido. -Comprobación de la pureza del compuesto, comprando la muestra con el producto puro. -Elección del disolvente adecuado para cromatografía preparativa. -Análisis de fracciones recogidas en una cromatografía en columna
Cromatografía Líquida de Adsorción en Columna La Cromatografía en Columna se usa sólo con fines preparativos, siendo el métodos más general para la separación y purificación de compuestos orgánicos, tanto sólidos como líquidos.
2. Diga cuál es la diferencia entre una cromatografía en capa fina y la de columna. Que en la cromatografía en capa fina (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa delgada de un adsorbente (como por ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa) depositada sobre un soporte plano como una placa de vidrio, o una lámina de aluminio o de plástico mientras que la cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria), la muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte y el resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. 3. ¿Qué debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para un compuesto que se purificara en cromatografía en columna? De acuerdo a la polaridad de la muestra se determina la polaridad del eluyente y determinar las demás fases que rodean la columna para evitar que la muestra no se desplace más de lo necesario o en caso contrario, que no logre desplazar.
4. ¿Por qué es necesario realizar una cromatografía en capa fina a los eluatos obtenidos de la columna cromatográfica? Porque la cromatografía en columna va de la mano con la de capa fina, esto para poder observar la separación y purificación de compuestos, sin ella no se tendría completa la cromatografía en columna. 5. Escriba una lista de eluyentes utilizados en cromatografía en columna en orden de polaridad creciente. Anote su bibliografía. Orden de elución de los compuestos orgánicos Polaridad Orden de elución Tipo de compuestos Menor Menor retención (eluyen Alcanos antes) Alquenos Dienos Éteres Hidrocarburos halogenados Hidrocarburos aromáticos Aldehídos y cetonas Ésteres Aminas Alcoholes y tioles Mayor Mayor retención (eluyen Fenoles después) Ácidos carboxílicos Ácidos sulfúricos Fuente: Csákÿ A.G. Técnicas experimentales en síntesis orgánica. 2ªed. España:editorial síntesis
Bibliografía: 1. Durst H.D. Química orgánica experimental. Barcelona: editorial Reverté, 1985. PP. 111-13 2. Andrejus Korolkovas, Joseph H. Burckhalter, Compendio esencial de química farmacéutica, Editorial Reverté, 1983, P. 182 3. Csákÿ A.G. Técnicas experimentales en síntesis orgánica. 2ªed. España:editorial síntesis, 2002. P.P 176-178, 181-182
