INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS SISTEMAS DE CONTROL DE CALIDAD PRACTICA 10: CONTROL DE CALIDAD EN LA COLORACION COLOR ACION DE LOS EXTENDIDOS SANGUINEOS, TINCION DE WRIGHT
INTRODUCCION En la mayoría de los laboratorios los colorantes más empleados para la tinción hematológica se basan en el de Romanowsky constituido fundamentalmente con la mezcla de eosina (ácido) y azul de metileno (básico). Además se han incorporado el empleo de derivados por oxidación del azul de metileno que se conoce con el nombre de azures (A, B, C). Son los azures los responsables de la coloración púrpura o roja de ciertas estructuras. Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de forma que las que tienen carácter básico fijan la eosina mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno. Esto explica que las estructuras basófilas se tiñan de color azul mientras que los competente acidófilas adquieren un color rosado. La diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permite clasificar a los leucocitos polimorfonucleares en 3 grupos:
Granulocitos eosinófilos, en los que la granulación específica contiene sustancias carácter básicos que fijan los colorantes ácidos y se tiñen de color rojo-naranja. Granulocitos basófilos, en los que la granulación específica posee sustancias carácter ácido que fijan los colorantes básicos y se tiñen de color azul oscuro. Granulocitos neutrófilos, en los que la granulación específica posee compuestos carácter neutro por lo que fijan ambos colorantes simultáneamente, de ahí que tiñen de color pardo.
de de de se
Dentro del grupo de colorante tipo Romanowsky los más utilizados son el de Wright, Giemsa y May-Grünwald-Giemsa, entre otras.
OBJETIVOS Conocer la importancia y efecto que tiene sobre las células un reactivo mal empleado (buffer de fosfatos)
FUNDAMENTOS Los colorantes ácidos se unen con los componentes básicos de las células (citoplasma), inversamente, los colorantes básicos son atraídos por los compuestos ácidos de las células y se combinan con ellos (ácidos nucleicos y nucleoproteínas), por lo que se denomina basófilo; la eosina es un colorante ácido, por lo tanto se puede usar indistintamente los términos “eosinófilo" y “acidófilo" para describir las propiedades tintóreas de los componentes celulares. Algunas estructuras se tiñen por una combinación de ambos y se denomina neutrófilos. La coloración de los núcleos celulares, esta basada en la interacción molecular entre eosina y un complejo azur B —DNA. La tinción de Wright cuyo colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñe de color azul las partes acidas de las células) y eosina (que tiñe las partes alcalinas) disueltos en metanol (que permite la fijación de las células), adicionando a la preparación buffer de fosfatos (que rehidrata a las células después de la exposición con metanol).
METODOS Control de calidad en la tinción de Wrigth
Realizar una punción venosa
Preparar extendidos sanguíneos y marcar con lápiz
Secar al aire y agregar alcohol metílico 1 min
Cubrir el extendido con el colorante de Wright 1 min A diferentes pH, 6.8 , 7.5 , 6.4 hasta la formación de una capa Agregar buffer de fosfatos 5 min
Lavar con agua destilada
Observar al microscopio a 100x
metálica y homogeneizar soplando
RESULTADOS Tabla 1: bitacora de resultados BITACORA DE RESULTADOS
FECHA: 15 NOV 2017
Control de calidad en las tinciones celulares Resultados y observaciones Metodología utilizada: tinción de Wright pH de los reguladores utilizados: 6.8, 7.5 y 6.4 Célula de referencia: Monocito Características que debe tener la célula de referencia:
Observación de las células a diferentes pH con el objetivo de inmersión (100x) Plaqueta
Eritrocitos
Monocito
Figura 1: extendido sanguíneo pH 6.8 En esta figura se puede observar que el monocito presenta un plasma de color grisáceo y el núcleo también, no se distinguen bien sus partes, lo eritrocitos presentan una coloración grisácea.
Linfocito
Eritrocitos
Monocito
Neutrófilos
Figura 2: extendido sanguíneo a pH 7.4 En esta figura se puede observar que el monocito presenta un plasma de color grisáceo y el núcleo de color morado así como los leucocitos que se observan alrededor del monocito.
Monocito
Eritrocitos
Plaqueta
Figura 3: extendido sanguíneo a pH 6.4 En esta figura se puede observar que el monocito presenta un plasma de coloración grisácea así como su núcleo que es del mismo color, los eritrocitos tienen color rosada.
Características de una buena tinción: 1. Los eritrocitos deben ser de color rosado a salmón. 2. Los núcleos son de color azul oscuro o violeta. 3. Los gránulos citoplasmáticos de los neutrófilos los son de color lavanda a lila. 4. Los gránulos citoplasmáticos de los basófilos los son de color azul oscuro a negro. 5. Los gránulos citoplasmáticos de los eosinófilos los son de color rojo a anaranjados. 6. La zona entre las células debe ser incolora, clara, limpia y sin colorante precipitado.
Figura 4: Linfocito
Figura 5: Basófilo
Figura 6: Eosinófilo
Figura 7: Neutrófilo
Tabla 2. Identificación de puntos críticos durante el proceso.
Identificación de puntos críticos del proceso
Acciones correctivas
Acciones preventivas
Usar mucha fuerza al momento de realizar el extendido sanguíneo
No utilizar mucha fuerza
Practicar
Portaobjetos sucio o graso
Desengrasarlo o limpiarlo
Tener el material limpio y completo antes de utilizarlo
No correr el extendido sanguíneo derecho
Hacerlo despacio
Practicar
El ángulo del portaobjetos incorrecto
Hacerlo a un ángulo de 45 grados
Antes de correr el extendido sanguíneo fijarse en el ángulo correcto
Al soplar sobre la capa metálica
No soplar con mucha fuerza porque se cae el colorante además de la saliva que cae sobre el extendido
Soplar suavemente
Tiempos de los colorantes
Fijarse en los tiempos de cada colorante
Traer cronómetro
DISCUSIÓN De a cuerdo a los resultados de las figuras 1, 2, 3, se puede observar que en la figura 1 a pH de 6.8 no se observa una buena coloración o la coloración esperada al encontrar la célula de referencia que es el monocito, ya que su citoplasma como su núcleo son de color grisáceo ocasionando una difícil identificación por lo tanto a este pH es el incorrecto para la tinción de Wright, en la figura 3 a pH de 6.4 también se observa que el citoplasma y el núcleo del monocito tienen coloración grisácea aunque los eritrocitos tienen el color esperado rosado, pero aun así es una mala tinción ya que no se logra ver bien la célula de referencia y en cuanto a la figura 2 con pH de 7.4 se observan mejor las células sanguíneas se logra diferenciar el núcleo del citoplasma con sus característicos colores, en la literatura menciona que el pH ideal es de 6.4 el cual difiere de nuestros resultados ya que a ese pH no se logra observar bien a nuestra célula de referencia, el posible error que esté pasando es que el analista se haya equivocado al momento de utilizar el buffer de fosfatos incorrecto o simplemente etiqueto mal, se tendría que repetir esa tinción o las 3 para corroborar este resultado, también se tiene que evaluar la calidad del reactivo, si no está precipitado o esta caduco. La importancia de realizar una buena tinción es que podemos confundirlas con patologías de diferente índole y por lo tanto un diagnostico incorrecto con un tratamiento innecesario para un paciente por eso es muy importante saber realizar estas técnicas así como sus fundamentos en este caso para la tinción de Wright Los resultados indicados son orientativos ya que la intensidad y la tonalidad del color varían con el pH usado en la tinción.
En general la coloración con el reactivo de Wright da lugar a coloraciones más rojizas al disminuir el pH del buffer de fosfatos utilizada.
CONCLUSIÓN
Se Conoció la importancia y efecto que tiene sobre las células un buffer de fosfatos a diferentes pH
El mejor pH al cual se observaron mejor las células fue 7.4. difiriendo de la literatura.
Se tienen que repetir los extendidos para corroborar el pH ideal
Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel importante en la decisión de una patología.
REFERENCIAS
Artículo de revisión Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología Luis Esaú López-Jácome,* Melissa Hernández-Durán,* Claudia Adriana Colín-Castro,* Silvestre Ortega-Peña,* Guillermo Cerón-González,* Rafael Franco-Cendejas disponible en línea en [http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf] (fecha de consulta: 19/nov/2017)
https://www.thinglink.com/scene/724250009217794050 19/nov/2017)
Calvo GA, Esteban RFJ, Montuenga FL. Técnicas en histología y biología celular. 2nd ed. Madrid Spain: Elsevier; 2009
Koneman E. Diagnóstico microbiológico. 6a ed. México DF: Editorial Médica Panamericana S.A.; 2006.
http://www.cromakit.es/pdfs/inserts/997939.pdf (fecha de consulta: 19/nov/2017)
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