UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO Facultad de Ingeniería Ambiental y de Recursos Naturales
MICROBIOLOGIA GENERAL
Grupo Horario 02A Semana 9: CINETICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
1. Sarmiento Gonzales Giannina 2. Vasquez Huaman Rubí Dayan 3. Gonzales Rojas Maryori 4. Salazar Aliaga Kevin
Profesor: Semestre Académico:
Blgo. Juan Jara Chumpitaz 2012-B
101315H 100237C 093211H 101308A
CINETICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
1. INTRODUCCIÓN AL CRECIMIENTO BACTERIANO Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que ocurre es un aumento de la población. En los microorganismos cenocíticos (en los que la duplicación del genoma no se acompaña de división celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamaño de la “colonia” cenocítica. El crecimiento
bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista:
A escala individual A escala poblacional
Los eventos de crecimiento en el ámbito individual individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de éste podemos abordar los siguientes temas:
inicio y transcurso de la replicación cromosómica y de plásmidos; segregación de cromosoma y plásmidos a las células hijas; síntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular; señales que coordinan la replicación genómica con la división celular.
El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye poblaciones incluye los siguientes tópicos:
cinética del crecimiento; factores que afectan al tiempo de generación (g); factores ambientales que limitan el crecimiento.
En el presente capítulo nos dedicaremos al estudio en el crecimiento de poblaciones (que es el más frecuentemente empleado al trabajar con microorganismos), con una visión de algunos métodos para obtener crecimientos balanceados. 2. CRECIMIENTO EN BACTERIAS A NIVEL DE POBLACIONES: En su mayoría las bacterias se reproducen mediante un mecanismo asexual en el cual la célula crece, duplica su material genético y luego se divide por la mitad; este proceso da origen a dos células cada una de las cuales repite el proceso. Este tipo de reproducción se denomina fisión binaria. (Vera García) El crecimiento bacteriano sigue tres fases. Cuando una población bacteriana se encuentra en un nuevo ambiente con elevada concentración de nutrientes que le permiten crecer necesita un
período de adaptación a dicho ambiente. Esta primera fase se denomina fase de adaptación o fase lag y conlleva un lento crecimiento, donde las células se preparan para comenzar un rápido crecimiento, y una elevada tasa de biosíntesis de las proteínas necesarias para ello, como ribosomas, proteínas de membrana, etc. La segunda fase de crecimiento se denomina fase exponencial, ya que se caracteriza por el crecimiento exponencial de las células. La velocidad de crecimiento durante esta fase se conoce como la tasa de crecimiento k y el tiempo que tarda cada célula en dividirse como el tiempo de generación g. Durante esta fase, los nutrientes son metabolizados a la máxima velocidad posible, hasta que dichos nutrientes se agoten, dando paso a la siguiente fase. La última fase de crecimiento se denomina fase estacionaria y se produce como consecuencia del agotamiento de los nutrientes en el medio. En esta fase las células reducen drásticamente su actividad metabólica y comienzan a utilizar como fuente energética aquellas proteínas celulares no esenciales. La fase estacionaria es un período de transición desde el rápido crecimiento a un estado de respuesta a estrés, en el cual se activa la expresión de genes involucrados en la reparación del ADN, en el metabolismo antioxidante y en el transporte de nutrientes.
Basado en el concepto que una célula se divide dando dos células hijas, y éstas a su vez se vuelven a dividir dando dos células cada una de ellas, se presenta en el siguiente cuadro la proliferación de una población de células a partir de una sola, con un tiempo de generación de 30 minutos.
Al graficar en un sistema de coordenadas el tiempo (abscisas) y el número de células (ordenadas) se obtiene una gráfica como la que se muestra en el siguiente esquema:
3. MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE UNA POBLACIÓN El crecimiento de una población microbiana se puede medir estimando el incremento de masa celular o el aumento del número de células. En ambos casos se pueden emplear métodos directos o métodos indirectos. Los más utilizados son los siguientes:
3.1. Métodos de medida de la MASA CELULAR 3.1.1
Determinación del peso seco (directo)
Las células de un cultivo se recogen por centrifugación de un volumen determinado, se lavan, se secan y se pesan. Se admite que 1 mg contiene entre 5 y 10 células Método laborioso y poco sensible pero es válido para hongos. 3.1.2
Determinación del peso húmedo (directo)
Pasos a seguir:
Se tara un tubo centrífuga Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante Se determina el peso del sedimento
3.1.3. Determinación de un componente característico (directo) Se debe encontrar componentes como el peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc. 3.1.4. Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo (indirectos) Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos. 3.1.5. Métodos Turbidimétricos (indirectos)
Se basan en la capacidad de las células para dispersar la luz que incide sobre ellas. Dado que el tamaño de las células en cultivo puro permanece casi constante, el grado de dispersión es directamente proporcional a la biomada presente. Se mide en términos de TURBIDEZ, disminución de la luz transmitida a través del tubo, lo que equivale a mayor cantidad de luz absorvida. Al aumentar la masa microbiana, aumenta la turbidez y aumenta la absorvancia Ambos parámetros se miden con un espectofotómetro que mide unidades de densidad óptica También se puede medir la turbidez por comparación con escalas prefabricadas.
3.2. Métodos directos de medida del número de células 3.2.1. Recuento en cámara de Petroff-Hausser Las cámaras de recuento son portas excavados modificados sobre cuya superficie esta marcada una rejilla con pequeños cuadros de área conocida. Se utilizan para contar el número de células por unidad de volumen de suspenciones bacterianas. Para trabajar se cubre la cámara con un portaobjetos y por capilaridad se introduce la muestra. La de Petroff-Hausser se utiliza para contar bacterias. La excavación mide 0.02 mm de profundidad y está dividida en 25 cuadros grandes, subdivididos a su vez en 16 pequeños (hay 400 celdillas en 1mm2)
3.2.2. Recuento en placa. Diluciones seriadas Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original. (Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la práctica correspondiente, que se suele realizar en la 3ª tanda). 3.2.3. Recuento sobre filtros de membrana Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.
CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO) Una población de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, n o de células, ADN, ARN, proteínas, etc., es un valor constante y similar en cada caso : M/M = N/N = [ADN]/[ADN] = [proteínas]/[proteínas] = ... = K
Así pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logarítmico, el cultivo se comporta como una reacción autocatalítica de primer orden: Velocidad de aumento del componente = K·{cantidad del componente} También se puede decir que el n o de células, la masa celular u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado. Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que
todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera:
aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento ( ), que es característico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.
EXPRESIÓN MATEMÁTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO
Para deducirla vamos a aprovechar la definición empírica anterior, atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del número de individuos. a) En función del aumento de masa celular:
, y por lo tanto, dM = M· ·dt Si integramos, resulta: M/M0 = e (t-t0) Aplicando logaritmos neperianos:
De aquí se puede deducir que el coeficiente es
b) En función del aumento del número de células. Supongamos que partimos de una célula. Tras una división (generación celular), tendremos 2, tras dos divisiones tendremos 4, luego 8, etc: tenemos una serie geométrica. 1, 2, 22, 23, 24, ... 2n (donde n es el número de generaciones transcurridas). Si en vez de partir de una célula partimos de N 0 células iniciales, tenemos: N = N0·2n ; por lo tanto: N/N0 = 2n Por otro lado, el número de generaciones se puede calcular fácilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generación ( g):
Sustituyendo esta expresión en la fórmula {12.3} tenemos: N/N0 = 2(t-t0)/g Apliquemos logaritmos neperianos:
Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones matemáticas {12.1} y {12.4} que hemos deducido (la de la sección A, basada en masa, y la de la sección B, basada en número de individuos) son equivalentes: , y por lo tanto:
(t-t0) = (t-t0)/g·ln2, de donde se deduce el valor del coeficiente de crecimiento
exponencial: , expresado en h-1 Esta es la expresión matemática del coeficiente del crecimiento balanceado, en función del tiempo medio de generación (g). En un medio ideal, sin limitación de nutrientes, este coeficiente es = máx, o sea, el máximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un crecimiento balanceado no restringido. En un medio donde exista algún nutriente limitante (o sea, cuya concentración está por debajo del límite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al máximo, según la fórmula empírica siguiente (ecuación de Monod):
Donde [S] es la concentración del nutriente limitante; K S es la constante de saturación, equivalente a la concentración de nutriente para la que el coeficiente es semimáximo. Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por ) es una función hiperbólica de la concentración del sustratro (nutriente) limitante (ver gráfico). Este sustrato puede ser una fuente de C y/o de energía, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc. Ejemplos de KS:
la KS para la glucosa en E. coli es 1·10-6M
la KS para el triptófano en esta bacteria es 2·10--7 M
Estos bajos valores se deben a la alta afinidad de las permeasas de membrana hacia los sustratos, lo cual es una adaptación evolutivamente adquirida de las bacterias a los medios muy diluidos en nutrientes en los que normalmente viven. (Por el contrario, los medios de laboratorio donde se suelen cultivar las bacterias suelen ser más concentrados).
CRECIMIENTO DIAUXICO El crecimiento diaúxico es un tipo crecimiento microbiano bifásico que tiene lugar cuando hay presentes dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados como fuente de carbono. En este tipo de crecimiento microbiano se observa una curva de crecimiento bifásica debido a la utilización secuencial de distintas fuentes de carbono. El metabolismo del organismo es selectivo para uno de los sustratos (se usa la fuente de carbono que permite un crecimiento más rápido) y cuando la agota, comienza a metabolizar el otro. Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio líquido provisto de dos fuentes de carbono (p. ej., glucosa y lactosa), de las cuales una (en este ejemplo, la glucosa) es usada preferencialmente. Si representamos la cinética del crecimiento poblacional según hemos aprendido en el apartado anterior, obtenemos una curva como la de la figura siguiente: Obsérvese que se dan dos fases de crecimiento exponencial separadas por una breve fase intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos fases exponenciales se conoce con el nombre de crecimiento diáuxico. 1. Bases del crecimiento diáuxico: La bacteria usa en primer lugar sólo la fuente preferencial de C (en este caso, la glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos heterotrofos), sin "tocar" la otra fuente. Una vez que agota la primera fuente, se dispone a usar la segunda (ej.: lactosa), pero tarda un tiempo hasta que sintetiza los enzimas catabólicos necesarios para degradar esa segunda fuente. Cuando las bacterias han logrado niveles de esos enzimas adecuados, se restablece el crecimiento exponencial, aunque, como se puede constatar en el gráfico, con una pendiente menor (lo que significa que esta fuente alternativa permite una tasa m menor que la preferencial).
CULTIVOS CONTINUOS. SISTEMAS ABIERTOS Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que se compone de:
una cámara de cultivo de volumen constante, a la que llega un suministro de nutrientes, y de la que se eliminan o separan los productos tóxicos de desecho (por un dispositivo de rebosadero).
Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema está en estado estacionario, con las células creciendo exponencialmente. Los parámetros a tener en cuenta son:
flujo (f), medido en ml/h volumen de la cámara de cultivo (v, en ml) densidad celular en la cámara (x) factor de dilución D = f/v (en h--1). El inverso de este factor de dilución es el tiempo medio de residencia (1/D= TMR)
Existe una pérdida de células por el rebosadero: -dx/dt = x·D El crecimiento bruto es dx/dt = x·m Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = x·m - x·D = x·(m - D) Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m ) se haga igual al factor de dilución (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentración de células se hace constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinámico de equilibrio. Las pérdidas de células por drenaje se compensan con las ganancias por crecimiento. Existen dos tipos de procedimientos para obtener cultivos continuos: 1.1.Turbidostato Permite cultivos continuos con un coeficiente m cercano al m máx, trabajando a valores altos de D. Ello lo logra ajustando los valores de densidad celular de modo que ningún factor nutricional se haga limitante. Se dice que es un sistema de control interno porque es la misma concentración de bacterias la que regula el flujo de entrada y de salida (por medio de un mecanismo electrónico basado en la medición y control de la densidad óptica del cultivo).
Inconvenientes:
es difícil de manejar y ajustar;
si las bacterias tienen tendencia a adherirse a superficies (paredes internas del aparato), los resultados de medida de la D.O. quedan falseados (infravalorados).
Aplicaciones Se emplea bastante en el estudio de los factores que incrementan o disminuyen la tasa de crecimiento. 1.2.Quimiostato Para introducirnos al funcionamiento del quimiostato, partamos de la observación de lo que pasaría en el turbidostato si desconectamos el fotómetro y ajustamos la bomba 1 para que vierta medio fresco al cultivo a una tasa (flujo) menor que el que mantiene la m cercana a la m máx: Las bacterias tenderían a crecer a mayor velocidad que su dilución debida a adición de medio fresco; por lo tanto, en un principio aumentaría la concentración de bacterias. Pero este incremento no podría continuar indefinidamente. Pero el crecimiento tampoco se detendría. De hecho, tras un cierto tiempo, el cultivo alcanzaría un nuevo estado estacionario de equilibrio, en el que la tasa de crecimiento se hace proporcional a la tasa de adición de medio fresco. En este caso, el cultivo crece exponencialmente, pero a tasas m
Ventajas del quimiostato en comparación con el turbidostato:
En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de tasas de crecimiento exponencial, mientras que, como vimos, en el turbidostato se cultivan en un rango estrecho de valores de m cercanos al m máx. El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que existe un nutriente o sustrato presente en una concentración suficientemente baja como para limitar la densidad de población. SR es la concentración de nutriente en el reservorio, y determina el valor de S, que es la concentración de nutriente limitante en el recipiente de cultivo. La tasa de adición de ese sustrato determina la tasa de crecimiento.
Así pues, el quimiostato también permite elegir la densidad de células a la que se quiere trabajar. -
Expresión matemática del quimiostato:
x = concentración celular en equilibrio Y = constante de rendimiento en el medio empleado (masa de microorganismo formada/masa de sustrato consumida) SR= concentración del sustrato limitante en el reservorio D = factor de dilución KS= constante de saturación respecto del sustrato limitante La fórmula nos dice que sabiendo Y, KS y m máx se puede fijar la densidad celular (x) simplemente ajustando dos parámetros del aparato: SR (concentración del sustrato o nutriente limitante en el reservorio) D (coeficiente de dilución, regulable por el flujo) Por otro lado, se puede demostrar también que la concentración de sustrato limitante en equilibrio en la cámara de cultivo es: S= KS·D/(m máx- D) Esta fórmula nos dice que el efecto principal de cambiar el flujo (D) es alterar la concentración S de sustrato limitante en el cultivo, lo que a su vez afecta a la tasa específica de crecimiento (m ). Véase la gráfica compleja en el esquema, bajo el dibujo del quimiostato. Algunos comentarios (atiéndase la explicación del profesor): La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilución (D). Este margen es el más adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el valor de tiempo de generación (g) varía ampliamente. O sea, el quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular. En cambio, a altas tasas de dilución la concentración microbiana cambia rápidamente, y en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (DC: dilución crítica). A muy bajas diluciones (DM) el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la fuente de energía. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energía sólo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para el crecimiento. A este valor lo llamamos energía de mantenimiento. Los procesos relacionados con esta energía de mantenimiento son el potencial de membrana, el transporte de solutos y la renovación de proteínas.
-
Aplicaciones del cultivo continuo en quimiostato:
Aportan una fuente continua de células en fase exponencial, lo que se aplica a procesos industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas, de antibióticos, de aminoácidos, etc). En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite estudiar:
aspectos fisiológicos (por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante);
selección de mutantes
CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS Y SU EXPRESION MATEMATICA Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos, pero supóngase por ahora que éste no es el caso y que la primera alternativa es la válida. Luego hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno estequiométrico, por el cual la concentración final de microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del medio de cultivo, y el otro cinético, el que dirá con qué velocidad se lleva a cabo el proceso.
Importancia: Es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos porque es necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir consumiéndose el substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una fermentación. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qué va a pasar, cuándo va a completarse el crecimiento, cómo se va a acumular el producto, etc. En los sistemas cerrados (que pueden ser líquidos o sólidos), no existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de sustancias de desecho. En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos
1. CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO SOLIDO: En los sistemas cerrados (que pueden ser líquidos o sólidos), no existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de sustancias de desecho. En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos. La cinética del crecimiento de microorganismos que crecen aislados. Es la forma de crecimiento de la levadura (hongo unicelular) y de las bacterias.
Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo Tienen las siguientes propiedades:
CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LÍQUIDO CURVA DE CRECIMIENTO (BATCH)
Como se puede constatar en el anterior gráfico, el crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:
1.1. Fase de retardo (fase “lag”) Es el período de tiempo durante el que el inóculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un período de ajuste metabólico. Su duración depende de varios factores:
Tamaño del inóculo; Bondad del inóculo (estado metabólico previo del inóculo): si el inóculo procede de células en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros constituyentes de las células son bajos, y las células deben reponerlos en el medio fresco. Si las células están dañadas por algún agente, el lag también es largo, ya que necesitan un tiempo para la reparación de los daños. Si las células del inóculo se tomaron de un cultivo previo en fase logarítmica, el lag es más corto. Medio del que procede el inóculo: Si el medio es similar al medio fresco, el lag es más corto; Si el medio del inóculo era un medio rico y el medio fresco es más pobre, la fase de retardo se hace más larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la síntesis de las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas en el medio rico.
Pero aun cuando la inoculación se hace desde un cultivo previo en fase logarítmica, cuyo medio sea idéntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. ¿Por qué?:
Necesidad de neutralizar sustancias tóxicas en el medio fresco; Porque se produce dilución de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las bacterias en el medio nuevo; por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcanzar una concentración de esos metabolitos adecuada para el cre cimiento, éste no “arranca”.
Ejemplo: Supongamos que inoculamos una bacteria heterotrófica en un medio ligeramente ácido, sometido a aireación: en un principio, se produce dilución de CO2, por lo que se retardan reacciones de carboxilación que requieren este CO2, y se produce un retardo. 1.1.1
Fase de transición, de crecimiento acelerado, que conduce a …
1.2.Fase de crecimiento exponencial (= fase logarítmica).
La fase 2 se debe a que cada célula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus compañeras. Ello demuestra que las células del inóculo no están todas en las mismas condiciones fisiológicas. Durante la fase logarítmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generación (g) es característico para cada especie o cepa, en cada medio concreto: El valor del tiempo de generación (g) depende de:
Composición del medio Temperatura pH Osmolaridad (tonicidad), etc.
División binaria de células procariotas. 1 El cromosoma circular está unido a un punto de la membrana plasmática 2 El cromosoma se duplica. Las dos copias están fijas a la membrana en puntos cercanos 3 La célula se alarga, se agrega nueva membrana plasmática entre los puntos de unión 4 La membrana plasmática crece hacia el interior 5 La célula original se ha dividido en dos células hijas. La imagen corresponde al corte transversal de una célula procariota durante la fisión binaria en una etapa similar a la fase 4 descripta.
Los microorganismos heterotrofos suelen crecer más rápidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintéticos, y dentro de estos últimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. Algunos microoorganismos tienen, a su temperatura óptima tiempos de generación
muy cortos (15, 20 min), mientras que otros tienen crecen más lentamente, con tiempos de generación que pueden ser de varias horas o incluso días.
1.2.1. Fase de aceleración negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a… 1.3.Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo (m = 0), pero aún existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares. En este período se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular. Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transición (de aceleración negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a aminoácidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono). En la fase estacionaria aún existen reacciones metabólicas, pero el metabolismo general es diferente al de la fase logarítmica:
Las células son más pequeñas, debido a que existe división celular después de que se haya detenido el incremento de masa. Suelen ser más resistentes a agentes físicos y químicos; Existe reciclado de ciertos materiales intracelulares; aja el contenido en ARN.
1.3.1. Fase de transición hacia … 1.4.Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energía. Algunas veces las células aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas “fantasmas”, “ghost”). La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por
ejemplo, en bacterias entéricas es suave, mientras que en Bacillus es más acentuada). Te recuerdo que puedes hacer un experimento "virtual" con la curva de crecimiento de una bacteria. Que disfrutes.
2.
CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SÓLIDOS
Un medio sólido es una solución nutritiva (como el líquido), pero incorporado a un gel, que le da consistencia.
Los tipos de gelificantes usados para los medios sólidos (más explicaciones en la 2ª tanda de prácticas):
agar-agar (o simplemente, agar): es el más comúnmente empleado Gelatina (inconveniente de que se licúa a temperaturas relativamente bajas, y además, algunos microorganismos lo degradan por gelatinasas). Silicagel (o gel de sílice): tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para quimioautotrofos.
Los medios sólidos se suelen inocular mediante asa de siembra o espátula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados, como las placas de Petri (ver prácticas). Tras la incubación a la temperatura y condiciones pertinentes, cada bacteria o agrupación bacteriana que ha quedado en un punto determinado del medio da origen, por crecimiento, a una acumulación de células, visible a simple vista, denominada colonia. La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 células para una colonia de unos 5 mm). Esto se debe a que en el medio sólido, a diferencia del líquido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio sólido permite un aporte continuo de nutrientes (por difusión desde el entorno de la colonia, hacia ella), y eliminación continua de productos de desecho (por difusión desde la colonia hacia fuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de células. Como el alumno comprobará en prácticas (2ª tanda), cada especie bacteriana suele originar colonias de un tipo determinado, en cada medio concreto. Con vistas a la determinación taxonómica, se suele tomar nota de una serie de características de las colonias (caracteres culturales):
Tamaño (relativo) Forma general Forma de los bordes de la colonia Aspecto de la superficie y elevación sobre el sustrato Color Consistencia, etc.
3.
EXPRESIÓN MATEMÁTICA DE LA CINÉTICA DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS:
N=X
CRECIMIENTO LOGARÍTMICO EN CULTIVOS POR LOTES: En cultivos por lotes, tal y como se ha descrito con anterioridad, existe una fase de crecimiento, llamada fase de crecimiento logarítmico. La velocidad de crecimiento para esta fase es directamente proporcional a la concentración de las células y está dada por la siguiente relación:
Si quitamos el signo de proporcionalidad
= ……(1)
= Velocidad o tasa de crecimiento bacteriano en la fase de crecimiento logarítmico =Velocidad especifica de crecimiento
X= concentración de microorganismos
CRECIMIENTO CON SUSTRATO LIMITADO: Si el sistema tiene un limitante y este es el sustrato, una vez que éste empiece a escasear el cultivo de microorganismos termina de crecer, por lo que su crecimiento tiene un límite. En un cultivo continuo su crecimiento también es limitado, y el comportamiento del cultivo de microorganismos, sigue experimentalmente la siguiente relación propuesta por Monod.
=Velocidad especifica de crecimiento =máxima velocidad de crecimiento
…………….. (2)
=Constante promedio de velocidad. Concentracion de sustrato a la mitad
del
máximo de velocidad de crecimiento. Masa/unidad de volumen =concentración del sustrato. Masa/unidad de volumen Sustituyendo (1) en (2)
Graficando en el plano:
Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular, etc. después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos µ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento µ a partir de medidas experimentales del incremento en el número de células, biomasa, etc. Basado en el concepto que una célula se divide dando dos células hijas, y éstas a su vez se vuelven a dividir dando dos células cada una de ellas, se presenta en el siguiente cuadro la proliferación de una población de células a partir de una sola, con un tiempo de generación de 30 minutos.
Al graficar en un sistema de coordenadas el tiempo (abscisas) y el número de células (ordenadas) se obtiene una gráfica como la que se muestra en el siguiente esquema:
Los tiempos de duplicación varían según el microrganismo del que se trate. Por ejemplo: Eschericha coli 0,35 hs Rhizobium meliloti 1,8 hs Nitrobacter sp aproximadamente 20 hs
Rendimiento de la utilización del substrato El rendimiento de utilización de diferentes substratos puede ser diferente (hay substratos, o alimentos, que "engordan" más que otros), varía entre diferentes microorganismos (en un símil antropomórfico: hay personas que engordan más que otras comiendo lo mismo) y varía también en función de otras condiciones ambientales o fisiológicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si está sano o enfermo o si está en verano o en invierno). También varía el rendimiento en función de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo.
Podemos calcular el rendimiento de la utilización del substrato en función de la cantidad de substrato añadido al cultivo, o en función de la cantidad de carbono presente en ese substrato (por ejemplo). Asimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total 8gramos de células, por ejemplo) o de carbono presente en las células (aproximadamente el 505 de la masa celular corresponde a carbono).
Haciendo las transformaciones que se indican a la derecha sobre la fórmula que relaciona la variación de biomasa con la de substrato, llegamos a la definición de un nuevo concepto qs denominado tasa específica de consumo de substrato por el organismo .
La tasa específica de consumo de substrato la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el substrato. Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor será la velocidad de crecimiento (µ). Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, también mayor será la tasa de crecimiento. Sin embargo, hay una cierta compensación entre la tasa de consumo del substrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de substrato tienen rendimiento más bajo (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento disminuye). A esta correlación inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur .
Relación entre la tasa de crecimiento (µ) y la concentración de substrato (S) En condiciones de substrato abundante, la concentración de este no afecta al valor de µ; pero cuando el substrato se hace limitante, sí existe ese efecto. La expresión matemática que relaciona ambos parámetros se conoce con el nombre de ecuación de Monod y es la siguiente:
En esta ecuación la tasa de crecimiento (µ) depende de la máxima que puede alcanzar el microorganismo, de la concentración de substrato y de un valor Ks que representa la concentración de substrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la máxima.
La ecuación de Monod tendrá mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuación el rendimiento debe ser independiente de la concentración de substrato.
