Escuela Académica Profesional De Ingeniería Agroindustrial
TEMA Asignatura
: Biotecnología
Docente
: ing.
Estudiantes :
Yaneth Gonzales Elguera
Mayumi Patiño Condori
Miguel Monzon Roque
Dina Aybar Damian
Maribel Pampañaupa Alvites
Abancay-Apurímac 2015
092069 102084 102081 081218 092085
CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO I. INTRODUCCION El objetivo de la microbiología predictiva en sistemas de alimentos consiste en describir matemáticamente el crecimiento, sobrevivencia o muerte de microorganismos bajo condiciones ambientales específicas. El comportamiento microbiano se ve afectado por diversos factores intrínsecos y extrínsecos. Sin embargo, generalmente los más importantes y los que controlan o definen el crecimiento o sobrevivencia son: temperatura, pH, y actividad de agua. La evaluación de la respuesta microbiana bajo la combinación de esos factores permite la descripción, modelado y predicción de diferentes situaciones. Las expresiones matemáticas permiten predecir la respuesta microbiana ante condiciones no evaluadas dentro del intervalo de los niveles de los factores o variables estudiadas. Los modelos microbianos son una herramienta de vital importancia ya que proveen de manera rápida, información necesaria para la toma de decisiones, análisis de riesgos, aseguramiento de la calidad, desarrollo de productos y procesos, análisis de datos, planeación de ensayos de laboratorio, entre otros (la importancia de estos puntos se explica con detalle en la revisión bibliográfica). El modelado microbiano tiene sus inicios hacia 1920 con el estudio cinético de los tratamientos térmicos. Con la llegada de los computadores el interés por los modelos microbianos creció ya que se facilitó el manejo de los modelos multifactoriales. La respuesta microbiana puede predecirse con base en la respuesta que se obtiene a un solo factor presente. Actualmente los modelos predictivos se han venido desarrollando con mayor intensidad para microorganismos patógenos (especialmente bacterias causantes de infecciones e intoxicaciones de origen alimentario). Con este proyecto se pretende ampliar algo más el conocimiento que se tiene de los modelos microbianos respecto a la flora deteriorativa, y predecir el comportamiento de la levadura en productos alimenticios como jugos, mermeladas, compotas y demás productos azucarados. II. OBJETIVOS Obtener la ecuación cinética del crecimiento del microorganismo (levadura), en las diferentes concentraciones con respecto al tiempo. III. REVISION BIBLIOGRAFICA 3.1. CRECIMIENTO MICROBIANO El crecimiento microbiano hace referencia al aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo y no al aumento de tamaño de un microorganismo. El aumento del número de microorganismos permite la formación de colonias o de poblaciones. Es por eso que en microbiología el crecimiento se estudia por poblaciones y no en microorganismos individuales. Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria. El resultado de la fisión binaria son dos células hijas por cada célula madre, así, una célula se divide en dos, dos en cuatro y cuatro en ocho y así sucesivamente. Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el
medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos, pero supóngase por ahora que éste no es el caso y que la primera alternativa es la válida. Luego hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno estequiométrico, por el cual la concentración final de microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del medio de cultivo, y el otro cinético, el que dirá con qué velocidad se lleva a cabo el proceso. (Prescott y col .,1999). La microbiología predictiva está relacionada con la compleja dinámica del comportamiento de la población microbiana , tal como fue observado por monod (1949), “ el crecimiento de los cultivos bacterianos a pesar de la inmensa complejidad del fenómeno ,generalmente obedece a leyes relativamente sencillas, las cuales hacen posible definir ciertas características cuantitativas del ciclo del crecimiento, esencialmente las tres constantes del crecimiento: crecimiento total ,tasa del crecimiento exponencial y crecimiento latente. Estas definiciones no son puramente arbitrarias y corresponden a elementos fisiológicos distintos del ciclo de crecimiento” (McMeekin y ros, 2002). 3.2. CURVA DE CRECIMIENTO La curva de crecimiento de un cultivo microbiano puede ser subdividida en cuatro partes distintas denominadas fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. De las cuatro fases de la curva de crecimiento, habitualmente la fase de crecimiento exponencial o logarítmico es la que presenta mayor interés por ser la fase en la que el incremento del número de microorganismos es máximo. Durante esta fase el tiempo de generación (g) de los microorganismos (el tiempo que la población de microorganismo necesita para duplicar su número) se mantiene constante. Grafico 1: curva de crecimiento microbiano
3.2.1. Fase de latencia
La fase de latencia, es el periodo de ajuste que las células experimentan al ser transferidas de un medio al otro antes de iniciar su crecimiento. En esta fase se producen las enzimas necesarias para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente. En esta fase no hay incremento en el número de células, pero hay gran actividad metabólica, aumento en el tamaño individual de las células, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las células. (Penfold ,1914). 3.2.2. Fase exponencial o fase logarítmica la fase exponencial o logarítmica es aquella durante la cual los microorganismos crecen y se dividen hasta el nivel máximo posible, en función de su potencial genético ,tipo de medio y condiciones en que crece .en este periodo hay una relación lineal entre el logaritmo del número de células (o cualquier otra propiedad medible de la población) y el tiempo .los microorganismos se dividen y duplican en número en intervalos regulares .como cada célula se divide en un momento ligeramente diferente del resto, la curva de crecimiento aumenta suavemente, en lugar de realizar discretos saltos. (Robinson y col .,1998) 3.2.3. Fase estacionaria La fase estacionaria es resultado del agotamiento de los nutrientes disponibles o del efecto de acumulación de productos tóxicos de metabolismo que tienen como consecuencia la disminución de la velocidad del crecimiento .la transición entre la fase exponencial y la fase estacionaria se caracteriza por un crecimiento desequilibrado, durante el cual los diversos componentes celulares son sintetizados a diferentes velocidades (Buchanan y Solberg ., 1972). 3.2.4. Fase de muerte La fase de muerte es consecuencia de diversos factores: uno importante es el agotamiento de las reservas celulares de energía. Al igual que el crecimiento, la muerte también asume una fusión exponencial que puede ser representada por una disminución lineal del número de las células viables a loa largo del tiempo (Madigan y col ., 1999).
3.3. CINÉTICA DE LA DEGRADACIÓN BIOLÓGICA Grafico 2: cinética de la degradación biológica
La velocidad de acumulación de biomasa es
𝒅𝒙 𝒅𝒕
= 𝝁𝒙
X= (biomasa) μ =velocidad específica de crecimiento (generaciones t-1)
3.4. CINÉTICA DE MONOD (1942) 𝝁 = 𝝁𝒎𝒂𝒙
𝒔 𝒌𝒔 + 𝒔
𝒅𝒙 = 𝝁𝒙 𝒅𝒕
𝒅𝒙 𝒔𝒙 = 𝝁𝒎𝒂𝒙 𝒅𝒕 𝒌𝒔 + 𝒔
μ = velocidad específica de crecimiento (generaciones t-1) μmax = velocidad máxima de crecimiento (generaciones t-1) S = concentración de sustrato Ks = constante de velocidad media (velocidad esp. de crecimiento) Constante de Monod Posee limitaciones
1) A muy bajas concentraciones de sustratos no va bien (conc. mín. de sust que no contempla) 2) A muy altas concentraciones de sustratos Ks real es cte.
Y= coeficiente de rendimiento 𝒅𝒙 𝒅𝒕
𝒔𝒙
= 𝝁𝒎𝒂𝒙 𝒌𝒔+𝒔
𝒚=
𝒂𝒖𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒃𝒊𝒐𝒎𝒂𝒔𝒂 𝒅𝒙/𝒅𝒕 𝒅𝒙 = = 𝒅𝒆𝒔𝒄𝒆𝒏𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒏𝒄 𝒅𝒆 𝒔𝒖𝒔𝒕𝒓𝒂𝒕𝒐 𝒅𝒔/𝒅𝒕 𝒅𝒔 𝒅𝒔 ( 𝝁𝒎𝒂𝒙 ) 𝒔𝒙 𝒔𝒙 = = = 𝒌 𝒅𝒕 𝒚 𝒌𝒔 + 𝒔 𝒌𝒔 + 𝒔
Realmente la ecuación es 𝒅𝒙 𝒅𝒚
𝒔𝒙
= 𝒚𝒌 𝒌𝒔+𝒔 − 𝒃𝒙
;
𝟏 𝝁
=
𝒌𝒔 𝝁𝒎𝒂𝒙
∗
𝟏 𝒔
+
𝟏 𝝁𝒎𝒂𝒙
b=cte. de declive endógeno (t-1) 3.5. ADAPTABILIDAD Y VARIABILIDAD DE RESPUESTAS MICROBIANAS. IMPLICACIONES SOBRE LA MICROBIOLOGÍA Y LA BIOTECNOLOGÍA PREDICTIVA El proceso de adaptación de los microorganismos a las condiciones del medio en que se encuentran depende de varios factores como es el caso de la composición del medio mismo o del estado fisiológico de manera distinta en la predicción de la cinética de los microorganismos. Dichas respuestas de los microorganismos a las condiciones de crecimiento pueden ser evidenciadas a través de sus parámetros de crecimiento como son el tiempo de latencia, tiempo de generación y la velocidad de crecimiento. 3.5.1. Tiempo de latencia Un fenómeno inherente a la cinética micro0biena es latencia, la cual es típicamente observada como la respuesta retarda de la población microbiana anta (repentino) cambio en el ambiente. La fase de latencia puede producir en ambos procesos, de crecimiento y de inactivación (Swinnen y col ., 2004). En el caso de las condiciones de crecimiento, la fases de latencia es el periodo de ajuste durante el cual las células bacterianas se modifican por si mismas con el objetivo de sacar ventaja del nuevo ambiente e iniciar el crecimiento exponencial (Buchanan y Klawitter ,1991).por tanto, durante la fase de latencia
las células se adaptan a su nuevo entorno induciendo o reprimiendo la síntesis y actividad de determinadas enzimas, iniciando la replicación de su material genético, y en el caso de las esporas , diferenciándose en células vegetativas(Montville , 2000). Dado que la típica curva de crecimiento es de tipo sigmoildal, la duración de la fase de latencia puede ser cuantificada como el tiempo obtenido por la extrapolación de la tangente en la parte exponencial de la curva de crecimiento, hacia el nivel del inoculo. Esta definición está actualmente más extendida (Swinnen y col. ,2004). La duración del tiempo de latencia suele ser estimado erróneamente, esto es usualmente atribuido al efecto de la historia previa de las células. Robinson y col .,(1998)formalizaron el concepto dependiente de dos elementos
de tiempo de latencia
La cantidad de trabajo necesario por parte de las células para adaptarse al nuevo ambiente y/o reparar los daños debidos ese cambio. La proporción en la que estas reparaciones pueden hacerse. Debido a la existencia de la multitud de factores anteriormente mencionados que afectan el comportamiento de la fase de latencia, es difícil obtener predicciones (Swinnen, 2004). 3.5.2. Tiempo de generación El tiempo de generación es el tiempo necesario para duplicar la población microbiana (Según Stanier y col., 1989) se define como el tiempo requerido para que todo los componentes del cultivo aumenten en un factor de 2. Durante este periodo de generación el número de células y la masa celular se duplica. El tiempo de generación varía entre los distintos microorganismos. Muchas bacterias tienen tiempos de generación de 1-3horas, conociéndose pocos microorganismos que crezcan muy rápidamente dividiéndose en menos de 10minutos.otras tienen tiempos de generación de varias horas o incluso días .el tiempo de generación es útil como indicador del estado fisiológico de una población celular, y es usado con frecuencia para comprobar el efecto negativo o positivo de un determinado tratamiento sobre un cultivo microbiano ( Madigan y col .,1997). Este tiempo de generación está directamente relacionado con la velocidad de crecimiento exponencial, que se define como la pendiente de la curva de crecimiento logarítmico en la fase de crecimiento exponencial. Generalmente, estos dos parámetros son estimados por el ajuste de los modelos primarios (Delignette-Muller,1998).
3.5.3. Velocidad de crecimiento Como ya se ha indicado anteriormente, el crecimiento se define como un incremento en el número de células microbianas en una población, lo cal también puede ser medido como un incremento en masa microbiana en este contexto, la velocidad de crecimiento se define como el cambio en número de células o masa celular por unidad de tiempo (Madigan y col .,1999). Un cultivo microbiano creciendo en equilibrio imita una reacción autocatalitica de primer orden, es decir, la velocidad del aumento de bacterias en un tiempo dado es proporcional al número o masa de bacterias presentes durante ese tiempo (Stanier y col.,1989). La tasa del crecimiento exponencial se ve influenciada por las condiciones ambientales (temperatura, composición del medio), así como por las características genéticas del microorganismo (Madigan y col .,1997).
3.6. INFLUENCIA DE LOS FACTORES FÍSICOS, QUÍMICOS AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
Y
Los alimentos son ecosistemas complejos .los ecosistemas están constituidos por el medio ambiente y los organismos que viven en él. El ambiente de un alimento está constituido por factores intrínsecos inherentes al alimento (el pH, la actividad de agua y los nutrientes) y factores extrensicos a él (la temperatura, la composición del aire o la presencia de otras bacterias) (Montville,2000). El crecimiento bacteriano está influido notablemente por la naturaleza química y física de su ambiente. El conocimiento de estas influencias ambientales permite controlar el crecimiento microbiano y estudiar la distribución ecológica de los microorganismos. (Prescott y col .,1999).Numerosos factores afectan el crecimiento de los microorganismos en los alimentos, y , a menudo ,sus interacciones tienen un efecto significativo sinérgico o antagónico sobre el crecimiento . Estos interactivos pueden ser muy importantes en los sistemas alimentarios, en los cuales el crecimiento bacteriano puede verse favorecido o inhibido por los múltiples ingredientes, condiciones de almacenamiento o constituyentes alimentarios (Eifert y col .,1996). 3.6.1. Temperatura El control de la temperatura se encuentra entre los factores más críticos precisos para el logro de un suministro alimentario que reúna las propiedades sanitarias y organolépticas correctas. Probablemente sea la temperatura el más importante de los factores ambientales que afectan a la viabilidad y el desarrollo microbiano (ICMSF,1983). El factor que más influye sobre el efecto de la temperatura en el crecimiento es la sensibilidad de las reacciones catalizadas por enzimas a
determinadas temperaturas .en condiciones de baja temperatura , un aumento eleva la velocidad de crecimiento , porque la velocidad de una reacción catalizada por enzimas , como de cualquier reacción química casi se duplicara por cada incremento de 10°c.como la velocidad de cada reacción aumenta ,el metabolismo en general es más activo a temperatura altas , y el microorganismo crece más rápidamente . a partir de cierto punto ,un mayor incremento de la temperatura disminuye la velocidad de crecimiento ocasionan daños a los microorganismos al desnaturalizar las enzimas, las proteínas transportadoras y otras proteínas (Prescott y col ., 1999; Montville ,2000). Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si consideramos la variación de la velocidad de crecimiento en función de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que la velocidad es máxima. Por encima de esta temperatura óptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular (Madigan y col .,1997).
3.6.2. Actividad de agua (aw) La actividad de agua (aw) de una solución es el 1% de su humedad relativa (cuando se expresa en %).equivale también a la relación entre la presión de vapor de solución (Psol) y la del agua pura (Pagua). La actividad de agua de una solución o un sólido puede establecerse aislando la muestra en un cámara y midiendo la humedad relativa después de que el sistema haya alcanzado el equilibrio (Prescott y col .,1999).
La actividad de agua esta inversamente relacionada con la presión osmótica. La mayoría de los microorganismos, incluyendo las bacterias patógenas, crecen más rápidamente a niveles de aw de 0.995-0.980.la aw de la mayoría de los medios de cultivo utilizados en el laboratorio es de 0.999-0.990. A valores de aw inferiores a estos, la velocidad de crecimiento y la población estacionaria o la masa celular final disminuye, y la fase de latencia. A una aw suficientemente baja, la cual es difícil de definir con precisión, la fase de latencia se hace infinita, es decir el crecimiento cesa (ICMSF, 1983). La gran mayoría de los microorganismos requiere valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. Los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes: bacterias aw>0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw>0.80.Como puede verse,
los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con actividad de agua menor (más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. En función de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halófilos y xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente (Prescott y col ., 1999). 3.6.3. PH El pH es una medida de la actividad de los iones de hidrogeno de una solución que se define como el logaritmo negativo de la concentración de iones de hidrogeno (expresado en moles). Es decir, cambio de una unidad de PH representa un cambio de 10 veces en la concentración de iones de hidrogeno .por eso, por ejemplo el vinagre (con un pH aproximado a 2) y el amoniaco doméstico (con un pH aproximado a 11) tienen una diferencia de concentración de iones de hidrogeno aproximada a un billón de veces (Madigan y col., 1997). Cada especie tiene un intervalo definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo para su crecimiento .Aunque los microorganismo crecen a menudo en medios en un amplio de intervalo pH, su tolerancia tiene un límite .variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la membrana plasmática o inhibiendo la actividad de las enzimas y proteínas transportadoras. Los cambios en el pH externo pueden modificarse también la ionización de las moléculas de nutrientes, disminuyendo, por ello, su disponibilidad para el organismo (Prescott y col.,1999). El pH interno en la mayoría de los microorganismos está en el rango de 6,0 a 8,0. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también, distintos. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalófilos que toleran pH=10.0. 3.6.4. Potencial redox Nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar. Electrones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno (O2). Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que se produzca el crecimiento (Prescott y col ., 1999).
En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo. Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entéricas, o como Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácticas) o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios) (Prescott y col ., 1999). 3.6.5. Nutrientes Los microorganismos requieren para su desarrollo los siguientes elementos: agua, fuentes de energía, fuente de nitrógeno, vitaminas y otros factores de crecimiento y minerales. Los hongos tienen las necesidades de agua más reducidas, seguidos de las levaduras, bacterias gram negativas y bacterias gram positivas. Los microorganismos pueden utilizar azúcares, alcoholes y aminoácidos como fuente de energía. Algunos de ellos son capaces de emplear la energía de carbohidratos complejos, como almidones y celulosa, ya que tienen la capacidad de degradar estos compuestos hasta azúcares sencillos. También las grasas son utilizadas como fuentes de energía, aunque sólo un número relativamente pequeño de los microorganismos de los alimentos son capaces de degradarlos. Los aminoácidos constituyen la fuente primaria de nitrógeno para los organismos heterotróficos. Un gran número de otros compuestos nitrogenados también pueden cumplir esta función con relación a las diversas clases de organismos. Por ejemplo, ciertos microorganismos son capaces de utilizar nucleótidos y aminoácidos libres, mientras que otros emplean péptidos y proteínas (McMeekin y Ross, 2002). En general, la mayoría de los microorganismos utilizan compuestos simples como los aminoácidos, antes de tener que desdoblar compuestos más complejos, como las proteínas de alto peso molecular. Ocurre lo mismo con los polisacáridos y grasas. 3.6.6. Nitrógeno, Azufre y Fósforo En la síntesis de su material celular los microorganismos utilizan el nitrógeno principalmente para formar el grupo amino de los aminoácidos constituyentes de las proteínas. En algunos casos de simbiosis el nitrógeno fijado por bacterias se comparte con ciertas plantas (generalmente leguminosas), lo cual permite aumentar la fertilidad del suelo. El azufre se utiliza generalmente para sintetizar aminoácidos y vitaminas como la timina y la biotina. El fósforo se utiliza en síntesis de ácidos nucleicos y de los fosfolípidos de las membranas celulares. 3.6.7. Oxígeno
Los microorganismos aerobios utilizan el oxígeno molecular con el cual producen más energía a partir de los nutrientes. Sin embargo existen microorganismos anaerobios facultativos que utilizan el oxígeno disponible, pero si no lo hay pueden crecer mediante procesos de fermentación o respiración anaeróbica. La bacteria Escherichia coli muchas levaduras son anaerobios facultativos. Existen además los anaerobios obligados para los cuales el oxígeno es perjudicial y por consiguiente no lo utilizan. En este caso los átomos de oxígeno de sus componentes celulares los obtiene normalmente del agua. Es comprensible entonces el uso del ión peróxido para el control bacteriano ya que en este caso es una forma tóxica de oxígeno. III.
MATERIALES, EQUIPOS
Cuadro1: materiales y equipos utilizados para la determinación de la cinética de crecimiento 4.1. MATERIALES
2 Matraz Erlenmeyer de 250ml ,100ml 12 Tubos de ensayo 3 Pipetas de 10ml Algodón Gasa Alcohol 96° Papel aluminio Papel graff Pabilo Tejera Mechero Agua destilada 1000ml Gradilla
4.2. EQUIPO
Autoclave Incubadora Refrigeradora Balanza analítica
4.3. MUESTRAS CULTIVO 863
DE
MEDIO
Extracto de levadura 10g Peptona 10g Glucosa 20g Sacarosa 30g Agua destilada 1000ml
Fuente: Elaborado por estudiantes de la carrera profesional de ingeniería agroindustrial ciclo 2014-II
Material biológico: saccharomyces cerevisiae
V. METODOLOGÍA 5.1. Determinación de biomasa, elaboración de la curva de crecimiento 1. Preparar los materiales listos para ser esterilizados en autoclave
2. Pesar las muestras de glucosa de 10g, sacarosa 30g, peptona de 10g. 3. preparar el precultivo inoculando levadura saccharomyces cerevisiae seca aproximadamente 0.5- 1g en 40ml de un medio 863 (glucosa al 2%) como fuente de carbono. 4. incubar a una temperatura de 60°c con agitación por una noche 5. inocular el 5% del pre cultivo en 150ml de un medio 863(3% de sacarosa). 6. Tomar 5ml del cultivo de acuerdo a las horas indicadas por el docente encargado del curso por 3 días en los tubos de ensayo(9.00am,10.00am,11.00am,12.00pm,3.00pm,6.00pm ;7.00am ,12.00pm,6.00pm;7.00am, 6.00pm) 7. Una vez terminada los once tubos contenidas cada una con 5ml de cultivo llevar a la centrifuga 8. centrifugar las muestras a 4000rpm por 15min, para separar las células de la levadura; el sobrenadante se guarda en tubos por separado. 9. El precipitado que contenía las células se re suspende en 5ml de SSF 0.85% y se colocan en tubos tarados en una estufa al vacío de 80°c durante 24 horas hasta que alcanzo un peso constante. 10. Una vez pesadas las 24 horas se obtuvo por deferencia de peso la cantidad en gramos de la levadura precipitada , la cual se le resto el valor de un blanco en el cual fue preparado solo con solución salina fisiológica 0.85%.
RESULTADOS los resultados que se encontró en la practica se desarrollaran a continuación los cálculos son básicamente para determinar los valores la velocidad de crecimiento y la constante de saturación (constante de monod) para locual se utilizara la siguiente ecuación partiendo la de la ecuación de Michael Menten
𝒗=
𝒗𝒎𝒂𝒙 [𝑺] 𝒖𝒎𝒂𝒙 [𝑺] =𝒖= 𝒌𝒔 + [𝑺] 𝒌𝒔 + [𝑺]
Donde u= h-1 umax=h-1 Ks=g/l Para determinación de los valores de u y ks se trabajo con 4 concentraciones de sacarosa utilizando como microorganismo sacharomyces cerviseae
Cuadro 2: distribución de la muestras con las respectivas concentraciones Muestra
concentración
A
30%
B
10%
C
40%
D
20%
Fuente: Elaborado por estudiantes de la carrera profesional de ingeniería agroindustrial ciclo 2014-II
Resultados para la muestra A a 30% de concentración de sacarosa Cuadro 3: resultados de la biomasa de la muestra A a las 48 horas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 18 22 24 26 30 40 48
0,008 0,0094 0,0095 0,0095 0,0096 0,0097 0,0098 0,0099 0,01 0,015 0,019 0,02 0,03 0,08 0,12 0,13 0,15 0,18 0,25 0,26
Grafico 3: curva de crecimiento de la muestra A
curva de crecimiento muestra A 0.3
biomasa(g/l)
0.25 0.2 0.15
Series1
0.1 0.05 0 0
10
20
30
40
50
60
tiempo(min)
Ecuación para determinar la biomasa en un tiempo determinado 𝑥
𝑡 𝑑𝑥 = 𝑢 ∫ 𝑑𝑡 𝑥𝑜 𝑥 0
∫
ln 𝑥 − ln 𝑥𝑜 = 𝑢𝑡 𝑥 = 𝑥𝑜𝑒 𝑢𝑡 Encontrando el valor de u Grafico 4: curva para determinar valor de u 0.3
y = 0.0084x - 0.0755 R² = 0.988
biomasa(g/l)
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0
5
10
15
20
25
tiempo(min)
30
35
40
45
Del grafico anterior obtenemos u que es igual a la pendiente Donde µ=0,0084 remplazando este valor en la ecuación anterior y x0=0,008 𝑥 = 0,008𝑒 0,0084𝑡
Muestra B concentración de 10% Cuadro 4: resultados de la biomasa de muestra B a las 48 horas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 18 22 24 26 30 40 48
0,002 0,003 0,003 0,0035 0,004 0,0046 0,008 0,01 0,014 0,014 0,016 0,022 0,03 0,044 0,064 0,076 0,088 0,11 0,164 0,168
Grafico 5: curva de crecimiento de la muestra B 0.18 0.16
Título del eje
0.14 0.12 0.1 0.08
Series1
0.06 0.04 0.02 0 0
10
20
30
Título del eje
40
50
60
𝑥 = 𝑥𝑜𝑒 𝑢𝑡 Como se hizo en el caso anterior también se realizara lo mismo para esta muestra Determinando valor de u Grafico 6: curva para determinar valor de u y = 0.0051x - 0.0445 R² = 0.9945
0.18 0.16
biomasa(g/l)
0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0
10
20
30
40
50
tiempo(min)
Resultando el valor de u= 0,0015 h-1 y X0=0,002 Entonces la ecuación para la biomasa quedara de la siguiente manera 𝑥 = 0,002𝑒 0,0015𝑡 MUESTRA C CONCENTRACION 40% Cuadro 5: resultados de la biomasa para muestra C a las 48 horas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 18 22
0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,01 0,012 0,015 0,016 0,019 0,02 0,031 0,11 0,175
24 26 30 40 48
0,21 0,231 0,242 0,25 0,25
Grafico 7: curva de crecimiento para la muestra C 0.3
biomasa(g/l)
0.25 0.2 0.15 Series1
0.1 0.05 0 0
10
20
30
40
50
60
tiempo(min)
Grafico 8: curva para determinar valor de u 0.3
y = 0.0169x - 0.1992 R² = 0.9938
biomasa(g/l)
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0
5
10
15
20
25
30
tiempo(min)
Resultando el valor de u= 0,017 h-1 y X0=0,001 Entonces la ecuación para la biomasa quedara de la siguiente manera
𝑥 = 0,001𝑒 0,017𝑡 MUESTRA D CONCENTRACION 20% Cuadro 6: resultados de la biomasa para la muestra D a las 48 horas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 18 22 24 26 30 40 48
0,0009 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,01 0,015 0,018 0,019 0,02 0,03 0,068 0,1 0,12 0,13 0,162 0,23 0,241
Grafico 9: curva de crecimiento para la muestra D 0.3
biomasa(g/l)
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0
10
20
30 tiempo(min)
40
50
60
Grafico 10: curva para determinar valor de u 0.25 y = 0.0077x - 0.0706 R² = 0.9959
biomasa(g/L)
0.2 0.15 0.1 0.05 0 0
10
20
30
40
50
tiempo(min)
Resultando el valor de u= 0,007h-1 y X0=0,0009 Entonces la ecuación para la biomasa quedara de la siguiente manera 𝑥 = 0,0009𝑒 0,007𝑡
encontrados los valores de u de cada concentración ahora determinaremos el valor de umax y ks cuadro 7: valores para graficar la curva para el cálculo de umax y ks S B D A C
u 10 20 30 40
1/S 0,0051 0,0077 0,0084 0,017
0,1 0,05 0,03 0,025
1/u 196,078 129,87 119,048 58,82
Grafico 11: curva para determinar umax y ks
curva para determinar µmax y ks y = 1565.4x + 44.423 R² = 0.8745
250 200
1/µ
150
Series1
100
Lineal (Series1) 50 0 0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
1/s
Para encontrar estos valores se hará uso de ecuación de la recta 𝟏 𝒌𝒔 𝟏 𝟏 = . + 𝝁 𝝁 𝑺 𝝁𝒎𝒂𝒙
𝒚 = 𝒂𝒙 + 𝒃 y = 1565,4x + 44,423 si x=0 y= 44,423=b donde 𝝁𝒎𝒂𝒙 𝟏 𝝁𝒎𝒂𝒙 𝟏 𝝁𝒎𝒂𝒙
=𝒃
= 𝟒𝟒, 𝟐𝟑
𝛍max=0,023h-1 Y para el cálculo de ks 𝑘𝑠 𝜇𝑚𝑎𝑥
=𝑎
𝑘𝑠 = 1565,4 0,023 Ks=36 g/l
DISCUSIONES BU¨LOCK, 1987 establece el valor de velocidad máxima de crecimiento para la saccharomyces cerevisiae 0,45 h-1, el valor encontrado es menor a comparación de este resultando 0,0023 h-1 Marison, 1996 determino un valor para la constante de saturación (Ks) para la saccharomyces cerevisiae de 25 mg/l (0,025g/l) resultando nuestro valor muy superior de lo encontrado por Marison resultando 36g/l CONLUSIONES Según los resultados obtenidos en la práctica los valores determinados tanto para la umax y la constante de saturación en el primer caso el valor de la velocidad de crecimiento es muy inferior a lo encontrado por la bibliografía consultada y en el segundo caso el valor de la constante de saturación (Ks) resulto muy elevado o podemos afirmar que el valor determinado por Marison es igual a 25g/l valor que es cercano al calculado. Los resultados obtenidos para cada muestra se calcularon sus respectivas ecuaciones para determinar la biomasa en función al tiempo y la biomasa inicial. De la misma forma para cada concentración se le realizo su respectiva curva de crecimiento microbiano observándose que para cada concentración existía un crecimiento de biomasa mas que las otras concentraciones
BIBLIOGRAFÍA C.G. Sinclair, 1987 department of chemical engineering, university of Manchester institute of science and technology. PO Box 88
Jhon bu’lock, 1987. Biotecnología básica. Editorial Acribia, S.A Crecimiento Microbiano (Prescott y col ., 1999). (McMeekin y ros, 2002). Curva de Crecimiento ; Microbiología ((Penfold ,1914),(Buchanan y Solberg ., 1972) Tiempo de Latencia(Swinnen y col ., 2004),(Montville , 2000), (Swinnen y col. ,2004). Tiempo de Generación (Según Stanier y col., 1989) ( Madigan y col .,1997). Velocidad de Crecimiento(Madigan y col .,1999),( Stanier y col., 1989) CUESTIONARIO 2. En las fases del crecimiento microbiano o celular . explique la fase de latencia obtenga una ecuación para calcular el tiempo lag (tlag).
3. En que consiste la inhibición del crecimiento microbiano por sustrato, por producto del metabolismo. Obtenga una ecuación para calcular la constante de inhibición del sustrato. Efecto de una concentración de sustrato o producto Si se aumenta la concentración inicial de sustrato a niveles altos la velocidad de crecimiento pueden disminuir debido a la inhibición por sustrato. Para sustratos como la glucosa u otros carbohidratos, la mayoría de los microorganismos son capaces de crecer a concentraciones de 100-150 g/lt, pero muy pocos crecerán a 300-500 g/lt. Es decir, a altas concentraciones de azúcar o sal se observa la inhibición por deshidratación de los microorganismos debido al fenómeno de osmosis que se da en células. Existen sustratos que a concentraciones bajas favorecen el crecimiento de algunos microorganismos pero que a altas concentraciones se vuelven inhibidores para los mismos tales como el fenol, formaldehido o el metanol. La inhibición por sustrato generalmente se expresa de la siguiente forma 𝜇=
𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑆 𝑆 𝑘𝑖
𝑘𝑠 +𝑆+( )2
Inhibición por producto Los productos que alcancen una concentración suficientemente alta en el medio pueden inhibir y eventualmente detener su propia producción. Este fenemo es bien conocido en la producción de etanol y limita el grado máximo que puede ser alcanzado por fermentación en las bebidas alcohólicas.(C.G. Sinclair, 1987)
