Apuntes de ciné tica de crecimiento microbiano Iván Paredes M.SC. Ingeniería Bioquímica
Cinética de Cultivos Celulares
Crecimiento celular en un cultivo por lotes El conocimiento de la cinética de crecimiento y producción de metabolitos es fundamental en el tratamiento cuantitativo de los procesos de cultivos celulares. El conocimiento de la cinética de cultivo permite la predicción del comportamiento del cultivo; la evaluación de velocidades, rendimientos y productividades; y entrega información útil para establecer estrategias de producción y optimización del proceso. El comportamiento cinético de una población está determinado por un conjunto de factores genéticos y ambientales (figura 1). Entre estos últimos destacan las condiciones de operación, como la composición del medio, la temperatura, el pH, agitación, aireación, etc.; y la modalidad del cultivo, entre las que se distinguen el cultivo por lotes, el cultivo por lotes alimentados y el cultivo continuo.
Figura 1: Aspectos que intervienen en la interacción entre las células y el medio ambiente a lo largo de su
crecimiento.
El cultivo por lotes se define como aquel que se realiza sin intercambio de materia con los alrededores, salvo en lo que se refiere a gases (aireación, producción de CO 2, y otros gases), los que se suministran y retiran en forma continua. La curva característica de crecimiento de un cultivo por lotes (figura 2), se cumple siempre que se den ciertas condiciones: que todas las células que componen la población se reproduzcan a intervalos regulares, que no existan sustancias inhibidoras del crecimiento y que la composición del medio se simple, en especial a las fuentes de carbono y nitrógeno.
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Crecimiento celular en un cultivo por lotes El conocimiento de la cinética de crecimiento y producción de metabolitos es fundamental en el tratamiento cuantitativo de los procesos de cultivos celulares. El conocimiento de la cinética de cultivo permite la predicción del comportamiento del cultivo; la evaluación de velocidades, rendimientos y productividades; y entrega información útil para establecer estrategias de producción y optimización del proceso. El comportamiento cinético de una población está determinado por un conjunto de factores genéticos y ambientales (figura 1). Entre estos últimos destacan las condiciones de operación, como la composición del medio, la temperatura, el pH, agitación, aireación, etc.; y la modalidad del cultivo, entre las que se distinguen el cultivo por lotes, el cultivo por lotes alimentados y el cultivo continuo.
Figura 1: Aspectos que intervienen en la interacción entre las células y el medio ambiente a lo largo de su
crecimiento.
El cultivo por lotes se define como aquel que se realiza sin intercambio de materia con los alrededores, salvo en lo que se refiere a gases (aireación, producción de CO 2, y otros gases), los que se suministran y retiran en forma continua. La curva característica de crecimiento de un cultivo por lotes (figura 2), se cumple siempre que se den ciertas condiciones: que todas las células que componen la población se reproduzcan a intervalos regulares, que no existan sustancias inhibidoras del crecimiento y que la composición del medio se simple, en especial a las fuentes de carbono y nitrógeno.
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Figura 2: Curva característica del crecimiento de un cultivo celular por lotes
La curva presenta varias zonas o fases: 1. Fase de latencia: Se produce inmediatamente después de la inoculación. En ella no hay iniciación de la replicación. En esta fase se realiza la adaptación y aclimatación del microorganismo a las condiciones ambientales del cultivo (nutrientes, temperatura, soporte, pH, etc.), comienza a activar su maquinaria enzimática para responder en forma adecuada a las nuevas condiciones. La duración va a depender de que tan diferentes son estas condiciones en relación a las anteriores (antes de la inoculación). Existe un efecto significativo si el cambio se realizó desde un medio solido a uno líquido. Esta fase no es productiva, por lo que se busca que su duración sea lo más corta posible, haciendo que el medio de destino sea lo más similar al medio de origen, además es recomendable que en el momento de realizar la inoculación, el cultivo este creciendo en forma vigorosa. La cantidad de biomasa a inocular es aproximadamente el 10% de la biomasa que se busca el terminar el cultivo. En cultivos industriales la propagación se realiza en forma e scalonada. 2. Fase de crecimiento exponencial: En esta fase el tiempo entre las duplicaciones es el mismo, produciéndose un crecimiento vigoroso del cultivo. Las bacterias son las que más se ajustan a este modelo, al duplicarse siguiendo una progresión geométrica. En levaduras el tiempo de duplicación va aumentando durante el transcurso del cultivo, debido a un envejecimiento celular, por lo tanto la fase de crecimiento exponencial es más corta. En un medio totalmente controlado, las bacterias detienen su crecimiento solo al sufrir un agotamiento de nutrientes en el medio de cultivo, en cambio en un cultivo de levaduras, se observaría una fase de desaceleración más larga. 3. Fase estacionaria: En la fase estacionaria biomasa permanece constante, sin observar una pérdida de la viabilidad del cultivo. El crecimiento se detiene a causa de un agotamiento de algún nutriente, falta de oxígeno, acumulación de un compuesto toxico o inhibitorio, etc. Dependiendo del nutriente limitante, se presentan diferentes cambios en la fase estacionaria. En algunos microorganismos es posible la acumulación de oligosacáridos, si el nutriente limitante no es carbono.
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4. Fase de muerte del cultivo: Esta fase es una consecuencia del agotamiento de la fuente de carbono y energía o la acumulación de compuestos tóxicos sobre los límites tolerados por la célula; por lo que el cultivo no es capaz de mantenerse viable, provocando la lisis celular. En algunos casos esta lisis celular, da espacio a que este material vertido al medio de cultivo sea aprovechado por otras cé lulas, produciéndose un crecimiento críptico. Es posible distinguir también otras cortas fases de aceleración y desaceleración del crecimiento. La fase estacionaria puede presentar una suave pendiente positiva si el nutriente limitante es la fuente de nitrógeno. En el caso el metabolismo de la fuente de carbono y energía puede continuar por algún tiempo, con acumulación de compuestos de r eserva y aumento de la biomasa.
Modelación de crecimiento celular Durante el crecimiento celular existe una variación de la biomasa en el tiempo, la cual puede ser representada por:
= =
Según la ecuación de Malhtus se tiene el siguiente comportamiento en una población si se tiene una progresión geométrica:
= = ∙ ∙ Donde k es una constante asociada al crecimiento celular, α es una constante asociada a la muerte celular y X es la concentración de biomasa. Si suponemos una muerte celular despreciable en relación a la duplicación, la ecuación se puede e xpresar de la siguiente manera:
= ∙ 1 De esta forma k pasa a ser la velocidad específica de crecimiento, que se notara como μ. Por lo tanto la ecuación de velocidad de variación de biomasa queda como:
= = ∙ Aplicando los límites de integración desde un tiempo inicial a un t iempo t:
= ∙ Resolviendo:
3
= ∙ ( )
O
= ∙ ∙
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Al graficar el ln(X) versus el tiempo (figura 3), se puede obtener μ, por medio de la determinación de la pendiente de la ecuación de la recta.
( ) = ( ) + ∙ ln x
µ
tiempo Figura 3: determinación grafica de la velocidad especifica de crecimiento .
El parámetro μ es de especial relevancia en el estudio de la cinética de cultivos celulares. Su dimensión es tiempo -1. Relacionado con μ, existe otro parámetro cuya interpretación física es más directa: el tiempo de duplicación, t d, definido como el tiempo que media entre dos duplicaciones sucesivas, aplicando esto a la ecuación anterior
ln
2 00 = ∙
Por lo tanto el td, queda finalmente como:
= () En forma referencial se pueden tomar los siguientes tiempos de duplicación: 4 a n i g á P
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Tiempos de duplicación (horas) Bacterias 0,3 a 2,5 Levaduras 1,0 a 4,0 Mohos 1,5 a 7,0 Microalgas 18 a 35 20 a 40 Células animales
Efecto de la concentración de sustrato en el crecimiento celular El valor de μ depende del microorganismo que se trate y de los parámetros ambientales de cultivo. Entre estos cabe mencionar la composición del medio de cultivo, la temperatura, pH, Eh, la presencia de tenso activos y la actividad termodinámica del agua. El efecto del medio de cultivo es tanto cuantitativo como cualitativo. La naturaleza de los nutrientes influye en el valor de μ, en especial en el caso de las fuentes de carbono, energía y nitrógeno. El efecto cuantitativo de la fuente de carbono y energía sobre la velocidad específica de crecimiento, fue estudiado por Monod en 1949, quien observo experimentalmente la relación de μ con la concentración de sustrato y propuso la siguiente ecuación para representarla, representada gráficamente en la figura 4:
= ∙ + Donde Ks: es la constante de afinidad del microorganismo por el sustrato, entre mas afín sea, más
pequeño será el valor del K s. μm:
valor máximo que puede obtener la velocidad especifica de crecimiento cuando la
concentración de sustrato es órdenes de magnitud mayor que Ks. La velocidad específica de crecimiento es función de la concentración de sustrato limitante, sin importar la concentración de los otros nutrientes.
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Figura 4: relación entre la velocidad específica de crecimiento y la concentración de sustrato limitante en un
cultivo celular.
De la grafica se puede evaluar las siguientes situaciones: •
Ks = S
entonces
•
S >>> Ks
entonces
•
S <<< Ks
entonces
= = = ∙
La ecuación de Monod se puede linealizar tomando los recíprocos para obtener la expresión:
= ∙ + Una grafica de 1/μ frente a 1/S (Figura 5), produce una línea recta con pendiente Ks/μm, abscisa al origen -1/Ks y ordenada al origen μm.
Figura 5: Grafica de doble reciproca de 1 /μ frente a 1/S
La aplicación de la ecuación planteada por Monod, se ha extendido a las fuentes de otros nutrientes, además de la fuente de carbono y energía.
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Los valores de la constante de saturación Ks (tabla 1), son del orden de las unidades o las decenas de partes por millón, por lo que cuando la concentración de sustrato es de gramos o decenas de gramos por litro, la velocidad especifica de crecimiento se hace prácticamente igual a μm. Por este motivo la pendiente de la figura 3 es una estimación de μm en ausencia de inhibidores.
Tabla 1: valores referenciales de Ks para diferentes géneros de microorganismos.
Durante en largo periodo de del crecimiento S >>> Ks; si es 10 veces mayor se supone un μ = µm, si es igual o menor a 10 veces se comienza a tener evidencia de la falta de sustrato y comienza la desaceleración del crecimiento. En la fase de crecimiento exponencial la velocidad específica de crecimiento es constante y se asume como μm. De esta forma la ecuación para la variación de biomasa en el tiempo queda como:
= ∙ ∙ +
Cuando Ks es menor que S, al integrar y despejar, la ecuación queda:
Donde:
∙∙ ∙+∙ = ∙
= 00 = ∙ ∙ +0 +0 +0 0 = ∙ ∙ +0 +0 +0 0
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Efectos de inhibición sobre la velocidad especifica de crecimiento El modelo de Monod no siempre logra representar adecuadamente los datos experimentales, en especial cuando el medio de cultivo es complejo y contiene varias fuentes de carbono y de nitrógeno. En esos casos pueden resultar más adecuados otros modelos de crecimiento, entre los que destaca la ecuación logística y sus modificaciones.
= ∙ ∙ ( ∙ ) Donde
= 1 siendo Xm el máximo número de individuos que soporta el ambiente.
Cuando βX es pequeña, se hace despreciable frente a 1. Cuando βX es igual a 1, el crecimiento se detiene, con este modelo se logra poner un límite al crecimiento. Luego de ordenar e integrar la ecuación finalmente queda:
∙ ∙ = ∙ ∙ ( ∙)
Cuando el tiempo es pequeño, el denominador se hace despreciable. La relación de Monod se aplica en el caso de que el crecimiento no sea inhibido, si el cultivo es afectado por concentraciones altas de producto o sustrato la ecuación de Monod se modifica. Si corresponde a una inhibición por alta concentración de sustrato se obtiene
= ∙
( + ) ∙ +
Por otro lado, si la inhibición es por producto la ecuación queda:
= ∙
( + ) ∙ +
Las altas concentraciones de sustrato provocan un estrés osmótico, por ejemplo Sacaromices aceptan concentraciones de glucosa del orden de 100 [g/L], pero si se sube a 150 [g/L] causa problemas a nivel de concentración osmótica. Otros efectos inhibidores pueden ser: modificación del potencial químico del sustrato, intermediarios o productos; cambio en la permeabilidad celular; efectos sobre las enzimas a nivel de síntesis o actividad. Levenspiel y Han propusieron una ecuación de Monod generalizada, tratando de cubrir la mayor parte de las situaciones, en particular la inhibición por sustrato, producto o las mismas células:
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= ∙ ∗ ∙ + + ∗ O bien
= ∙ +
Donde:
= ∙ 1 ∗
= ∙ 1 ∗
Siendo:
Ci : concentración del inhibidor
Ci : concentración critica del inhibidor que detiene completamente el proceso (en este
*
caso el crecimiento celular)
n y m: Son constantes relacionadas con el poder toxico del inhibidor.
Sustituyendo en la ecuación general Ci por S, P o X; se podrá tratar la inhibición por sustrato, *
producto o las propias células. Cuando Ci <<< Ci la ecuación se reduce a la ecuación de Monod. Para el caso de la inhibición por producto (Ci=P) o por las propias células (Ci=X), las constantes de la ecuación pueden evaluarse a partir de una liberalización del tipo Lineweaver-Burk, de 1/μ frente a 1/S.
= ∙ ∗ ∙ + ∙ ∗ ∙ ∗ O
= ∙ + En la figura 6 se recoge la forma que toma dicha linealización para las seis formas más comunes de inhibición: a) Inhibición no competitiva, con n>0 y m=0 b) Inhibición competitiva, con n=0 y m<0 c) Inhibición generalizada (anticompetitiva), con n>m>0 d) Inhibición generalizada (anticompetitiva), con m>n>0 e) Inhibición anticompetitiva, con n=m>0
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f)
Caso general, con n>0 y m<0
Figura 6: Representación de Lineweaver-Burke para distintas formas de inhibición por el producto, de
acuerdo con el modelo de Han y Levenspiel
Efecto de la temperatura sobre la cinética del cultivo celular Como todas las reacciones químicas, el crecimiento celular es afectado por la temperatura. La relación entre la variación de biomasa y el efecto de la temperatura puede expresarse de la siguiente manera.
= ∙ ∙ Donde μ es la velocidad especifica de crecimiento y es la velocidad específica de muerte, ambas -1
con dimensión de tiempo . El crecimiento observado es un balance entre el crecimiento y la mortalidad, sin embargo, en condiciones generales μ<<<α, por lo que el termino de muerte celular se desprecia. Cuando se pasan las temperaturas optimas de crecimiento, la relación entre μ y α cambia, y la muerte celular pasa a ser significativa. Al graficar el efecto sobre la velocidad especifica de crecimiento frente a la temperatura (figura 7), se pueden distinguir 2 zonas. En la zona 1, el aumento de la temperatura tiene un efecto positivo μ, alcanzando a su punto máximo al llegar a la temperatura óptima.
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Temperatura optima
1
2
Figura 7: Influencia de la temperatura sobre la velocidad especifica de crecimiento.
De manera aproximada puede decirse que la velocidad específica de crecimiento se duplica por cada incremento de 10°C en la temperatura, hasta que empieza a producirse la ruptura estructural de las proteínas y lípidos celulares. Los microorganismos pueden dividirse básicamente en 3 tipos dependiendo de la temperatura óptima para su crecimiento (figura 8), estas clases son psicrófilos (<20°C), mesófilos (20-37°C) y termófilos (>38°C).
Figura 8 : Intervalos de temperatura para el crecimiento de: 1 psicrófilos; 2 mesófilos; 3 termófilos.
El efecto de la temperatura sigue un comportamiento del tipo Arrhenius:
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− = ∙ ∙ Y
− = ′ ∙ ∙ Dónde: •
A y A’ corresponden a la constante de Arrhenius.
•
Ea y Ea’ corresponden a la energía de activación, con valores de 15-20 60-70
para Ea’.
para Ea y de
∙
•
R es la constante de los gases de 1,98
•
T corresponde a la temperatura absoluta e n grados kelvin.
El aumento de la velocidad de mortalidad (y disminución de μ), a altas temperaturas, se debe principalmente a la desnaturalización termal de las proteínas, la cual provoca un aumento energético del mantenimiento celular para mecanismos de reparación (el coeficiente de mantención también sigue una dependencia del tipo Arrhenius). A bajas temperaturas, los mecanismos regulatorios de las células son afectados, además de las limitaciones difucionales como el transporte de sustratos hacia dentro de la célula. Como resultado, la producción de biomasa decae a temperaturas extremas.
Efecto del pH, Eh y aw sobre el crecimiento celular El pH es un parámetro que afecta tanto al crecimiento como a la formación de producto. La mayoría de los organismos tiene un rango de función entre 3 a 4 unidades de pH. El pH para un crecimiento máximo crecimiento varía frecuentemente entre 1 y 1,5 unidades de pH. La relación de μ con el pH presenta también un valor óptimo. Sin embargo la forma de la curva es más variada que en el caso de la temperatura y no se dispone de un modelo matemático simple y general para representarla. Como regia general, el pH óptimo para bacterias está ubicado en el rango de 6 a 7.5, el de levaduras entre 3.5 y 5.5 y el de los mohos se extiende de 3 a 7, aunque existen variadas excepciones a ella (tabla2). Rangos típicos Tipo celular
pH
Bacteria
4-8 3-6 3-7 6,5-7,5
Levadura Hongos Células eucariotas
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Tabla 2: rangos típicos de pH para diferentes microorganismos
Durante el cultivo, el pH tiende a cambiar por diferentes motivos. Cuando la fuente de nitrógeno +
es amonio, el pH tiende a bajar. El amonio en solución se encuentra como NH4 , el microorganismo +
+
lo incorpora a las células como R-NH3 , donde R es el esqueleto carbonado, en el proceso un H es -
liberado al medio. Si la fuente es nitrato (NO 3 ), los iones de H son removidos del medio al reducir NO3- a R- NO3+, por lo que el pH tiende a subir. Cuando de utilizan compuestos amino orgánicos (como la glutamina), el pH tiende a subir debido a la desaminación del compuesto. Otro cambio de pH ocurre cuando se producen compuestos como ácido láctico o ácido piruvico. Si se conoce la causa predominante del cambio de pH, es posible obtener información del crecimiento midiendo la adición v de ácido o base para neutralizar el cambio de pH. El potencial redox. Eh, del cultivo tiene también importancia, ya que su valor determina la posibilidad de ocurrencia de reacciones de oxidación del sustrato y es especialmente relevante para organismos quimioautótrofos que utilizan una reacción inorgánica como fuente de energía. Finalmente, cabe mencionar la actividad termodinámica de agua, aw. Para su desarrollo los microorganismos requieren niveles mínimos de aw que posibiliten que el agua cumpla con su rol de solvente y reactante. Estos valores son normalmente mayores que 0.90, aunque existen mohos y levaduras que pueden crecer a aw tan bajas como 0.6. Este factor es de especial relevancia en el deterioro microbiano de alimentos de humedad intermedia y en los procesos de cultivos en sustrato sólido.
Crecimiento Diaúxico El crecimiento diaúxico es un tipo crecimiento microbiano en dos etapas, que tiene lugar cuando hay presentes dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados como fuente de carbono. En este tipo de crecimiento microbiano se observa una curva de crecimiento bifásica debido a la utilización secuencial distintas fuentes de carbono. El me tabolismo del organismo es selectivo para uno de los sustratos (se usa la fuente de carbono que permite un crecimiento más rápido) y cuando la agota, comienza a metabolizar el otro. Como se puede ver en la figura 9, la velocidad especifica de crecimiento, cuando se utiliza el nutriente que es más afín, es mayor que la que se desarrolla con el segundo nutriente. En el caso de tener múltiples compuestos, se registraría un comportamiento similar consecutivo.
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Figura 9: Curva de crecimiento celular en presencia de glucosa y lactosa.
Estequiometria del Crecimiento Microbiano El proceso de reproducción celular aparece representado esquemáticamente en la Figura 10. Desde una perspectiva cuantitativa, para que la representación a) sea posible, se deberá cumplir con lo establecido en b), de manera de no violar los principios de conservación de masa y energía y hacer posible la construcción de una nueva célula igual a la anterior. La información para la construcción de la nueva célula está contenida en el cromosoma y es transmitida de generación en generación. La materia debe ser suministrada a través de los componentes del medio de cultivo. La energía se obtiene del catabolismo de la fuente de carbono y energía, de reacciones inorgánicas de oxidación o de la radiación solar en el caso de organismos fotosintéticos.
4 1 Figura 10. Reproducción celular: a) Formación de nuevas células. b) Requerimientos cuantitativos.
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Desde un punto de vista cuantitativo, las cantidades necesarias de nutrientes pueden determinarse a partir de la estequiometria del crecimiento y formación de productos, ya que un crecimiento microbiano puede expresarse en forma de reacción química. Ejemplo: Sacharomyces cerevisiae en glucosa en condiciones aerobias:
+ + → + + Para poder calcular los coeficientes estequeométricos es necesario conocer la composición química del microorganismo por medio de un análisis elemental. Esta ecuación se expresa por convenio en función de un único átomo de carbono. De esta manera se obtiene que:
.
.
.
Estos valores pueden variar según el sustrato utilizado. La biomasa se representa en base a su composición elemental. Composiciones típicas de bacterias, levaduras y mohos aparecen en la Tabla 3. Los elementos cuantitativamente más importantes son C, H, O y N, l0 que justifica la aproximación hecha en la ecuación del ejemplo. Los siguen un segundo grupo compuesto por Mg, S, P, Ca, Na y K, mientras que los restantes elementos se encuentran en niveles muy bajos. Estos elementos deben ser suministrados como compuestos aptos para ser metabolizados. La fuente de carbono puede ser un carbohidrato u otro compuesto orgánico, o bien CO2, carbonato o bicarbonato en el caso de células quimioautotróficas y fotosintéticas. La fuente de nitrógeno puede ser amonio, nitrógeno amino de aminoácidos y proteínas, urea, nitrato o nitrógeno elemental, siendo las dos primeras las más comunes. El resto de los elementos son proporcionados por sales inorgánicas. Debido a deficiencias genéticas, ciertas cepas requieren de factores de crecimiento, tales como vitaminas, aminoácidos y nucleótidos.
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Tabla 3: Composición química de células microbianas
La expresión en forma de reacción química permite la aplicación de balances de matera para cada componente la determinación de los coeficientes estequeométricos. Se debe suponer un medio definido y se aplica principalmente al sustrato limitante. Continuando con el ejemplo anterior se pueden plantear los siguientes balances:
: 6 = + : 1 2 + 3 = 1,703 + 2 : 6 + 2 = 0,459 + 2 + : = 0,171 Se disponen de 4 ecuaciones para determinar 5 incógnitas, por lo tanto se define el coeficiente respiratorio (CR o RQ), que corresponde a los moles de CO2 formados por cada mol de O2 consumido, en este caso queda como:
: 1,033 = El sistema de 5 ecuaciones con 5 incógnitas puede resolverse para conducir a la siguiente ecuación ajustada:
+ , + , → . + , + , ,
,
,
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Si el producto principal se produce como consecuencia del metabolismo primario, se puede plantear una reacción química similar a la ecuación del ejemplo, introduciéndose el producto indicado como CHvOw; si el producto contiene nitrógeno puede tenerse en cuenta en forma análoga.
+ + → + + +
En el caso que el producto se obtenga indirectamente como consecuencia del metabolismo primario o sea un metabolito secundario, no puede aplicarse la estequiometria simple de la ecuación anterior.
Requerimientos nutricionales Resulta útil distinguir dos tipos de medios de cultivo, de acuerdo a su composición: complejos y definidos. Los medios complejos son formulados en base a desechos, subproductos y extractos naturales, tales como melaza, licor de maceración de maíz, extracto de levadura, y otros. Su composición química es compleja y variable y contienen varias fuentes de cada elemento. Estos medios pueden requerir suplementación con compuestos que proporcionen cantidades adicionales de algunos elementos, tales como N, Mg y P. Los medios complejos son extensamente utilizados en microbiología básica (taxonomía, fisiología, genética), microbiología analítica, microbiología de aguas y alimentos y en fermentaciones industriales. Los medias definidos se formulan en base a compuestos puros, tales coma glucosa, sulfato de amonio, metionina, fosfato mono acido de potasio, etc. Debido a ello su composición química es conocida y reproducible, conteniendo fuentes de cada elemento y los nutrientes esenciales que pueden ser requeridos. Estos medios son usados preferentemente en investigación y desarrollo de procesos de cultivos. En el campo industrial, se percibe una creciente utilización de medios definidos. Una clase especial de medio definido es el medio mínimo, que se puede caracterizar como aquel formado por solo una fuente de cada elemento. El típico medio mínimo está compuesto por glucosa, sulfato de amonio y otras sales minerales. En la Tabla 4 se entrega un listado parcial de componentes de medios complejos industriales y en la Tabla 5 se dan ejemplos de medias definidos, donde se puede apreciar que estos pueden llegar a ser bastante complicados en su formulación, pero siempre con la característica de ser químicamente definidos.
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Tabla 4: Medios de cultivos con fines industriales
Los medios complejos son adecuados a nivel industrial por ser más baratos y porque en ciertos casos se obtienen con ellos mejores rendimientos y productividades. Ello se debe a que al contener una variedad de moléculas orgánicas, evitan a la célula el trabajo de sintetizarlas a partir de glucosa y compuestos inorgánicos. Por otro lado, los medios definidos permiten un mejor control de las condiciones ambientales de crecimiento y producción, siendo fácil excluir sustancias tóxicas o inhibidoras e incluir precursores e inductores en los niveles adecuados. Por esta razón, ciertos cultivos que requieren un control ambiental estricto resultan más productivos cuando utilizan medios definidos. Para optimizar la composición de un medio complejo, se puede recurrir a diversas técnicas experimentales y teóricas.
Tabla 5: Ejemplos de medios definidos.
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Rendimiento de una reacción La extensión en que los reactantes se convierten en productos se denomina rendimiento de la reacción. Generalmente, rendimiento es la cantidad de producto formado o acumulado por cantidad de reactante suministrado o consumido. Desafortunadamente, no existe una definición concreta de rendimiento, siendo varios los parámetros utilizados para definirlo en diferentes situaciones. Los términos utilizados para expresar rendimiento no son necesariamente aceptados de manera universal. Cuando reactantes o productos se ven involucrados en reacciones diferentes, el rendimiento observado puede ser diferente del re ndimiento teórico.
Existe un tercer tipo de rendimiento aplicable en determinadas situaciones. Para reacciones con una conversión incompleta de reactante puede ser interesante especificar la cantidad de producto formado par cantidad de reactante añadido a la reacción en vez del realmente consumido. Por ejemplo, considerando la reacción de isomerización catalizada por glucosa isomerasa:
↔ La reacción se realiza en un reactor cerrado con enzima pura. En el equilibrio, la mezcla de azucares contiene 55% en moles de glucosa y el 45% de fructosa. El rendimiento teórico de la fructosa a partir de la glucosa es 1 mol mol-I porque de la estequiometria se deduce que la formación de 1 mol de fructosa necesita 1 mol de glucosa. El rendimiento aparente será también 1 -1
mol mol si la reacción Se produce en un sistema aislado. Sin embargo, si la reacción comienza cuando únicamente existe glucosa, el rendimiento de equilibrio de fructosa par mol de glucosa añadida al reactor es 0,45 mol mol-I. Este tipo de rendimiento para reacciones incompletas puede denominarse coma rendimiento bruto.
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Rendimientos en cultivos celulares Cuando se consideran procesos como el crecimiento celular se están agrupando muchos efectos individuales de conversiones químicas y enzimáticas. A pesar de esta complejidad, los principios del rendimiento pueden aplicarse al metabolismo celular para relacionar el flujo de sustrato en las rutas metabólicas para la formación de biomasa y otros productos. Los rendimientos que se muestran generalmente y aquellos de especial importancia se expresan mediante coeficientes de rendimiento o factores de rendimiento. Varios coeficientes de rendimiento son de uso común, como el rendimiento de biomasa a partir de sustrato, el rendimiento de biomasa a partir de oxígeno o el rendimiento de producto a partir de sustrato. Los coeficientes de rendimiento permiten cuantificar la necesidad de nutrientes y las caracter ísticas de producción de un organismo. La definición de los coeficientes de rendimiento puede generalizarse de la siguiente manera:
= ∆ ∆ Donde YFG es el factor de rendimiento, F y G son las sustancias involucradas en el metabolismo, ΔF la masa o moles de F producidos y ΔG la masa o moles de G consumidos. Como ΔG es negativo en valor para una sustancia consumida, para que el rendimiento se calcule como una cantidad positiva es necesario añadir un signa negativo a la ecuación. En la Tabla 6 se muestra una lista de los coeficientes de rendimiento mas frecuentemente utilizados. Aunque el término “rendimiento” se refiere generalmente a la cantidad de producto formado por cantidad de reactante, el rendimiento puede utilizarse también para relacionar otras cantidades. Algunos coeficientes de rendimiento se basan en cantidades tales como el ATP formado o el calor involucrado en el m etabolismo. Símbolo YXS YPS YPX YXO YCS RQ YATP Ykcal
Definición Masa o moles de biomasa producida por unidad de masa o mol de sustrato consumido. Masa o moles de producto formado por unidad de masa o mol de sustrato consumido. Masa o moles de producto formado por unidad de masa o mol de biomasa formada. Masa o moles de biomasa formada por unidad de masa o mol de oxígeno consumido. Masa o moles de dióxido de carbono formado por unidad de masa o mol de sustrato consumido. Moles de dióxido de carbono formados por mol de oxígeno consumido. Este rendimiento es el denominado cociente respiratorio. Masa o moles de biomasa formada por mol de ATP formado. Masa o moles de biomasa formada por kilocaloría de calor involucrada en la reacción Tabla 6: Algunos coeficientes de rendimiento metabólicos
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Un problema en la aplicación de la ecuación generalizada de rendimiento, es que los valores de ΔF y ΔG dependen del periodo de tiempo en el que se miden. En un cultivo discontinuo, ΔF y ΔG pueden calcularse como la diferencia entre los valores inicial y final, obteniéndose un rendimiento global que representa una especie de valor medio durante el periodo entero de cultivo. Por otro lado, ΔF y ΔG pueden calcularse entre otros dos puntos cualquiera en el tiempo , lo cual puede producir un valor diferente de YFG. Los rendimientos pueden variar durante el cultivo y algunas veces es necesario calcular el rendimiento instantáneo en un determinado punto en el tiempo. Para un reactor cerrado de volumen constante en el que la reacción entre F y G es la única reacción en la que intervienen estos componentes, si rF y rG son velocidades volumétricas de producción y consumo de F y G respectivamente, el rendimiento instantáneo puede calcularse de la siguiente manera:
� ∆ = ∆→ ∆ = = � = Por ejemplo, YXS en un determinado instante se define como:
= = Cuando se expresan rendimientos de cultivo, debe manifestarse el tiempo o período de tiempo al cual se refieren. Tal como se describió anteriormente, es necesario distinguir entre rendimiento teórico y observado. Este aspecto es particularmente importante en el metabolismo celular porque siempre existen muchas reacciones produciéndose de manera simultánea, por lo que ambos rendimientos pueden ser diferentes. Considerando el ejemplo de rendimiento de biomasa a partir de sustrato, YXS. Si la masa total de sustrato consumido es S T, parte de ST igual a SG se utilizara para el crecimiento celular mientras el restante, SR, se canalizara hacia otros productos y actividades metabólicas no relacionadas con el crecimiento. Por lo tanto, el rendimiento de biomasa observado basado en el consumo total de sustrato es:
′ = ∆∆ = ∆∆+ ∆ Donde ΔX es la cantidad de biomasa producida e Y’XS el rendimiento de biomasa observado a partir de sustrato. A efecto comparativo, el rendimiento de biomasa teórico o verdadero a partir de sustrato es:
= ∆∆ Donde ΔSG es la masa de sustrato realmente utilizada en la producción de biomasa. Debido a la complejidad del metabolismo, generalmente no se conoce el valor de ΔSG y el rendimiento
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observado es el único rendimiento disponible. Los rendimientos teóricos se refieren normalmente a un rendimiento máximo posible, ya que ellos representan el rendimiento en ausencia de reacciones paralelas.
Cinética de consumo de sustrato El parámetro de rendimiento de un nutriente en células, es útil para la formulación de medios de cultivo y para el estudio cuantitativo de los proce sos de cultivos celulares, este se define como la masa celular obtenida por unidad de nutriente consumido:
∆ = = ∆ A través de este parámetro se puede relacionar las velocidades de variación de biomasa y de consumo de sustrato: Si el rendimiento se definió como:
∆ = ∆ Reordenando la ecuación queda:
∆ = 1 ∙ ∆ Ahora, cuando se evalúa que ocurre en un intervalo de tiempo muy pequeño; es decir dividiendo la ecuación por Δt y llevando al límite cuando Δt→0:
1
lim ∆ , ∆→0
La ecuación queda:
= 1 ∙
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Recordando que:
= ∙ La ecuación puede ser escrita como:
= 1 ∙ ∙ Siendo esta una expresión que modela el perfil de la concentración de sustrato durante un cultivo por lotes, en términos de veloc idad de consumo. Ahora si se divide por la biomasa, se obtiene:
1 ∙ = = ∙ ℎ Donde qS, corresponde a la velocidad específica de consumo de sustrato, por lo que la ecuación queda:
= En la figura 11, se muestra los perfiles característicos que se obtienen al graficar la variación de la concentración de sustrato y biomasa, durante el tiempo de cultivo 2 1,8 ) l / g ( n o i c a r t n e c n o C
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 Cinetica de Sustrato
50
100 Cinetica Celular
150 Tiempo en minutos
Figura 11: Variación de biomasa y sustrato en el tiempo en un cultivo por lotes.
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Si la velocidad de consumo de sustrato, depende del rendimiento y de μ, y si se supone un rendimiento constante durante el cultivo, qS, tendrá una relación directamente proporcional con μ, y cuando esta obtenga su valor máximo, también lo hará q S. El rendimiento de la fuente de carbono y energía depende de la velocidad específica de crecimiento. Para encontrar esta relación se recurre a un balance de masa de la fuente de carbono y energía:
∆ = ∆ + ∆ + ∆ La ecuación expresa que el sustrato consumido se utiliza para crecimiento, mantención de la viabilidad celular y producción de metabolitos extracelulares. El término de crecimiento engloba el sustrato consumido para formar parte de la biomasa y para generar energía para la biosíntesis: esta última porción aparece como CO2 en la ecuación estequeométrica. El término de mantención se refiere al sustrato utilizado para generar energía para funciones distintas al crecimiento, como son el transporte de nutrientes, la rotación de proteínas, el equilibrio osmótico y otras. El término de producto puede o no estar presente, según el microorganismo considerado las condiciones de cultivo. Dividiendo la ecuación por Δt y llevando al límite cuando Δt→0:
= + + Reemplazando cada término en función de parámetros de cultivo se obtiene:
∙ = ∙ + ∙ + ∙ °
°
Donde qP, corresponde a la productividad especifica. Si no hay producción de metabolito extracelular y se reemplaza cada término en función de parámetros del cultivo.
∙ = ∙ + ∙ °
El rendimiento máximo, Y
O
XS
se define como la biomasa obtenida por unidad de sustrato
consumido destinado a crecimiento. Así definido, Y
O XS
no puede medirse directamente por análisis
químico. Definición análoga corresponde a Y°PS. Ambos son límites teóricos. Si se toma la ecuación, se simplifica por X y se divide por μ, queda:
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= + ∙ + °
°
� frente a 1� y si no hay producto
Tomando esta ecuación y realizando un gráfico de 1 O
extracelular, Y
XS
puede ser determinado por extrapolación, como se muestra en la Figura 12, la
que también permite calcular el valor del coeficiente de mantención m, el que corresponde a la pendiente de la recta.
Figura 12: Relación de Y xs con µ para la fuente de carbono y energía
En los casos de producción de metabolitos extracelulares, la gráfica de recíprocos será recta si la productividad específica, qP es constante en el rango de µ considerado. En este caso la pendiente será
+ , de donde se deberá conocer 2 valores para determinar el tercero. °
Algunos
valores de m se entregan en la Tabla 7
Tabla 7: valores seleccionados de coeficientes de mantención
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Cuando no se dispone de datos experimentales, se puede recurrir a un método de cálculo o estimación de los rendimientos. Un balance de los contenidos de un elemento en la célula y en el respectivo nutriente conduce a la ecuación:
= % % Ejemplo:
2)24
Fuente de N: (
= 14132∙ 2 ∙ 100 = 21%
% Dónde:
14 corresponde al peso atómico del nitrógeno 2 corresponde al número de átomos de nitrógeno 132 corresponde al peso molecular del compuesto Si se toma un estimado de 10% de contenido de nitrógeno en la biomasa, tomando en cuenta que va entre 6 y 14%, el rendimiento será:
= 21,2 = 2,12 10 Por lo tanto, en forma teórica se puede decir que por cada unidad de masa de sulfato de amonio consumido, se obtiene 2,12 de biomasa. Se supone que el elemento pasa del nutriente a la biomasa. En cuanto a la fuente de carbono y energía, no todo el carbono metabolizado aparece en la biomasa, sino que una porción forma parte de los productos de oxidación (C02 y moléculas orgánicas pequeñas en metabolismo anaerobio). Para este caso se tiene que:
∙ = % % En metabolismo aerobio f está comprendido entre 0.5 y 0.6, mientras que para el crecimiento anaerobio f es aproximadamente 0.1. La ecuación anterior considera el CO2 desprendido en la generación de energía de crecimiento y mantención por lo que el YXS calculado es una estimación del entregado por la ecuación:
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∙ = ∙ + ∙ °
Diseño de medios de cultivo Para la formulación de medios de cultivo se debe conocer la concentración celular que se desea, la composición elemental de la biomasa (normalmente de datos generalizados como los de la Tabla 3) y las fuentes de cada elemento que se utilizaran como nutrientes. Además de los requerimientos de factores de crecimiento. Los rangos de concentraciones celulares m ás utilizados aparecen en la Tabla 8.
Tabla 8: Valores típicos de concentraciones celulares
El cálculo se realiza determinando Y XS para cada nutriente con ayuda de las ecuaciones:
= % % ∙ = % %
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∆ = = ∆ Llegando a:
0 = + 0 El valor de Sf se supone cero en primera instancia. Luego los valores de So obtenidos pueden multiplicarse por 1,1-1,5, a exce pción del nutriente que se quiere sea el limitante.
Cinética de Formación de productos De forma análoga a los rendimientos celulares se puede definir el rendimiento de sustrato en producto:
∆ = = ∆ ∆ = = (∆ ) í °
El valor de YPS puede ser medido experimentalmente e Y°PS, puede ser calculado de datos experimentales graficando la ecuación:
= + ∙ + °
°
Pero considerando ahora el término de formación de producto, siempre que qP sea conocido y constante y se conozca el valor de m. Otra forma de estimar Y°PS es determinar el rendimiento teórico de un metabolito, Y*PS. Este parámetro entrega el valor máximo que se puede alcanzar en la conversión del sustrato a producto, bajo la condición ideal que no haya consumo de sustrato para crecimiento ni mantención. De acuerdo a la ecuación de balance de sustrato:
∆ = ∆ + ∆ + ∆ Y°PS coincide plenamente con Y*PS en el caso de metabolitos extracelulares.
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Los valores de Y*PS son útiles como referencia para evaluar el comportamiento de un cultivo y adoptar decisiones sobre acciones a seguir. Un YPS muy alejado de Y*PS implica que el proceso puede ser mejorado invirtiendo recursos en investigación y desarrollo. Valores de Y PS cercanos a Y*PS aconsejan no invertir en mejorar más ese proceso. El cálculo de Y* PS
se basa en la estequiometria de la reacción de conversión de sustrato a
producto y es sencillo para productos cuyas rotas biosintéticas sean simples y conocidas. De no ser así, el cálculo resulta más elaborado y algo incierto. La Tabla 9 resume algunos valores de Y* PS calculados en la forma propuesta.
Tabla 9: Rendimientos teóricos de productos
De interés resulta también la aplicación de Y°PS o Y*PS junto a Y°XS y m, a la determinación de las fracciones del sustrato total consumido que se invierten en crecimiento, mantención y producción. Una porción mayoritaria del sustrato se utiliza en generar biomasa, energía de mantención; siendo menor el sustrato destinado a la producción del metabolito de interés, como se aprecia en la Tabla 10.
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Tabla 10: Destino del sustrato en producción de algunos metabolitos
Estas ideas y conceptos en cuanto a las posibilidades de mejoramiento en la producción de un determinado metabolito o enzima han llevado al actual concepto de ingeniería metabólica, que busca individualizar las reacciones metabólicas cuya alteración lleve a la sobreproducción. El rendimiento de sustrato en producto, es muy sensible a las condiciones ambientales, lo que dificulta su aplicación práctica, como parámetro es de mayor utilidad la productividad específica. Ordenando la ecuación de rendimiento:
∆ = ∙ (∆) Dividiendo la ecuación por Δt y llevando al límite cuando Δt→0:
= ∙ Si se había definido previamente:
= ∙ La ecuación queda:
= ∙ ∙ Definiendo:
= ∆� ∆ = = ∆ ∆� ∆ ∆ La ecuación puede ser escrita como:
= ∙ ∙ Lo que significa que la variación de producto en el tiempo es proporcional a la cantidad de biomasa y a la velocidad especifica de crecimiento; esto considerando que es un metabolito asociado al crecimiento. Dividiendo la ecuación anterior por la concentración de biomasa, para obtener la variación específica en el tiempo, se llega a:
∙ = ∙ =
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Para evaluar un proceso industrial, además de los rendimientos se requiere considerar el aspecto cinético, ya que no es lo mismo obtener una cierta conversión de sustrato a producto en un corto tiempo que en un lapso prolongado. También es importante obtener una alta concentración de producto que reduzca los costos de recuperación. Un parámetro que considera lo anterior es la productividad volumétrica, referida a un metabolito o a biomasa, empleándose las notaciones Q P y Q X.
= ∙ Por lo tanto:
= = Para evaluar globalmente un cultivo, es válida la aproximación:
= ∆ ∆ = ∆ ∆ En procesos por lote es necesario calcular la productividad para todo el tiempo del proceso, el cual incluye no solo el tiempo de cultivo:
∆ = = + + O
∆ = 1 ∙ ln 0 + + Analíticamente se puede calcular Q X como:
= ∙ + + De esta ecuación es posible determinar el efecto de los cambios del proceso en la productividad.
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De esta manera se tendrá una productividad específica, que permite establecer parámetros de escalamiento, ya que corresponde a una propiedad intrínseca de la biomasa asociada a parámetros cinéticos; y una productividad volumétrica, la cual es una característica del sistema, de cada cultivo en particular, por este motivo se puede evaluar la eficiencia del sistema y realizar comparaciones sobre la misma base del sistema de cultivo. La relación cinética entre el crecimiento y la formación de producto, depende del rol que tenga este producto en el metabolismo celular. Las dos cinéticas más comunes son en las que el producto es sintetizado durante el crecimiento y una vez que este ha terminado. Un patrón menos común es el caso en el que el crecimiento comienza sin la formación de producto, pero luego de cierto periodo de tiempo, el producto comienza a aparecer mientras en crecimiento continua (figura 13).
Figura 13: relación de la síntesis de un producto con el crecimiento: a) asociado al crecimiento; b)
parcialmente asociado al crecimiento; c) no asociado al crecimiento.
Para modelos mixtos Ludeking y Piret (1959), propusieron la siguiente ecuación:
= ∙ + ∙ Al dividir por la concentración de biomasa se llega a:
= ∙ 1 ∙ + ∙ 1
O
= ∙ +
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