BIOQUIMICA MONOGRAFIA 1

Practica de laboratorio 1

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA MEDICINA HUMANA

CURSO DE BIOQUIMICA INFORME DE LABORATORIO N°1 FOTOCOLORIMETRIA GRUPO C2 MESA “6”

Castillo Tarrillo Giancarlo Gomez Silva Henrry Meza Capcha Kelly Jasmin Ramos Tascca Christian Tiravantti Barrientos Franco

28 DE MARZO 2013


I.

MARCO TEÓRICO

La fotocolorimetría es un método óptico de análisis que mide la cantidad de luz absorbida por una sustancia coloreada. Como cualquier otro método espectroscópico, se basa en la medida de la intensidad y la longitud de onda de la radiación . En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la radiación visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiación ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La región del infrarrojo se sitúa por encima de los 800 nm. En el proceso de absorción de la radiación, un fotón incidente transmite su energía a una molécula (llamada absorbente) lo que da lugar a su excitación pasando a un nivel de energía superior. Este proceso se representa de la siguiente forma: A + h -> A* -> A + calor en la que A es el absorbente en su estado de energía bajo, A* en su nuevo estado de excitación energética y ην (h es la constante de Planck y ν la frecuencia) es la energía del f otón incidente, el cual posee una longitud de onda λ (λ*ν = c, donde c es la velocidad

de la luz). A* es ordinariamente inestable y rápidamente revierte a su estado energético más bajo, perdiendo así la energía térmica correspondiente. Sólo se absorben determinadas frecuencias luminosas, y la selección de las mismas depende de la estructura de la molécula absorbente. Leyes de la absorción de energía radiante Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es absorbida la energía radiante. En términos generales, puede decirse que hay dos variables capaces de afectar al grado de absorción: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a través de la solución. La relación entre ambas se expresa con la fórmula denominada Ley de Beer: P = Po 10-abc P = potencia radiante transmitida Po = potencia radiante incidente una cantidad proporcional a la misma, medida colocando en la cubeta el solvente puro. a = absortividad, constante característica del absorbente y de la longitud de onda de la radiación incidente. b = longitud del paso de la luz a través de la solución del absorbente, expresada generalmente en cm. c = concentración del absorbente Algunos autores prefieren utilizar términos de Io e I, expresando entonces intensidad en lugar de potencia. En la práctica lo que tiene importancia es la proporción P / Po denominada transmitancia (T) o cuando se multiplica por 100, porcentaje de transmitancia (%T). La ley de Beer también puede escribirse de la siguiente forma log (Po / P) = abc El término log (Po / P) se define como la Absorbancia. Cuando las medidas se efectúan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas estandarizadas que


posean un paso de luz constante) y los efectos ópticos debidos a la cubeta son reproducibles, el término b de la expresión de la absorbancia se hace constante. Dado que a es también constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración: A = kc (k = ab). La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la Transmitancia es que la relación existente entre la concentración y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T. Dado que la Absorbancia es proporcional a la concentración, tendremos que: A1 / A2 = C1 / C2 donde, A1 = Absorbancia del problema A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida C1 = Concentración del problema C2 = Concentración del estándar Concentración (problema) = A1 (problema) / A2 (estándar)* Concentración estándar Curvas de calibración Una curva de calibración relaciona las A ó %T con las concentraciones y su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construcción de una curva de calibración que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la práctica. La elaboración de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin embargo, la medida más conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final.

II. 



 

OBJETIVOS Determinar la concentración de la muestra problema a través del MÉTODO DE LA CURVA ESTANDAR ,para ello se deberá utilizar varios estándares de concentraciones conocidas y a partir de la elaboración de la curva (absorbancia vs concentración) . Determinar la concentración de la muestra problema a través del MÉTODO DEL FACTOR DE CALIBRACIÓN, mediante la determinación del valor del factor de calibración a partir de una concentración estándar y su respectiva absorbancia. Tratar de conseguir valores experimentales similares a los teóricos. Comparar los valores de concentración de la muestra problema a partir de los dos métodos.


III.

RESULTADOS

PARTE EXPERIMENTAL METODO DEL FACTOR DE CALIBRACIÓN (METODO ANALITICO) 1.-Preparar la siguiente batería de tubos. Solución stock: Permanganato de potasio (KMnO4) 10mg%

Tubos N°

Tubo 1

Tubo2

Tubo 3

Tubo 4

ml KMnO4

0.5

1

2

4

ml Agua destilada

4,5

4

3

1

Volumen final

5

5

5

5

Concentración mg %

1 mg %

2 mg %

4 mg %

8 mg %

A410

0,018

0,023

0,031

0,060

A525

0,118

0,256

0,506

1,002

A650

0,009

0,015

0,032

0,061

Fc [ ]

8,474

7,812

7,905

7,984

adicional

P1C2M4


1. Hallando “Concentración mg%” :

N1.V1=N2.V    

10.0,5 = X.5 10.1 = X.5 10.2 = X.5 10.4 = X.5

……..X1 = 1 ……..X2 = 2 ……..X3 = 4 ……..X4 = 8

2. Con las gráficas elegir la longitud de onda óptima para el KMnO4 Para elegir la longitud de onda óptima tenemos que tener en cuenta la ley de Lambert- Beer que nos dice que el tipo de longitud de onda que va a incidir sobre la muestra debe tener como característica principal obtener la máxima absorción en la solución, por lo tanto entre las 3 longitudes de onda aplicadas en la práctica de laboratorio y llevadas a las gráficas (A410, A525, A650) la longitud de onda óptima para el KMnO4 es A525

0.14

0.12 1 O B 0.1 U T A R 0.08 A P S A I C0.06 N A B R O S0.04 B A

0.02

LONGITUD

0 0

100

200

300

400

500

600

700

DE ONDA

0.3

0.25 2 O B U 0.2 T A R A P S 0.15 A I C N A B R 0.1 O S B A

0.05

LONGITUD

0 0

100

200

300

400

500

600

700

DE ONDA


0.6

0.5 3 O B U0.4 T A R A P S 0.3 A I C N A B R0.2 O S B A

0.1

LONGITUD

0 0

100

200

300

400

500

600

700

DE ONDA

1.2

1 4 O B U 0.8 T A R A P S 0.6 A I C N A B R 0.4 O S B A

0.2

LONGITUD

0 0

100

200

300

400

500

600

700

3. Calculando el Factor de Calibración :

Fc = [ ] tubo n / Abs tubo    

Fc1 = 1/0,118 ……..Fc1= 8,474 Fc 2= 2/0,256 ……..Fc2= 7,812 Fc 3= 4/0,506 ……..Fc3= 7,905 Fc 4= 8/1,002 ……..Fc4= 7,984

4. Calculando el factor de calibración promedio de las 4 muestras: (8,474 + 7,812 + 7,905 + 7,984 )/4= 8,043

DE ONDA


5. Reemplazando en la fórmula: Muestra problema

Volumen de KMnO4

0.9 ml

Volumen de H2O añadido

8.1 ml

Volumen total

9 ml

Dilución

(0.9)/9 =0.1

Factor de dilución

10

Factor de calibración

8.043

Abs MP

0.486

Fc = 8,043 Abs MP = 0,486 Fd = 10 [ MP] = 39.08 METODO DE LA CURVA ESTANDAR Empleamos para medir la concentración de la muestra problema [MP] por comparación con una serie de elementos de concentración conocido estándar. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible que fueron la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría y la variable a determinar que es la concentración. Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibración, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración .


Tubos N°

Tubo 1

Tubo2

Tubo 3

Tubo 4

ml KMnO4

0.5

1

2

4

ml Agua destilada

4,5

4

3

1

Volumen final

5

5

5

5

Concentración mg %

1 mg %

2 mg %

4 mg %

8 mg %

A410

0,018

0,023

0,031

0,060

A525

0,118

0,256

0,506

1,002

A650

0,009

0,015

0,032

0,061

adicional


La formula de la recta que se forma es: y = 0.1245x ,reemplazando el valor de la absorbancia en “y” se halla el “x” ….0.486= x. (0.1245)……x=3.8725 Para hallar

[MP]= (3.904) . Fd …… [MP]= (3.904) . 10 [MP]= 39.04

V. CONCLUSIONES

VI. CUESTIONARIO 1. ¿Por qué es necesario hacer dilaciones en algunas muestras.? Porque al vaciar en el tubo de ensayo el KMnO 4 y luego también la cantidad de agua mencionada, el soluto tiende a no diluirse adecuadamente en la solución, entonces las moléculas están más juntas y va a haber mayor moléculas que absorban la luz visible; y como nosotros vamos a medir el grado de absorbancia en de las moléculas, al llevarlo al espectrofotómetro saldría una absorbancia alta además de errada. Por lo tanto se debe agitar el tubo de ensayo de tal modo que el color del KMnO4 cambie a una tonalidad menor y con ello estaríamos asegurando que el soluto este bien diluido en otras palabras las moléculas no estén tan juntas; y obtendremos un mejor resultado a la hora de llevarlo al espectrofotómetro. 2. MENCIONE LOS FACTORES QUE AFECTAN LA LEY DE LAMBERT Y BEER 







 

La luz debe ser preferiblemente monocromática o la longitud de onda debe estar entre los limites estrechos. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de absorción de la solución .Esto permite también conseguir la sensibilidad optima. No debe haber ionización,disociación o solvatación del soluto con respecto a la concentración o la tiempo. La solución es muy concentrada,originando un color intenso.La ley solo se cumple para rangos de 10-7 - 102 M,es decir no debe ser ni muy concentrada ni diluida. El PH La T°


3.

4. Una solucion coloreada presenta una A de 0.450 en una cubeta de 2 cm, hallar la A cuando la sustancia se ha diluido 5 veces y se lee en una cubeta de 1 cm.

Base teorica: El factor de dilución es el número total de volúmenes al que se lleva un volumen dado de muestra original, o parte alícuota. En otros términos, el factor de dilución también corresponde a la división de la concentración de la muestra original sobre la concentración de la muestra diluida.

Resolución: La cantidad de diluciones que se le ha hecho son 5 veces por ende ,la dilucion es 1/6 , entonces la concentración ha disminuido a 1/6 de la inicial. A=0.450

l= 2cm

C=c

A´=?

l´=1cm

C´=c/6

La extinción molar prescinde porque no varia Relacionando con la ley de Lambert y Beer Obtenemos: (0.450).(1).(c/6)=(A´).(2).(c)

A´=0.0375 5. Hallar el coeficiente de extinción m olar del KMnO4 realizado en la práctica Sabemos que: ABS (mp) = Ɛ x C x l

Donde: ABS (mp): absorbancia de la muestra problema Ɛ: coeficiente de extinción molar

C: concentración l: longitud de la cubeta de la lectura Resolviendo: ABS (mp) = Ɛ x C x l

0,486= Ɛ x 39,08 x 1 0,012 = Ɛ


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