Berbagai metode imunoserologi telah dikembangkan, sehingga antibodi yang telah diketahui identitasnya dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen. Beberapa metode imunoserologi yang sering digunakan adalah : 1. Reaksi presipitasi Reaksi yang dilakukan untuk mengetahui kadar antibodi dalam serum. Presipitasi terjadi karena reaksi antara antigen yang larut dengan antibodi. Membentuk komplek berupa anyaman. 2. Reaksi aglutinasi Berbeda dengan reaksi presipitasi, reaksi aglutinasi ini dilakukan untuk antigen yang tidak larut, berbentuk partikel atau antigen yang larut tapi terikat dengan partikel atau sel. Antigen tersebut bereaksi dengan antibodi membentuk suatu agregat yang dpat dilihat yang disebut aglutinasi. 3. Reaksi netralisasi Reaksi antara antigen dan antibodi untuk mencegah adanya efek yang berbahaya antara lain adanya eksotoksin bakteri atau virus. Senyawa yang dapat menetralkan toksin disebut dengan antitoksin, merupakan antibodi spesifik yang diproduksi oleh sel hospes. Reaksi antara antitoksin yang dapat menetralkan t oksin bakteri disebut dengan reaksi netralisasi. 4. Reaksi fiksasi komplemen Reaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah yang tidak dapat dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi. 5. Reaksi imunofluoresensi Teknik ini merupakan kombinasi antara zat warna fluoresein dengan antibodi sehingga menimbulkan warna pendaran ketika dilihat pada mikroskop dengan sinar ultra violet. Uji ini merupakan cara yang cepat, sensitif dan sangat spesifik. 6. Radioimmuno assay (RIA) Teknik RIA merupakan cara diagnostik yang mampu mengukur konsentrasi antigen maupun antibodi yang berkadar rendah, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi adanya kelainan tubuh secara dini. Terdapat dua cara untuk melakukan pemeriksaan dengan teknik RIA ini, pertama dengan penentuan berdasarkan reaksi antigen antibodi dalam larutan (liquid phase radio immuno assay) dan yang kedua adalah berdasarkan reaksi pada zat padat atau partikel (solid phase radio immuno assay). 7. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) ELISA merupakan teknik yang paling luas digunakan dari kelompok enzyme immunoassay (EIA). Terdapat dua cara ELISA yaitu yang ecara langsung mendeteksi antigen dan secara tidak langsung untuk mendeteksi antibodi. Teknik ELISA cukup sederhana sehingga interpretasi terhadap hasil pemeriksaan sangat jelas baik untuk menentukan hasil positif maupun negatif. .
Diagnosis Penyakit 2.1 Diagnosis Penyakit Infeksi dengan Uji Serologi 2.1.1 Uji Aglutinasi Uji aglutinasi merupakan salah satu uji serologi yang digunakan untuk mendiagnosa suatu penyakit. Uji aglutinasi ini dapat dilakukan dengan menambahkan antibodi yang homolog pada antigen yang dapat berupa sel ataupun partikel lateks yang telah diserapi antigen yang dapat larut. Penambahan antibodi pada pertikel lateks ini dapat menyebabkan terjadinya proses aglutinasi atau penggumpalan, sehingga menyebabkan terbentuknya agregat sel-sel yang kasat mata. Proses penggumpalan ini disebabkan karena antibodi berlaku sebagai jembatan untuk membentuk jaringan kisi-kisi antibodi dan antigen partikulat sehingga membentuk gumpalan. Uji aglutinasi ini tidak hanya dapat digunakan untuk diagnosis penyakit menular tertentu yang reaksi aglutinasi antigen-antigennya yang telah diketahui oleh serum penderita, tetapi juga dapat digunakan untuk mengetahui mikroorganisme atau bakteri yang belum diketahui. Hal ini dapat diketahui karena kemampuan spesifik serum yang telah diketahui untuk menggumpalkan suspensi sel-sel yang yang belum diketahui tersebut, sehingga mikroorganisme atau bakteri yang belum diketahui tersebut dapat diidentifikasi. Uji aglutinasi terhadap bakteri dapat diklakukan dalam tabung-tabung reaksi kecil atau sebuah kaca objek. Kebanyakan uji bakteri dilakukan dengan pengenceran antiserum secara serial di dalam tabung yang kedalamnya ditambahkan antigen dalan jumlah yang konstan. Setelah diinkubasi, pengamatan dapat dilakukan secara visual, kemudian ditentukan titernya. Titer antiserum adalah suatu nilai nisbi dan berbanding terbalik dengan pengenceran tertinggi yang memiliki gumpalan sel dan antibodi. Titer yang lebih tinggi menunjukkan adanya konsentrasi antibodi yang lebih tinggi pula. Beberapa contoh uji aglutinasi adalah sebagai berikut: * Uji Widal Uji Widal adalah prosedur uji serologi untuk mendeteksi bakteri Salmonella enterica yang mengakibatkan penyakit Thipoid. Uji ini akan memperlihatkan reaksi antibodi Salmonella terhadap antigen O-somatik dan H-flagellar di dalam darah. Prinsip pemeriksaan adalah reaksi aglutinasi yang terjadi bila serum penderita dicampur dengan suspense antigen Salmonella typhosa. Pemeriksaan yang positif ialah bila terjadi reaksi aglutinasi antara antigen dan antibodi (agglutinin). Antigen yang digunakan pada tes widal ini berasal dari suspense salmonella yang sudah dimatikan dan diolah dalam laboratorium. Dengan jalan mengencerkan serum, maka kadar anti dapat ditentukan. Pengenceran tertinggi yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi menunjukkan titer antibodi dalam serum. * Uji Weil-Felix Uji Weil-Felix merupakan uji yang dilakukan terhadap infeksi oleh riketsia. Uji ini melibatkan antigen heterofil, beberapa riketsia memiliki antiten yang sama seperti yang terdapat pada galur-galur Proteus spp. Artinya serum dari pasien yang menderita infeksi oleh riketsia akan mengaglutinasikan suspensi bakteri Proteus spp.Reaksi Weil-Felix ini bersifat diferensial, atau diagnostik terhadap penyakit-penyakit tertentu yang disebabkan oleh riketsia karena terjadinya aglutinasi galur-galur ini secara selektif. Uji Aglutinasi biasanya digunakan dalam penentuan golongan darah ABO dan penentuan tipe Rh. * Penggolongan Darah ABO Pada proses transfusi darah, pertimbangan utama ditunjukkan pada interaksi antara antibodi
resipien dan sel-sel donor. Transfusi yang inkompatibel (tidak serasi) akan mengakibatkan terjadinya penggumpalan serta lisis sel yang ditransfusikan oleh isoantibodi dan komplemen serum si donor. Hal ini dapat menyebabkan terganggunya fungsi ginjal pada donor.
Orang-orang dengan golongan darah O, yang memiliki agulitinin anti-A dan anti-B dalam serum darahnya disebut sebagai donor universal, sedangkan golongan darah AB yang memiliki aglutinogen A dan B disebut sebagai resipien universal. *
Penentuan tipe darah Rh Pada sistem Rh tidak dijumpai isoantibodi alamiah terhadap antigen Rh. Namun demikian, seseorang dengan Rh negatif yang menerima sel-sel darah dengan Rh positif akan memberikan respon dengan cara mensintesis antibodi terhadap faktor Rh. Untuk melakukan uji Rh dapat dilakukan dengan menambahkan antigen D pada darah. Penyakit yang dapat ditimbulkan apabila perkawinan terjadi antara rherus yang berbeda adalah eritroblastosis fetalis bada bayi mereka. Hal ini dapat terjadi bila ayah rhesus positif sedangkan ibunya rhesus negatif, rhesus positif lebih dominan terhadap rhesus negatif. . Anak dari pasangan beda rhesus punya kemungkinan 50-100% berrhesus positif. Kemungkinan berrhesus negatif hanya 0-50%. Artinya rhesus si anak lebih mungkin berbeda dengan si ibu. Perbedaan rhesus antara calon bayi dengan ibu akan menimbulkan masalah. Melalui plasenta, rhesus darah janin akan masuk ke peredaran darah si ibu. Selanjutnya ini akan menyebabkan tubuh si ibu memproduksi antirhesus. Melalui plasenta juga, antirhesus ini akan melakukan serangan balik ke dalam peredaran darah si calon bayi. Sel-sel darah merah si calon bayi akan dihancurkan.Pada kehamilan pertama, antirhesus mungkin hanya akan menyebabkan si bayi lahir kuning (karena proses pemecahan sel darah merah menghasilkan bilirubin yang menyebabkan warna kuning pada kulit). Tapi pada kehamilan kedua, problemnya bisa menjadi fatal jika anak kedua juga memiliki rhesus positif. Saat itu, kadar antirhesus ibu sedemikian tinggi, sehingga daya rusaknya terhadap sel darah merah bayi juga hebat. Ini bisa menyebabkan janin mengalami keguguran. 2.1.2 Uji presipitin Pada uji presipitin terjadi reaksi antara satu antigen yang dapat larut dengan antibodi homolognya. Reaksi ini berlangsung dengan poembentukan presipitat (enndapan) kasat mata pada batas permukaan reaktan-reaktan bersangkutan. Reaksi semacam itub biasanya dilakukan dengan menggunakan antibodi (antiserum) dengan jumlah konstan dan antigenj dengan berbagai pengenceran. Dengan mengingat bahwa konsentrasi antibodi itu konstan, maka dapat kita lihat bahwa hanya terbentuk sejumlah kecil presipitat bila antibodinya berlebihan. Dengan ditambahnya konsentrasi antigen, maka jumlah presipitat meningkat dan mencapai maksimum bila perbandingan antara antigen dan antibodinya optimum. Sesudah zone ini, dengan bertambahnya konsentrasi antigen, maka jumlah presipitat menurun lagi. Jadi ada tiga zone reaksi antigen-antibodi pada uji presipitin : zone kelebihan antibodi, zone setara, dan zone kelebihan antigen. Pada zone kelebihan antibodi, semua antigen telah bereaksi dengan antibodi dan telah diendapkan (tidak ada antigen bebas di dalam supernatan). Sebaliknya di dalam zone kelebihan antigen, semua antibodi telah bereaksi dengan antigen (tidak ada antibodi di dalam supernatan),
tetapi kompleks yang terbentuk tetap dapat larut karena banyaknya kelebihan antigen mengikat antibodi menjadi kompleks yang berukuran kecil yang tidak terikat saling membentuk agregat besar yang kasat mata.di dalam zone setara terjadi presipitasi antigendan antibodi secara maksimum (tidak terdapat antigen bebas maupun antibodi bebas di dalam supernatan) karena keduanya terdapat dalam proporsi optimum sehingga dapat membentuk kisi-kisi antigen dan antibodi yang menjadi kasat mata dan tidak dapat larut. Karena alasan ini, maka uji presipitin akan paling bermanfaat bila memungkinkan reaktan berdifusi sampai konsentrasi optimumnya tercapai. A. Uji Cincin Uji cincin adalah uji presipitin yang paling sederhana. Kedalam sebuah tabung bermulut kecil diletakkan larutan antigen diatas larutan serum yang mengandung antibodi. Kedua larutan tersebut akan berdifusi sampai keduanya mencapai konsentrasi optimum untuk terjadinya presipitasi, pada titik tersebut muncullah suatu zona rapat atau cincin endapan diantara kedua larutan tersebut. B. Metode Difusi Agar Ketepatan yang lebih tinggi dan pemisahan komponen di dalam campuran antigen dan antibodi dapat diperoleh dengan cara membiarkan reaktan-reaktan tersebut berdifusi bersama-sama dalam di dalam suatu gel agar. * Metode difusi tunggal. Dalam metode difusi tunggal yang dirancang Oudin, antigen ditaruh diatas gel agar yang mengandung antiserum di dalam suatu tabung reaksi bermulut sempit. Setelah dibiarkan selama beberapa jam atau beberapa hari, antigen itu merembes ke dalam gel membentuk pita-pita endapan pada berbagai taraf, bergantung kepada jumlah dan macam antigen-antibodi yang ada. Karena presipitasi terjadi ketika antigen menembus gel, maka cincin endapan mula-mula muncul di dekat puncak gel dan nampaknya bergerak perlahan ke arah bawah. Efek semacam ini mungkin sesungguhnya disebabkan karena adanya peningkatan jumlah antigen yang menyebabkan endapan itu melarut (karena reaksi antigen-antibodi itu dapat balik). Presipitasi terbentuk kembali pada posisi yang lebih kebawah dalam tabung tersebut, yaitu pada tempat konsentrasi antigen yang optimum. Faktor-faktor yang menentukan taraf untuk terjadinya reaksi ialah ukuran molekul dan konsentrasi nisbi reaktan. * Metode difusi ganda. Oakley dan Fulthorpe memodifikasi teknik Oudin dalam metode difusi tunggal dengan cara menaruh antiserum di dalam agar di dasar tabung reaksi dan melapisinya dengan gel agar lalu diatasnya ditaruh larutan antigen. Kedua reaktan itu berdifusi kearah masing-masing di dalam agar dan presipitasi terjadi pada titik terdapatnya konsentrasi optimum. Ini adalah difusi ganda satu dimensi. Metode difusi ganda dua dimensi yang dirancang oleh Ouchterlony mempunyai keuntungan dibandingkan dengan metode sebelumnya, bahwa berbagai antigen dan antiserum dapat dibandingkan secara langsung. Dalam uji ini, reaktan merembes dari sumur-sumur yang berisi antiserum dan antigen homolog dalam konsentrasi optimum. Bila pita endapan yang dibentuk kedua antigen dan antibodi itu melebur pada titik pertemuannya, maka berarti kedua antigen itu sama. Bila bersilangan, artinya kedua antigen itu berbeda. C. Radioimunoasai Radioimunoasai ialah suatu teknik mikro dengan kepekaan tinggi untuk meentukan jumlah antigen yang amat sedikit. Teknik ini pada hakikatnya merupakan proses dua langkah. Langkah yang pertama menyangkut kompetensi antara antigen uji (tidak berlabel atau tidak radio aktif)
dengan konsentrasi yang tidak diketahui (beragam) dan suatu antigen indikator yang dikenal (berlabel atau radioaktif) dengan konsentrasi yang sudah diketahui (daoat dihitung). Mereka berkompetensi untuk bereaksi dengan antibodi yang dikenal dan jumlahnya terbatas, yang spesifik bagi antigen yang diberi label radioisotop. Ketiga reaktan ini diinkubasikan selama beberapa jam sehingga dapat terjadi reaksi pengikatan antigen-antibodi. Langkah kedua menyangkut ditambahkannya kedalam sistem itu antiserum (anti-antibodi) yang spesisifik dan erhadapnya mampu mengikat komponen antibodi dari kompleks kekebalan yang tebentuk selama inkubasi pada langkah yang pertama. Ini mengakibakan terjadinya presipitasi kompleks antigen-antibodi.Radioaktivitas endapan tersebut ditetapkan di dalam detektor dan penghitung radioisotop. Bila antigen uji pada langkah pertama telah bereaksi dengan antibodi, maka antigen indikator radioaktif tidak dapat bereaksi dengan antibodi itu. Hitungan radioaktifnya akan redah karena antigen indikator tidak terdapat dalam endapan. Namun demikian, bila antigen uji itu tidak bereaksi dengan antibodi, maka antibodi itu tentunya bebas untuk mengikat antigen indikator radioaktif. Maka hitungan radioaktifnya akan tinggi karena antigen indikator terikat dalam endapan. Jadi identitas dan konsentrasi antigen uji dapat ditentukan oleh radioaktivitas endapan. Teknik radioimunoasai ini penting untuk menentukan adanya antigen hepatitis B, yang mungkin ada di dalam serum donor darah yang tidak memperlihatkan gejala (donor yang membawa virus (antigen) tanpa memperlihatkan gejala). Substansi-substansi lain yang dapat diukur dengan radioimunoasai meliputi insulin, testosteron, estradiol, igE manusia, serta bahan bahan lain yang biasanya ada dalam jumlah amat kecil di dalam darah atau air seni. 2.1.3 Uji Fiksasi Komplemen Uji fiksasi (penambatan) komplemen didasarkan pada adanya antibodi penambatan komplemen di dalam serum. Adanya komplemen menyebabkan antibodi ini melisis sel-sel. Tujuan uji fiksasi komplemen adalah untuk menentukan ada atau tidaknya antibodi spesifik di dalam serum. Uji ini terdiri dari dua sistemyaitu sebagai berikut. 1. Sistem penambatan komplemen Dalam sistem ini serum, suspense bakteri (antigen lain), dan komplemen dicampurkan. Bila antigen dan antibodi dari dalam serum itu bergabung, maka komplemen itu dinyatakan tertambat. Karakteristika Sistem Komplemen adalah sebagai berikut. * Komplemen adalah nama yang diberikan terhadap suatu seri protein(plasma) yang terdiri dari 21 protein * Mekanisme kerja sistem ini seperti proses pembekuan darah yang membentuk suatu sistem enzim yang terstimulasi dalam plasma yang kebanyakan adalah proteinase-proteinase. * Ciri spesifik sistem ini : menghasilkan suatu respon yang cepat dan bertingkat terhadap suatu stimulus yang dapat berupa kompleks imun. * Protein plasma yang diberi simbol C diikuti dengan angka, menunjukkan nomor penemuan komplemen tersebut, bukan suatu nomor urutan reaksi. * Protein komplemen utama yaitu : C1 (q,r,s), C2, C3, C4 ,…dst hingga C9, faktor B, faktor D, faktor H, properdin,dll. * Pada setiap tahap aktivasi selalu dihasilkan suatu aktivitas enzim baru yang juga komponen komplemen. * Produk reaksi pertama berlaku sebagai katalis enzimatik yang mengaktifkan komponenkomponen selanjutnya, demikian seterusnya hingga dihasilkan suatu respon bertingkat yang menyerupai cascade. Kerja ini menyerupai “air terjun” yang terus berlangsung tanpa bisa
dihentikan di tengah-tengah reaksi. Fragmen enzim diberi nama a dan b misalnya C2a dan C2b. * Pusat katalitik sistem ini berada pada C3. * Akhir dari aktivitas komplemen adalah : terbentuknya suatu pori fungsional pada membran sel di mana komplemen tersebut melekat, kemudian terjadi perubahan konformasi fosfolipid sel yang menyebabkan lisis dan berakhir dengan kematian sel. Hal ini disebut MAC (membrane attack complex). Sistem Komplemen terdiri dari tiga jalur yaitu sebagai berikut. * Jalur Klasik. Jalur ini diawali dengan stimulasi dari kompleks antigen-antibodi yang kemudian mengaktivasi C1q, C1r, C1s, ketiga komponen ini menghasilkan komponen enzimatik yang menstimulasi C4, C4 menghasilkan komponen enzimatik yang menstimulasiC2, komponen C2 ini kemudian menghasilkan komponen enzimatik dan menstimulasi C3 Convertase (pusat katalitik sistem komplemen). * Jalur MB-Lecitin. Jalur ini diawali oleh stimulasi dari kompleks manosa binding protein pada permukaan patogen yang kemudian menstimulasi MBL, MASP-1, MASP-2. Ketiga komponen ini kemudian mnghasilkan komponen enzimatik yang menstimulasi C4, (seperti halnya pada jalur klasik) C4, C4 menghasilkan komponen enzimatik yang menstimulasiC2, komponen C2 ini kemudian menghasilkan komponen enzimatik dan menstimulasi C3 convertase (pusat katalitik sistem komplemen). * Jalur Alternatif. Jalur ini diawali oleh stimulasi dari permukaan patogen yang mengandung LPS (Lipopolisakarida) yang kemudian langsung menstimulasi C3, C3 menghasilkan komponen enzimatik yang menstimulasi faktor B, faktor B menghasilkan komponen enzimatik yang menstimulasi fakator D, faktor D kemudian menghasilkan komponen enzimatik yang akhirnya mensimulasi C3 convertase. Setelah Ketiga jalur tersebut mengaktivasi C3 Convertase, C3 convertase ini kemudian menghasilkan C3a, C5a dan C3b. C3a, C5a kemudian menstimulasi peptida mediator untuk inflamasi dan menstimulasi rekrutmen sel fagositik. C3b kemudian berikatan dengan reseptor komplemen pada sel fagositik dan kemudian menstimulasi opsonisasi dan penghilangan kompleks imun. Selain itu, C3b juga menstimulasi komponen terminal komplemen yang kemudian terjadi reaksi cascade : menstimulasi C5b, C6,C7,C8,C9 dan akhirnya membentuk Membran attack complex dan menyebabkan lisis pada patogen. Persamaan atara ketiga jalur tersebut adalah sebagai berikut. o Ketiganya sama-sama akan mengaktivasi pusat katalitik sistem komplemen yaitu C3; Ketiganya pada akhirnya akan menginduksi C9; dan ketiganya sama-sama membentuk membran attack complex. Perbedaan atara ketiga jalur tersebut adalah sebagai berikut. o Stimulus yang menginduksi masing-masing jalur berbeda-beda. Jalur Lecitin distimulasi oleh kompleks antigen antibodi, Jalur MB-Lecitin distimulasi oleh kompleks manosa-binding Lecitin, dan Jalur Alternatif distimulasi LPS (lipopolisakarida) dari permukaan patogen. o Komponen yang distimulasi oleh stimulus masing-masing jalur berbeda. Jalur Lecitin selanjutnya mengaktivasi C1q,C1r,C1s, C4 dan C2, jalur MB Lecitin selanjutnya mengaktivasi MBL, MASP-1, MASP-2, C4 dan C2, dan jalur alternatif mengaktivasi C3, B,dan D. 2.
Sistem indikator hemolitik Antibody hemolitik (hemolisin)dibuat dengan cara mengimunisasi kelinci dengan sel-sel darah merah biri-biri. Serum dari kelinci yang sudah diimunisasi dengan sel biri-biri ini dicampur dengan sel-sel darah merah biri-biri. Bila komplemen tertambat digunakan di dalam
reaksi antibodi uji dan atigen maka tidak akan terjadi hemolisis. Oleh sebab itu, reaksi hemolitik meninjukan uji negatif. Ini menunjukan bahwa semua reaktan didalam uji fiksasi komplemen harus disesuaikan dengan tepat. Uji fiksasi komplemen terutama bermanfaat bila kombinasi antara antigen uji dan antibodi tidak menimbulkan reaksi kasat mata seperti yang terjadi pada aglutinasi dan presipitasi. Uji fiksasi komplemen ini banyak digunakan secara luas di dalam diagnosis laboratories penyakit menular, termasuk penyakit yang disebutkan oleh bakteri, virus, protozoa, dan cendawan. Salah satu penerapan yang diketahui paling baik dari uji ini adalah uji Wasserman untuk sifilis, meskipun uji ini telah diganti oleh uji-uji lain. 2.2 Diagnosis Penyakit Infeksi dengan Uji Serologi Khusus 2.2.1 Pengertian Elisa Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat. 2.2.2 a.
Macam
-
Macam
Teknik
Elisa
Indirect Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah: 1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji. 2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate. 3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar. 4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang,
bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking. 5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.\ 6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat. 7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia. 8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya. Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. b.
Direct Prinsip elisa langsung tidak ajuh berbeda dengan elisa tidak langsung. Pada elisa langsung, antigen secara langsung diadsorpsikan ke substrat padat. Permukaan substrat dicuci dan antibodi akan ditempeli enzim yang digunakan untuk menunjukkan adanya antigen. Hasilnya akan terlihat jika ditambahkan subtrat. Pada konfigurasi ini diperlukan antiserum yang spesifik untuk antigen tersebut. Antiserum ini harus dikonjugasikan dengan enzim. Perbandingan elisa langsung dan tidak langsung dapat dilihat pada gambar berikut. c.
ELISA Sandwich Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibodi primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi. Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi. Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara
antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi detektor, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibodi detektor yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: * Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang microtiter * Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).
d.
ELISA Avidin-Biotin Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibodi, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan pada teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detektor (antigen bertaut enzim signal, bersifat optional apabila antibodi yang diinginkan tidak tertaut dengan enzim signal). Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin yang tertaut dengan suatu antibodi avidin dengan mengubah antibodi avidin menjadi antibodi streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin (pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.
e.
ELISPOT ELISPOT adalah metode umum untuk memantau respon imun pada manusia maupun hewan. Metode ini dikembangkan oleh Cecil Czerkinsky pada tahun 1983. Uji ELISPOT merupakan versi modifikasi yang dikembangkan dari ELISA sebelumnya. Tes ELISPOT pada awalnya dikembangkan untuk menghitung sel B yang mensekresi antigen-antibodi spesifik, dan kemudian telah diadaptasi untuk berbagai tugas, khususnya identifikasi dan penghitungan sitokin sel yang memproduksi pada tingkat sel tunggal. Secara sederhana, pada kondisi yang sesuai uji ELISPOT memungkinkan visualisasi dari produk yang keluar dari sel diaktifkan atau menanggapi individu. Setiap tempat yang berkembang di uji mewakili sebuah sel reaktif tunggal. Dengan demikian, uji
ELISPOT menyediakan baik informasi (jumlah menanggapi sel) kualitatif (jenis protein kekebalan tubuh) dan kuantitatif. Berdasarkan sensitivitas dari tes ELISPOT, analisis frekuensi populasi sel langka (misalnya, antigen-spesifik tanggapan) yang tidak mungkin sebelumnya, sekarang relatif mudah. Sensitivitas yang luar biasa ini sebagian karena produk dapat dengan cepat ditangkap sekitar sel mensekresi. Baik sebelum diencerkan dalam supernatan, ditangkap oleh reseptor sel yang berdekatan, atau terdegradasi. Hal ini membuat tes ELISPOT jauh lebih sensitif dibandingkan pengukuran ELISA konvensional. Batas deteksi adalah di bawah 1/100, 000 render dalam menghitung sel aktif yang memproduksi. Hal ini memungkinkan banyak proses analisis yang otomatis, dan memungkinkan tingkat akurasi yang lebih besar daripada apa yang dapat dicapai dengan menggunakan pemeriksaan manual. Alat tes ELISPOT menggunakan teknik yang sangat mirip dengan sandwich ELISA. Adapun teknik penggunaan ELISPOT adalah sebagai berikut. 1. Antibodi monoklonal (lebih disukai untuk spesifisitas yang lebih besar) atau antibodi poliklonal penangkapan yang dilapisi secara aseptik ke lempeng (fluoride polyvinylidene)didukung PVDF. Antibodi ini dipilih untuk kekhususan mereka untuk analit yang bersangkutan. 2. Sel dirangsang dengan tepat yang dipipet ke dalam plate dan lempeng ditempatkan menjadi 37 ° C dilembabkan CO2 inkubator untuk jangka waktu tertentu. 3. Selama periode inkubasi, antibodi bergerak langsung di sekitar dari sel-sel mensekresi, mengikat analit yang dilepaskan. Misalnya yang dieksresikan adalah sitonin. 4. Kemudian mencuci sel-sel dan zat terikat, sebuah antibodi spesifik terbiotinilasi poliklonal (alkaline phospathase conjugated streptavidin) untuk analit dipilih akan ditambahkan ke plate. Antibodi ini adalah reaktif dengan epitop yang berbeda dari sitokin target dan dengan demikian digunakan untuk mendeteksi sitokin ditangkap. 5. Selanjutnya setelah mencuci untuk menghilangkan antibodi terikat terbiotinilasi, sitokin terdeteksi kemudian divisualisasikan menggunakan avidin-HRP dan substrat pencetus (misalnya, AEC, BCIP / NBT). 6. Sebuah endapan berwarna biru-hitam terbentuk dan muncul sebagai bintik-bintik di lokasi lokalisasi sitokin, dengan setiap titik individu yang mewakili sebuah sel yang mensekresi analit individu. Bintik-bintik dapat dihitung dengan sistem otomatis pembaca ELISPOT atau manual, menggunakan sebuah mikroskop stereo.
f.
Elisa Kompetitif (Elisa Pemblok) Teknik ELISA kompetitif merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu. Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu kompetitor ke dalam lubang microtiter. Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi. * Pada pendekteksian antigen 1. Microtiter diisi antibodi spesifik yang dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik tertaut enzim signal, sehingga antibodi spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter. 2. Microtiter dibilas untuk membuang antibodi spesifik yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. 3. Kemudian larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam
lubang-lubang microtiter sehingga terjadi kompetisi antara antigen spesifik tertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibodi spesifik. 4. Dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. 5. Lalu, kedalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen yang telah berinteraksi dengan antibodi spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. 6. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibodi spesifik. * Pada pendeteksian antibody 1. Microtiter diisi antigen spesifik yang dapat berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan maupun antibodi spesifik tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter. 2. Microtiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dindinglubang microtiter. 3. Lalu larutan yang mengandung antibodi spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibodi spesifik tertaut enzim signal dengan antibodi yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antigen spesifik. 4. Dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi spesifik tertaut enzim signal atau antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. 5. Lalu kedalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibodi spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. 6. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antibodi yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibodi atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesifisitas dari antibodi dan antigen. 2.2.3 Kelebihan dan Kekurangan Teknik ELISA * Kelebihan 1. Teknik pengerjaan relatif sederhana. 2. Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja,sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi) 3. Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi. 4. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antaraantibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik) 5. Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
* Kekurangan 1. Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA lebih banyak jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen 2. Harga antibody monoclonal relative lebih mahal daripada antibody poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relative cukup mahal. 3. Pada beberapa teknik ELISA dapat terjadi kesalahan pengujian akibat control negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking, sehingga antibody sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibody bertaut enzim signal dan menimbulkan signal. 4. Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relative cepat sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat. (Pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi)
