Banyak strategi yang berbeda fasa terbalik kromatografi cair kinerja tinggi (RP-HPLC) pengembangan metode yang digunakan saat ini. Makalah ini menjelaskan strategi untuk pengembangan sistematis tekanan ultrahigh cair kromatografi (UHPLC atau UPLC) metode menggunakan 5 cm × 2.1mm kolom dikemas dengan sub-2 mparticles * dan simulasi komputer (DryLab ® paket). Data keakuratan mod komputer eling di Space Desain bawah tekanan kondisi ultrahigh dilaporkan. Akurasi yang dapat diterima untuk ini prediksi dari model komputer disajikan. Karya ini menggambarkan strategi pengembangan metode, dengan fokus pada pengurangan waktu hingga faktor 3-5, dibandingkan dengan pengembangan metode HPLC konvensional dan bagian pameran dari elaborasi Space Desain seperti yang diminta oleh FDA dan ICH Q8R1. Selanjutnya makalah ini menunjukkan ketepatan waktu prediksi retensi pada tekanan tinggi (laju peningkatan aliran) dan menunjukkan bahwa bantuan simulasi komputer dapat diterapkan dengan presisi cukup untuk aplikasi UHPLC (p> 400 bar). Contoh cepat dan pengembangan metode efektif dalam analisis farmasi, baik untuk dan isokratik pemisahan gradien disajikan. Ungkapan "kromatografi cair kinerja tinggi" diciptakan oleh Horvath et al. pada tahun 1967 [1]. Seperti bereksperimen dalam lab di Yale dengan dangkal porous "pellicular" bahan, tekanan naik pertama kalinya di atas 1000 psi, Horvath mengatakan, "ini bukan LC lagi, ini adalah LC tekanan tinggi (HPLC)". Dan visioner kerja konsekuen lain Hungaria, Halász dengan partikel kecil 35 tahun yang lalu meletakkan fundaments untuk kolom dikemas dengan partikel halus dan ia membuat pemisahan 15 senyawa mungkin dalam 60 detik pada awal tahun 1974 [2]. Pemahaman dasar-dasar kromatografi fasa terbalik (RPC) dilakukan oleh Csaba Horvath dan timnya di Yale, adalah sangat mempengaruhi perkembangan masa depan dalam HPLC seperti konsep Space Desain dan DryLab ® sudah pada tahun 1976 [3]. Pekerjaan terhadap partikel yang lebih kecil dan lebih kecil dilanjutkan dan di tahun 2004 Waters memperkenalkan teknologi baru yang disebut UPLC menawarkan kemungkinan-kemungkinan baru untuk mengurangi waktu analisis dengan faktor 3-4 menggunakan tekanan tinggi hingga 1000 bar. Optimalisasi selektivitas dalam praktek HPLC saat ini berarti untuk menemukan kondisi yang paling baik untuk pemisahan tertentu. FDA meminta dukungan ilmiah metode seperti yang dijelaskan dalam ICHQ8R1 [4]. Praktis langkah pertama adalah untuk memilih fase diam yang tepat, yang memberikan faktor pemisahan yang wajar (k> 1). kinerja kolom kriteria lainnya sejumlah plat minimum ca. 10.000, yang diperlukan untuk pemisahan dengan simetri suitablepeak. suitablepeak. Saat ini lebih dari 400 yang tersedia secara komersial kolom fase balik telah ditandai dalam hal selektivitas relatif mereka, berdasarkan lima-kolom interaksi solut oleh subtractionmodelhidrofobik [5]. Setelah memilih kolom, komposisi fase gerak, waktu
gradien dan suhu dan faktor lain yang harus dioptimalkan untuk mendapatkan pemisahan yang memuaskan dan menetapkan Space Desain. Menurut ICH Q8 Desain Ruang berarti kombinasi multidimensi dan interaksi dari variabel input (misalnya, atribut material) dan parameter proses yang telah ditunjukkan untuk memberikan jaminan kualitas. Dalam kebanyakan kasus pemisahan dapat dicapai dengan kolom yang sesuai dan varian yang berbeda dari parameter fase gerak. Ada strategi yang berbeda ofHPLCmethod pengembangan yang digunakan saat ini. Semua pendekatan isokratik yang memakan waktu dan melelahkan dan memerlukan konsumsi pelarut cukup. pemodelan Komputer adalah alat yang berguna untuk mengoptimalkan pemisahan [6]. Tanpa meninjau dan memberikan laporan melelahkan tentang segmen pengembangan ofmethod dan optimalisasi ringkasan singkat diberikan di sini. Dalam upaya untuk meningkatkan efisiensi pengembangan ofmethod dan memaksimalkan informasi tentang kekhususan metode, beberapa program com-putermodeling telah dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir 20. Themost strategi andwidespread berhasil mengoptimalkan Desain Spacemainly bymeasuring dan memvisualisasikan efek dari komposisi fase themobile: gradien waktu dan bentuk, pH, kekuatan ion, eluen terner, konsentrasi aditif dan suhu. Program yang sama juga tersedia, seperti LC-'s ACD Simulator (Advanced Kimia Pembangunan) dan ChromSword (Merck Darmstadt). Program menggunakan nomor yang jelas kecil percobaan pada fase stasioner tertentu, memprediksi pemisahan di bagian-bagian dari Space Desain berdasarkan perubahan komposisi fase inmobile, cara elusi (baik isokratik atau gradien), suhu, pH atau parameter kolom tersebut sebagai kolom panjang, diameter, ukuran partikel dan aliran-rate [7]. Snyder, Dolan dan rekan kerja yang direkomendasikan berjalan dasar untuk desain eksperimen multifaktor sudah pada tahun 1996 [8]. Pendekatan khas adalah untuk secara bersamaan model selektivitas suhu dan kecuraman gradien pada kolom RP dipilih untuk menjalankan dasar awal [9,10]. Dalam hal ini berjalan dasar adalah mereka percobaan, di mana komputer-model yang "berbasis" (dihitung) untuk dapat ca model. 5000 eksperimen dengan presisi a> akurasi 97%. Untuk konvensional dan panjang 25 cm kolom 15, 1-2mL/min aliranrate dan air gradien% asetonitril-500-100 dalam waktu TG1 = 2030menit dan tg2 = 60-90menit yang disarankan untuk memberikan prediksi yang akurat untuk pengembangan furthermethod. Dengan bantuan resolutionmaps - yang menunjukkan resolusi kritis dari puncak untuk dipisahkan [11] - kolom suhu programand gradien dapat dengan cepat dan efisien dioptimalkan. paket perangkat lunak lain menggunakan database disesuaikan atau database vendor metode kromatografi, dimana kondisi metode dapat
diprediksi dari struktur senyawa [12,13]. Sistem pakar (misalnya EluEx) memprediksi pKa dan log P (oktanol-air partitioncoefficients) dari zat terlarut dan menyarankan komposisi fase gerak untuk pemisahan [14]. Pendekatan ini bekerja hanya, apabila seluruh struktur dalam sampel yang akan dipisahkan diketahui. Karena penurunan rutinitas metode optimasi isokratik dan nilai informatif gradien linier dari 5 sampai% asetonitril 100 atau metanol, kebanyakan pengguna lebih memilih untuk menjalankan gradien dan menemukan puncak substansi eksperimental agak cepat. Namun dalam bidang desain obat pKa dan nilai log P memainkan peranan penting untuk menemukan obat dengan aktivitas biologi tinggi. Strategi otomatis untuk pengembangan metode HPLC (ChromSword) telah dilaporkan oleh Galushko et al. [15], yang menggabungkan strategi yang berbeda. Krisko et al. menyajikan strategi, yang menerapkan suatu sistem seleksi otomatis kolom dan serangkaian kolom KCKT, bervariasi dan aktivitas silanol hidrofobik, dalam kombinasi dengan perangkat lunak pemodelan untuk mengembangkan metode kromatografi [7]. Secara teoritis pendekatan ini independen dari tipe kolom dan geometri. Setelah fewnumber dasar awal menjalankan kondisi kromatografi yang optimal dapat ditemukan segera melalui simulasi komputer dan prediksi. Penggunaan kolom pendek (20-50mm) dan kecil (sub-2 m *) partikel menawarkan kemungkinan untuk mengurangi waktu analisis tanpa kehilangan resolusi [16-18]. Karena kecepatan dan sensitivitas, partikel kecil mendapatkan perhatian yang cukup besar dalam beberapa tahun terakhir untuk dan biomedis analisis farmasi [19-23]. Tujuan dari pekerjaan kami adalah untuk menunjukkan, bahwa metode pengembangan dibantu-alat komputer dapat diterapkan dalam kromatografi cair cepat dengan keaslian yang tinggi dan efisiensi untuk mengeksplorasi bagian-bagian dari Ruang Desain. Metode dikembangkan untuk jenis fase stasioner hybrid (Beh C18), yang merupakan kolom yang populer dalam praktek UHPLC, dan untuk lainnya silika-basedsub * mpackedmaterialsusing theDryLab paket ®2. Data yang disajikan untuk akurasi prediksi-tion komputer, ketika sub-2 m * dikemas kolom diterapkan untuk pengembangan metode sistematis. Contoh dari industri farmasi (kotoran / degradasi profil, membersihkan analisis kontrol) dilaporkan untuk pemisahan netral dan juga untuk senyawa dasar. Pada ultrahigh-tekanan waktu retensi secara teoritis fungsi kompleks tekanan. Fenomena ini dilaporkan beberapa kali [24], oleh karena itu memotivasi untuk mempelajari bagaimana program simulasi komputer yang berfungsi pada tekanan tinggi.
2. Eksperimental 2.1. Kimia, kolom Asetonitril dan methanol (gradient grade) dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman). Untuk air pengukuran dipersiapkan baru-Q peralatan usingMilli (Milli-Q gradien A10 oleh Millipore). Bahan referensi dan sampel, seperti etinilestradiol dan kotoran dan degradasi produk, estradiol, dienogest, finasteride, gestodene, asetat norethisterone, levonorgestrel dan bicalutamid dan kotoran yang diproduksi oleh Gedeon Richter Plc (Budapest, Hungaria). Duloxetine dan kotoran dan produk degradasi dibeli dari Nosch Labs (Hyderabad, India). Waters UPLCTM Beh C18 kolom dengan ukuran partikel 1,7 m * (50mm × 2.1mm) dibeli dari Perairan Ltd, Budapest. Pinnacle Restek DB kolom C18, 50mm × 2.1mm, 1.9 * m dan Restek Pinnacle DB kolom Bisphenol, 50mm × 2.1mm, 1.9 * m dibeli dari Lab-Comp Ltd, Budapest. Zorbax SB C1 kolom (Agilent) 50mm × 2.1mm, 1,8 * m dibeli dari Kromat Ltd, Budapest. 2.2. Peralatan, softwareUPLC dilakukan menggunakan sistem Acquity Waters dilengkapi dengan pengiriman pompa pelarut biner, suatu sampler otomatis, array detektor foto dioda dan perangkat lunak Memberdayakan. Sistem UPLC dibeli fromWaters Ltd Budapest, Hungaria. Sistem UPLC telah a5 * L loop injeksi dan 500 sel aliran NL (path panjang = 10 mm). Volume tinggal sistem diukur akan 0.12mL. Metode pengembangan dilakukan dengan menggunakan DryLab ® 2010 software optimasi kromatografi (Molnar-Institut, Berlin, Jerman). Log P (oktanol-air koefisien partisi) nilai yang diprediksi oleh ChemDesk (Obat Kimia di meja tulis Anda), yang diberikan olehdibantu desain dan penyusunan Komputer (CADD) dan tersedia di Gedeon Richter Plc. 2.3. Sampel yang digunakan untuk pengembangan metode Pada contoh pertama (Bagian 3.1) sampel tablet berduri dikromatografi. Kotoran dikenal dan degradants dari etinilestradiol sebagai 6-alpha-hydroxy-etinilestradiol, 6-beta-hydroxy-etinilestradiol,keto-etinilestradiol, estradiol 6 dan didehydro-etinilestradiol saham solusi-9,11 diselesaikan dalam asetonitril, kemudian naik menjadi tablet sampel solusi dan dilutedwith asetonitril-air (50:50) (V: V). Untuk contoh yang dijelaskan dalam Bagian 3.2, sampel representatif untuk membersihkan validasi sampling dibuat. Permukaan garis peralatan di pabrik kami terdiri dari sebagian besar>) 95% stainless steel (tetapi
ada permukaan lain, yang terbuat dari plexi-glass, polytetrafluorethylene (PTFE), silikon dan tekstil. Ref-erence solusi dari senyawa minat kami (dienogest, estradiol, etinilestradiol, finasterid, gestodene, levonorgestrel dan asetat norethisterone), kosong dan solusi berduri sampel dari permukaan yang disebutkan di atas dan solusi plasebo disuntikkan selama berjalan dasar awal. steroidswere itu dibubarkan in3.1. Contoh untuk pengembangan metode gradien untuk senyawa netral (simultan program gradien dan suhu kolom untuk pemisahan UHPLC) Contoh ini menggambarkan yang cepat dan efisien mengembangkan bangan metode yang diterapkan untuk penentuan kotoran dan produk degradasi dari farmasi bahan aktif steroid (etinilestradiol) dari tablet, memanfaatkan kekuatan pemisahan m-2 * sub dikemas kolom. Bahan aktif dan kotoran dan degradants (6-alpha-hydroxy-etinilestradiol, 6beta-hydroxy-etinilestradiol, 6-keto-etinilestradiol, 9,11 - didehydroetinilestradiol dan estradiol) adalah senyawa netral polar, sehingga tidak diperlukan untuk menambahkan buffer ke fase mobile. Asetonitril dipilih sebagai pengubah organik karena viskositas rendah dan menguntungkan UV cutoff. Simultan optimasi program gradien dan suhu kolom dilakukan dengan menggunakan kolom C18 Pinnacle Restek dengan ukuran partikel 1,9 m * (50mm × 2.1mm) dengan asetonitril air sebagai fase gerak. Aliran-rate yang ditetapkan sebesar 0.5mL/min. Fase gerak "A" terdiri dari% asetonitril 5 dan 95% air, fase gerak "B" adalah asetonitril. Dua dasar gradien dengan lereng yang berbeda (7 dan 21min gradien waktu) dilakukan pada dua suhu yang berbeda-membangun struktur kolom (35 dan 65 ◦ C). injeksi volumewas 1 * L. Tablet sampel dibubuhi dengan kotoran dikenal dan produk degradasi dikromatografi. Tujuan kami adalah untuk mencapai resolusi dasar dalam analisis waktu sesingkat mungkin. Hasilnya akan ditampilkan sebagai peta resolusi pada Gambar. 1, dimana nilai terkecil resolusi (Rs) dari setiap dua puncak kritis dalam chromatogramis diplot sebagai fungsi dari dua parameter eksperimental bervariasi secara bersamaan. Dalam hal ini parameter gradien waktu dan suhu kolom. Hal ini dapat dilihat bahwa gradien cepat dengan lereng sangat curam (waktu gradien = 2.3min) dapat pro-vide resolusi tertinggi jika suhu kolom dijaga pada 50 ◦ C. Kondisi optimum yang diprediksi telah ditetapkan dan-pemerintah kromatogram percobaan yang dicatat. Gambar. 2 menunjukkan kromatogram diprediksi dan eksperimental. Untuk menentukan ketepatan pendekatan newfast kita (7 dan 21min gradien dasar berjalan) diterapkan selama 5 cm × 2.1mm dikemas (sub-2 m *) kolom, dan eksperimental diperoleh kromatogram
diprediksi (retensi kali dan resolusi) dibandingkan (Tabel 1 ). Retensi waktu diperkirakan berada dalam perjanjian yang baik dengan yang eksperimental; rata-rata kesalahan waktu retensi adalah 1,6% (lihat Tabel 1), yang dapat dianggap sebagai prediksi yang sangat akurat dengan profil seperti gradien cepat. Rerata resolusi diprediksi (Rs) kesalahan adalah 6,6%. Kesalahan nilai resolusi berisi kesalahan waktu retensi dan juga ketidakpastian prediksi lebar puncak. Dengan demikian prediksi ini bisa dianggap sebagai paket fromthe dukungan perangkat lunak yang akurat DryLab ® dan menyarankan dasar berjalan gradien cepat (7 dan 21min) dapat diterapkan dalam pekerjaan rutin sehari-hari sehingga menghemat waktu yang signifikan. Waktu yang dihabiskan formethod pembangunan di contoh ini adalah sekitar 5 jam (2 kali gradien suhu × 2 × 5 sampel), dan kemudian predictedmethod itu diverifikasi dalam percobaan dan terbukti menjadi pemisahan yang cocok. Sejak itu thismethodwas divalidasi dan diterapkan di laboratorium kami untuk analisis rutin. Sebelumnya lama 25min tion konvensional-memisahkan diterapkan untuk tugas ini, sehingga waktu analisis disingkat dengan faktor sekitar 10. 3.2. Contoh untuk metode pengembangan isokratik untuk senyawa netral (simultan suhu% kolom Band isokratik untuk pemisahan UHPLC) contoh kedua kami menjelaskan proses pengembangan suatu metode generik, yang diterapkan untuk penentuan simultan dari tujuh residu API steroid (dienogest, estradiol, etinilestradiol , finasterid, gestodene, levonorgestrel dan asetat norethisterone) dalam mendukung pembersihan analisis kontrol di daerah formulasi. Dalam kasus steroid (senyawa netral) kelarutan (log P oktanol-air koefisien partisi) adalah salah satu sifat yang paling penting tentang selektivitas. Dalam kondisi kromatografi cocok diekstrapolasi faktor retensi dan isokratik berhubungan baik dengan oktanol-air partisi (log P) atau distribusi koefisien [25]. Dalam hal ini log P nilai dari senyawa yang akan dipisahkan adalah diperkirakan sebelumnya (dengan ChemDesk) dan karena kecil perbedaan dalam nilai P log (log Pdienogest: 3,013, log Pestradiol: 3,784, Pethinylestradiol log: 3,860, log Pfinasterid: 3,813, log Pgestodene: 3,215, log Plevonorgestrel: 3,490 dan log Pnorethisterone asetat: 4,466) isokratik
berjalan dasar dianggap. Simultan optimasi B% isokratik dan kolom-tem perature dilakukan dengan menggunakan kolom C18 Waters UPLCTM Beh dengan ukuran partikel 1,7 m * (50mm × 2.1mm) dengan berair-ace tonitrile sebagai fase gerak. Aliran-rate yang ditetapkan sebesar 0.5mL/min. The fase gerak "A" terdiri dari% asetonitril 5 dan 95% air, maka mobile fase "B" adalah asetonitril. Dua berjalan dasar isokratik (35 dan 55% B) pada dua suhu kolom yang berbeda (45 dan 60 ◦ C) dicapai. Volume injeksi adalah 1 * L. Resolusi diperoleh peta ditunjukkan pada Gambar. 3. Dalam hal ini resolusi kritis dalam kromatogram diplot sebagai fungsi dari% fase gerak "B" dan suhu. resolutionmap menunjukkan bahwa pemisahan dicapai dengan 40 "B" eluen% pada 50 ◦ C akan memberikan resolusi yang cukup. Aliran-rate diangkat menjadi 0.65mL/min melakukan sangat cepat pemisahan. Kondisi optimum yang diprediksi telah ditetapkan dan pengalamankromatogram mental dicatat. Gambar. 4 menunjukkan diprediksi dan eksperimental kromatogram. Ketepatan prediksi dalam kasus% isokratik B "-temperatur model" di bawah kondisi UHPLC dievaluasi dengan perbandingan diprediksi dan eksperimental diperoleh retensi kali dan resolusi (Tabel 2).
Prediksi dan eksperimen diperoleh kromatogram (Retensi kali dan resolusi) dibandingkan. Yang diprediksi retensi timeswere di agreementwith unggul eksperimental orang, rata-rata kesalahan waktu retensi adalah 0,74% (lihat Tabel 2). Resolusi alsowere predictedwith akurasi yang tinggi (rata-rata kesalahan adalah 3,76%). Jadi kita bisa menyatakan bahwa bantuan simulasi komputer tion bisa presisi tinggi appliedwith untuk kondisi UHPLC di kasus simultan B% isokratik dan kolom-tem perature. Dalam contoh ini waktu yang dihabiskan pada pengembangan metode kurang dari 4 jam 3.3. Contoh untuk pengembangan metode gradien untuk dasar senyawa (simultan program gradien dan pH fase gerak untuk pemisahan UHPLC) Simultan optimasi program gradien dan mobile pH fasa dilakukan dengan menggunakan kolom C18 SB Zorbax dengan ukuran partikel 1,8 m * (50mm × 2.1mm) dengan metanol dan buffer sebagai fase gerak. Aliran-rate yang ditetapkan sebesar 0.5mL/min. The fase gerak "A" terdiri dari% metanol 5 dan% buffer 95 (10 mm fosfat + 0,1% trietilamina), fase gerak "B" adalah 80% metanol dan 20 buffer%. Dua dasar lereng gradientswith berbeda (7 dan 21min gradien waktu) dijalankan pada tiga berbeda mobile nilai pH fasa (pH1 6.2, 6.6 dan PH3 pH2 7.0). Vol injeksi-
ume adalah 3 * L. Kapsul sampel dibubuhi dengan kotoran dikenal dan produk degradasi dikromatografi. Tujuan Kami adalah untuk mencapai resolusi baseline dan berfokus pada duloxetine duloxetine-3-isomer puncak. Sebelumnya beberapa upaya dilakukan untuk memisahkan ini puncak-pasangan pada sistem konvensional dalam Labora kita tory, namun upaya ini tidak berhasil. Sekarang pengaruh pH pada selektifitas sistematis dievaluasi dan disimulasikan. Dengan bantuan peta resolusi sebagai fungsi pH, dan efisiensi (Kapasitas puncak) sub-2 partikel m *, pemisahan awal dapat dicapai antara puncak kritis pasangan-disebutkan. Peta resolusi yang diperoleh ditunjukkan pada Gambar. 5. Dalam hal ini resolusi penting dalam kromatogram tersebut diplot sebagai fungsi gradien waktu (menit) dan pH fase gerak. Peta Resolusi menunjukkan bahwa pemisahan dicapai pada pH 6,7 akan memberikan cukup resolusi dalam 10min. Prediksi kondisi optimum adalah menetapkan dan kromatogram eksperimental dicatat. Gambar. 6 menunjukkan prediksi dan eksperimental kromatogram. Ketepatan prediksi dalam kasus gradien tahap pH model program mobile-bawah kondisi UHPLC wasevaluated dengan perbandingan diprediksi dan eksperimental diperoleh retensi kali dan resolusi (Tabel 3). Retensi waktu diperkirakan juga dalam perjanjian yang sangat baik
dengan fase ones.Whenmobile eksperimental pHwas dioptimalkan rata-rata errorswas waktu retensi di bawah 2% (lihat Tabel 3). The rata-rata (resolusi Rs) kesalahan diperkirakan sebesar 6,5%. Waktu yang dihabiskan untuk metode pembangunan di contoh ini dibutuhkan kurang lebih 7 jam (2 kali gradien × 3 pH), predictedmethodwas thenthe diverifikasi dalam percobaan dan terbukti menjadi pemisahan yang tepat. Previmenerus puncak duloxetine dan duloxetine-3-isomer gagal terpisah dengan metode konvensional tetapi dengan metode ini UHPLC pemisahan pasangan ini-puncak kritis dengan resolusi Rs = 1,89 adalah mungkin untuk mencapai dalam 10 menit. Contoh ini menggambarkan ketepatan waktu retensi prediksition ketika aliran-tingkat berubah dibandingkan dengan, seperti yang ditetapkan selama menjalankan eksperimen dasar. Yang cepat dan efisien pembangunan bangan metode yang digunakan untuk penentuan kekotoran bahan farmasi aktif (bicalutamid) fromtablet, ISKlizing kekuatan pemisahan dari 2 * m-sub dikemas kolom dilakukan. Bahan aktif dan kotoran nya (bicalutamid, bicalutamid-beta-anilin dan bicalutamid-beta-sulphenyl) bersifat polar senyawa netral. Simultan optimasi program gradien dan kolom suhu dilakukan menggunakan Restek Pinnacle DB Bisphenol columnwith ukuran partikel 1,9 m * (50mm × 2.1mm) dengan aque-
ous asetonitril sebagai fase gerak. Aliran-rate yang ditetapkan sebesar 0.4mL/min. Fase gerak "A" terdiri dari% asetonitril 5 dan 95% air, fase gerak "B" adalah asetonitril. Dua dasar gradients dengan lereng yang berbeda (7 dan waktu 21min gradien) adalah dilakukan pada dua suhu kolom yang berbeda (35 dan 65 ◦ C). Volume injeksi adalah 2 * L. Tablet sampel berduri dengan kotoran dikenal dikromatografi. Tujuan kami adalah untuk mencapai pemisahan cepat dan kemudian memprediksi waktu retensi untuk berbeda (peningkatan)-laju aliran berdasarkan berjalan awal perterbentuk pada 0.4mL/min. Sebuah pemisahan gradien cepat (30-68% B, di 6min) dapat memberikan resolusi yang sesuai jika kolom-tempera mendatang disimpan di 45 ◦ C (Gbr. 7). Prediksi kondisi optimum adalah menetapkan dan recordedwith chromatogramswere eksperimen yang berbeda flow-rate (0.4, 0.5, 0.6 dan 0.8mL/min). Gambar. 8 menunjukkan diprediksi dan eksperimental kromatogram. Pada pandangan pertama kali retensi diperkirakan berada dalam baik setujupemerintah dengan yang eksperimental. Tapi, ketika diprediksi dan nilai eksperimental diplot terhadap tekanan (Gbr. 9), signifikan perbedaan dapat dilihat antara lereng dipasang kurva. Kurva dipasang pada waktu retensi eksperimental thanthe lereng terjal curvesfitted onpredicted ineachcase nilai.
Jadi akurasi prediksi komputer benar-benar tergantung pada diterapkan tekanan (flow-rate), tetapi ketika aliran-rate ditingkatkan dengan faktor 1,2-2,0 dibandingkan dengan nilai yang diterapkan untuk dasar berjalan-the-dibantu simulasi komputer dapat diterapkan dengan shufmencukupi presisi untuk aplikasi UHPLC. Rata-rata retensi kesalahan waktu tidak melebihi 5% ketika aliran-rate (tekanan) adalah digandakan (Gbr. 10). Ketika aliran-rate ditingkatkan dengan faktor 1,25 dan 1,50 - dibandingkan dengan aliran diterapkan untuk dasar berjalan - error prediksi sekitar 3 dan 4% (masingtively). Percobaan lanjutan akan dicapai untuk studi ini fenomena. Pekerjaan lebih lanjut direncanakan ke-tiga-dimensi optimiza tion dari contoh di atas untuk dapat menunjukkan pengaruh lebih maka faktor dasar (kemiringan lereng dan kolom-marah ature) oleh studi sistematis dari komposisi terner dan pH pada saat yang sama. Dengan cara ini kita ingin menjelajahi Desain Ruang yang lebih rinci sesuai dengan permintaan dari peraturan berwenang untuk membuktikan secara ilmiah, bahwa metode kuat dan diandalkan. 4. Kesimpulan Kekuatan pemisahan kolom pendek dikemas dengan sub-2 m * partikel reportedmany kali. Namun dalam studi ini juga terbukti bahwa dengan menggunakan model komputer, waktu yang diperlukan untuk metode
pembangunan dapat sangat berkurang. Hal ini dimungkinkan untuk mengembangkan metode untuk analisis farmasi (Assay, profil kenajisan, membersihkan validasi) dalam sehari atau bahkan dalam beberapa jam. Jika 50mm × 2.1mm sub-2 * kolom m diterapkan selama pengembangan metode sistematis, gradien dasar berjalan dengan 7 dan 21min (pada tingkat-aliran 0.4-0.5mL/min) dapat provide diandalkan akurasi untuk model simulasi komputer di bawah ultrahigh-tekanan kondisi jika pemisahan gradien diperlukan. Rata-rata waktu retensi kesalahan diperkirakan lebih rendah dari 2%, yang dapat dianggap sebagai prediksi yang sangat akurat, sehingga sarangested cepat gradien berjalan dasar awal dapat diterapkan dalam rutinitas sehari-hari karya yang dihasilkan dalam menghemat waktu yang signifikan. Berdasarkan percobaan kami kita dapat menyatakan bahwa pemisahan DryLab ® pemodelan dapat diterapkan untuk tekanan tinggi (tidak hanya dalam praktek KCKT) dengan akurasi yang tinggi. Rata-rata kesalahan waktu retensi tidak melebihi 5% bila flow-rate (tekanan) ini diperbanyak (p ~ 600 bar). Ketika aliranratewas enhancedwith faktor 1,25 dan 1,50 - dibandingkan dengan flowappliedfor menjalankan dasar - thepredictionerrorwas sekitar 3 dan 4% (masing-masing). Poin kedua adalah bahwa teknologi kolom yang digunakan untuk sub-
m * partikel 2 baik dikembangkan untuk mengurangi aktivitas silanol dari fase diam dan dengan demikian simulasi komputer dapat berlaku juga untuk pemisahan zat terlarut dasar dengan dapat diandalkan presisi.
Gambar. 1. Dua-dimensi resolusi peta suhu kolom (◦ C) terhadap gradien waktu (TG, min) untuk pemisahan API steroid dan kotoran terkait dan degradasi produk. Gambar. 2. Prediksi (A) dan percobaan (B) kromatogram yang dioptimalkan oleh 7 dan 21min berjalan gradien dasar di dua suhu kolom yang berbeda (35 dan 65 ◦ C). Kolom: Restek Pinnacle C18 1.9 * m (50mm × 2.1mm), fase gerak "A": asetonitril-air 5-95V / V%, mobile fase "B": asetonitril, elu gradienttion (35-70% B, di 2.3min), aliran: 0.5mL/min (p = 299 bar), suhu kolom : 50 ◦ C, volume injeksi: 1 * L, deteksi: 220 nm, analit: API kutub netral (Steroid) dan kotoran yang terkait dan produk degradasi: (1) 6-alphahydroxyetinilestradiol, (2) 6-beta-hydroxy-etinilestradiol, (3) 6-ketoetinilestradiol,
(4) tidak diketahui degradant, (5) estradiol, (6) 9,11-didehydroetinilestradiol, (7) etinilestradiol, 8) tidak diketahui degradant (dan (9) ketidakmurnian tidak diketahui. Gambar. 3. Dua dimensi resolusi peta suhu kolom (◦ C) terhadap mobile fase% "B" untuk pemisahan residu API steroid. Gambar. 4. Prediksi (A) dan percobaan (B) kromatogram yang dioptimalkan oleh 35 dan 55% B berjalan isokratik dasar di dua suhu kolom yang berbeda (45 dan 60 ◦ C). Kolom: Waters UPLC Beh C18 1,7 m * (50mm × 2.1mm), fase gerak "A": asetonitril-air 5-95V / V%, mobile fase "B": asetonitril, elusi isokratik dengan 40% B, aliran: 0.65mL/min (p = 435 bar), suhu kolom: 50 ◦ C, injeksi volume: 1 * L, deteksi: 220 nm, analit: API kutub netral (steroid): (1) dienogest, (2) estradiol, (3) etinilestradiol, (4) finasterid, (5) gestodene, (6) levonorgestrel dan 7) norethisterone asetat (. Gambar. 5. Dua-dimensi resolusi peta dari waktu gradien (min) terhadap mobile pH fasa untuk pemisahan API dasar dan kotoran yang terkait dan degradasi produk.
Gambar. 6. Prediksi (A) dan percobaan (B) kromatogram. Kolom: Zorbax SB C18 50mm × 2.1mm, 1.8 * m, mobile fase "A": metanol-buffer 5-95V / V% (buffer 10mMphosphate +% trietilamina 0,1, pH 6,7), mobile fase "B": metanol-buffe 80-20V / V% (buffer: 10mm fosfat +% trietilamina 0,1, pH 6,7), elu gradien tion (awal 0% B, pada 0.7min 0% B, pada 3.1min 65% B dan 100 B% pada 10min), aliran 0.5mL/min (p = 531 bar) suhu kolom,: 30 ◦ C, volume injeksi: 3 * L, dideteksi tion: 230 nm, analit: dasar obat API dan kotoran yang terkait dan degradasi produk: (1) puncak asal stres cahaya (unknown) (2) 1-naftol (3) duloxetine (4 duloxetine-3-isomer pengotor (5)-duloxetine kenajisan dimetil dan (6) duloxetine pengotor "A". Gambar. 7. Dua dimensi resolusi peta suhu kolom (◦ C) terhadap gradien waktu (TG, min) untuk pemisahan bicalutamid dan kotoran yang terkait. Gambar. 8. Eksperimental (A-D) dan diprediksi (E-H) kromatogram. Kolom: Restek Pinnacle DB Bisphenol 1,9 m * (50mm × 2.1mm), fase gerak "A": asetonitril-air 5-95V / V%, mobile fase "B": asetonitril, elusi gradien (30-68% B, di 6min), aliran: 0.4mL/min (A dan E), 0.5mL/min (B dan F), 0.6mL/min (C dan G) dan 0.8mL/min (D dan H), kolom suhu: 45 ◦
C, volume injeksi: 2 * L, deteksi: 270 nm, analit: API kutub netral dan kotoran terkait: (1) ketidakmurnian tidak diketahui, (2) bicalutamid-beta-anilin, (3) bicalutamid, dan (4) bicalutamid-betasulphenyl. Prediksi ini didasarkan pada berjalan dasar dilakukan dengan tingkat-aliran 0.4mL/min. Gambar. 9. Eksperimental dan prediksi waktu retensi diplot terhadap tekanan. Analit: (A) bicalutamid-beta-anilin, (B) bicalutamid, dan (C) bicalutamid-beta-sulphenyl.
