Makalah Kromatografi Cair
Diajukan sebagai Tugas Mata Kuliah Kimia Analisis 2
Disusun Oleh : Ridhan
( 09220160002 09220160002 )
Alda Titania Dewanti
( 09220160009 )
Nurussarirah M Abuhaji
( 09220160024 09220160024 )
Aninditha Dzakiah
( 09220170094 09220170094 )
Umar Mustafa Uba
( 09220130003 )
KELAS
: C1
JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA MAKASSAR 2017
KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum. Wr. Wb. Kita panjatkan puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat NYA, sehingga kami penyusun dapat menyelesaikan penyusunan makalah ini. Tidak lupa shalawat serta salam selalu kita curahkan kepada junjungan kita Nabi besar Muhammad SAW yang telah membimbing umatnya di jalan yang benar. Kami ucapkan terimakasih kepada pihak-pihak yang sudah membantu dalam penyusunan makalah ini. Terima kasih secara Khusus Kepada Dosen Pembimbing Mata Kuliah Kimia Analisis II Ibu Ir. Mustafiah,ST.,MT.,IPP .
Makalah
ini kami susun
berdasarkan tugas dari mata kuliah Kimia Kimia Analisis II yang berjudul “Kromatografi Cair” . Akhir kata, semoga makalah ini dapat diterima dan bermanfaat bagi orang banyak. Penyusun juga meminta maaf apabila banyak kesalahan dalam penyusunan makalah ini, kritik dan saran sangat diharapkan oleh penyusun. Wassalamu’alaikum. Wr. Wb. Makassar, 3 Oktober 2017
Penyusun
ii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR.............. .......................................................................................... ii DAFTAR ISI ...................................................................................................................... iii BAB I PENDAHULUAN 1.1.LATAR BELAKANG ...................................................................................................1 1.2.RUMUSAN MASALAH...............................................................................................1 1.3.TUJUAN ........................................................................................................................2 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI ............................................................3 2.2 KROMOTOGRAFI CAIR VAKUM ...........................................................................11 2.3 KROMOTOGRAFI CAIR PADAT ............................................................................13 BAB III PENUTUP 3.1 KESIMPULAN............................................................................................................17 3.2 SARAN ........................................................................................................................17 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................18
iii
iv
BAB I PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang Alat Kromatografi adalah suatu alat umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan.
Penemu
Alat
Kromatografi
adalah Tswett
pada
tahun 1930, mencoba
memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang barisi kapur (CaSO4). Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerahdaerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan alat kromatografi untuk memisahkan fraksifraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu alat dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Pada tahap awal alat kromatografi cair menggunakan kolom dari gelas dengan diameter 1 sampat 5 cm dengan panjang 50 sampai 500 cm dan fase diam berdiameter 150-200 m. Laju alir sangat lambat, sehingga pemisahan sering sampai berapa jam bahkan ½ hari. Hal ini jelas kurang menguntungkan, maka diusahakan cara-cara mempercepat pemisahan. Usaha tersebut adalah dengan menggunakan pompa untuk mengalirkan fase gerak, ternyata efisiensi pemisahan menjadi turun dan hal ini dapat diatasi dengan memperkecil ukuran partikel fase diam. Sejak tahun 1960, sudah ditemukan teknologi pembuatan partikel fase diam. Dengan fase diam dengan diameter kecil sampai 10 partikel-partikelnya kecil memerlukan tekanan yang tinggi agar laju alir menjadi besar. 1.2.Rumusan Masalah Adapun rumusan masalah dari makalah ini adalah : 1. Apakah yang dimaksud dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ? 2. Apakah yang dimaksud dengan Kromatografi Cair Vakum ? 3. Apakah yang dimaksud dengan Kromatografi Cair Padat ? 4. Bagaimana bentuk dan cara kerja alat dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Kromatografi Cair Vakum dan Kromatografi Cair Padat ?
1.3.Tujuan Tujuan dari penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui : 1.
Pengertian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
2.
Pengertian Kromatografi Cair Vakum
3.
Pengertian Kromatografi Cair Padat
4.
Bentuk dan cara kerja alat dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Kromatografi Cair Vakum dan Kromatografi Cair Padat
2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat. Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks. Pada akhir 1960an, semakin banyak usaha yang dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien. Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi
dengan
kepekaan
tinggi
yang
dapat
diintegrasikan
dengan
sistem
kromatografinya. KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.
2.1.1. Keuntungan dan Kelemahan Kromatografi Kinerja Tinggi KCKT
menawarkan
beberapa
kromatografi lainnya, antara lain : 3
keuntungan
dibanding
dengan
metode
a)
Cepat, waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.
b)
Resolusi tinggi, berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
c)
Sensitivitas detektor, detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).
d)
Kolom dapat digunakan kembali, berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.
e)
Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah, zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara KCKT.
f)
Mekanisme pemisahan lebih variatif, banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g)
Mudah recovery sampel, umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor. Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi,
KCKT memiliki beberapa kelemahan, yaitu: a)
Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus
b)
Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik
2.1.2. Jenis-Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal 4
dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis.Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi) Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan
adalah
oktadesilsilan
(ODS
atau
C18)
dan
kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena jika pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibandingkan jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi, karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3. Kromatografi penukar ion HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan
pemisahan
kromatografi
ion
dilakukan
dengan
menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi 5
oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Kromatografi Afinitas Dalam
kasus
ini,
pemisahan
terjadi
karena
interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
2.1.3. Instrument Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Instrumentasi HPLC
pada
dasarnya
terdiri
atas:
wadah
fase
gerak (Reservoir), pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), 6
kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :
1. Wadah fase gerak (Reservoir) Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detektor, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh
7
karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. 2. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan
fase
gerak
dengan
kecepatan
20
mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC: a) Pompa reciprocating Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom. b) Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. c) Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom. 8
3. Tempat Injeksi Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan : a) Stop-F low : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromatografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom. 4. Kolom Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :
9
Parameter
Kolom konvensional
Kolom mikrobor
Tabung
Stainless steel
Stainless steel
kolom
Panjang 3,10,15,20 dan
Panjang 25 dan 50 cm
25 cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 1 atau 2
Diameter dalam 4,6 cm
mm
Fase diam
Porous,
silika
kecil,
silika
ukuran Porous, silika ukuran kecil, yang silika
dimodofikasi kimiawi phase),
atau
polimer
dimodofikasi
secara secara
kimiawi
(bonded
(bonded phase),
atau
polimer-
polimer- polimer
stiren/divinil
stiren/divinil benzen. Rata-rata diameter
benzen.
Rata-rata partikel
diameter atau
yang
partikel
10µm
3,5
atau
10µm
3,5 dengan kisaran sempit.
dengan
kisaran sempit. Tekanan
500-3000 psi
1000-5000 psi
operasional (35-215 bar)
(70-350 bar)
Fase gerak
Hidrokarbon+pelarut
Hidrokarbon+pelarut
terklorinasi atau alkohol terklorinasi untuk
fase
normal.
Untuk
fase
terbalik fase
(reversed
atau
alkohol
untuk fase normal. Untuk terbalik
(reversed
phase) phase) digunakan metanol
digunakan metanol atau
atau asetonitril + air atau
asetonitril + air atau bufer. Kecepatan alir 10 bufer. Kecepatan alir : 100 µl/menit. Modifikasi 1-3 ml/menit
instrumen Sistem pelarut
penghantaran yang
mampu
memberikan kontrol aliran di bawah 10µl/menit. Katup injeksi sampel bervolume kecil;
sel
detektor
bervolume kecil. Kinerja
Efisiensi dengan ukuran
meningkat Sangat berkurangnya partikel
dan
sensitif, akan tetapi lambat,
fase konsumsi fase gerak hanya
diam, akan tetapi umur 10
efisiensi
¼ dari kolom konvensional.
kolom dengan ukuran partikel
3
µm
lebih
pendek.
5. Detektor Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Karakteristik detector HPLC: Dasar
Jenis
Pendeteksian
Maksimum Peka
Sensitivitas
sensitifitas
suhu
terhadap kecepatan alir
Absorbsi UV
Spesifik 2 x 10-16
Tidak
Rendah
Absorbsi IR
Spesifik 10-6
Tidak
Rendah
Flourometri
Spesifik 10-11
Tidak
Rendah
Indek bias
Umum
Tidak
+ 10-4 0 C
Ya
2% 0C
Tidak
Tidak ada
Ya
1,5% 0C
1 x 10 -7
Konduktometri Spesifik 10 -8 Spektometri
Umum
10-10
massa elektrokimia
Spesifik 10-12
2.2.Kromatografi Cair Vakum Kromatografi Suction Column atau vacuum liquid chromatography (VLC) atau kromatografi cair vakum (KCV) adalah bentuk kromatografi kolom khususnya berguna untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap suatu ekstrak. Kondisi vakum adalah alternatif untuk mempercepat aliran fase gerak dari atas ke bawah. Metode ini sering digunakan untuk fraksinasi awal dari suatu ekstrak non polar atau ekstrak semipolar (Raymond, 2006).
11
Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan atmosfer atau pada tekanan lebih besar dari atmosfer dengan menggunakan bantuan tekanan luar misalnya gas nitrogen. Untuk keberhasilan praktikan di dalam bekerja dengan menggunakan kromatografi kolom vakum cair, oleh karena itu syarat utama adalah mengetahui gambaran pemisahan cuplikan pada kromatografi lapis tipis (Harris, 1982). Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolit sekunder secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai perbandingan pelarut n-heksana:etil dan asetat:metanol (elusi gradien) dengan menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen (Helfman, 1983). Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Bila fasa gerak berupa gas, disebut kromatografi gas, dan sebaliknya kalau fasa gerak berupa zat cair, disebut kromatografi cair (Hendayana, 1994). Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap dipakai (Hostettman, 1986). Kromatografi ialah cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan zat-zat terlarut yang bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan suatu benda penyerap. Cara ini umum dilakukan pada pemisahan zat-zat berwarna (Kennedy, 1990). Kromatografi vakum cair merupakan salah satu jenis dari kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran larutan dengan perbandingan pelarut dan kerapatan dengan menggunakan bahan kolom. Kromatografi kolom lazim digunakan untuk pemisahan dan pemurnian sen yawa (Schill, 1978).
2.3. Kromatografi Cair Padat Kromatografi Cair Padat atau Liquid Solid Chromatography disebut juga kromatografi penyerapan. Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini.
12
2.3.1
Bagan Alat Kromatografi Cair Padat
Keterangan : (a) a solvent inlet filter ; (b) pump ; (c) inline solvent filter ;(d) injection valve ;(e) precolumn filter ; (f) column ; (g) detector ; (h) recorder ; (i) backpressure regulator ; and (j) waste reservoir. 2.3.2
Cara Kerja Alat Pelarut inlet membawa fasa gerak yang kemudian dipompa melalui filter pelarut inline dan akan melewati katup injeksi. Fasa gerak akan bercampur dengan sampel yang telah diinjeksikan. Campuran tersebut akan melewati filter lainnya dan melewati kolom sehingga komponen-komponen sampel akan terpisah. Detektor akan mendeteksi pemisahan analat dan merekamnya, biasanya komputer yang akan merekan informasi tersebut. Sampel akan akan ke backpressure filter dan menjadi waste. PEMISAHAN YANG TERJADI
13
MEKANISME PEMISAHAN Mekanisme pemisahan yang dapat digunakan pada kromatografi cair – padat ini antara lain : 1. Adsorpsi
Terjadinya pemisahan ialah akibat gaya tarik fasa stasioner yang kuat terhadap komponen – komponen yang harus dipisahkan. Gaya tarik yang kuat ini disebabkan oleh interaksi kimiawi dan atau interaksi Van Der Walls. 2. Pertukaran Ion Pertukaran kation (cation exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif. Pertukaran anion (anion exchange). Pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. 3. Saringan Molekula 4. Reaksi Selektif Teknik yang dapat digunakan antara lain : 1) Kolom
14
Digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa berdasarkan adsorpsi dan partisi. Adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, dan Al 2O3. Cara pembuatannya yaitu cara kering dan cara basah. 2) Planar Kromatografi planar mempunyai dua bentuk, yaitu: a) Kromatografi kertas b) Kromatografi lapis tipis
15
Larutan cuplikan diteteskan pada suatu titik pada permukaan fasa diam planar. Setelah pelarut menguap, kemudian dikembangkan dengan fasa gerak melalui permukaan tersebut dalam ruang pengembang.
16
BAB III PENUTUP
3.1. Kesimpulan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat. Kromatografi Suction Column atau vacuum liquid chromatography (VLC) atau kromatografi cair vakum (KCV) adalah bentuk kromatografi kolom khususnya berguna untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap suatu ekstrak. Kondisi vakum adalah alternatif untuk mempercepat aliran fase gerak dari atas ke bawah. Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam Cara Kerja Kromatografi padat cair: pelarut inlet membawa fasa gerak yang kemudian dipompa melalui filter pelarut inline dan akan melewati katup injeksi. Fasa gerak akan bercampur dengan sampel yang telah diinjeksikan. Campuran tersebut akan melewati filter lainnya dan melewati kolom sehingga komponen-komponen sampel akan terpisah.
3.2. Saran Melengkapi kekurangan-kekurangan di makalah dan memperdalam materi tentang kromatografi cair.
17
DAFTAR PUSTAKA
Analisis-kadar-kapsaisn-dari-ekstrak-bon-cabe-dengan-menggunakan-kromatografi-cairkierja-tinggi.pdf. Diakses pada 23 Oktober 2017. [FDA] Food and Drug Administration. 1994. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods. Rockville: FDA. Gritter, R. J., Bobbit, J. M., Schwarting, A. E. 1991. Pengantar Kromatografi. Edisi Kedua. a.b. Kosasih Padmawinata. Universitas Teknologi Bandung: Bandung Johnson, E. L. and Steven son, R (1978). Basic liquid chromatography. Varian, California Kromatografi-vakum-cair.pdf. Diakses pada 22 Oktober 2017 Lindsay, S. 1992. High performance liquid chrotomagraphy.second edition, John Wiley &Sons, Chischer: New York Sastrohamidjojo,Harjono, 2005, Kromatografi, Universitas Gadjah Mada: Yogyakarta
