Reverse Phase Chromatogra Chromatography phy (RPC) (RPHPLC) Dosen Dosen : Asep Asep Sa Saefu efumil millah lah,, M.S M.Si, i, Ph.D Ph.D
Outline
Pendahuluan Prinsip Proses Pemisahan Retensi Optimasi Pemisahan
Outline
Pendahuluan Prinsip Proses Pemisahan Retensi Optimasi Pemisahan
Pendahuluan HPLC – Modes:
Normal Phase. - Fasa diam → Polar - Fasa gerak → Non-polar Non-polar
• Reverse Phase: - Fasa diam → Non-polar Non-polar - Fasa gerak → Polar
Fasa Diam Bonded Phases: Ethyl Silyl C-2 C-8 Octyl Silyl Octadecyl Silyl C-18 CN Cyanopropyl Silyl Synthesis of RP Packings
-Si-CH2-CH3 -Si-(CH2)7-CH3 -Si-(CH2)17-CH3 -Si-(CH2)3-CN
Cont’d
Secara umum: tR lebih lama pada fasa diam dengan atom C banyak→retensi lebih kuat→perlu %B yang lebih tinggi Fasa diam dengan retensi tinggi → analit polar Fasa diam dengan retensi rendah (Σatom C<<)→ analit nonpolar Aktivitas silanol→ menguntungkan pada pemisahan analit polar (hidrofilitas tinggi)
Fasa Gerak
Secara umum fasa gerak RPC → campuran air (A) dengan pelarut nonpolar (B)
Eluen non-aqueus →untuk analit dengan kenonpolaran tinggi
Eluen → gradien
Pelarut → sangat murni
Selektivitas: Jenis dan Kekuatan Pelarut
P’ = Φa Pa + Φb Pb
P’
Cont’d
60%
45%
%B
Nomogram merupakan penjabaran lebih lanjut dari diagram triangle, dan perbandingan kekuatan elusi pelarut dan %B untuk ketiga jenis eluen.
Nomogram digunakan untuk mempermudah perkiraan %B dengan kekuatan sebanding pada jenis pelarut berbeda Jika ingin mengganti eluen MeOH/H2O 70% maka dapat ditarik garis ke ACN/H2O didapatkan nilai 60% dan ke arah THF/H2O didapatkan 45%
Prinsip
Normal Phase; Molekul hidrofilik dari fasa gerak akan terabsorpsi pada permukaan fasa diam. Meningkatnya polaritas fasa diam →absorbsi berkurang, sampel terelusi dari kolom.
Prinsip
Rever se Ph ase ;
Molekul hidrofobik terabsorpsi pada fasa diam yang hidrofobik dengan fasa gerak polar. Berkurangnya polaritas fasa gerak dengan menambahkan pelarut organik akan mengurangi interaksi hidrofobik antara solut dan fasa diam menghasilkan desorpsi→absorbsi berkurang, sampel terelusi dari kolom. Semakin hidrofobik molekul maka semakin lama berada dalam fasa diam→dibutuhkan konsentrasi pelarut organik yang tinggi untuk mengelusi solut
I nter aksi H idrofobik
Gradien Eluen
Cont’d
Fast tR cepat, R s rendah
Slow tR lama, R s lebih baik
(2) Benzena, (3) Klorobenzene, (4) o-diklorobenzena, (5) iodobenzena
Proses Pemisahan (dengan gradien eluen)
Cont’d
Retensi Senyawa
Kekuatan retensi
Alifatik Dipol terinduksi (CCl4) Dipol permanen (CHCl3) Basa Lewis lemah (ROR, RCHO, RCOR) Basa Lewis kuat (Amina) Asam Lewis lemah (ROH, ArOH)
Makin berkurang
Asam Lewis kuat (RCOOH)
Retensi berkurang dengan menurunnya kekuatan interaksi hidrofobiknya Alifatik memiliki interaksi hidrofobik yang tinggi sehingga lebih te rtahan dalam fasa diam
Cont’d Σ atom C >>
Interaksi hidrofobik dengan fasa diam >>>
tR meningkat Senyawa
Waktu retensi
(1) 1-Dekena (C10H20) (2) 1-Undekena (C11H22) (3) 1-Dodekena (C12H24) (4) 1-Tridekena (C13H26) (5) 1-Tetradekena (C14H28)
tR Makin bertambah
Branched-chain compared to normal isomer ?
Terelusi lebih cepat Karena interaksi hidrofobik rantai dengan percabangan lebih lemah dibandingkan rantai lurus
Cont’d %B >>, Retensi <<
T naik Retensi <<
Hidrofobisitas kolom << Retensi <<
Optimasi Pemisahan RPC
Untuk meningkatkan resolusi pemisahan pada RPC yaitu dengan mengubah selektivitas terhadap : 1. Kekuatan pelarut (%B) 2. Jenis pelarut (MeOH, ACN, THF) 3. Jenis kolom (C18, siano) 4. Temperatur Efektivitas relatif keempat parameter sebagai berikut:
Efek Pelarut
Dengan %B 45% diperoleh pemisahan yang lebih baik antara senyawa 3 dan 4 dengan resolusi 1.5.
Cont’d
Efek Temperatur
Pemisahan PAH terbaik pada temperatur 22ºC dengan nilai resolusi 2.1
Efek Kolom
Dengan tiga kolom ; symmetry C18, altima HP C18 amide, Spherisorb ODS-2, pemisahan belum optimal masih terdapat peak sampel yang overlap.
Pada Kolom Luna phenyl-hexyl, peak-peak kesepuluh sampel terpisah dengan baik.
Pengembangan Metode RPC A.
Sampel nonionik: Fasa diam C8 atau C18, ACN:air, T ambien
1. %B dengan 1≤k ≤10 2. Ubah pelarut B 3. Gunakan campuran pelarut B organik 4. Ubah fasa diam (mulai dari langkah 1) 5. Ubah T 6. Optimasi parameter fisik :dimensi kolom, ukuran partikel, laju alir
Cont’d B. Sampel Ionik: Fasa diam C8 atau C18, MeOH (buffer pH 2.5), T 40ºC 1. %B atau gradien 2. (a) Ubah pH (b) gunakan IPC (ion-pair chromatography) 3. %B 4. Ubah pelarut B organik 5. (a) Ubah pH (b) Ubah pH dan reagen IP 6. Ubah T 7. Ubah fasa diam menjadi fenil atau siano (mulai dari langkah 1) 6. Optimasi parameter fisik :dimensi kolom, ukuran partikel, laju alir
C. Metode lain: IPC, IEC, dll
HIC
HILIC
Karakteristik HIC, RPC, HILIC, NPC. HIC
RPC
HILIC
NPC
Fasa diam
Nonpolar (atom C<<)
Nonpolar (atom C>>)
Polar
Polar
Fasa Gerak
Pure aqueous
A(air)-B(pelarut organik)
A(nonpolar)B(Air)
Gradien %B
Gradien %B
A(nonpolar, heksana)-B(cukup polar, CHCl3)
Gradien [garam]
Gradien %B Pemisa han
Sampel yang interaksi hidrofobik kuat dan tidak stabil terhadap pelarut organik (contoh:protein)
Sampel nonionik dan ionik berdasarkan interaksi hidrofobik
Sampel yang sangat ionik
Sampel yang ionik
Retensi
Nonpolar tertahan
Nonpolar tertahan
Polar tertahan
Polar tertahan
Nonpolar terelusi lebih dahulu
Nonpolar terelusi lebih dahulu
Lebih polar terelusi lebih dahulu
Lebih polar terelusi lebih
Aplikasi
Normal
Mutan
Sampel riset bioteknologi: tryptic hydrolisate dari aktivator plasminogen suatu protein yang terdiri dari 527 asam amino pada bentuk normal dan yang telah bermutasi (mutan). Kedua kromatogram dibandingkan, perbedaan terlihat pada satu jenis asam amino, mutan tidak mengandung Arg (arginin) tetapi terdapat Glu (asam glutamat) Kromatogram ditampilkan berkebalikan untuk memudahkan perbandingan
Cont’d
Interaksi Hidrofob lemah
Interaksi Hidrofob kuat
Sampel : PAH
17 senyawa dalam PAH terpisah dengan baik
Pemisahan berdasarkan kenaikan interaksi hidrofobik, terlihat senyawa yang hidrofobisitas lebih lemah (benzena) terelusi lebih cepat, dan sementara heksasiklik benzena yang interaksinya kuat, terelusi terakhir
Waktu retensi sampel PAH cepat : 15 menit
Hidrophobic Interaction Chromathography (HIC)
Interaksi sampel dan fasa diam terlalu kuat pada RPC, eluen aqueous terlalu lemah tanpa penambahan pelarut organik (pelarut organik tidak diizinkan dalam pemisahan protein karena dapat mendenaturasi dan menghilangkan aktivitas biologinya)
Pemisahan menggunakan fasa diam dengan atom C lebih kecil : butil, fenil.
Eluen yang digunakan memiliki kandungan garam yang tinggi, terelusi ketika gradien garam menurun
Komposisi fasa diam mempengaruhi retensi
HIC
Proses pemisahan pada HIC
Cont’d
Optimasi pemisahan protein dengan HIC
Referensi
Snyder, Llyod. R, et. Al. 2010. Introduction to Modern Liquid Chromatography, Third Edition . John Wiley & Sons, Inc.
Meyer, Veronika R. 2010. High Performance Liquid Chromatography, Fourth Edition . John Wiley & Sons, Inc.
GE Healthcare. Hidrophobic Interaction Chromatography and Reverse Phase Chromatography: Principles and Methods.
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Se rviceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Princip lesofChromatography/ReversedPhase/
http://www.lamondlab.com/MSResource/LCMS/N anoflowHPLC/hplc.php
