Analisis Instrumen
High performance liquid chromatography (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
Oleh Kelompok 6 Off AA Erni Yustisiani
(209331423410)
Nadia Relyta D
(209331423411)
Nur Shofwah Al-Kiswiyah
(209331423412)
Oscar Prananda Pajaindo (209331423413) Rosita Mei Susanti
(209331423414)
JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI MALANG Februari 2012
High performance liquid chromatography (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan metode yang dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom, Selain itu HPLC memiliki kekuatan bertekanan tinggi sampai dengan 600 psi, Ini membuat HPLC dapat bekerja lebih cepat daripada kromatografi lain. HPLC dapat dilakukan dengan dua teknik yaitu : 1. KCP (Kromatografi-Cair-Padat) 2. KCC (Kromatografi-cair-cair) Fasa Diam Dalam penerapannya HPLC menggunakan fasa diam dengan ukuran yang sangat kecil dibandingkan dengan kromatografi kolom yaitu 5-10
dan tekanan sampai 600 psi.
Ukuran dari fasa diam yang sangat kecil menyebabkan fasa diam mempunyai luas permukaan yang besar, keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien pemisahan dipertinggi. Tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak (eluen) dapat bergerak lebih cepat dengan laju alir 1-10 mL per menit sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya.Ukuran butir kecil dari fasa diam dan tekanan yang tinggi dari fasa gerak akan menghasilkan pemisahan yang baik. Fasa Gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa larutan melewati kolom menuju detector. Sebaliknya dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan Larutan-larutan. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa
persyaratan berikut: zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis. zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram. zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. zat cair tidak kental. sesuai dengan detektor. Peralatan HPLC 0100090000038500000002001c00000000000400000003010800050000000b 0200000000050000000c02e5057108040000002e0118001c000000fb02c9ff00 00000000009001000000000440002243616c69627269000000000000000000 00000000000000000000000000000000040000002d010000040000002d0100 00040000002d0100000400000002010100050000000902000000020d000000 320a3400000001000400000000007008e40520002000050000000902000000 021c000000fb021000070000000000bc02000000000102022253797374656d0 07650053b0874992100cc039e764091a1765842490880992100040000002d01 0100040000002d010100030000000000
Gambar diatas merupakan diagram balok skematik peralatan HPLC. Berdasarkan diagram tersebut, peralatan HPLC dapat dibagi dalam 5 unit yaitu : Unit penghantar atau eluen bertekanan tinggi Pada bagian ini prinsipnya meliputi peralatan reservoir sampel beserta sistem penghilang gas (degassing system), alat pengatur gradient, dan sistem pompa bertekanan tinggi. Pada peralatan KCKT modern umumnya disertai dengan bejana sebagai tempat eluen yang terbuat dari gelas atau “stainless steel” yang berkapsitas 1-2 liter. Pada reservoir dilengkapi dengan sisitem penghilang gas terlarut seperti gas oksigen dan nitrogen. Adanya gas terlarut dapat menyebabkan gangguan pada sisitem kolom dan detector, serta pelebaran puncak yang diperoleh. Pada bagian ini juga terdapat sistem pengatur gradien eluen. Jika digunakan 1 macam pelarut, maka elusinya disebut elusi isokratik, sedangkan bila digunakan 2 macam pelarut, maka elusinya disebut elusi bergradien. Pada elusi bergradien perbandingan pelarutnya dapat diubah-ubah secara kontinyu selama proses elusi. Efisiensi pemisahan pada KCKT ini akan lebih bagus
jika digunakan elusi bergradien. Pada unit penghantar solven juga tedapat unit pompa yang memiliki kekuatan “output” minimum 100 psi, dan umumnya bisa sampai 4000-6000 psi dengan kecepatan alir eluen paling sedikit 3 mL/menit. Unit sistem penyuntikan atau penginjeksian sampel Sampel cuplikan harus dimasukkan kedalam kolom sebagai lapisan setipis mungkin. Ukuran sampel sekitar 1-20 mikro Liter. Ada dua cara untuk memasukkan cuplikan, yaitu cara injeksi dan katup pemasukkan cuplikan mikro (micro-sampling valve). Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum : Stopped Flow Solvent Flowing Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan : Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom. Unit kolom Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi. Kolom yang lebih panjang akan menghasilkan resolusi bertambah baik, tetapi perlu tekanan lebih tinggi lagi. Tabung kolom dapat dikelilingi selubung air (water jacket) untuk pengaturan suhu. Jenis isi kolom (kemasan kolom) tergantung cara kromatografi yang dipakai apakah adsorpsi, partisi, atau penukar ion. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC) Unit detector Detector merupakan suatu bagian penting dari sebuah peralatan
analitik
kromatografi cair yang modern. Fungsi dari detector yaitu mendeteksi adanya komponen cuplikan, dan mengukur banyaknya komponen. Klasifikasi detector pada HPLC dibedakan menjadi dua yaitu Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat molekul sampel maupun fase gerak (bulk property detector). Detector ini adalah Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif di banding dengan detector ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu. Berdasarkan pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel ( solute property detector). Detector ini dibedakan menjadi Detektor yang tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak. Contohnya adalah detector fotometer (UV-vis dan inframerah). Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan untuk
pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut. Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui. Yang kedua adalah detector polarografi dan radioaktif. Kedua detector ini dipengaruhi oleh laju aliran. memerlukan pemisahan fase gerak terlebih dahulu termasuk FID dan ECD. Detector yang sering digunankan pada HPLC adalah : Detector spektometrik Detector spektometrik, biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Detector fluorometrik Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaringpenyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor untuk menahan radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah menggunakan penyaring pada sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan panjang gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat
subnanogram yang telah bereaksi dengan reagen fluoresamin. Detector elektokimia Detektor
elektrokimia
biasanya
didasarkan
pada
daya
hantar
listrik
(konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga, dimana komponenkomponen smpel mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial +0,60 V. Syarat – syarat pemilihan detector yang baik yaitu: Mempunyai respon terhadap solut yang cepat Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. Stabil dalam pengopersiannya. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier). Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak Unit pencatat atau recorder
Cara Kerja HPLC Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven kemudian masuk ke dalam katup injeksi berputar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolngan mikrosiring, sampel dimasukkan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukkan oleh perekam (recorder). Tekanan solven diatur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa memasok solven pada tekanan konstan hingga tekanan + 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter permenit. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. Dibawah ini merupakan contoh kromatogram hasil pemisahan dengan HPLC.
Source : en.wikipedia.org
Kelebihan dan Kelemahan HPLC Kelebihan HPLC adalah : mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran mudah melaksanakannya kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali mudah melakukan "sample recovery" Kelemahan HPLC adalah : Membutuhkan proses preparasi yang lama Tingkat kemurnian sampel harus tinggi sehingga dibutuhkan proses pemurnian Reagen yang digunakan harus memiliki tingkat kemurnian yang tinggi Alatnya mahal Hanya bisa dilakukan oleh operator yang terlatih saja
