BAB II PROSEDUR PEMERIKSAAN CD4 I. Persiapan 1.1 Alat FACSCount -
Hidupkan alat, biarkan sistem bekerja sendiri (protokol disket telah terpasang pada flopp drive).
-
Setelah 2 menit akan tampak pesan dilayar.
-
Alat dapat dibiarkan selama 1 hari, jika dilakukan prosedur shutdown dan probe sampel dalam posisi diatas FACSCount Software Version 1.4 10/93 Becton Dickkinson Immunocytometry Sstems FACSCount
San 10/02/93 Jose Jose CA 95131 13:12:34
1.2 Botol Cairan Pencuci dan Botol Pembuangan Sebelum melakukan pemeriksaan kontrol dan sampel, siapkan larutan pada botol system fluid reservoir dan kosongkan botol pembu angan. 1. Pengisian Sistem Fluid Reservoir Reservo ir a.Buka a. Buka pintu tempat cairan pencuci dan botol pembuangan dengan cara menekan bagian atas tengah dari pintu kemudian biarkan pintu terbuka. b.Lepaskan tubing system fluid dari panel fluidic dengan cara menekan clip metal konektor putih kenudian tarik t arik tubing dari fitting-nya. c.Lepaskan c. Lepaskan system fluid detection probe dari fluidic panel dengan cara menekan tabs putih disamping konektor dan t arik. d.Pindahkan system fluid reservoir dari alat BD FACSCount dan letakkan pada bidang datar. e.Isi e. Isi dengan cairan system hampir penuh sekitar 1 inci (2,5 cm) dari atas. f. Tutup reservoir dan tempat kembali pada alat. g.Hubungkan system fluid tubing dan fluid detection probe connector pada alat dengan cara menekan systen fluid tubing secara perlahan sampai terdengar bunyi
9
10
click dan menghubungkan system fluid detection probe connector dengan menekan tabs pada tempatnya. h.Periksa system fluid filter apakah telah terisi cairan dengan cara : -
Jika
terdapat gelembung udara pada filter, buka clamp plastic pinch sampai
udara keluar dari vent t ubing. -
Jika
perlu, ketuk secara perlahan untuk menghilangkan gelembung keluar dari
air vent tubing. 2.
Jika
telah keluar, tutup clamp.
Mengosongkan Botol Pembuangan
a.Lepaskan waste fluid tuing dari fluidics panel dengan cara menekan metal clip pada konektor dan tarik. b.Lepaskan waste fluid detection probe connector dari fluidis panel dengan cara tekan tabs puti pada sisi konektor dan tarik. c.Lepaskan botol pembuangan dari alat dan letakkan pada tempat datar. d.Kosongkan botol pembuangan pada tempat pembuangan biohazard. e.Tambahkan 200 ml larutan blech yang telah diencerkan pada tabung pembuangan, kemudian tutup kembali. f. Hubungkan kembali botol pembuangan dengana alat.
1.3 Pengisian Cairan System Periksa flow cell setiap hari pada saat menghidupkan alat. Lakukan prime pada system jiak terdapat gelembung udara pada flow cell. Jika
mengganti filter ulangi prosedur priming lima kali untuk memastikan tidak ada
gelembung udara. - Tekan ³UTILIT´ pada layar alat FACSCount untuk masuk ke layar utility UTILITY
- Tekan ³DRAIN´ pada layar akan tampak pesan : DRAIN Put on tube of distilled water Press DRAIN to start drainin
11
- Tekan ³DRAIN´ kembali. Buka kedua pintu optik untuk melihat cairan mengering pada flow cell, akan tampak pesan DRAIN
Press STOP to sto drainin
- Jika semua cairan telah keluar dari flow cell, tekan ³STOP´. Floow cell secara otomatis akan terisi dengan cairan, kemudian akan tampak pesan : DRAIN
Refilling flow cell. Please wait.
UTILITY
- Tekan ³MAIN´ untuk kembali ke menu layar FACSCount. Untuk memulai prosedur pembersihan harian, tekan ³CLEAN´. Untuk mematikan alat tekan ³SHUTDOWN´
II. PROSEDUR PEMERIKSAAN 2.1 Pemeriksaan Kontrol 1. Persiapan a. Siapkan tubs reagen kontrol bead (Low, Medium, High) dan sampel darah normal dalam tabung K 3EDTA. b. Vortex tubs reagen kontrol bead dengan posisi keatas selama 5 detik c. Vortex kembali dengan posisi kebawah selama 5 detik d. Buka tutup reagen menggunakan coring station dengan cara :
12
-
Masukkan tubs reagen kedalam alat coring station
-
Tekan dari lever core ke bawah
-
Biarkan lever kembali ke posisi semula
-
Pindahkan tubs reagen kontrol ke workstation dengan posisi tegak keatas
-
Tutup workstation untuk mengindari cahaya
e. Bolak-balik tabung sampel darah normal f.
Siapkan 3 buah tubs reagen dan beri label masing-masing Low, Medium, High
g. Pipet sebanyak 50 Ql darah normal masukkan ke dalam 3 buah tubs reagen h. Tutup semua tubs reagen dan vortex selama 5 detik i.
Biarkan semua tubs reagen selama 60 ± 120 menit pada suhu kamar (20 ± 25 oC,
68 ± 77 oF) pada workstation dan tutup pintu workstation untuk menghindari cahaya j.
Buka semua tutup tubs reagen kemudian tambahkan 50 Ql larutan fixatif ke dalam
semua tubs reagen k. Tutup kembali semua tubs reagen dengan tutup yang baru dan vortex selama
5
detik (sampel dapat dibiarkan selama 24 jam sebelum penambahan control bead) l.
Pindahkan tubs reagen kontrol dan tempatkan pada daerah kontrol workstation
m. Vortex tubs reagen kontrol zero/low masukkan sebanyak 50 Ql kontrol low (tutup merah) ke dalam tubs reagen berlabel Low n. Vortex tubs reagen kontrol medium/high masukkan sebanyak 50
Ql
kontrol
medium (tutup biru) ke dalam tubs reagen berlabel Medium o. Vortex tubs reagen kontrol medium/high masukkan sebanyak 50 Ql kontrol high (tutup ungu) ke dalam tubs reagen berlabel High p. Tutup kembali tubs reagen dengan tutup yang baru q. Periksa semua reagen tutup menggunakan alat BD FACSCount 2. Memasukkan Informasi Control dan Reagen a. Tekan ³CONTROL´ pada layar CONTROL BEADS Lot Code:
39011721
Counts-Low:
50
Med: 248
Hi h: 999
13
Lot code dan count values dari bead akan tampak pada layar dimana nilainya merupakan nilai terakhir yang digunakan. Jika pertama kali dilakukan, lot code dan count values merupakan nilai default alat b. Masukkan 8 digit lot code dari kontrol bead. Tekan ³ENTER´ untuk data berikutnya c. Masukkan nilai bead untuk kontrol Low, Medium dan High. Nilai kontrol dapat dilihat pada kertas yang menyertai reagen d. Tekan ³Confirm´ untuk menyimpan informasi ke dalam disket. Kemudian akan tampak laar reagen REAGENTS Lot Code:
30012121
Counts-CD4:
1000
CD8:
2000
e. Masukkan 8 digit lot code reagent. Nilai reagent dapat dilihat pada label bag reagen. Tekan ³ENTER´ untuk data berikutnya f.
Masukkan referensi bead CD4 untuk reagent lot. Nilai referensi dapat dilihat pada
label bag reagen g. Tekan ³Confirm´ untuk menyimpan data kedalam disket. Akan tampak data yang telah dimasukkan kedalam alat, lanjutkan dengan memasukkan nomor ID kontrol normal CONTROL
NormID:
12345678_____
Type in the lab normal ID number And ress the ENTER ke .
3. Pembacaan a. Masukkan ID kontrol normal (sebanyak 15 karakter). Setelah memasukkan data ID kontrol normal pada layar akan tampak : CONTROL
NormID:
First pair. Move the CD4-Low tube Into osition and ress the RUN ke .
12345678_____
14
b. Vortex reagen Low menghadap ke atas selama 5 detik c. Buka tutup reagen Low, tempatkan pada sampel holder pada alat CD4 FACSCount d. Tekan ³RUN´, akan tampak pesan pada layar : CONTROL
NormID:
12345678_____
NormID:
12345678_____
Control boost. Please wait.
Kemudian akan tampak pesan : CONTROL-Low Event Rate:
300
Total: 1000
Bead search. Please wait. CONTROL-Low Event Rate:
NormID:
310
12345678_____
Total: 2500
Ac uirin initial data. Please wait. CONTROL-Low Event Rate:
NormID:
320
12345678_____
Total: 9500
Acquiring/analyzing data. Please wait. Jika
analisa telah selesai, sampel holder akan turun, lanjutkan ke pembacaan kontrol
berikutnya CONTROL
NormID:
12345678_____
Move the CD4-Medium tube Into osition and ress the RUN ke . Jika
telah selesai pembacaan reagen kontrol, hasil akan tercetak dan akan ditampilkan
pada layar CONTROL Control run:
NormID: PASSED
Control ruselt are on printout.
12345678_____
15
Untuk memeriksaan sampel, tekan ³SAMPLE´. Untuk kembali ke menu utama, tekan ³MAIN´. Jika
terdapat hasil kontrol yang tidak memenuhi syarat maka akan tampak pesan :
CONTROL
NormID:
See printout for error code(s).
Tekan ³Continue´ untuk melihat hasil kontrol. 4. Hasil Printout
12345678_____
16
III. Pemeriksaan Sampel Pasien 1. Syarat Sampel Syarat sampel untuk pemeriksaan CD4 : -
Menggunakan antikoagulan K 3EDTA (cair)
-
Penyimpanan tidak lebih dari 48 jam pada suhu kamar (20 ± 25 C)
o
2. Pengerjaan Sampel Pasien a. Siapkan sampel pasien, larutan fiksatif dan tubs reagen CD4, tempatkan pada workstation b. Beri label/identitas masing-masing 1 tubs reagen untuk tiap 1 pasien c. Vortex dengan posisi keatas selama 5 det ik d. Vortex kembali dengan posisi kebawah selama 5 detik e. Buka tubs reagen menggunakan coring station f.
Campur sampel darah dengan cara membolak balik tabung
g. Tambahkan sebanyak 50 Ql sampel darah pasien ke dalam tubs reagen h. Tutup tubs reagen yang telah mengandung sampel darah pasien dan vortex selama 5 detik i.
Inkubasi tubs selama 60 ± 120 menit pada suhu kamar, tempatkan pada
workstation dan lindungi dari cahaya dengan menutup pintu pelindung sampel workstation j.
Buka tutup tubs dan tambahkan sebanyak 50 Ql larutan fiksatif
k. Tutup kembali tubs dan tutup yang baru dan vortex selama 5 detik l.
Baca tubs reagen sampel dalam waktu kurang dari 48 jam
3.Memasukkan Data Pasien dan Reagen
17
a. Pada layar hasil kontrol, tekan ³SAMPLE´, akan tampak layar reagen, masukkan lot code reagen dan reference bead count REAGENTS Lot Code:
30012121
Counts-CD4:
1000
CD8:
2000
b. Setelah memasukkan data tekan ³Confirm untuk masuk ke menu sampel SAMPLE
NormID: ________________
Type in the sample¶s accession number and ress the ENTER ke .
c. Masukkan kode pasien (< 15 karakter) 4.Pembacaan Sampel a. Setelah memasukkan informasi pasien, akan tampak : SAMPLE
NormID: 1234____________
Move the CD4 tube into osition and ress the RUN ke .
b. Vortex tubs reagen sampel selama 5 detik c. Buka tutup tubs reagen sampel, tempatkan pada sampel holder d. Tekan ³RUN´, akan timbul pesan SAMPLE
Acc.#: 1234____________
Sample boost. Please wait.
SAMPLE-CD4 Event Rate: 230 Ac uirin initial data. Please wait.
Acc.#: 1234____________ Total: 2560
18
SAMPLE-CD4
Acc.#: 1234____________
Event Rate: 220
Total: 9500
Ac uirin /anal zin data. Please wait.
e.
Jika
telah selesai akan tampak pesan :
SAMPLE-CD4
Acc.#: 1234____________
Move the CD8 tube into position and press the RUN key.
f.
Tekan ³STOP´ untuk membatalkan pemeriksaan CD8
g. Tutup kembali tubs reagen sampel h. Hasil sampel akan di printout dan t ampak pada layar SAMPLE-CD4
i.
Acc.#: 1234____________
CD4: 642
CD4/CD8: 0.78
CD4/CD3: 0.43
CD8: 820
CD3 Avg: 1486
CD8/CD3: 0.55
Untuk membaca sampel berikutnya, tekan ³SAMPLE´, masukkan kode pasien,
lakukan mulai dari langkah a ± d pada pembacaan sampel j.
Jika
terdapat kesalahan maka pada layar akan tampak pesan :
SAMPLE-CD4
Acc.#: 1234____________
See prinout for error code(s).
k. Tekan ³Continue´ untuk melihat hasil sampel
5. Hasil Printout Sampel FACSCount SW Version 1.1 4/93
Sample Results
19
Reagent Lot ID : 20052121 Reference Bead Counts - beads/ Ql CD4 Tube : 1004 CD8 Tube : 2032
Date : 3/15/93 18:42
Last Control Run : PASSED Control Run Date : 3/15/93 18:42 Control Run Reagent Lot ID : 20052121 Control Run Control Lot ID : 29031721
Accession #: 5678
Absolute Counts - cells/ Ql CD4 :
838
CD8 : 1107 Total CD3 Average : 2002 CD4/CD8
: 0.76
CD4/CD8 : 0.42 CD8/CD3 : 0.55
Signature: ________________________________ _________________________________________ Commnents: ______________________________ _________________________________________ _________________________________________
