Arus balik KROMATOGRAFI KIMIA ANALITIK Kromatografi arus balik dalam kimia analitik (Laporan Teknis IUPAC) Abstrak :
Kromatografi Melawan Waktu (CCC) adalah istilah umum umum yang mencakup semua bentuk
kromatografi cair-cair yang menggunakan fase diam cair bebas-pegang yang diadakan di tempat oleh medan gaya sentrifugal sentrifugal atau kompleks sederhana. Sistem cair biphasic digunakan dengan satu fase cair menjadi fase diam dan yang lainnya adalah fase gerak. Meskipun dimulai hampir 30 tahun yang lalu, CCC tidak memiliki kolom yang dapat diandalkan. Ini berubah sekarang, dan sentrifugal yang baru dirancang muncul di pasar membuat kolom CCC yang sangat baik. Ulasan ini berfokus pada keuntungan dari fase diam cair dan membahas teori kromatografi CCC. Perbedaan utama dengan kromatografi cair klasik (LC) adalah volume variabel dari fase diam. Ada dua cara berbeda untuk mendapatkan fase diam cair menggunakan gaya sentrifugal, cara hidrostatik dan cara hidrodinamik. Dua jenis kolom CCC ini dijelaskan dan dibandingkan. Aplikasi CCC yang dilaporkan dalam kimia analitik dan perbandingan dengan metode pemisahan dan pengayaan lainnya menunjukkan bahwa teknik ini dapat berhasil digunakan dalam analisis tanaman dan produk a lami lainnya, untuk pemisahan biokimia dan farmasi, untuk pemisahan alkaloid dari ramuan medis, dalam analisis makanan, dll. Berdasarkan penelitian selama dua dekade terakhir, rekomendasi juga diberikan untuk penerapan CCC dalam analisis penelusuran organik dan dalam kimia radioanalitik. PENDAHULUAN Kromatografi
tandingan saat ini (CCC) adalah teknik kromatografi cair (LC) yang
menggunakan dua fase cairan yang tidak dapat dicairkan tanpa dukungan yang kuat. Sebagai teknik LC, CCC menggunakan banyak istilah yang sudah didefinisikan untuk kromatografi [1]. Artikel ini akan memberikan dasar-dasar teknik CCC dan secara singkat menggambarkan kolom kromatograf i khusus yang mampu mempertahankan fase cair statis menggunakan medan sentrifugal. Suatu pendekatan cepat untuk memilih sistem pelarut yang dapat digunakan dalam CCC diberikan. Aplikasi CCC akan disajikan untuk menunjukkan minat dan keaslian teknik dalam kimia analitik. DESKRIPSI TEKNIK CHROMATOGRAPHY COUNTERCURRENT Dapat dikatakan bahwa nama teknik, kromatografi berlawanan arah, tidak tepat karena dua fase cair tidak mengalir berlawanan satu sama lain. CCC adalah teknik LC L C dengan fase stasioner cairan bebas-pendukung [2]. Penemu teknik, Yoichiro Ito, menamakannya setelah metode partisi berlawanan Craig yang juga menggunakan partisi antara dua fase cair untuk memisahkan zat terlarut [3]. Penamaan teknik dan akronim CCC yang nyaman diadopsi oleh para penggunanya dan tidak dapat diubah sekarang karena banyaknya publikasi yang mengartikannya [3-9], meskipun LC bebas-dukungan mungkin menjadi nama alternatif. Tantangan utama CCC adalah mendapatkan fase stasioner cair bebas-dukungan yang stabil. Kolom CCC tidak bisa berupa tabung sederhana dengan frit pada ujungnya seperti pada teknik LC lainnya. Dalam semua "kolom" CCC modern, bidang sentrifugal digunakan untuk menahan fase diam cair di tempat sementara fase cairan cair didorong melaluinya. Bidang sentrifugal menyiratkan bagian yang berputar, rotor, roda gigi, kumparan, segel berputar, motor, dan pengatur kecepatan. Namun, seluruh mesin CCC hanyalah kolom kromatografi.
Keuntungan dari fase fasa stasioner cair bebas-dukungan Di CCC, fase baik bisa menjadi fase gerak. Faktanya, fase gerak dapat diubah selama berlari jika komponen sampel yang disuntik ditahan terlalu lama di kolom. Setidaknya dua pelarut yang tidak dapat bercampur, misalnya, air dan oktan1-ol, heptana, atau kloroform diperlukan. Sistem fase khas untuk pemisahan organik dapat mencakup sebanyak tiga, empat, atau lebih pelarut. Diagram fase dapat membantu seorang oporter merancang sistem cairan biphasic yang paling cocok untuk aplikasi tertentu. Kemungkinan unik Kelemahan utama dari fase diam cair adalah bahwa itu adalah cairan. Tidak ada masalah dalam menjaga fase diam yang solid di dalam kolom. Namun, sulit untuk menjaga fase diam cair saat cairan lain, fase gerak, didorong melaluinya. Medan gravitasi bumi digunakan dalam mesin Craig dan perangkat CCC droplet sederhana. Namun, bidang rendah ini membutuhkan laju aliran fase semburan rendah, sehingga eksperimen berlangsung selama berhari-hari. Medan yang lebih kuat diperlukan, dan semua kolom CCC modern memiliki bagian yang berputar, rotor, roda gigi, dll. Untuk menciptakan medan sentrifugal yang kuat dan efisien untuk secara efektif menahan volume besar fase diam stasioner cair terhadap aliran fase gerak. Pilihan besar kombinasi pelarut untuk membuat sistem cairan biphasic dapat menjadi keuntungan (yaitu, lebih banyak pilihan) tetapi juga kerugian — ini bisa menghabiskan waktu untuk membuat pilihan yang tepat, khususnya jika Anda tidak tahu cara memilih. Harus selalu diingat bahwa setiap perubahan komposisi yang dibuat dalam satu fase cair dapat menyebabkan perubahan dalam fase cair lainnya, y ang membuat elusi gradien dalam CCC kurang lugas daripada di LC klasik. Di CCC, ketersediaan fase stasioner untuk komponen terpisah ditentukan oleh proses difusi dalam c airan dan efisiensi pencampuran fase (diatur oleh parameter desain kolom, kondisi hidrodinamika operasional, dan sifat fisikokimia dari sistem cairan dua fase). CCC memberikan kemampuan unik untuk pencampuran fase dinamis dari sistem cairan dua fase selama proses kromatografi. Penggunaan silika sebagai bahan tulang punggung untuk fase diam dalam kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) membatasi pH fase gerak ke kisaran 2 – 2 –8. 8. Fase gerak yang bersifat asam dapat membelah bagian berikatan organik; yang dasar bisa melarutkan silika, meskipun fase stasioner HPLC modern dan mahal dapat bekerja dengan fase pH 1 dan / atau pH 10 [10]. Sebaliknya, jika pelarut yang digunakan untuk membuat sistem cairan biphasic tidak sensitif terhadap pH, tidak ada masalah pH tambahan karena material yang paling sering digunakan dalam kolom CCC adalah Teflon. Interaksi fase zat terlarut yang kuat dapat merugikan untuk bahan biologis di HPLC. Sebaliknya, pembagian cair-cair adalah satu-satunya interaksi yang bertanggung jawab untuk retensi zat terlarut di CCC, dan partisi ini dapat sangat lembut untuk molekul dan melestarikan aktivitas biologis. Larutan dapat menggunakan volume fase stasioner yang sangat tinggi. CCC secara definitif merupakan teknik pemisahan preparatif yang sangat baik [11] sebagai keuntungan penting dari sifat cair dari fase diam adalah kemampuan memuat. Bahan yang disuntikkan dapat larut dalam seluruh volume fase stasioner. Adsorpsi cairan-cair i soterm menyajikan kisaran linier yang lebih besar dibandingkan dengan isoterm padat liqid-padat. Overload stasioner-fase kurang masalah di CCC daripada di HPLC biasa karena volume tinggi fase stasioner-sering setinggi 90% dari total volume kolom. Namun demikian, fitur CCC ini dapat berguna untuk kimia analitik jika teknik ini diterapkan untuk menyiapkan bahan referensi standar.
BERTHOLD dkk
Mekanisme sederhana Rasio partisi cair-cair (KD) dari zat terlarut dalam sistem cairan biphasic yang digunakan untuk melakukan pemisahan CCC adalah satu-satunya parameter dalam persamaan retensi VR = VM + KD VS (1) di mana VM dan VS adalah ponsel- dan volume fase stasioner, masingmasing, di dalam aparatur CCC. VM sesuai dengan volume penahan di HPLC [3]. Rasio partisi KD atau koefisien partisi dari zat terlarut (jika hanya satu zat terlarut yang terlibat) adalah rasio dari konsentrasi zat terlarut dalam fase stasioner atas konsentrasi zat terlarut dalam fase gerak. Sebagai contoh, untuk zat terlarut yang tidak dapat terionkan, jika fase diam adalah oktan-1-ol dan fase gerak adalah air, KD adalah oktan-1-ol / partisi air co-efisien [12]. Karena tidak ada dukungan yang kuat, volume kolom VC adalah VC = VM + VS (2) Volume kolom selalu diketahui, baik yang diberikan oleh pabrik atau diukur. Persamaan 1 dapat ditulis sebagai VR = V C + (KD - 1) VS (3) menunjukkan bahwa, di samping partisi zat terlarut antara dua fase cair, VS adalah satu-satunya parameter yang bekerja pada retensi zat terlarut. Teori kromatografi Parameter kromatografi Sebagian besar persamaan klasik yang digunakan untuk LC dapat diterapkan di CCC. Mereka secara singkat ingat di sini, m enunjukkan kekhususan fase diam cair. Persamaan 1 atau 3 memberikan volume retensi zat terlarut. Semua parameter LC dapat digunakan dalam CCC yang mengekspresikan nilainya menggunakan VS , volume fase diam cair [1,11]. Faktor retensi diekspresikan sebagai k = (VR - VM) / VM = KD VS / VM (4) Faktor pemisahan digunakan untuk membandingkan faktor retensi dari dua puncak yang berbeda, 1 dan 2 α = k2 / k1 = KD2 / KD1 (5) Resolusi puncak mengukur kualitas pemisahan. Hal ini dinyatakan sebagai rasio dari perbedaan volume penampakan puncak atas rata-rata lebar puncak, wb, pada basis RS = (VR2 - VR1) / [1/2 (wb1 + wb2)] (6) Efisiensi kromatografi dapat dinyatakan menggunakan N, nomor pelat teoritis sebagai N = 16 (VR / wb) 2 (7) Menggabungkan persamaan, dapat ditentukan bahwa persamaan resolusi puncak dalam CCC adalah (8) Rumus :
Persamaan 8 berlaku untuk semua teknik kromatografi. Ini tidak digunakan secara umum karena volume fase mobile dan fase stasioner adalah konstan. Ini akan menunjukkan bahwa ini tidak benar di CCC di mana VM dan VS tidak konstan dan harus ditentukan untuk semua kromatogram. Volume fase stasioner variabel Fitur unik CCC adalah volume fase diam tidak konstan. Ini jelas karena sifat cair dari fase diam. Nomenklatur IUPAC untuk kromatografi mendefinisikan rasio fase, β, sebagai volume fase gerak, VM, dibagi dengan volume fase stasioner, VS [1]. D alam semua teknik kromatografi, kecuali CCC, volume ini dan parameter β adalah konstanta. Lebih lanjut, volume VM dan VS tidak selalu dihubungkan dengan persamaan. 2 karena mereka berada di CCC. Untuk alasan ini, penting untuk memperkenalkan SF, rasio retensi volume fase stasioner atau fraksi fase stasioner, yang didefinisikan sebagai rasio volume fase stasioner cair di atas volume kolom SF = VS / VC Parameter SF mengekspresikan rasio volume kolom CCC yang ditempati oleh fase stasiun. Sebagai parameter tanpa dimensi, SF memungkinkan perbandingan kapasitas retensi fase stasioner dari berbagai aparatur CCC. SF sering dinyatakan sebagai persentase. Persamaan 10 adalah persamaan. 8 penulisan ulang menggunakan fraksi fase stasioner SF Rumus :
Gambar 1 dan Persamaan. 10 menggambarkan pentingnya SF di CCC. Semua Gambar. 1 kromatogram dilakukan dengan sampel yang sama, dipisahkan dengan kolom CCC yang sama dan komposisi fase fasa yang sama. Jumlah fase diam cair hadir di kolom CCC adalah satu-satunya parameter yang berubah. Jika jumlah fa se stasioner yang dipertahankan dalam kolom CCC menurun, resolusi puncak kromatografi menurun, menghasilkan kromatogram yang berbeda secara dramatis pada Gambar. 1. Persamaan 8 menunjukkan bahwa volume fase stasioner harus dimaksimalkan untuk meningkatkan resolusi puncak. Persamaan 1 atau 3 menyatakan volume retensi zat terlarut yang juga sangat bergantung pada VS, volume fase diam. Tentu saja, jika tidak ada fase diam yang dipertahankan di kolom CCC, semua zat terlarut akan mengelusi volume VR = VM yang juga akan menjadi VC, volume kolom. Hal ini dapat dilihat pada Gambar. 1. Ketika faktor SF menurun, ada lebih sedikit fase diam di dalam kolom. Akibatnya, ada lebih banyak volume fase-ponsel (Persamaan 2). Solute dengan konstanta partisi, KD, lebih rendah dari unity, solutes 1 hingga 6 pada Gambar. 1, elute dengan volume retensi yang meningkat (Persamaan 3). Larutkan dengan KD> 1 elute dengan volume penajaman menurun (zat terlarut 8-10 dan persamaan 3 juga). Solute 7, dengan KD = 1, tidak sensitif terhadap SF atau VS (eq. 3). Ini mengelusi volume kolom dalam semua kasus (Gambar 1, VC = 120 mL, garis putus-putus vertikal) [2].
Gambar grafik
KOLOM CCC Dari berbagai desain kolom yang digunakan untuk mempertahankan fase diam cair [59], hanya dua yang memiliki potensi untuk pengembangan komersial berkelanjutan. Mereka disebut hidrostatik dan konfigurasi hidrodinamik. Kolom Hidrostatik CCC Kolom CCC hidrostatik pertama menggunakan gravitasi untuk menjaga fase diam cair; mereka disebut kolom dro plet CCC (DCCC). Mereka membutuhkan waktu elusi yang sangat panjang (berhari-hari). Kolom DCCC tidak lagi digunakan saat ini. Kolom CCC hidrostatik modern dikenal dan dipasarkan dengan nama kromatografi partisi sentrifugal (CPC) [7]. Dua karakteristik utama mereka adalah: (1) mereka memiliki satu sumbu rotasi yang menghasilkan medan sentrifugal yang konstan dan (2) mereka melingkupi volume geometris, tabung, saluran, atau lokasi yang berulang dengan sendirinya melalui tabung penghubung yang membentuk pola (Gambar 2A) . Dapat dilihat bahwa ada cukup banyak saluran penghubung yang hanya mengandung fase bulan. Gambar
Desain ini mengurangi waktu kontak untuk pertukaran zat terlarut dengan fase diam. Ini juga membangun tekanan hidrostatik kecil yang menjelaskan penurunan tekanan signifikan yang diperlukan untuk mengoperasikan sentrifugal hidrostatik. Semua sentrifugasi hidrostatik mengandung dua segel putar; satu di bagian atas dan yang lainnya di bagian bawah. Mereka tenang untuk beroperasi.
Dalam sistem CCC toroidal (helix CCC) yang dioperasikan di bawah gaya sentrifugal, dimensi koil direduksi menjadi yang sesuai untuk pemisahan analitis. Koil dipasang di sekeliling pinggiran mangkuk sentrifugal sehingga medan gaya sentrifugal aksi radial yang stabil mempertahankan fase diam di satu sisi kumparan seperti pada sistem hidrostatik dasar yang dijelaskan di atas. Kolom hidrodinamik CCC Sentrifugal hidrodinamika yang digunakan dalam kolom CCC memiliki dua sumbu rotasi, sumbu utama dan satu planaryary yang menghasilkan medan gaya sentrifugal variabel. Bisa ada sejumlah sumbu planet tetapi yang paling umum adalah sumbu tunggal, ganda, dan triple. Setiap sumbu planet memiliki kumparan atau spool yang dipasang di atasnya yang berisi gulungan-gulungan tuba Teflon yang kontinyu. Dalam kolom hidrodinamik, penting untuk mengetahui rasio jari-jari spool, r, di atas radius rotor, R. Rasio ini secar a tradisional disebut β [3-6]. Karena β didefinisikan dalam LC sebagai rasio fase VS / VM sehingga rasio beta CCC harus dicatat β r = r / R (lihat Gambar 3). Gambar
Tabungnya dapat dihubungkan dari bagian luar centrifuge, melilit putaran kumparan, dan kembali ke luar lagi tanpa segel silau — karenanya, dari sudut pandang kromatografi itu setara dengan satu kolom panjang yang panjang dan kontinyu. Medan gaya variabel menghasilkan zona pencampuran dan pengendapan di seluruh panjang kolom melingkar seperti ditunjukkan pada Gambar. 2B. Ada kontak terus-menerus antara dua fase cair di seluruh kolom tanpa penumpukan tekanan yang signifikan. Sentrifugal hidrodinamika bekerja dengan tekanan fase-seluler yang rendah tetapi dapat menghasilkan derau dari rakitan roda gigi, yang dapat dikurangi dalam sentrifugal yang dirancang dengan baik. Kolom ini sering disebut kolom CCC kecepatan tinggi (HSCCC) karena kolom ini dapat beroperasi jauh lebih cepat daripada kolom Craig, DCCC, dan berbasis gravitasi. Tabel 1 membandingkan fitur dari dua jenis kolom CCC. Tidak mungkin untuk mengatakan bahwa satu jenis jelas lebih unggul dari yang lain. Situasi terbaik adalah memiliki kedua jenis kolom CCC untuk mencakup semua kemungkinan kasus. Studi sedang mengembangkan sentrifugal CCC berskala besar berdasarkan kedua jenis yang mampu menghasilkan massa material murni yang signifikan (preparative CCC) [13 –15]. Sentrifugal seperti ini dapat digunakan untuk menghasilkan bahan referensi standar untuk tujuan analisis dan untuk memurnikan pereaksi analitis.
Tabel
Ada yang disebut sumbu silang yang merupakan kolom CCC hidrodinamik yang berisi dua gulungan tabung melingkar yang dipasang di rotor sedemikian rupa sehingga sumbu rotasi kumparan berada pada sudut yang tepat dari sumbu utama rotasi. Gerak cairan dalam kolom CCC Kolom CCC Hidrostatik atau BPK Seperti digambarkan pada Gambar. 2, gerakan cair dalam dua jenis kolom CCC sangat berbeda. Hal ini relatif mudah dimengerti bahwa fase diam cair akan disimpan secara fisik di saluran-saluran kolom hidrostatik. Jika laju alir fase bergerak dihentikan, kedua fase cair tetap berada di tempatnya (dengan demikian istilah hidrostatik). Cara fase bergerak bergerak melalui fase diam tergantung pada kerapatan relatifnya. Pada Gambar 2A, fase bergerak hitam adalah cairan yang lebih ringan (fase atas dalam tabung reaksi). Diilustrasikan memasuki saluran melalui ujung bawah dan meninggalkan di ujung atas-ini disebut modus menaik di mana fase gerak naik melalui fase stasioner yang lebih padat. Fasa cair yang lebih padat atau lebih rendah dapat digunakan sebagai fase gerak. Dalam hal ini, itu akan masuk dalam saluran dari ujung atas dan pergi melalui ujung bawah — ini dikenal sebagai mode menurun di mana fase densitas seluler turun melalui fase diam yang lebih ringan yang dipertahankan [7]. Pada Gambar. 2A, fase gerak ditunjukkan putus menjadi tetesan. Dalam prakteknya, fase gerak mengalir melalui fase diam, membengkok ke arah rotasi karena efek Coriolis, dan menghasilkan semprotan atau tetesan pencampuran ketika kaskade menyentuh dinding kamar atau antarmuka cair. Kolom hidrodinamik CCC atau HSCCC Sampai saat ini, alasan mengapa fase diam cair dipertahankan dalam kolom hidrodinamik tidak sepenuhnya diketahui. Dalam memutar kumparan atau gulungan dengan tabung digulung, heliks tabung menghasilkan gaya, yang disebut kekuatan sekrup Archimedean, yang mendorong cairan yang terkandung ke salah satu ujung tabung yang disebut kepala, ujung tekanan yang lebih tinggi. Ujung tabung yang lain disebut ekor — ujung bawah bertekanan rendah. Ketika dua cairan tak bercampur hadir dalam tabung atau kolom melingkar berputar, cairan yang lebih berat akan bergerak menuju ujung ekor kumparan, menggeser cairan yang lebih ringan ke arah ujung kepala. Intensitas dan arah gaya sekrup Archimedean tergantung pada kecepatan rotasi dan arah dan pitch heliks dari tabung melingkar [14]. Seperti ditunjukkan oleh Gambar. 2B, ketika fase cair hitam lebih terang dimasukkan melalui ekor kumparan berputar, ia akan melalui cairan padat dalam suksesi pencampuran dan zona pengendapan sampai ke kepala. Fase yang lebih ringan bergerak ke arah ekor-ke-kepala melalui fase padat. Jika fase padat adalah fase gerak, itu harus memasuki kolom CCC melalui kepala. Ini disebut arah head-to-tail melalui fase yang lebih ringan. Jika laju aliran fase bergerak dihentikan sementara rotor masih
berputar, gaya sekrup Archimedean akan memindahkan fase cair lebih ringan ke arah ujung kepala kumparan dan fasa yang lebih berat ke ujung ekor kumparan. Ini adalah gerakan masing-masing fase yang membuat proses menjadi hidrodinamik. Fase diam diadakan dalam kesetimbangan terhadap aliran fase gerak. Meningkatkan aliran ini dan fase stasioner lebih banyak dipindahkan dari kolom, menghasilkan volume retensi fase stasioner lebih rendah (SF lebih rendah). SISTEM PELARUT Tiga kriteria Banyak sistem pelarut dua fase dengan spektrum polaritas yang luas atau mengandung reagen pengekstraksi dapat diterapkan untuk memisahkan zat organik, bioorganik, dan anorganik. Entah fase cair atau organik dari sistem fasa dua fase dapat digunakan sebagai fase gerak. Banyak contoh sistem pelarut yang digunakan dalam CCC dapat ditemukan dalam literatur [5,15,16]. Secara umum, sistem pelarut yang dikenal dari pemurnian CCC preparatif juga dapat digunakan pada skala analitis. Sistem untuk pemisahan anorganik sangat berbeda dari pemisahan organik, seperti pada kebanyakan kasus yang pertama m engandung reagen pengompleks atau ekstraksi (ligan) [17]. Ada tiga kriteria penting untuk memilih sistem cairan dua fase. Pertama dan tentu saja, ini harus membentuk dua fase yang tidak dapat dipisahkan. Kedua, fase yang dipilih menjadi fase diam harus dipertahankan oleh kolom CCC. Ketiga, sampel harus dipisahkan oleh sistem cairan dua fase yang dipilih. Dua fase yang tidak dapat dicampur Ada campuran pelarut yang tak terhitung jumlahnya yang membentuk dua fase yang tidak dapat dipisahkan. Ketika sifat dari zat organik yang dipisahkan diketahui, seseorang dapat menemukan sistem pelarut yang sesuai dengan mencari literat ur untuk sistem pelarut yang telah berhasil diterapkan pada senyawa yang serupa [2 –10]. Dalam hal sistem dua fasa berair berair, fasa organik terdiri dari satu pelarut atau campuran pelarut yang berbeda. Berbagai sistem pelarut tidak berair / tidak berair (misalnya, heptana / asetonitril) telah digunakan untuk pemisahan senyawa nonpolar dan / atau senyawa yang tidak stabil dalam larutan berair. Pemisahan makromolekul dan partikel sel dapat dilakukan dengan berbagai sistem fasa polimer berair / berair. Di antara berbagai sistem fase polimer yang tersedia, dua jenis berikut adalah yang paling serbaguna untuk melakukan CCC. Sistem poli (etilen oksida) (PEO) / kalium fosfat menyediakan sarana yang mudah untuk menyesuaikan koefisien partisi makromolekul dengan mengubah massa molekul PEO yang dipilih dan / atau mengubah pH dan / atau konsentrasi dari buffer fosfat. The PEO 6000 / Dextran 500 sistem menyediakan lingkungan fisiologis, cocok untuk pemisahan sel mamalia dengan mengoptimalkan osmolaritas dan pH dengan elektrolit [6]. Untuk prakonsentrasi dan pemisahan spesies anorganik, fase diam yang mengandung r eagen pengekstraksi dari berbagai jenis (pertukaran kation, pertukaran anion, dan netral) dalam pelarut organik biasanya digunakan [2,18-25]. Komponen fase-bergerak tidak boleh mengganggu analisis selanjutnya. Larutan asam anorganik dan garamnya paling sering digunakan. Fase gerak juga dapat mengandung agen pengompleks spesifik, yang dapat mengikat satu atau beberapa elemen di bawah pemisahan. Retensi signifikan dari fase diam cair Parameter yang bertanggung jawab untuk retensi signifikan dari fase diam cair diukur dengan parameter SF (eq. 9) tergantung pada kolom CCC itu sendiri oleh lubang tubing yang digunakan untuk membuat kumparan (s), kumparan diameter, dan rasio β (lihat Gambar 3). Ini juga tergantung pada parameter eksperimental: kecepatan rotasi dan laju alir fase gerak [14]. Sifat fisikokimia dari sistem cairan dua fase juga bertanggung jawab kritis terhadap penyimpanan fase-fase cair yang baik. P erbedaan densitas fase cair, viskositas fase-gerak, dan tegangan antar muka adalah tiga parameter sistem cairan utama yang bekerja pada rasio SF [23]. Sebagai contoh, sistem dua fase berair (ATPS) yang dibuat dengan PEO, potasium fosfat, dan air
sangat sulit untuk dipertahankan dalam kolom hidrodinamik karena tegangan antar muka yang sangat rendah, viskositas tinggi pada fase atas PEO, dan perbedaan densitas rendah. Adalah mungkin untuk bekerja dengan ATPS menggunakan kolom hidrostatik. Selain itu, penambahan ekstraksi reagen dan garam mineral ke sistem dua fase (dalam kasus pemisahan anorganik) dapat sangat mempengaruhi sifat fisikokimia sistem cair dan, akibatnya, perilaku hidrodinamik dan nilai SF. Metode unik menggunakan sifat cair dari fase stasioner Tiga kegunaan unik dari sifat cair dari f ase diam di CCC disajikan di bawah ini. Dalam ketiga kasus ini, metode dikembangkan karena zat terlarut dipertahankan terlalu lama dalam fase diam. Cara-cara melakukan pemisahan kromatografi tidak akan mungkin dengan teknik kromatografi lainnya bekerja dengan fase diam yang solid. Metode dual-mode Gambar 4 menunjukkan cara langsung untuk menjelaskan metode dual-mode. Selama langkah A, chro- matograph CCC digunakan karena akan menjadi pemisahan klasik. Solute 1 dan 2 elute karena mereka memiliki rasio partisi yang rendah. Larutan 3 dan 4, dengan rasio partisi tinggi, memiliki afinitas tinggi untuk fase diam. Mereka bergerak sangat lambat di dalam "kolom" CCC. Menggunakan keuntungan dari fase diam cair, peran fase diaktifkan setelah satu kolom volume, VC, fase gerak telah melewati kolom. Selama langkah B (Gambar 4), fase gerak baru adalah cairan yang sebelumnya fase diam, dan dipompa ke arah yang berlawanan. Solute 4, yang bergerak paling lambat dalam langkah A (Gambar 4), adalah yang paling dekat dengan apa yang sekarang menjadi outlet kolom. Larutan 3 dan 4 memiliki afinitas tinggi untuk apa yang sekarang fase bulan. Solute 4 adalah yang pertama meninggalkan kolom diikuti oleh zat terlarut 3 (Gbr. 4, kromatogram bawah). Urutan elusi zat terlarut adalah 1, 2, 4, dan 3. Metode dual-mode sangat berbeda dari metode backflush yang digunakan dalam kromatografi gas multidimensional (GC) atau LC di mana arah mengalir fase gerak diubah. Ini menurunkan faktor resolusi puncak zat terlarut yang terpisah sebagian dalam kolom. Selama langkah B dari metode dual-mode CCC, itu adalah fase diam sebelumnya yang bergerak mundur. Ini meningkatkan resolusi puncak faktor zat terlarut di dalam kolom.
Gambar fig. 4
CCC Bersamaan CCC Bersamaan adalah solusi lain untuk memaksa zat terlarut yang sangat ditahan untuk mengeluarkan dari kolom [24]. D alam CCC bersamaan, dua pompa digunakan. Fase diam cair perlahan didorong dalam arah yang sama dengan fase gerak. Paling sering, laju aliran fase "stasioner" kurang dari 1% dari laju alir fase gerak. Metode ini digunakan untuk mengukur konstanta partisi oktan-1-ol-air yang sangat besar menggunakan fase gerak berair dan fase diam oktan-1-ol bergerak lambat. Konstanta KDo / w diekspresikan sebagai [2] KD = (tR Faq - VM, aq) / (VS, oct - tR Foct) (11) Dalam persamaan. 11, VM, aq adalah volume fase berair yang terkandung dalam "kolom" CCC dan VS, ok adalah volume fase oktan-1-ol "stasioner", Faq dan Foct, masing-masing, laju aliran dari fase berair dan oktan-1-ol, dengan Foct << Faq, dan tR adalah waktu retensi zat terlarut. Metode ekstrusi elusi Cara lain untuk memulihkan zat terlarut yang memiliki afinitas kuat untuk fase diam
cair adalah dengan mengekstraksi seluruh isi kolom setelah centrifuge berhenti setelah elusi satu kolom volume. Telah ditemukan bahwa bagian utama dari pelebaran band terjadi ketika zat terlarut meninggalkan kolom dalam fase gerak. Di dalam kolom, di mana dua fase cair bersentuhan satu sama lain, puncaknya tipis. Ekstrusi dua fase yang terkandung dalam kolom mempertahankan puncak tipis dan menghasilkan faktor resolusi puncak yang sangat tinggi [25]. Tabel 2 membandingkan volume retensi dari enam senyawa campuran yang dipisahkan dalam delapan kemungkinan cara CCC dengan sistem cairan biphasic y ang sama dan kolom CCC. Penggunaan k lasik dari CCC dalam mode fase terbalik (RP) (cairan apolar sebagai fase diam) memisahkan pada awal semua enam senyawa yang membutuhkan volume besar fase gerak untuk mengelusi senyawa 6. Ide pertama untuk menghemat waktu dan pelarut adalah bekerja menggunakan mode fase normal (NP) dengan cairan polar yang digunakan sebagai fase diam. Dalam konfigurasi cair ini, rasio partisi K'D masih merupakan rasio konsentrasi zat terlarut dalam fase diam pada fase bergerak. Jadi K'D (fase normal) adalah kebalikan dari KD (fase yang telah dibuktikan) dan urutan elusi dibalik. Tabel 2 menunjukkan bahwa metode terbaik untuk memilih akan tergantung pada senyawa mana yang paling diinginkan. Semua metode menggunakan pelarut 4 –10 kali lebih sedikit daripada metode klasik. Tabel.2
Kondisi pemisahan yang optimal Hal ini menunjukkan bahwa kondisi terbaik untuk pemisahan optimal adalah retensi yang baik dari fase stasioner (Gambar 1) dan solute memiliki rasio partisi KD antara 0,5 dan 2 [26]. Mengubah komposisi sistem liq-uid mengubah rasio partisi terlarut dan karenanya selektivitas kromatografi dan resolusi puncak. Keaslian CCC adalah bahwa dalam banyak kasus kedua komposisi fase bergerak dan f ase stasioner saling terkait. Mengubah satu mengubah komposisi yang lain. Diagram fase-biner sering digunakan untuk memprediksi komposisi dua fase [2,7,9]. Larutan terlarut yang tinggi selalu dapat dielusi menggunakan sifat cair dari fase diam. Dalam beberapa kasus terbatas, gradien langkah juga dapat digunakan [16]. Untuk pemisahan organik, dua sistem fase cair yang diperoleh dengan sistem pelarut kuaterner yang dibuat dengan mencampur heptana, etil asetat, metanol, dan air ditemukan sangat berguna di CCC. Campuran dapat berubah dari sangat apolar (sistem heptana / metanol) menjadi sangat polar (etil asetat / sistem air) dengan kemungkinan modulasi yang luas menambahkan lebih banyak a tau lebih sedikit pelarut polar (metanol) atau apolar (heptana) [27,28]. Partisi senyawa anorganik, serta yang organik, tergantung pada sifat-sifat sistem yang digunakan, koefisien partisi zat yang akan dipisahkan, dan parameter operasi sentrifugal planet seperti rotasi dan kecepatan revolusi, arah dan kecepatan ponsel -fase memompa, diameter internal kolom, dan volume sampel. Karena ion anorganik biasanya diekstraksi sebagai senyawa kompleks mereka, proses kompleksasi, laju dan laju perpindahan massa adalah
salah satu faktor utama yang menentukan efisiensi pemisahan. Kinetika sangat penting karena pemisahan CCC dapat menjadi proses nonquilibrium.
APLIKASI CCC memainkan peran yang semakin penting dalam ilmu pemisahan. Semua komponen dalam larutan sampel yang disuntikkan ke dalam kolom dapat dipulihkan, dan adsorpsi dan pencemaran yang irreversible dari sampel hampir dapat dihilangkan. Sampel mentah dapat disuntikkan langsung ke kolom, yang menyederhanakan persiapan sampel. Sekarang CCC berhasil digunakan untuk pemisahan zat organik dan anorganik dari campuran yang rumit. Zat organik CCC telah menjadi metode pilihan dalam kimia produk alami dan telah memungkinkan pemisahan sejumlah produk alami yang menarik secara biolo gis yang sulit atau tidak mungkin untuk dipisahkan dengan teknik lain [2,16,30]. Ekstrak kasar tanaman atau organisme lain sering terlalu rumit untuk analisis langsung dengan HP LC. Bahan-bahan tertentu mungkin ireversibel mengikat ke bahan pengepakan atau dapat memasang filter kolom inlet, dan karenanya mengurangi umur kolom. Pembatasan tersebut tidak berlaku untuk CCC analitis, yang merupakan metode menarik untuk pengayaan dan pemisahan berbagai analit. Teknik ini juga digunakan untuk pemisahan biokimia dan farmasi. CCC sangat cocok untuk pemisahan alkaloid dari ramuan medis menggunakan sistem pelarut sederhana, untuk analisis total ho rmon sampel alami [31], dan untuk skrining senyawa bioaktif baru dalam ekstrak mentah dan sampel kompleks lainnya [32]. CCC juga telah disarankan sebagai alternatif untuk metode gumpalan goyang untuk mengukur koefisien partisi cair-cair sebagai cara untuk mengkarakterisasi sifat lipofilik-hidrofilik dari suatu senyawa [33]. Di bawah ini, beberapa metode menarik dijelaskan secara singkat yang telah berhasil digunakan dalam analisis berbagai sampel atau yang dapat diterapkan untuk tujuan analitis tanpa modifikasi prosedur dan peralatan yang serius. Analisis tanaman dan berbagai produk alami Berbagai jenis hidrodinamika (HSCCC, kumparan silang sumbu) dan sentrifugal hidrostatik (toroidal coil) dapat digunakan untuk pemisahan dan konsentrasi berbagai senyawa dari tanaman dan berbagai produk alami. Kuantitas senyawa yang terpisah dapat berkisar dari jumlah jejak hingga gram. 1. Sentrifugal coil sentrifugal Sentrifugal kumparan toroidal telah berhasil diterapkan pada pemisahan dan pemurnian hormon tanaman, yaitu, auxins indole, giberelin, sitokinin, dan asam absisat. Indole auksin dipisahkan oleh heksana-etil asetat-metanol-air (rasio volume 0,6: 1,4: 1,0: 1,0) atau kloroform-asetat-asam-air (2: 2: 1 ) dalam kolom dengan total kapasitas 18 mL. Sistem pelarut terakhir sangat berguna untuk pemisahan asam absisat dari asam indol-3-asetat. Giberelin (GA3, GA4, dan GA7) dipisahkan satu sama lain dalam buffer eter-metanol-fosfat (pH 7) (3: 1: 2). Metode CCC cocok untuk pemisahan empat sitokinin dalam buffer etil asetat-metanol-fosfat (pH 7) (3: 1: 3) [2,4,5]. Sebuah centrifuge planet koil toroidal untuk pemisahan skala analitik digunakan untuk pemurnian asam absisat (ABA) yang diperoleh dari ekstrak tanaman mentah dan tekadnya dalam beberapa jaringan tanaman menggunakan HPLC dan GC-MS [34]. Hasil isolasi 3-oxo-∆5-steroid isomerase (KSI) dari E. coli lisat mentah diterbitkan [35]. Pemisahan dilakukan pada ca. 3 mg KIA berlabel 15N menggunakan sistem pemolesan polimer berdasarkan PEO 3350. Metode ini menghilangkan hilangnya sampel dan denaturasi yang disebabkan oleh dukungan padat dan menghasilkan protein murni baik dalam pemisahan preparatif maupun analitik. 2. Sentrifugal hidrodinamik berkecepatan tinggi (HSCCC) Banyak aplikasi dalam analisis dan persiapan produk alami oleh CCC telah dilaporkan [1,36 –38]. Pemisahan produk alami
polifenol seperti flavonoid sulit karena senyawa ini cenderung menunjukkan "tailing puncak" dalam RP-HPLC, serta adsorpsi ireversibel pada silika gel. Kesulitan-kesulitan tersebut tidak ada di CCC dan merupakan alasan mengapa CCC telah diakui sebagai teknik yang paling bernilai untuk i solasi polifenol [39]. Flavonoid dan hydroxyanthraquinone dapat dengan mudah dipisahkan oleh CCC dengan selektivitas tinggi [40]. Zhang telah mempublikasikan hasil pemisahan alkaloid (dari Stephania tetrandra S. Moore) menggunakan sistem n-hexane-etil asetat-metanol-air pada rasio volume yang berbeda, hidroksi-anthraquinones (dari rimpang Rheum palmatum L.) menggunakan sistem heksana-etil asetat-metanol-air (9: 1: 5: 5) dan flavonoid (dari buckthorn Hippophae rhamnoides laut) menggunakan sistem kloroform-metanol-air (4: 3: 2) oleh CCC; kapasitas total kolom adalah 43 mL, kecepatan revolusi maksimum centrifuge adalah 2000 rpm [40]. Dengan meningkatkan laju aliran fase gerak dalam pemisahan analitik ini, waktu pemisahan untuk campuran sampel mentah dipersingkat menjadi dalam 15 menit, yang cukup sebanding dengan HPLC analitis. Miligram dan bahkan jumlah gram zat dapat diisolasi dengan teknik CCC. Ini memungkinkan untuk menghasilkan bahan referensi standar untuk setiap studi analitis. Untuk pemisahan yang lebih efisien dari senyawa-senyawa yang memiliki kisaran polaritas yang luas, fasa-fasa yang lebih rendah dan atas dari sistem pelarut digunakan sebagai fase gerak berturut-turut. Metode ini mencapai pemisahan lengkap dari lima komponen yang ada dalam campuran sampel 1 mg. Fraksi puncak dari masing-masing senyawa menjadi sasaran analisis spektrometri massa untuk konfirmasi struktur senyawa [41]. Gambar 5 menunjukkan kromatogram berlawanan dari lima senyawa utama dalam ekstrak kasar rimpang Rheum palmatum L. Tiga puncak (1, 2, dan 3) dielusi dengan fase atas dalam mode TN diikuti oleh dua puncak (A dan B) yang dielusi dengan fase bawah dalam mode RP. Hasilnya menunjukkan bahwa puncak A, B, 1, 2, dan 3 masing-masing sesuai dengan chrysophanol, emodin, physcion, aloe-emodin, dan rhein. CCC digunakan untuk seleksi sistematis dan optimalisasi sistem pelarut dua fase untuk memisahkan alkaloid dari Coptis chinensis Franch menggunakan sistem larutan kloroform-metanol-HCl (0,3 –0,1 mol / L) pada rasio volume yang berbeda [42] . Satu pemisahan run menghasilkan empat alkaloid murni, termasuk palmatine, berberin, epiberberine, dan coptisine dari ekstrak alkaloid mentah. Aplikasi analitis CCC berhasil ditunjukkan untuk pemisahan jumlah mikrogram flavonoid dari ekstrak etanol mentah sea buckthorn dalam kumparan multilayer dengan kapasitas total 8 mL menggunakan sistem pelarut dua fase yang terdiri dari kloroform-metanol-air (4 : 3: 2) [43]. Lima puncak, termasuk isorhamnetin dan quercetin, terselesaikan dengan baik dan dielusi dalam 8 menit. Campuran buatan dari tiga (50 µg masingmasing) coumarin tanaman umum (herniarin, scopoletin, dan umbellif erone) dan satu flavanone (hisperetin) dipisahkan dengan kolom CCC hidrodinamik yang terhubung ke detektor array fotodioda. Fase yang lebih rendah dari kloroform-metanol-air (rasio volume 13: 7: 8) sistem digunakan sebagai fase gerak, dan resolusi puncak awal dari empat senyawa dicapai dalam waktu kurang dari 30 menit [44,45]. Beberapa flavonoid, termasuk 7-O-glucosylbaicalein, baicalein, dan chrysin, dipisahkan dari ekstrak etil asetat dari biji Oroxylum indicum (obat herbal) menggunakan kolom volume total 27-50 mL oleh sistem pelarut dua fase kloroform. –Methanol – water (8: 10: 5) [46] dan hexane – ethyl acetate – methanol – water pada berbagai rasio volume [47]. Semua konstituen ini diidentifikasi dan dideteksi o leh spektroskopi NMR dan ionisasi elektrospray / spektrometri massa (ESI / MS) setelah elusi isokratik atau elusi-langkah. Pemisahan fraksi flavonoid dari biji Oroxylum di- dicum (Bignoniaceae) dicapai dalam 6-20 menit menggunakan kolom koil 4,6 mL (0,76 mm i.d. tubing) [48]. Hasil isolasi dan pemurnian tanshinone IIA, tanshinone I, dihydrotanshinone I, dan cryptotanshinone menggunakan HSCCC diterbitkan.
Gambar fig.5
arasi hydroxyanthraquinones dari obat-obatan Cina tradisional Rheum officinale Baill (Dahuang) dan Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc (Huzhang) [50,51]. Kolom hidrodinamik CCC dapat digunakan untuk pemisahan hormon tanaman indole [31,52], tanaman a lkaloid [31], dan s-triazine herbisida [53,54] dan untuk isolasi produk alami bioaktif [55]. Pembagian skala analitik yang efisien ditunjukkan untuk pemisahan hormon tanaman indole dengan kum paran multilayer dalam sentrifugal dengan kapasitas total hingga 10 mL dalam heksana-etil asetat – metanol – air (rasio volume 1: 1: 1: 1) [ 31,56]. Sistem heksana-etil asetat-metanol-air pada rasio volume yang berbeda digunakan untuk pemisahan indol oleh HSCCC dalam kolom 40 mL [57]. Empat hormon tanaman indole sepenuhnya terselesaikan tetapi hanya dalam 90 menit, yang lambat untuk aplikasi analitik rutin. Namun, harus disebutkan bahwa ligan bioaktif sering sangat mirip dalam struktur, dan sangat sulit untuk mendapatkan ligan individu dalam bentuk murni untuk evaluasi farmakologis. Pemisahan lengkap bioaktif lignan schisanhenol dan asetatnya dalam kolom kumparan multilayer menggunakan sistem n-heksana-etanol-air (6: 5: 5) [62] adalah contoh yang menunjukkan bahwa HSCCC dapat menjadi metode pelengkap untuk HPLC. bahkan jika pemisahannya tidak cepat. Pemisahan campuran buatan vincamine [58], alkaloid utama Vinca minor (Apocynaceae) dan vincine (11methoxyvincamine), dilakukan pada centrifuge dengan kolom multilayer (0,85 mm id) menggunakan heksana-etanol-air (6: 5: 5) sistem. Perbandingan pemisahan dengan hasil yang diperoleh oleh RPHPLC menunjukkan bahwa kedua metode memberikan resolusi puncak dasar yang baik, tetapi mungkin untuk mendapatkan puncak tambahan dari isomer vincine, yang tidak diselesaikan oleh HPLC. CCC digunakan dalam analisis rasa untuk pemisahan zat labil, seperti senyawa aroma atau prekursor masing-masing (poliol dan glikokonjugat), dari campuran alam yang kompleks [59]. Aplikasi dari kolom CCC hidrodinamik kumparan multilayer untuk analisis prekursor rasa reaktif dari Rosa damascena bunga dilaporkan [60]. Keserbagunaan, penyelesaian kekuatan CCC, dan kemampuan analitisnya telah ditunjukkan dengan beberapa sistem sentrifugal planet kecepatan tinggi analitik yang baru dikembangkan. Interfacing CCC dengan spektrometri massa disarankan oleh Oko pada 1980-an. Ini menyediakan metodologi analitik yang mengintegrasikan keuntungan dari CCC dengan batas deteksi rendah dan kemampuan identifikasi specometri massa [61-64]. Kemampuan termospray MS / CCC ditunjukkan dalam mengidentifikasi dan mengalien lignan bioaktif dan struktural yang dikenal dari ekstrak mentah Schisandra rubiflora (Rhed et Wils), obat herbal tradisional Cina untuk pengobatan hepatitis [65]. Pemisahan campuran auxin indole oleh HSCCC [63] dicapai dalam waktu 20 menit dengan sangat baik pelat teoritis CCC. Efisiensi pemisahan terbaik untuk indole-3-acetamide, asam indole-3-acetic, dan asam indole-3-butyric diperoleh pada coil multilayer kecil yang nyaman untuk studi analitis (kolom 0,3 mm dan kapasitas 3-6 mL , diputar pada 3500 rpm), menggunakan sistem heksana-etil asetat-metanol-air (1: 1: 1: 1). CCC / MS diterapkan juga untuk penentuan alkaloid, asam triterpenoic, mycinamicins, colistins, dll. [62]. Peralatan CCC
CCC juga berhasil menggunakan forarasi hydroxyanthraquinones dari obat tradisional Cina Rheum officinale Baill (Dahuang) dan P olygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc (Huzhang) [50,51]. CCC hidrodinamik kolom dapat digunakan untuk pemisahan hormon tanaman indole [31,52], tanaman alkaloid [31], dan s-triazine herbisida [53,54] dan untuk isolasi produk alami bioaktif [55]. Pembagian efisien timbangan analitik ditunjukkan untuk pemisahan hormon tanaman indole dengan kumparan multilayer dalam sentrifugal dengan kapasitas total hingga 10 mL dalam heksana-etil asetat metanol - air (rasio volume 1: 1: 1: 1) [ 31,56]. Sistem hexane-ethyl acetate-methanol-water pada rasio volume yang berbeda digunakan untuk pemisahan indole oleh HSCCC dalam 40 mL kolom [57]. Keempat hormon tanaman indole benar-benar teratasi tetapi hanya dalam 90 menit, yang lambat untuk aplikasi analitik rutin. Namun, harus disebutkan bahwa ligan bioaktif sering sangat mirip dalam struktur, dan sangat sulit untuk mendapatkan ligan individu dalam bentuk murni mereka untuk evaluasi farmakologis. Pemisahan lengkap bioaktif lignan schisanhenol dan asetat dalam kolom kumparan multilayer menggunakan sistem n-hexane-etanol-air (6: 5: 5) [62] adalah contoh yang menunjukkan bahwa HSCCC dapat menjadi metode pelengkap untuk HPLC. bahkan jika pemisahannya tidak cepat. Pemisahan campuran buatan vincamine [58], alkaloid utama Vinca minor (Apocynaceae) dan vincine (11-methoxyvincamine), dilakukan pada centrifuge dengan kolom multilayer (0,85 mm id) menggunakan hexane-ethanol-water sistem (6: 5: 5). . Perbandingan pemisahan dengan hasil yang diperoleh oleh RP-HPLC menunjukkan bahwa kedua metode memberikan resolusi dasar puncak yang baik, tetapi dimungkinkan untuk mendapatkan puncak tambahan dari isomer vincine, yang tidak diselesaikan oleh HPLC. CCC digunakan dalam a nalisis rasa untuk pemisahan zat labil, seperti senyawa aromatik atau prekursor masing-masing (poliol dan glikokonjugat), dari campuran alam yang kompleks [59]. Aplikasi kolom kolom hidrodinamik CCC multilayer untuk analisis prekursor rasa reaktif dari Rosa damascena bunga dilaporkan [60]. Keserbagunaan, resolusi kekuatan CCC, dan kemampuan analitis telah ditunjukkan oleh beberapa sistem sentrifugal planet analitik kecepatan tinggi yang baru dikembangkan. Antarmuka CCC dengan spektrometri massa disarankan oleh Oko pada tahun 1980-an. Ini menyediakan metodologi analitik yang mengintegrasikan keuntungan dari CCC dengan batas deteksi rendah dan kapabilitas identifikasi spesium massa [61-64]. Kemampuan termospray MS / CCC ditunjukkan dalam mengidentifikasi dan mengasingkan lignin bioaktif dan struktural yang diketahui dari ekstrak mentah Schisandra rubiflora (Rhed et Wils), obat herbal tradisional Cina untuk pengobatan hepatitis [65]. Pemisahan campuran auxin indole oleh HSCCC [63] dicapai dalam waktu 20 menit dengan pelat teoritis CCC yang sangat baik. Efisiensi pemisahan terbaik untuk indole-3-acetamide, asam indole-3asetat, dan asam indole-3-butyric diperoleh dalam koil multilayer kecil yang nyaman untuk studi analitis (kolom 0,3 mm dan 3-6 mL kapasitas, diputar pada 3500 rpm), menggunakan sistem hexaneethyl acetate-methanol-water (1: 1: 1: 1). CCC / MS juga diterapkan untuk penentuan alkaloid, asam triterpenoic, mycinamicins, colistins, dll. [62] Peralatan analitis CCC dapat langsung terhubung ke frit electron ionization (EI), ionisasi kimia (CI), dan atom cepat membombardir MS (FAB / MS) tanpa pompa HPLC tambahan [62]. CCC-frit / MS dapat menjadi alat yang berguna untuk penyelidikan produk alami (terutama untuk pemisahan zat penting biologis) dan juga dapat berhasil diterapkan pada karakterisasi struktural produk alami. Kemampuan dan kekuatan penyelesaian CCC dalam pemisahan beberapa campuran produk alami (eritromisin dan dehidrasi) dikombinasikan dengan ESI / MS telah dibuktikan [66]. Penerapan sistem CCC / ESI / MS diilustrasikan dengan pemisahan dan deteksi senyawa biologis penting. Lima herbisida polar dipisahkan dan dikarakterisasi menggunakan kombinasi CCC / ESI / MS online [67]. Sistem pelarut biphasic isokratik standar dari n-hexane-etil asetat-metanol-air digunakan. Kromatografi digabungkan menjadi spektrometer massa tiga
kuadrupole melalui ESI / MS, memungkinkan spektrum massa untuk diperoleh dalam mode ion negatif masing-masing senyawa. Batas deteksi dilaporkan untuk seri senyawa ini bersama dengan perwakilan ion negatif dan kalibrasi data ESI / MS untuk pemisahan. CCC dapat berhasil terhubung langsung ke major tanpa ESI / MS. modifikasi pada antarmuka HPLC / MS konvensional. Metode CCC / ESI / MS dan APCI / MS on-line juga digunakan untuk identifikasi flavonoid menggunakan sistem heksana-etil asetat-metanol-air [68]. Analisis makanan CCC memiliki potensi untuk memainkan peran penting dalam analisis makanan karena memungkinkan analisis sampel mentah dan kompleks. Salah satu keuntungan utama CCC adalah ia dapat memisahkan zat-zat dari volume besar sampel semacam itu, yang penting untuk analisis makanan. Potensi ini belum diakui di bidang pengujian makanan. Akhirnya, menggabungkan pemisahan CCC dengan metode identifikasi dan pendeteksian analitik lainnya, seperti spektrometri massa, elektroforesis kapiler, atau HPLC, secara potensial berguna untuk analisis toksin pada makanan [69]. Salah satu penyakit yang paling sering adalah gastroenteritis yang dihasilkan dari makanan yang terkontaminasi dengan Enterotoxin Staphylococcal A (SEA) yang diproduksi oleh bakteri Staphylococcus auras. CCC dievaluasi untuk pemisahan SEA dari susu [70]. Sampel susu yang mengandung SEA dipisahkan pada kolom kumparan toroidal dengan kapasitas total 13 mL. Sistem fase polimer, terdiri dari PEO 1000 dan dipotassium fosfat, digunakan sebagai fase diam. CCC digunakan untuk pemisahan S EA baik alami dan panas denatured yang terkandung dalam sampel kasar jamur dalam kolom dengan kapasitas total 18 mL [71]. Metode sederhana ini tidak memerlukan persiapan sampel selain homogenisasi. Metode ini sekitar 10 kali lebih sensitif daripada metode imunologi seperti western blotting karena sampel yang sangat besar dapat diterapkan di CCC. CCC diterapkan pada analisis glikoglikolipid yang mengandung phosphocholine (GGPL-I dan GGPL-III) dari Mycoplasma fermentans, yang dianggap sebagai salah satu mikroorganisme penyebab rheumatoid arthritis (RA) [72]. Metode CCC adalah alat yang ampuh untuk pemisahan lipid mikroorganisme dan, yang lebih penting, ia dapat menjadi alat yang berguna untuk analisis interaksi host-patogen atau, dengan kata lain, interaksi lipid-protein di mikrodomain lipid. Kolom hidrodinamik CCC digunakan untuk memisahkan monomer, dimer, trimer, dan oligomer katekin dan / atau epikatekin dari procyanidins apel (tanin kental) [73]. Sifat farmakologi dari procyanidins (efek menguntungkan pada sistem sirkulasi, anti-alergi dan aktivitas antibiotik, dll) tergantung pada tingkat polimerisasi mereka, yang membuatnya perlu untuk menetapkan metode pemisahan yang dapat diandalkan. NP, RP , dan eksklusi-ukuran LC cenderung menyebabkan adsorpsi yang ireversibel terhadap proksianidin pada bahan pengemasan kolom, sedangkan tidak ada kerugian yang diamati dengan pemisahan CCC [74]. Selanjutnya, beberapa polifenol yang berhubungan dengan makanan, seperti oligomer katekin kental (pro-sianidin), asam fenolik, dan glikosida flavonol yang jelas dipisahkan di bawah kondisi HSCCC yang sama. Pemisahan terbaik prosianidin dicapai dengan sistem pelarut dua fase yang terdiri dari butan-1-ol- (metil tert-butil eter) –acetonitrile – 0,1% TFA (2: 4: 3: 8) menggunakan fase bawah sebagai mo- empedu. Keberhasilan pemisahan CCC katekin, glikosida flavonoid, dan prosianidin yang digunakan dalam analisis polifenol terkait makanan juga dilaporkan [75]. Campuran uji standar yang terdiri dari 21 produk alami yang tersedia secara komersial dari signifikansi pertanian digunakan untuk mengukur karakteristik kinerja CCC dari keluarga sistem pelarut yang terdiri dari heksana-etil asetat-metanol-air. Sebuah metode CCC elusi-ekstrusi dan pemilihan sistem dapat direkomendasikan untuk analisis berbagai anggur [76]. Kolom CCC hidrodinamik khusus dengan 1-mm i.d. tabung polytetrafluoroethylene (PTFE) digunakan untuk analisis ovalbumin yang diperoleh dari berbagai sumber [77]. Fraksi CCC dari
ovalbumin dari putih telur segar dan dari produk komersial yang mengandung albumin alami dan produk terdeteksinya dideteksi secara spektrofotometri setelah pemisahan menggunakan sistem berair biphasic yang mengandung PEO 1000 dan K2HPO4. Analisis lingkungan Teknik ini dapat berguna dalam analisis lingkungan untuk prakonsentrasi jejak bahan organik dari volume besar air dan sampel berair lainnya. Misalnya, surfaktan nonionik dari alkylphenyl poli (oxyethylene) eter (APEO) keluarga, digunakan dalam detergen, pembersih, dan bantu proses, berhasil diperkaya dari air limbah pada peralatan hidrostatik Sanki CPC [78,79]. Faktor konsentrasi 400 dicapai menggunakan etil asetat sebagai fase ekstraksi stasioner. K elayakan menggunakan kolom CCC hidrostatik untuk mengekstrak µg / kg kadar fenol dan pestisida organoklorin (OCP) dari sampel berair juga telah diteliti [80]. Efek pelarut ekstraksi (fase diam) dan volumenya, laju alir pemuatan sampel, kekuatan ionik, dan keberadaan bahan humat dalam sampel berair pada ekstraksi 13 fenol dan 20 OCPs telah diperiksa. Data pemulihan untuk analit-analit yang diekstraksi dari sampel air dan air limbah yang bocor dilaporkan. Metilena klorida lebih efektif daripada heksana dalam mengekstraksi fenol tetapi hanya sedikit lebih baik daripada heksana dalam mengekstrak OCP. Senyawa target terkonsentrasi menjadi volume kecil pelarut (2 mL) dari volume matriks berair yang relatif besar (> 100 mL). Ion anorganik Studi selama 15 tahun terakhir telah menunjukkan bahwa teknik ini dapat diterapkan untuk pemisahan analitik dan radio- lysis dan prakonsentrasi ion anorganik serta pemurnian anorganik aloral reagen. CCC memiliki potensi dalam analisis jejak dan ultratrace untuk prakonsentrasi logam sebelum penentuan multielement instrumental oleh spektrometri serapan atom (AAS), emisi atom plasma induktif cou- (ICP / OES) dan spektrometri massa (ICP / MS). Dalam alat CCC dengan kolom plastik, kaplet inlet dan outlet, larutan uji hanya bersentuhan dengan Teflon. Ini meminimalkan risiko kontaminasi sampel. Selain itu, pelarut dan reagen yang digunakan dapat dimurnikan sebelum pemisahan dan prakonsentrasi di kolom yang sama [81]. Penggunaan hanya satu kolom juga merupakan keuntungan dalam k asus ekstraksi analit dari solusi sampel yang sangat kompleks, misalnya, bahan geologi, ketika dua atau lebih sistem ekstraksi diperlukan untuk memulihkan elemen target. Perlu juga disebutkan bahwa, seperti pemisahan organik atau bioorganik, CCC memungkinkan seseorang untuk bekerja dengan sampel mentah yang mengandung partikel koloid atau padat. Karena CCC cen- trifuge adalah sistem tertutup, akan lebih mudah untuk bekerja dengan cairan radioaktif tanpa risiko radiasi radionuklida. Ini penting untuk studi radiokimia yang aman. Untuk pemisahan dan prekonsentrasi zat anorganik oleh CCC, berbagai sistem cairan dua fase digunakan. Karena kemungkinan menggunakan berbagai besar sistem ekstraksi cair-cair (LLE), CCC dapat diterapkan sebagai prakonsentrasi dan teknik preseparasi untuk berbagai elemen sebelum penentuan instrumen [22,81-89]. Lantanida dan aktinida Kutu yang dikenakan biaya dari unsur tanah jarang (REE) sangat sulit dipisahkan karena diameternya hampir sama dan kemampuan pengompleksannya serupa. Ekstraksi dan pemisahan UTJ dapat membantu memecahkan beberapa masalah analitis. Selain itu, pemisahan unsur-unsur tersebut dapat menjadi tes yang baik untuk memperkirakan efisiensi pemisahan teknik apa pun. 1. Hi drostatik CPC sentrifugal Pekerjaan pertama pada penggunaan kolom hidrostatik (CPC) untuk pemisahan spesies anorganik yang diterbitkan pada tahun 1988 oleh Araki [90]. Pemisahan dilakukan dengan sistem ekstraksi berdasarkan bis (2-ethylhexyl) hidrogen fosfat (B2EHP) di toluena. Pemisahan La, Ce, Pr; La, Pr, Nd; Pr, Nd; Nd, Sm; dan Sm, Eu menggunakan variabel HCl konsentrasi (dari 0,04 hingga 0,15 mol / L) ditunjukkan. Resolusi puncak dapat ditingkatkan dengan meningkatkan jumlah microcell (dari 1200 hingga 2400) [91]. Belakangan, Araki dkk. [92] mempublikasikan studi mereka tentang perilaku CPC
dari REE yang lebih berat (Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu) dalam penggunaan 0,01 mol / L B2EHP dalam kloroform pada konsentrat HCl yang berbeda - trations dalam fase gerak dan temperatur yang berbeda. Waktu pemisahan untuk REE terlalu lama (2-4 jam). Pemisahan CPC cahaya lantanida berhasil dilakukan dengan menggunakan l arutan B2EHP atau tributyl phosphate (TBP) dengan alkana tidak bercabang sebagai fase stasioner dan larutan HNO3 berair sebagai fase gerak [93 –95]. Beberapa sistem lain digunakan untuk pemisahan Sc, Y, dan REE yang dikenakan tiga kali [96]. BPK juga digunakan untuk pemisahan skala analitis REE trivalen oleh 0,1 mol / L Cyanex 272 [bis (2,4,4-trimethylpentyl) hidrogen fosfat] dengan heptana sebagai fase diam dan air pada pH yang sesuai sebagai fase gerak [ 33]. Ini ditunjukkan untuk pertama kalinya bahwa campuran UTJ dapat dipisahkan secara efisien dalam satu kali dijalankan oleh BPK menggunakan elusi gradien pH. Pemisahan lantanida yang diisi tiga kali sehari dengan ekstraktan 1-fenil-3-metil-4-benzoil-pirazol-5satu (HPMBP) dan 1-fenil-3-metil-4-kaprilil — pyrazol-5-satu (HPMCP) dalam pasangan fase tol ueneair dan faktor-faktor yang mempengaruhi efisiensi pemisahan telah diselidiki [97]. Perbedaan signifikan yang diamati dalam efisiensi pemisahan dengan HPMBP dan HPMCP, yang berasal dari perbedaan dalam konstanta tingkat disosiasi antar permukaan kompleks logam dan daerah antarmuka yang dihasilkan, menunjukkan bahwa pemisahan CPC ion lantanida dibebankan dengan asilpyrazolones dalam fase toluene-air pasangan didorong t erutama oleh proses antarmuka. Pemisahan NdIII, UIV, dan UVI berhasil dilakukan dalam waktu sekitar 1 jam dengan memilih 30% larutan TBP di n-dodecane sebagai fase diam dan 0,3 mol / L HNO3-0,05 mol / L hidrazin sebagai fase gerak [23] . Americium dipisahkan dari lantanida ringan menggunakan larutan oksida 5,8-di-ethyl-7hydroxydodecan-6-one (LIX 63) dalam minyak tanah sebagai fase diam [98]. 2. Sentrifugal hidrodinamika berkecepatan tinggi (HSCCC) Ito [99] REE terpisah menggunakan sistem dua fase fase B2EHP. Resolusi puncak antara La dan Pr adalah 6,95, dan bahwa antara Pr dan Nd adalah 1,74. Untuk lebih mendemonstrasikan kemampuan metode, pemisahan satu langkah dari semua 14 RE1E dilakukan menggunakan gradien eksponensial dari konsentrasi HCl dalam fase gerak [100]. Seluruh kelompok REE juga dipisahkan dalam sistem di-hexyl-N, N-diethylcarbamoyl methylenephosphonate (DHDECMP) di cyclohexane-HNO3 [101]. Sayangnya, waktu pemisahan selama 2 jam. REE diperkaya ke dalam fase stasioner yang terdiri dari larutan natrium fosfat bis (2-etilheksil) dalam toluena dari volume besar larutan berair, dan kemudian secara kromatografi dielusi oleh fase gerak dengan gradien pH bertahap [102-106]. Parameter pemisahan (N dan RS) ditemukan secara praktis independen dari kecepatan revolusi dan laju aliran yang disediakan rasio retensi (SF) dari fase diam tetap konstan [102]. Pemisahan REE dengan faktor pemisahan (α) serendah 1,86 (Y / Ho) dan 1,51 (Er / Y) hampir sepenuhnya dicapai dalam langkah CCC tunggal dengan resolusi puncak yang baik (RS = 1,55 untuk Y / Ho dan 1,05 untuk Er / Y [102]). Teknik CCC digunakan praktis untuk prakonsentrasi dan pemisahan jejak UTJ dari konstituen utama dari berbagai sampel geologi setelah dekomposisi mereka, untuk penentuan selanjutnya oleh ICP / OES dan MS [88,90]. Tiga sistem ekstraksi berdasarkan B2EHP, trioctylphosephine oxide (TOPO) dan di phenyl (dibutylcarbamoylmethyl) phosphine (Ph2Bu2) terbukti dapat diterapkan pada pemisahan kelompok UTJ dari sampel batuan, bijih, dan mineral yang terlarut (basal) , granit, dolomit, bijih fluorit-barit-hidropatit, syenit, dll.). Pemisahan satu tahap UTJ dari sebagian besar komponen matriks dicapai (Gbr. 6). Metode yang diusulkan pemisahan kelompok UTJ oleh CCC karena kesederhanaan mereka, fleksibilitas, dan waktu pemisahan yang relatif singkat, dapat dengan mudah bersaing dengan metode lain [107.110]. Penentuan konsentrasi isotop Nd dan Sm dalam sampel batuan adalah masalah analitis lain yang dapat diselesaikan dengan menggunakan CCC [88]. Rasio isotop ini memungkinkan seseorang untuk menilai usia bebatuan. Kualitas analisis MS tergantung pada kemurnian fraksi elemen yang akan
dianalisis. Karena Nd dan Sm memiliki isotop dengan massa yang sama, Nd harus benar-benar terpisah dari Sm. Selain itu, pecahan Nd dan Sm yang terputus harus bebas dari beberapa unsur kontaminan (Ba, Ca, Fe, dan lainnya) yang dapat mengganggu ionisasi pada MS. 1,0 mol / L B2EHP dalam sistem decane-HCl digunakan untuk pemisahan Nd dan Sm serta untuk isolasi kedua elemen dari mayoritas konstituen utama bahan geologi
Gambar figur 6-7
Sebuah prosedur untuk seluruh prakonsentrasi kelompok REE dari kalsium klorida kemurnian tinggi dan penentuan selanjutnya dari elemen ultratrace oleh ICP / MS telah dikembangkan [111]. Suatu larutan difenil (dibutilkarbamoylmetil) fosfin oksida dalam kloroform (0,5 mol / L) dipilih sebagai reagen untuk ekstraksi dan prakonsentrasi UTAMA dari larutan 5% CaCl2 encer. Konsentrasi UTJ dielusi menjadi volume kecil air, dan eluat berair menjadi sasaran pengukuran ICP / MS. Karakteristik kinerja prosedur telah diperiksa dengan menganalisa yang nyata sampel CaCl2 (merek produk). Hasil yang diperoleh menunjukkan penerapan CCC untuk analisis ultratrace. Sistem ekstraksi berdasarkan reagen organophosphorus netral bidentat disarankan untuk diterapkan pada pemisahan kelompok unsur transplutonium trivalen (TPEs) dari jejak dan jumlah makro REE [112-114]. Konstanta partisi yang lebih tinggi untuk semua TPE daripada untuk semua UTJ adalah keuntungan utama dari sistem ini. Pemisahan hanya membutuhkan 17-20 menit dalam kolom 20 mL diputar pada 500 rpm. Pemisahan elemen secara teokratis dimungkinkan, tetapi pemisahan dengan elusi bertahap lebih efisien karena cara ini menghasilkan volume eluen yang lebih kecil. Efek konsentrasi ekstraktan, pH dan laju aliran fase gerak pada efisiensi pemisahan Am dan Eu oleh CCC diselidiki menggunakan asam dichloro phenyldithiophosphinic di xy-lene sebagai fase diam dan 0,1 mol / L NaClO4 sebagai fase gerak [115 ]. Hasilnya menunjukkan bahwa faktor pemisahan tumbuh dengan meningkatnya konsentrasi ekstraktan dan nilai pH fase gerak. Perpisahan timbal balik antara AmIII dan EuIII dapat dicapai dengan mengoptimalkan kondisi pemisahan, faktor pemisahan, dan efisiensi pemisahan antara AmIII dan EuIII + dapat mencapai 2,87 dan 0,74, masing-masing. Pemisahan Am dari lantanida ringan telah dilakukan pada kolom melingkar kecil (10 mL) [116]. Ekstraktan yang memiliki afinitas tinggi untuk Am, LIX 63 digunakan sebagai fase diam. Puncak dari 24 1Am dan 152Eu jelas terpisah satu sama lain. Kuantitas dan komposisi isotop plutonium yang dilepaskan ke lingkungan adalah perhatian untuk lingkungan dan radiokimia. Hasil analisis ultratrace plutonium dalam tanah dengan menggunakan pemisahan CCC diikuti dengan penentuan ICP / MS telah dipublikasikan [117]. Efek matriks (poliatomic interferences) diminimalkan dengan menggunakan langkah preseparasi CCC dengan larutan tri-oktilamin 20% dalam toluena sebagai fase diam. Unsur-unsur matriks yang mengganggu, thorium dan ura-nium, dielusi dengan menggunakan 7,5 mol / L HNO3, 10 mol / L HCl, dan 3 mol / L HNO3, masing-masing. Faktor pemisahan 105 untuk thorium dan 104 untuk uranium. Plutonium hampir sepenuhnya pulih menggunakan 5 mL 0,025 mol / L asam oksalat-0,15 mol / L
HNO3 [118]. Kemampuan pemisahan kolom CCC hidrodinamik sehubungan dengan aktinida biasanya ditemukan lebih unggul daripada kolom hidrostatik (CPC) [119]. ZrIV, HfIV, TaV, dan NbV Group preseparation dari ZrIV, HfIV, TaV, dan NbV diinginkan dalam analisis sampel geologi komposisi yang berbeda mengandung jumlah jejak elemen-elemen ini. Presonentrasi Zr dan Hf dan pemisahan mereka dari Fe (komponen makro yang paling sering menjadi sumber interferensi spektral) memungkinkan untuk mengurangi pengaruh antar elemen dan untuk meningkatkan sensitivitas penentuan mereka oleh ICP / OES. Prekonsentrasi dan pemisahan Zr dan Hf pada kolom CCC hidrodinamik dengan kumparan satu lapis (volume 17 mL, kecepatan putaran 450 rpm) dalam sistem atas dasar campuran dua reagen ekstraksi, B2EHP dan N-benzoyl-N- phenyl- hydroxylamine (BPHA), dicapai [88]. Pemisahan dilakukan dengan langkah elusi. Pada tahap pertama, Zr dan Hf terkonsentrasi pada fase diam, sementara Fe dan elemen la innya dielusi. Kemudian Zr dan Hf dielusi menggunakan larutan asam oksalat sebagai fase gerak. Sebuah sistem dengan tetraoctyl "ethane1,2-diamine" di kloroform dapat diterapkan untuk prakonsentrasi Zr, Hf, Nb, Ta untuk penentuan mereka dalam sampel geologis [90]. Pada tahap konsentrasi, alkali, alkali-bumi, dan unsur tanah langka, Fe, Al, Cu, telah dihapus dari kolom. Kemudian Zr, Hf, Nb, dan Ta dipisahkan menjadi 10 mL 2 mol / L HCl. Zn dan Cd dielusi dengan 1 mol / L HNO3 pada tahap regenerasi fase stasioner. Menggunakan 0,001 mol / L 1-phenyl-3-methyl-4-benzoyl-5-pyrazolone dalam "isobutyl methyl ketone" sebagai fase diam, pemisahan Zr dan Hf dapat dicapai [90,120]. Pemisahan dilakukan dengan langkah elusi. Unsur alkali dan alkali-tanah Sistem 0,01 mol / L kobalt dicarbollide (CD) -nitrobenzena-HNO3 solusi dan 0,05 mol / L dicyclo- heksano-18-mahkota-6 (DCH18C6) -3% B2EHP-kloroform-HNO3 solusi yang digunakan untuk pemisahan radionuklida Cs dan Sr [87, 121]. Penerapan fase stasioner atas dasar CD memungkinkan konsentrasi Cs dan Sr yang akan dicapai. Elusi Cs dan Sr dari fase diam atas dasar DCH18C6 dan B2EHP menjadi fase gerak, mengandung barium nitrat, PEO, dan asam nitrat, telah dipelajari. Berbagai varian pemisahan Cs dan Sr dengan mengubah komposisi fase gerak dapat diperoleh. Elusi kuantitatif dan pemisahan lengkap Cs dan Sr melalui satu eluen atau elusi langkah adalah mungkin. Prosedur yang terakhir lebih cepat dan memungkinkan pengupasan elemen menggunakan fase gerak yang lebih sedikit. Nilai jumlah pelat teoritis (N) bervariasi dari 77 hingga 836, yang memadai untuk pemisahan yang dijelaskan. Sistem ekstraksi berdasarkan eter mahkota diketahui sesuai untuk pemisahan Rb, Ca, Sr, dan Ba [122]. Contoh pemisahan Sr dari elemen lain pada kolom hidrodinamika dengan kumparan satu-lapis dalam 0,1 mol / L DCH18C6-kloroform – 5,0 mol / L HNO3 sistem fase dilaporkan. Pemisahan selektif Rb juga dapat dicapai dalam sistem berbasis DCH18C6 tetapi dengan penggunaan picrate (Pi-) sebagai ganti nitrat sebagai Pi – adalah kontra-ion yang lebih baik untuk kompleks metal-crown ether cationic. Logam kelompok platina Pemisahan PdII dari PtIII, IrIII, dan RhIII dengan TOPO di heptana menggunakan centrifuge CPC diinspirasikan [123]. Pemisahan Pd dari Pt dicapai dalam 0,5 mol / L TOPO dalam heptana-0,1 mol / L HCl sistem dengan resolusi puncak 1,54 dan <0,3% puncak tumpang tindih. Sistem yang sama digunakan untuk pemisahan Pd dari logam kelompok P t lainnya. Efisiensi pemisahan CPC untuk mendistribusikan spesies, kompleks ion Pt, dan zat terlarut organik (3-picoline) untuk pasangan heptana-air telah dibandingkan [124]. Analisis efisiensi kromatografi dalam pemisahan yang melibatkan partisi kompleks logam jelas mengungkapkan pengaruh ki-kiik pembentukan kompleks dan disosiasi pada efisiensi kromatografi dan memberikan deskripsi semi-kuantitatif dari parameter kinetik yang relevan. Berbagai elemen 1. Hidrostatik CPC sentrifugal Sebuah metode telah dikembangkan untuk saling pemisahan ion logam seperti CuII, MnII, CoII, dan NiII dengan asam di-2-
methylnonylphosphoric di heptana sebagai fase diam [125]. Sistem CPC digunakan dengan 2136 saluran partisi, pada kecepatan rotasi 800 rpm. Empat ion logam dapat dielusi secara terpisah dengan mengubah pH larutan asam kloroasetat sebagai fase gerak dalam dua langkah. Kurva elusi diperoleh dengan memantau absorbansi masing-masing kompleks logam pasca-label dengan resorilol 4- (2-pyridylazo). Pemisahan FeIII, ZnII, CuII, CoII, dan NiII telah diteliti dengan menggunakan 0,16 mol / L bis (2-ethylhexy) asam fosfat dalam heptana sebagai fase diam [126]. Asetat, chloroacetate, dan buffer tar digunakan sebagai fase gerak. Kation CoII yang ada dalam larutan sulfat NiII yang tidak dimurnikan juga bisa dipisahkan dengan metode ini. Larutan sampel terus dikirim ke fase stasioner, dan kation CoII ditemukan dipertahankan dalam fase diam. Sistem CPC dioperasikan dengan 2136 saluran partisi dengan kecepatan rotasi 800 rpm. 2. Hidrodinamika sentrifugasi (HSCCC) Pemisahan CoII, CuII, FeII, FeIII, NiIII, dan Mg dilakukan dengan ko lom CCC hidrodinamik [127]. Pemisahan, menggunakan B2EHP dalam heptana (fase diam) dan asam sitrat encer (fase gerak), dapat dioptimalkan dengan memilih konsentrasi asam yang tepat. D eteksi berkelanjutan dari elemen dilakukan oleh spektrometer emisi atom arus searah langsung. Setiap puncak elemen dipecahkan dengan baik, N mulai dari 200 hingga 3600. Tingkat mg / kg ion logam dalam 500 mL fase gerak terus terkonsentrasi menjadi volume kecil fase diam (B2EHP dalam heptana) yang dipertahankan. Ion logam terkonsentrasi dielusi dengan asam nitrat dan kemudian ditentukan. Keserbagunaan metode ini lebih lanjut ditunjukkan dalam penentuan jejak logam di perairan yang berbeda. Ion logam secara efisien diperkaya oleh puncak pH yang memfokuskan HSCCC . Intensitas puncak untuk sampel standar 10 mL dalam aliran limbah meningkat lebih dari 100 kali lipat (deteksi oleh ICP / OES). Ca, Cd, Cu, Mg, Mn, Ni, dan Zn secara kromatografis diekstraksi menjadi fase stasioner organik yang mengandung B2EHP. Setelah larutan sampel dimasukkan ke dalam kolom, ion logam tetap di sekitar batas pH tajam yang terbentuk antara zona asam dan basa, bergerak menuju outlet kolom. Ion logam yang diperkaya akhirnya dielusi dengan batas pH tajam sebagai puncak yang sangat terkonsentrasi menjadi volume kurang dari 100 mL. Metode ini dievaluasi dalam hal efi siensi konsentrasi dan resolusi puncak dari elemen target dari matriks dalam analisis jejak sampel lingkungan dalam kondisi yang berbeda [130]. FeII dan FeIII dipisahkan menggunakan langkah elusi penurunan pH dengan fase diam yang mengandung 5 mmol / L TPMDPD dalam n-dekana dan kolom CCC hidrodinamik dengan koil tunggal kecil 16 mL [131]. Kromatografi perpindahan adalah cara menggunakan teknik kromatografi di mana zat terlarut dipisahkan dalam band dalam fase diam. Karena fase diam adalah cairan dalam CCC, adalah mungkin untuk menghentikan proses perpindahan ketika band yang terpisah masih dalam fase diam. Pengumpulan pita fase-stasioner dimungkinkan. Cara menggunakan instrumen CCC ini dijelaskan untuk pemisahan ion transisi-logam. CoII, NiII, CuII, dan ZnII dipisahkan menggunakan B2EHP di heptana sebagai fase stasioner melalui proses ekstraksi misel terbalik [132]. Proses pemilahan dan pengumpulan fase heptana stasioner memungkinkan pemulihan pita ion dengan kemurnian lebih tinggi dari 95%. Makalah [103.104.106] menarik secara teoritis karena mereka menunjukkan kemungkinan menggunakan puncak pH fokus dan kromatografi perpindahan untuk pemisahan CCC ion logam. Namun, prosedur yang dijelaskan dapat diragukan direkomendasikan untuk aplikasi praktis karena ada sejumlah metode pemisahan dan prakonsentrasi yang sangat baik untuk elemen yang dipelajari, terutama dalam analisis air. Pemurnian larutan garam oleh CCC Penerapan CCC telah diteliti untuk pemurnian larutan garam (untuk memperoleh pereaksi kemurnian tinggi, yang setelah penguapan, dapat digunakan untuk tujuan dekomposisi fusi dalam analisis jejak keramik berteknologi tinggi dan bahan lainnya ) [133].
Ada perbedaan dalam tujuan prakonsentrasi analitik dan prosedur pemurnian: dalam kasus pemurnian, konstituen yang dimurnikan dari larutan berair adalah komponen target, sedangkan elemen jejak (TE) dianggap sebagai pengotor untuk dipisahkan dan dibuang. Dalam hal ini, jumlah maksimum TEs harus dipisahkan dalam satu kromatografi. Persyaratan lain yang harus dipenuhi dalam penggunaan metode pemurnian apa pun terkait dengan kemurnian semua bahan kimia yang diterapkan dan dengan dekontaminasi minimum yang diperlukan dari solusi yang terlibat, yang mungkin karena kontak mereka dengan bahan perangkat. Seperti telah disebutkan sebelumnya, ketika menggunakan kolom CCC hidrodinamik, solusinya hanya berhubungan dengan Teflo n, yang merupakan salah satu bahan inert yang paling dikenal. Kemungkinan pemurnian larutan berair garam anorganik, seperti (NH4) 2SO4, NH4F, dan NH4Cl, dari sejumlah kotoran logam yang paling umum ditunjukkan dengan menggunakan azepan-1-yldithioformic acid, diethylammonium diethyithithocarbamat, 8-hydroxyquinoline , dibenzo-18- crown-6 (DB18C6), dan DCH18C6 sebagai mengekstrak reagen. Larutan yang diperoleh bebas dari Fe, Cu, Zn, Co, Cd, Ni, Mn; ini membuktikan pemurnian lengkap larutan garam dari unsur-unsur yang terdaftar. Perlu dicatat bahwa kontaminasi larutan oleh bahan kolom, reagen, dan pelarut organik dikontrol. Isi unsur dalam air dan 2 mol / L HCl melewati kolom kurang dari batas deteksi untuk spektrometri serapan atom elektrotermal (ET / AAS). Campuran HMDTCA, DCH18C6, dan DB18C6 dalam kloroform memungkinkan pemurnian larutan 1% (NH4) 2SO4 dari K, Fe, Cu, Zn, Co, Cd, Ni, Al, Mn; konsentrasi mereka dalam larutan murni berada di bawah batas deteksi untuk ET / AAS. Oleh karena itu, memvariasikan komposisi fase organik dapat memberikan pemurnian "lengkap" larutan garam dari TE kontaminan. APLIKASI LAIN DARI KOLOM CCC HYDRODYNAMIC Sejauh ini, pemisahan zat terlarut dalam sistem fase cair-cair telah dijelaskan. Tetapi juga dimungkinkan untuk menggunakan sistem cair-padat-cair dan cair-padat juga. Penggunaan bahan partikulat tersuspensi sebagai fase diam telah menawarkan tantangan untuk serangkaian aplikasi konvensional yang tidak menjanjikan dari sentrifugal planet dalam analisis sampel padat lingkungan. Metode baru y ang efektif untuk pemulihan langsung zat-zat organik beracun (hidrokarbon aromatik polisiklik, PAH) dari limbah lumpur liuk [134] dan tanah [135] telah diusulkan. Metode aliran berkelanjutan baru juga telah dikembangkan yang memungkinkan tidak hanya fraksinasi yang cepat dan efisien dari spesies TE dalam tanah dan sedimen yang harus dicapai tetapi juga memungkinkan studi yang diselesaikan secara waktu (kinetik) pada mobilisasi jejak dan elemen utama dalam formulir yang harus dibuat [136 –138]. Metode ini menghemat waktu dan hanya membutuhkan 4-5 jam daripada beberapa hari diperlukan untuk ekstraksi berurutan rutin (secara tradisional digunakan untuk fraksinasi TEs untuk menilai mobilitas mereka dan bioavailabilitas potensial). On-line penggandengan pencucian oleh kolom CCC hidrodinamik dan pengukuran ICP / OES telah diusulkan [139]. Ini memungkinkan data real-time pada proses pelindian yang akan diperoleh. Ini juga telah menunjukkan bahwa kolom hidrodinamik dapat berhasil digunakan dalam bidang aplikasi baru ini: untuk fraksinasi mikropartikel [140.141]. Tidak ada f ase diam konvensional dalam kasus ini. Gaya sentrifugal yang bekerja pada kolom CCC hidrodinamik menyediakan kecepatan migrasi yang berbeda dari komponen sampel yang ditangguhkan dalam satu cairan pembawa. Pemulihan PAH dari lumpur limbah cair dan tanah. Kontaminan organik, misalnya, PAH, tersebar luas di lingkungan sebagai akibat dari aktivitas manusia. Penentuan yang cepat dan tepat dari polutanpolutan ini di tanah, sedimen, dan lumpur limbah merupakan kebutuhan vital untuk pengelolaan
lingkungan. Ekstraksi analit dari sampel padat tetap merupakan langkah penting dalam analisis kontaminan. Serangkaian metode ekstraksi telah diusulkan untuk pemulihan P AH. Dalam kebanyakan kasus, prosedur pembersihan yang lebih banyak atau lebih sulit diperlukan sebelum penentuan instrumen PAHs dalam ekstrak. Sentrifugal hidrodinamik dapat digunakan untuk ekstraksi langsung dan pemisahan beberapa zat organik (misalnya, xenobiotik) dari media lumpur limbah [135]. Telah ditunjukkan bahwa sampel heterogen dapat disimpan di kolom berputar. Lumpur limbah (yang sebenarnya merupakan suspensi terkonsentrasi) adalah fase diam dalam kolom, sedangkan pelarut organik (heptana, diklorometana) atau campurannya digunakan sebagai fase gerak. Volume suspensi yang dipertahankan dalam kolom tergantung pada perbedaan kepadatan antara fase stasioner dan fase bergerak, dan parameter operasi centrifuge. Meskipun pemisahan PAHs berikutnya dari media lumpur limbah telah dilakukan, pemisahan kelompok PAH diikuti oleh penentu kuantitatif mereka oleh HPLC dengan detektor fluoresensi dapat lebih berguna. Prosedur yang dikembangkan terlihat menjanjikan dan dapat direkomendasikan untuk menganalisis sampel mentah (seperti lumpur limbah) tanpa pretreatment sampel. Selain itu, penggunaan pelarut “ringan” yang tepat untuk ekstraksi dinamis menggunakan sentrifugasi ini mungkin sangat perspektif untuk simulasi proses yang terjadi secara alami dan penentuan bentuk-bentuk PAH dan polutan l ain yang relevan secara lingkungan dalam padatan lingkungan. Fraksi kontinyu dari TE dalam padatan lingkungan Mobilitas dan bioavailabilitas TE dalam tanah, sedimen, dan lumpur sangat bergantung pada bentuk kimia dan jenis pengikatannya, yaitu proses penyerapan / desorpsi dapat secara signifikan mempengaruhi toksisitas logam di lingkungan alam [ 142]. Akibatnya, data total konten elemen cukup tidak cukup untuk memperkirakan risiko kemungkinan mobilisasi TE dan potensi penyerapan unsur-unsur yang dibebaskan oleh biota. Jadi, teknik dan prosedur analitik untuk membedakan bentuk-bentuk berbeda (spesies) TE diperlukan. Suatu pendekatan yang telah ditemukan lebih disukai adalah fraksinasi TE menjadi bentuk yang ditentukan secara operasional di bawah ti ndakan berurutan dari ekstraktan yang berbeda. Ekstraksi selektif, yang digunakan dalam prosedur ekstraksi berurutan, ditujukan untuk simulasi kondisi alam dimana TE yang terkait dengan komponen tanah tertentu (sedimen) dapat dilepaskan. Misalnya, perubahan dalam komposisi ion yang mempengaruhi reaksi adsorpsi / desorpsi dapat menyebabkan pelepasan unsur-unsur, yang tersimpan pada matriks oleh interaksi elektrostatik yang lemah. Penurunan potensi redoks dapat menyebabkan pelepasan oksida, tidak stabil di bawah kondisi reduksi. Ekstraksi berurutan harus direkomendasikan untuk memperoleh lebih banyak atau lebih sedikit informasi rinci tentang asal, bioavailabilitas biologis dan fisikokimia, mobilisasi, dan transportasi TE. Teknik aliran kontinyu baru telah diusulkan yang memungkinkan tidak hanya fraksinasi yang cepat dan efisien dari spesies TE dalam tanah dan sedimen yang ingin dicapai tetapi juga memungkinkan studi-studi yang diselesaikan secara waktu (kinetik) pada mobilisasi TE dalam berbagai bentuk yang akan dibuat [ 137-140]. Sampel partikel dipertahankan dalam kolom berputar sebagai fase stasioner di bawah aksi gaya sentrifugal sementara larutan berair dari reagen pengompleks, asam mineral, dan garam dipompa secara ko ntinu. Prosedur yang dikembangkan adalah hemat waktu dan hanya membutuhkan 4 -5 jam daripada beberapa hari diperlukan untuk ekstraksi sekuensial tradisional, otomatisasi lengkap menjadi mungkin.
PERBANDINGAN DENGAN TEKNIK ANALITIS LAINNYA, REKOMENDASI PENGGUNAAN, DAN KESIMPULAN Meskipun CCC adalah teknik pemisahan yang efisien, umumnya t idak cukup perhatian telah diberikan kepada CCC analitis, sedangkan banyak aplikasi yang sangat baik dari CCC persiapan telah dilaporkan selama beberapa dekade terakhir. Salah satu tujuan utama dari makalah ini adalah untuk menarik perhatian yang lebih luas dari komunitas analitis untuk metode yang menarik ini. Karena ahli kimia analitik memiliki pilihan yang baik untuk teknik pemisahan dan prakonsentrasi untuk berbagai zat dalam larutan dan karena CCC, sebagaimana metode lainnya, memiliki kelebihan dan kekurangannya sendiri, perlu untuk membandingkan CCC dengan metode lain untuk pemisahan dan pengayaan yang serupa. analit untuk menguraikan relung CCC dalam kimia analitik. Beberapa perbandingan dibuat di atas ketika menjelaskan prinsip-prinsip CCC dan aplikasi analitisnya. CCC paling sering dibandingkan dengan LLE satu tahap. Perbandingan dengan LLE berguna untuk beberapa alasan. Dari sudut pandang fisikokimia, LLE dan CCC keduanya didasarkan pada partisi substansi antara dua fase cairan bebas-dukungan. Perbedaannya adalah bahwa LLE hanya membuat pertukaran tunggal (satu pelat) ketika CCC, dengan fase bergerak dan fase diam yang bergerak, secara otomatis melakukan sejumlah besar pertukaran (beberapa pelat teoritis). Perbandingan serupa dapat dilakukan antara pertukaran tunggal yang diperoleh dengan ekstraksi fase padat (SPE) dan pertukaran ganda yang diamati dengan HPLC. Salah satu keuntungan besar dari metode LLE adalah kemungkinan ekstraksi zat dalam jumlah sangat besar karena mereka dapat mengakses volume dari dua fase dan tidak hanya permukaan fase padat seperti pada SPE. Inilah sebabnya mengapa LLE secara luas digunakan sebagai alat pemurnian, tetapi tidak hanya pada skala laboratorium, dan sejumlah besar informasi tentang kimia dan hidrodinamika LLE dari berbagai senyawa telah diakumulasi oleh ahli kimia dan insinyur kimia. Kekayaan informasi ini dapat diterapkan pada prediksi perilaku substansi di CCC, tentu saja, dengan mempertimbangkan fitur khusus CCC. Keuntungan lain dari kedua LLE dan CCC atas teknik LC lainnya, elektroforesis kapiler (CE) dan metode terkait adalah kemungkinan untuk bekerja dengan kuat.
larutan asam dan basa yang mungkin penting, terutama dalam analisis anorganik dan radiokimia di mana solusi tersebut sering digunakan. CCC adalah teknik multistage yang memungkinkan pemisahan yang jauh lebih baik daripada beberapa ekstraksi konvensional di corong pemisah. D alam teknologi LLE, proses multistage diterapkan dengan menggunakan kaskade ekstraksi ya ng terdiri dari aparatus satu atau beberapa tahap seperti mix er-penetler, kolom yang berbeda, atau kontaktor sentrifugal. Peralatan semacam itu tidak praktis untuk laboratorium analitik karena biayanya, volume minimum yang besar, dan jumlah pelat yang lebih kecil yang dapat direalisasikan pada aparatus yang cukup kecil. Sentrifugal CCC jauh lebih nyaman untuk digunakan di laboratorium. CCC tidak akan pernah menggantikan teknik yang sangat bagus seperti HPLC tetapi dapat melengkapi itu dalam memecahkan masalah analitis tertentu. Meskipun CCC menunjukkan efisiensi yang lebih rendah dan membutuhkan waktu pemisahan yang lebih lama dibandingkan dengan metode seperti HPLC dan CE, ia memiliki beberapa kelebihan. Karena CCC colnum tidak memerlukan dukungan yang solid, CCC bebas dari adsorpsi zat terlarut ke kolom, dan pemulihan sampel dan reagen tanpa kontaminasi atau dekomposisi adalah mungkin. Manfaat tambahan a dalah bahwa harus dimungkinkan untuk menggunakan kolom yang sama secara berulang untuk pemisahan dengan fase stasioner yang berbeda. Seperti yang telah ditunjukkan di atas, CCC dapat digunakan untuk pengayaan analit yang berbeda sebelum deteksi mereka. Metode serapan saat ini adalah pemimpin di antara teknik analisis untuk prakonsentrasi berbagai zat dengan menggunakan adsorben yang
berbeda. Meskipun banyak bahan adsorpsi efektif diketahui, adalah mungkin untuk membandingkan CCC dengan SPE pada alkil silika. Silika gel alkil-ikatan adalah kelas unik adsorben yang dapat diterapkan untuk pengayaan sejumlah besar zat, mulai dari biomolekul dan senyawa organik [143] hingga ion anorganik [144]. SPE pada gel silika yang terikat alkil harus dipertimbangkan sebagai teknik adsorpsi, tetapi metodenya juga banyak sama dengan LLE karena lapisan alkil pada permukaan silika berperilaku seperti pelarut organik di LLE atau CCC. Kisaran zat yang dapat diekstraksi dan didekonsentrasi oleh CCC dari larutan samudera hampir sama lebar seperti dalam SPE. CCC dapat digunakan untuk pemulihan analit dari media organik yang hampir tidak mungkin dengan fase alkil-ikatan: pelarut organik digunakan untuk elusi zat prakonsentrasi dari fase tersebut. Materi partikulat, polimer terlarut (misalnya, zat humat), dan komponen lain dari sampel "kasar" dapat menyumbat kartrid SPE serta kolom HPLC dan menyebabkan kesulitan dalam studi CE. Contoh aplikasi CCC yang diberikan di atas menunjukkan bahwa CCC jauh kurang sensitif terhadap komposisi sampel mentah. Keuntungan SPE atas CCC adalah kemudahan penggunaan, biaya perangkat yang lebih rendah, dan kemungkinan untuk mendapatkan eluat bervolume kec il (terkonsentrasi). Metode adsorpsi memungkinkan isolasi cepat dari a nalit kepentingan dengan faktor prekonsentrasi dari beberapa orde magnitudo yang dicapai dalam beberapa menit. Ini praktis tidak mungkin dilakukan dengan CCC. Ini dan kerugian dan kelebihan lain dari metode pemisahan yang berbeda dibandingkan dengan CCC dirangkum dalam Tabel 3.
Tabel 3.
Sebagai kesimpulan, kita dapat merumuskan beberapa rekomendasi tentang penggunaan CCC dalam bidang kimia analitik berikut (sebagian besar sebagai teknik pretreatment): • Analisis sampel yang mengandung partikel padat atau koloid, molekul tinggi, dan konstituen lain yang mungkin menyambungkan kolom LC , kartrid pengayaan adsorpsi, dan filter, dan mengganggu CE dan pemisahan lainnya. • Isolasi dan pemisahan bahan biologis yang dapat didenaturasi dan hilang karena interaksi yang kuat atau tidak dapat diubah dengan dukungan yang kuat. Bekerja dengan zat apa pun yang secara permanen diserap ke bahan kemasan kolom LC. • Analisis larutan yang mengandung konsentrasi asam, basa, garam, dan komponen sampel terlarut tinggi lainnya yang dapat mengganggu preseparasi dengan teknik lain dan penentuan analit berikutnya. • Studi analisis radio untuk mengurangi risiko memaparkan radionuklida dengan menggunakan sistem CCC tertutup. • Ultratrace analisis anorganik. Penggunaan kolom CCC di mana sampel bersentuhan dengan hanya Teflon meminimalkan risiko kontaminasi sampel. • Pemurnian reagen analitis. • Persiapan bahan referensi standar.
SINGKATAN DAN AKRONIM ATPS sistem dua fase berair APEO alkylphenol ethoxylate Spektrometri serapan atom AAS Kromatografi CCC berlawanan arah CE elektroforesis kapiler CPC kromatografi sentrifugal partisi B2EHP bis (2-ethylhexyl) laju aliran volume hidrogen fosfat F (mL min - 1) GA gibberellin GC Kromatografi gas HSCCC saat ini berlawanan ICP / OES kromatografi kecepatan tinggi secara induktif digabungkan plasma / ICP / MS emisi optik spektroskopi induktif ditambah plasma / mass spectrometry k faktor retensi Rasio partisi KD
Ekstraksi cair-cair LLE Kromatografi cair LC N nomor pelat teoritis Pestisida organoklorin OCP PEO poly (ethylene oxide) REE elemen tanah jarang Resolusi puncak faktor RS SF fase fase retensi fase stasioner Ekstraksi padat fase SPE dari TB tributil fosfat TOEDA tetraoctylethylenediamine TOPO trioctylphosphine oxide trivalent Unsur transplutonium TPE Volume kolom VC Volume sel fasa VM Puncak volume retensi VR Volume fase diam fase α faktor pemisahan dengan rata-rata lebar puncak
