Regulación de la apoptosis por subcelular reubicación de caspasas La escisión de las proteínas nucleares por las caspasas promueve la descomposición nuclear y, por lo tanto, desempeña un papel clave en la ejecución de la apoptosis. Sin embargo, los mecanismos moleculares detallados de estos eventos siguen sin estar claros. Para obtener más información sobre los mecanismos de los eventos nucleares durante la apoptosis, establecemos un protocolo de fraccionamiento rápido para la separación de las fracciones citoplásmica y nuclear de las células sometidas a apoptosis inducida por cisplatino. De manera importante, se observó la acumulación nuclear de efector caspasa-3 así como de iniciador caspasa-2, -8 y -9 usando el protocolo desarrollado y la microscopía de inmunofluorescencia. inmunofluorescencia. La detección de caspasas y sus productos de escisión en el núcleo se produjo en el mismo intervalo de tiempo después del tratamiento con cisplatino y tuvo lugar poco antes de la fragmentación nuclear. La entrada de caspasas iniciadoras al núcleo era independiente de caspasa-3. Dado que las tres caspasas iniciadoras tenían actividad catalítica en los núcleos, nuestros hallazgos indican que las caspasas iniciadoras podrían participar en la proteolisis de los componentes nucleares durante la apoptosis, promoviendo su desintegración y muerte celular apoptótica. La apoptosis es el modo más conocido de muerte celular programada que es crucial para el desarrollo del tejido y la homeostasis. Una de las características de la apoptosis es la descomposición del núcleo celular. Este proceso de múltiples pasos comprende la condensación de la cromatina, la fragmentación del ADN y el colapso de la envoltura nuclear. Las caspasas, una familia de proteasas dependientes de cisteína, juegan un papel importante en estos eventos tanto a través de la activación mediada por proteolisis de otras proteínas apoptóticas como directamente mediante la escisión de proteínas nucleares. Dado que el núcleo es la fuente de proteínas y ácidos nucleicos potencialmente inmunogénicos, el último de los cuales podría tener un origen viral o propiedades oncogénicas, su rápida demolición y eliminación representan pasos extremadamente extremadamente importantes en el curso de la apoptosis. Muerte de células. El papel principal en la descomposición del núcleo y otros compartimentos celulares durante la apoptosis pertenece a efector caspasa-3, mientras que el papel de otras caspasas en el proceso sigue sin estar claro. Es importante destacar que, mientras que los sustratos caspasa se informó que se distribuyen de manera uniforme en toda la célula, pocos sustratos nucleares de las caspasas iniciadoras han sido reconocidas. Caspase-3, así como otras caspasas con la excepción de caspase-2, no poseen una señal de localización nuclear (NLS) requerida para la importación de proteína nuclear por importins (carioferinas). De acuerdo con ello, se han sugerido varios mecanismos diferentes que subyacen a la acumulación nuclear de caspasa-3 durante la apoptosis, que incluyen difusión pasiva y transporte t ransporte activo. Como se mencionó anteriormente, anteriormente, solo caspasa-2 mostró albergar un NLS entre todas las caspasas. Al mismo tiempo, aunque algunos informes sugirieron la localización nuclear de caspasa-8 y -9, la caspasa-2 es la única caspasa iniciadora para la cual se ha descrito la localización nuclear como una forma de regular sus funciones. Sin embargo, los datos sobre la distribución celular de caspasa-2 y su sitio de activación siguen siendo controvertidos, aunque los hallazgos recientes han mejorado significativamente nuestra comprensión actual. En la mayoría de los estudios previos sobre localización de caspasa-2, los autores usaron expresión ectópica de caspasa-2 unida a una proteína fluorescente, p. GFP, que se transloca al
núcleo por sí mismo. Además, a menudo la evaluación de la localización de caspasa-2 se realizó solo en las últimas etapas de la apoptosis, es decir, después de 24 horas de tratamiento con un agente inductor de apoptosis sin tener en cuenta las alteraciones dependientes del tiempo en la estructura nuclear durante apoptosis. Resultados La lisis con NP-40 se seleccionó para la separación de componentes citoplásmicos y nucleares. Para investigar los cambios en la localización de las caspasas durante la apoptosis considerando las alteraciones dependientes del tiempo en las estructuras nucleares, comparamos varios enfoques de fraccionamiento y establecimos un protocolo para el fraccionamiento de las células HeLa y Caov-4. La pureza de las fracciones se evaluó en paralelo mediante dos enfoques: transferencia de Western (WB) y microscopía de fluorescencia / DIC usando la tinción con Hoechst33342 y ER-tracker Green. Para el análisis de WB, lamin B y PARP1 (poli (ADP-ribosa) polimerasa 1) se utilizaron como marcadores nucleares, GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) y vinculina como marcadores citosólicos, Na + / K + ATPasa como marcador de membrana plasmática, ERp29 ( Proteína del retículo endoplásmico 29) como un marcador ER, y cyt c (citocromo c) como marcador mitocondrial. La homogenización de Dounce sola mostró una baja eficacia de la extracción de componentes citoplásmicos (Fig. 1a, carril 1) y no permitió aislar la fracción nuclear pura. En particular, los marcadores citosólicos y ER - GAPDH, ERp29 y cyt c se detectaron en esta fracción usando análisis de WB (Fig. 1a, carril 4). Esto impidió una mayor aplicación de este enfoque. En contraste con la homogeneización Dounce sola, la aplicación del detergente no iónico NP-40 en el rango de concentración de 0.1 a 0.5% con y sin homogeneización Dounce permitió obtener fracciones nucleares y citoplásmicas puras (Figuras 1a yb). La lisis de las células con otro detergente no iónico, la digitonina, que también se usó previamente para el aislamiento de núcleos, permitió separar los núcleos del citosol, pero no de la membrana plasmática, ER o componentes mitocondriales (Fig. 1b). La adición de la etapa de centrifugación con sacarosa no aumentó la pureza de la fracción, sino que redujo el rendimiento de los componentes nucleares (figura 1a, carriles 3, 7). Por lo tanto, la lisis con NP-40 solo proporcionó la separación más rápida y eficiente de componentes puros citoplásmicos y nucleares. Para garantizar la pureza de los núcleos aislados utilizando 0.3% NP-40, se ha llevado a cabo la analítica de imágenes con Hoechst33342 y ER-tracker Green. El análisis posterior con DIC dual y microscopía de fluorescencia mostró la ausencia de componentes teñidos con verde ER-tracker en los núcleos aislados utilizando NP-40, pero no en el caso del uso de digitonina (Fig. 1c yd). En consecuencia, el método de fraccionamiento basado en la lisis celular con NP-40 se eligió para la preparación adicional de las fracciones citoplásmica y nuclear. La lisis se realizó en dos pasos. En primer lugar, se usó NP-40 a una concentración del 0,1% en condiciones hipotónicas (para aumentar la eficacia del colapso de la membrana plasmática) para la separación de los componentes citoplásmicos. Luego, los núcleos se purificaron con 0,3% de NP-40 en condiciones isotónicas (corresponde a la Fig. 1b, NP 0,3). Esta etapa de purificación de núcleos se introdujo ya que algunos componentes, a saber, los componentes ER, están estrechamente conectados a la membrana nuclear externa y son particularmente difíciles de separar. Además, de acuerdo con el análisis de microscopía de fluorescencia (datos no mostrados) que usa 0.3% de NP-40 permitió aislar núcleos más puros en comparación con 0.1% de NP-40. La mayor concentración de NP-40 (0.5%) no mejoró la separación de los componentes puros citoplásmicos y nucleares (Fig. 1b, NP 0.3 versus NP 0.5). Los principales pasos del protocolo se representan en la Fig. S1. El curso temporal de eventos apoptóticos inducidos por cisplatino. Para analizar la redistribución de las caspasas entre el citoplasma y el núcleo durante la apoptosis, las células HeLa y Caov-4 se trataron con cisplatino, un fármaco
genotóxico comúnmente utilizado contra diversos tipos de cáncer, incluidos el cáncer de cuello uterino y el de ovario. Independientemente de la naturaleza del estímulo apoptótico, la apoptosis se caracteriza morfológicamente por la condensación (hipercondensación de la cromatina o picnosis) y la fragmentación de los núcleos (cariorrexis). Para distinguir entre las etapas de los cambios en la morfología nuclear, definimos el curso temporal de estas alteraciones en células HeLa y Caov-4 en respuesta al tratamiento con cisplatino 35 μM. La tinción con DAPI mostró un aumento dependiente del tiempo en el porcentaje de células con núcleos condensados, que se controló mediante núcleos más brillantes y compactos que los de células viables (Fig. 2). Mientras que después de 16 horas de tratamiento con cisplatino se observó condensación nuclear en 18.9 ± 1.2% y 30.4 ± 0.8% de HeLa y Caov-4 células, respectivamente, números significativos de núcleos fragmentados (más de 6,0%) se detectaron solo después de 24 y 32 horas después del tratamiento con cisplatino de las células HeLa y Caov-4, respectivamente (Fig. 2a). Caspasa-2, -3, -8 y -9 se acumulan en el núcleo durante la apoptosis. El curso temporal de la redistribución de la caspasa durante la apoptosis inducida por cisplatino se evaluó mediante WB de sus formas pro- y escindidas en las fracciones citoplásmica y nuclear de las células HeLa y Caov-4. En células no estimuladas, iniciador caspasa-2, -8, -9 y efector caspasa-3 se detectaron en el citoplasma (Fig. 3a). Después de 16 horas de tratamiento con cisplatino, se observó la acumulación de efector caspasa-3 e iniciador caspasa-2 en las fracciones nucleares de ambas líneas celulares (Fig. 3a). Notablemente, tanto la caspasa-3 como la -2 se detectaron en las fracciones nucleares predominantemente en sus formas escindidas, lo que indica que podrían estar presentes en los núcleos de células apoptóticas en el estado catalíticamente activo. Además, se ha observado la segmentación de PARP1 a su fragmento de 89 kDa en el núcleo, lo que apoya aún más la presencia de caspasa-3 activa en este compartimento celular. La medición de las actividades de iniciador caspasa-2 y efector caspasa-3 con sus sustratos peptídicos fluorogénicos en los núcleos aislados usando el protocolo de fraccionamiento desarrollado también indicó la actividad catalítica de estas caspasas. En particular, se detectó un aumento de las actividades de caspasa-3 y -2 en las fracciones nucleares después de 16 horas de incubación con cisplatino (figura 3b), que es consistente con los resultados obtenidos por análisis de WB (figura 3a, nuc). Los tiempos de activación de la caspasa en el núcleo (Fig. 3a, nuc, Fig. 3b) fueron similares a los del citoplasma (Fig. 3a, cyt) y en los lisados celulares totales (Fig. 3c). Curiosamente, el iniciador caspasa-8 y -9 también se detectaron en las fracciones nucleares de las células HeLa y Caov-4 después de un tratamiento de 16 horas con cisplatino (Fig. 3a). La medición de la actividad de caspasa-8 usando su sustrato peptídico fluorogénico también demostró un aumento en su actividad catalítica en los lisados nucleares y celulares después de una incubación de 16 horas con cisplatino (Fig. 3b yc).
Figure 1. Subcellular fractionation of HeLa and Caov-4 cells. ( a) Comparison of the cytoplasmic and nuclear fractions of HeLa cells prepared by lysis with NP-40 and/or using Dounce homogeniser and/or centrifugation through a sucrose solution. NP 0.3 ′ , lysis with 0.3% NP-40 after Dounce homogenization; NP 0.3 ″, simultaneous application of Dounce homogeniser and 0.3% NP-40; NP 0.3, two-step lysis with 0.1% and 0.3% NP-40; suc, sucrose purification. ( b) WB analysis of the obtained by lysis with a non-ionic detergent cytoplasmic and nuclear fractions. NP, lysis with NP-40, first, at 0.1% and, then, using the indicated percentage for the additional purification of the nuclei; dig, two-step lysis with 0.1% digitonin. (a,b) Cyt, cytoplasmic extract; nuc, isolated nuclei. Lamin B and PARP1 (nuclear proteins), GAPDH (a cytoplasmic protein), Na +/K + ATPase (a plasma membrane protein), ERp29 (an ER protein) and cyt c (a mitochondrial protein) served as fractionation markers. (c) Cells and isolated nuclei stained with Hoechst33342 and imaged by dual DIC and fluorescence microscopy. (d) Cells and isolated nuclei stained with Hoechst33342 and ER-tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide) and imaged by fluorescence microscopy. ( c,d) Scale bars, 10 μm.
Por lo tanto, la efector caspasa-3 y las tres caspasas iniciadoras analizadas mostraron un tiempo de aparición similar en el núcleo en el curso de la apoptosis inducida por cisplatino. Además de la acumulación nuclear de caspasas, después de 16 horas de incubación con cisplatino, observamos la translocación nuclear de varias otras proteínas proapoptóticas, a saber, AIF (factor inductor de apoptosis), endonucleasa G así como GAPDH y hexocinasa II (Fig. 3a, nuc), y la entrada citoplásmica del fragmento de 89 kDa de PARP1 (Fig. 3a, cyt). Estos eventos de translocación ya se han informado en respuesta a un rango de apoptosis, así como a otros estímulos de estrés. Al mismo tiempo, vinculina, Na + / K + ATPasa, ERp29 y cyt c no pudieron detectarse en las fracciones nucleares de las células tratadas con cisplatino (Fig. 3a, nuc). Además, no se observó una disminución significativa en los niveles de laminina de longitud completa hasta las 24 horas de tratamiento con cisplatino (Figuras 3a y S3), lo que también indica que las caspasas se detectan en el núcleo antes de la degradación masiva de la lámina nuclear. Estos datos son consistentes con los resultados de la tinción DAPI y el análisis de microscopía, que demostraron solo niveles menores de fragmentación nuclear en este momento (Figura 2).
Figure 2. Cisplatin (35 μM)-induced changes in the morphology of HeLa and Caov-4 cells. ( a) Percentages of cells with condensed and fragmented nuclei detected by DAPI staining. Results are shown as mean ± s.e.m. of three independent experiments. At least 200 stained cells were counted in each experiment. ( b) Representative images obtained using confocal microscopy. The white arrows and asterisks mark examples of condensed and fragmented nuclei, respectively. Scale bars, 50 and 10 μm.
Con el fin de validar los resultados de fraccionamiento por un enfoque independiente, realizamos un análisis de microscopía de inmunofluorescencia. Como se muestra en la Fig. 4a, la acumulación nuclear de caspasa-2, -3, -8 y -9 se observó en 20.8 ± 2.7%, 22.2 ± 1.9%, 20.9 ± 2.1% y 22.1 ± 1.6% de tratados con cisplatino para celdas HeLa de 24 horas, respectivamente (las imágenes representativas se muestran en la Fig. S4). Los patrones de redistribución similares se observaron para las células Caov-4 -20.0 ± 2.4%, 23.0 ± 0.5%, 19.1 ± 0.8% y 14.2 ± 1.3% para caspasa-2, -3, -8 y -9, respectivamente (Fig. 4 ) Los datos están de acuerdo con los resultados del fraccionamiento subcelular, y además confirman que el iniciador caspasa-2, -8, -9 y efector caspasa-3 están presentes en los núcleos de células HeLa y Caov-4 tratadas con cisplatino. Además de la evaluación de los cambios inducidos por cisplatino en la distribución celular de las caspasas, decidimos probar los efectos de dos inductores de apoptosis diferentes con puntos de ataque extranuclear: factor de necrosis tumoral citoquina proinflamatoria combinado α (TNFα, 10 ng / ml) y un inhibidor de la síntesis de proteína cicloheximida (CHX, 5 μg / ml) tratamiento, y un inhibidor de proteína quinasa de amplia especificidad estaurosporina (0.1 μM). Ambos e stímulos apoptóticos indujeron la translocación nuclear del iniciador caspasa-2, -8, -9 y verdugo caspasa-3 después de 4 horas de tratamiento (Fig. S5a, nuc y S5b, nuc, respectivamente). Dado que el TNFα y la estaurosporina no inducen daño directo del ADN51, estos resultados implican que la translocación nuclear de las caspasas iniciadoras podría tener lugar no solo durante la apoptosis inducida por daño en el ADN, sino en respuesta a estímulos apoptóticos de diversos mecanismos de acción. Colectivamente, nuestros hallazgos demuestran que en el curso de la muerte celular apoptótica inducida por cisplatino, TNFα / CHX y estaurosporina, el iniciador caspasa 2, -8, -9 y el efector caspasa-3 se traslocan al núcleo, y su translocación precede a la fragmentación de este compartimiento intracelular. La translocación nuclear del iniciador caspasa-2, -8 y -9 durante la apoptosis no depende de la caspasa-3.
Se ha informado que la mayoría de las proteínas que se escinden en las et apas finales de la apoptosis son los sustratos de la caspasa-3. Al mismo tiempo, varios trabajos sugirieron que la translocación nuclear de caspasa-3 activa podría ser necesaria para la ejecución de la apoptosis, mientras que los defectos en su entrada nuclear podrían ser la base de mecanismos potenciales de resistencia a la apoptosis. Para abordar si la aparición de caspasas-8, -9 y -2 en el núcleo también depende de la caspasa-3, analizamos la distribución del iniciador caspasa-2, -8 y -9 en caspasa-3-deficiente MCF7 células tratadas con cisplatino. El fraccionamiento de las células MCF-7 seguido del análisis de WB mostró que las caspasa-2, -8 y -9 del iniciador se detectaron en la fracción nuclear después de 16 horas de tratamiento con cisplatino (Fig. 5a, nuc). Por lo tanto, en las células MCF-7 deficientes en caspasa-3, las caspasas iniciadoras siguieron el mismo patrón de redistribución en respuesta al tratamiento con cisplatino que en las células HeLa y Caov-4 (Fig. 3a, nuc). Curiosamente, no se observaron diferencias significativas en la acumulación nuclear de caspasa-2, -8 y -9 en el curso de la apoptosis inducida por cisplatino. La pureza de las fracciones obtenidas se validó mediante WB (figura 5a) y análisis de microscopía (figura S6a yb). La aplicación de microscopía de inmunofluorescencia confirmó estos resultados, mostrando claramente la acumulación de caspasa-2, -8 y -9 en los núcleos morfológicamente integrales de células tratadas con cisplatino a pesar de la ausencia de caspasa-3 (figuras 5b y S6c). Los números de células MCF-7 que muestran la acumulación nuclear de caspasa-2, -8 y -9 (figura 5b) fueron similares a los observados en células HeLa y Caov-4 (figura 4a). Además, la deficiencia de caspasa-3 no afectó la entrada nuclear inducida por cisplatino de otras proteínas proapoptóticas analizadas en este estudio, a saber, AIF, EndoG, GAPDH y hexoquinasa II. Por lo tanto, el momento de su acumulación en los núcleos de las células MCF-7 (Fig. 5a, nuc) fue similar a los observados para las células HeLa y Caov-4 (Fig. 3a, nuc).
Figure 3. Functionally active initiator caspase-2, -8, -9 and executioner caspase-3 accumulate in the nucleus in response to the treatment of HeLa and Caov-4 cells with cisplatin (35 μM). (a) WB analysis of caspase cellular localization upon cisplatin treatment. Representative images of three independent experiments are shown. ( b,c) Caspase activity measurement in the nuclear ( b) and cellular ( c) lysates at the indicated time points. Caspase activity was measured by the release of the fluorogenic group AMC from VDVAD-AMC, (fold increase in caspase-2 activity), DEVD-AMC, (fold increase in caspase-3-like activity) and by the release of AFC from IETD-AFC, (fold increase in caspase-8 activity). Results represent the means ± s.e.m. of at least three independent experiments.
In summary, effector caspase-3 and initiator caspase-2, -8 and -9 accumulate into the nucleus during apoptosis with similar accumulation timings. The translocation of initiator caspases is still observed in caspase-3-deficient cells treated with cisplatin, and therefore, does not depend on caspase-3 activity.
Figure 4. Confocal microscopy analysis of the cellular redistribution of caspase-2, -3, -8 and -9 in response to treatment with cisplatin (35 μM, 24 hr). ( a) Statistical analysis of nuclear translocation of caspases. Results represent the means ± s.e.m. of three independent experiments. At least 200 cells were counted in each experiment. * p < 0.005. (b) Representative images of Caov-4 cells stained with primary anti-caspase-2, -3, -8 or -9 and secondary Alexa Fluor 488 (depicted in green) antibodies. Nuclei were stained with DAPI (shown in blue). Scale bars, 50 and 10 μm.
Discusión La degradación del núcleo es un paso extremadamente importante en el proceso apoptótico2,5. Teniendo en cuenta el papel clave de las caspasas en la demolición nuclear, su translocación al núcleo juega un papel crítico en la descomposición de este compartimiento celular y la progresión de la apoptosis. Sin embargo, los patrones de redistribución de caspasa en respuesta a diferentes estímulos apoptóticos y mecanismos moleculares de estos eventos siguen siendo contradictorios. Para analizar los cambios en la localización de las caspasas durante la apoptosis, establecimos el protocolo de fraccionamiento que permite la separación rápida y eficiente de los componentes citoplásmicos y nucleares de HeLa, Caov-4, MCF-7 y probablemente otras células de mamíferos. Usando el enfoque desarrollado, la translocación nuclear de no solo iniciador caspasa-2 con NLS, sino también de caspasa-8 y -9, se demostró junto con la caspasa-3 efectora en respuesta al tratamiento con cisplatino (así como TNFα / CHX y estaurosporina por fraccionamiento de células HeLa). Anteriormente, entre las caspasas iniciadoras, se ha informado que la localización nuclear desempeña un papel importante solo para caspase-2. Sin embargo, no observamos ningún patrón distintivo de localización para esta caspasa en nuestros experimentos. Usando enfoques independientes, hemos demostrado que, durante la apoptosis, caspasa-2 ingresa al núcleo simultáneamente con otras caspasas iniciadoras y caspasa-3. El hecho de que los patrones de redistribución de las caspasas fueron similares en todas las tres líneas celulares sugiere la generalizaciónnaturaleza del fenómeno observado,
incluso aunque no se puedan excluir las variabilidades dependientes del tipo de células notificadas con frecuencia y no todas las caspasas iniciadoras puedan translocarse al núcleo en ciertas líneas celulares. Por ejemplo, caspasa-2, -3 y -8, pero no -9, se detectaron previamente en la fracción nuclear de células Jurkat después del tratamiento con etopósido y anticuerpo anti-CD95 / Fas / Apo-1, aunque el estudio evaluó solo una vez apuntar y utilizar un anticuerpo diferente contra caspase-9. Además, se informó que la procaspasa-8 puede estar presente en el núcleo sin estímulos apoptóticos y podría tener funciones no apoptóticas, en particular, en la reparación del ADN. Descubrir la diafonía entre las funciones apoptósicas y no apoptóticas de las caspasas en el núcleo es la pregunta para los estudios futuros. Del mismo modo, la posibilidad de variaciones dependientes del tipo de célula en la translocación nuclear de caspasa y su papel es altamente concebible, y debe abordarse en el trabajo futuro. Es de destacar que las cuatro caspasas estaban presentes en los núcleos de células apoptóticas predominantemente en su estado catalíticamente activo. Posiblemente, esto se debe a que las procaspasas son menos móviles que sus formas escindidas. De hecho, la escisión de las procaspasas da como resultado la pérdida del prodominio y del enlazador, y conduce a la reorganización de su estructura terciaria. Otros factores, como los cambios en los patrones de modificaciones postraduccionales de la caspasa que se observan durante la apoptosis, también podrían contribuir al aumento de la movilidad de las caspasas escindidas al alterar su carga y su conformación. Generalmente, la caspasa-3 se considera la principal proteasa efectora que escinde una gran cantidad de sustratos, desmantelando el núcleo y otros compartimentos celulares en el curso de la apoptosis. Sin embargo, aquí observamos tiempos y velocidades similares de la acumulación nuclear para iniciadores y epasas caspasas. Si bien el conjunto de datos obtenido no contradice el concepto de que la caspasa-3 es la principal proteasa apoptótica, sugiere que el papel de las caspasas iniciadoras en la degradación del núcleo durante la apoptosis podría subestimarse. Por lo tanto, es posible que las caspasas iniciadoras puedan escindir una cierta gama de proteínas nucleares, algunas de las cuales ni siquiera podrían ser objetivo por efector caspasas. En concordancia, se ha demostrado que cada caspasa-2, -3 y -7 escinde un conjunto particular de sustratos a diferentes velocidades que varían en más de 500 veces. Además, después de su translocación al núcleo, las caspasas iniciadoras podrían promover la proteólisis nuclear mediante la activación de caspasas efectoras directamente en esta célula compartimiento. Las caspasas iniciadoras también pueden tener funciones que son independientes de su actividad proteolítica, por ejemplo, se mostró que un producto escindido de caspasa-8 se transloca al núcleo y causa la regulación positiva de genes que codifican factores proapoptóticos. Curiosamente, la entrada nuclear inducida por cisplatino de las caspasas iniciadoras no dependía de la caspasa-3 efectora, ya que los patrones de redistribución de la caspasa del iniciador seguían siendo los mismos en las células MCF-7 deficientes en caspasa3. Aunque caspasa-7 puede compensar parcialmente la ausencia de caspasa-3 en algunos tipos de células, generalmente se acepta que todas las caspasas efectoras tienen funciones distintas no redundantes, y la ejecución de apoptosis en células MCF7 no es una excepción. Debido al papel crucial de la caspasa-3 en la muerte celular apoptótica, la translocación nuclear de las caspasas iniciadoras parece ser independiente no solo de la función de la caspasa-3, sino también de otras caspasas efectoras. En células con deficiencia de caspasa-3 o regulación negativa, la translocación nuclear y la función de las caspasas iniciadoras pueden ser particularmente importantes para la ejecución exitosa de la apoptosis. En respuesta a cisplatino, TNFα / CHX y estaurosporina, además de la entrada de caspasa en el núcleo, detectamos la translocación citoplásmica del fragmento apoptótico de 89 kDa de PARP1, lo que es plausible ya que la escisión mediada por caspasa de PARP1 elimina su dominio de unión a ADN. e interrumpe su NLS. Previamente, este evento de translocación ya se ha descrito en respuesta a diferentes estímulos apoptóticos, que
incluyen TNFα y etoposido, agente dañino para el ADN. Además, observamos la acumulación nuclear de GAPDH y hexoquinasa II durante la apoptosis inducida por cisplatino. La entrada nuclear de GAPDH también se ha demostrado en respuesta al daño del ADN, el estrés oxidativo y el tratamiento con TNFα. Aunque la entrada nuclear de hexoquinasa II todavía no se ha demostrado en células de mamíferos, se informó en levaduras. Al mismo tiempo, el tratamiento con cisplatino condujo a una acumulación significativa de AIF y endonucleasa G en el núcleo. El movimiento de estas proteínas al núcleo ya se ha demostrado en respuesta a un rango de estímulos apoptóticos y promueve la condensación de la cromatina y la fragmentación del ADN a través de la vía apoptótica independiente de las caspasas. Dado que se sabe que la permeabilidad de la membrana nuclear aumenta en el transcurso de la muerte celular apoptótica, las caspasas y otras proteínas proapoptóticas podrían ingresar al núcleo para inducir su demolición apoptótica independientemente de los sistemas de transporte específicos. Por otro lado, mientras que la translocación nuclear de las caspasas ya se detectó después de 16 horas de incubación con cisplatino, solo se observó fragmentación menor (6,6%) o nula de los núcleos por tinción con DAPI de las células HeLa y Caov-4, respectivamente. Al mismo tiempo, no se detectó una disminución en los niveles de lamina B o formas de caspasas de longitud completa. El análisis de microscopía confocal también demostró nuclear acumulación de caspasas en células con núcleos morfológicamente integrales.
Figure 5. Caspase-3 deficiency in MCF-7 cells does not prevent the translocation of initiator caspases to the nucleus induced by cisplatin (35 μM). (a) WB analysis of caspase cellular localization. Representative images of 3 independent experiments are shown. ( b) Confocal microscopy analysis of the cellular redistribution of initiator caspase-2, -8 and -9 in response to treatment with cisplatin (35 μM, 24 hr). Results represent the means ± s.e.m. of three independent experiments. At least 200 cells were counted in each experiment. * p < 0.005.
En resumen, nuestros resultados sugieren que, durante la apoptosis, el iniciador caspasa-2, -8, -9 se transloca al núcleo en paralelo con efector caspasa-3, y luego podría participar en la degradación nuclear. Por lo tanto, la identificación adicional de los sustratos nucleares de las caspasas iniciadoras puede arrojar luz sobre los
mecanismos de la demolición del núcleo durante la muerte celular apoptótica. Dado que las alteraciones en el sistema de transporte nucleocitoplasmático no se limitan al inicio de la apoptosis, sino que se observan en respuesta a diversos estreses patológicos y fisiológicos, la entrada nuclear de las caspasas también podría ocurrir no solo durante la muerte celular apoptótica y podría tener un significado mucho mayor en el metabolismo celular Por lo tanto, se necesitan más estudios para mejorar nuestra comprensión de las funciones y la translocación nuclear de la caspasa del iniciador. Materiales y métodos Cultivo celular y tratamiento. Células HeLa de carcinoma de cuello uterino humano, células Caov-4 de carcinoma ovárico humano, células MCF-7 de carcinoma de mama humano se cultivaron en DMEM (Gibco) suplementado con 10% de FBS inactivado por calor (Gibco) y piruvato de sodio 1% (PanEco) en presencia de 100 μg / ml de penicilina y 100 μg / ml de mezcla de estreptomicina (Gibco) en una atmósfera humidificada al 5% de CO a 37 ° C. Para inducir la apoptosis, las células se trataron con 35 μM de cisplatino (Teva), 10 ng / ml de TNFα / 5 μg / ml de CHX (Sigma), o 0,1 μM de estaurosporina (Sigma) durante los períodos de tiempo indicados. Western Blot. Las mediciones de proteínas se llevaron a cabo utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se mezclaron con tampón de carga de Laemmli, se hirvieron durante 5 minutos y se sometieron a SDS-PAGE (12%) seguido de transferencia sobre membranas de nitrocelulosa durante 30 min a 25 V usando la Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon durante 1 hora con 5% leche sin grasa en TBS a temperatura ambiente y posteriormente sondeada durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario (1: 1000). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-vinculina de conejo, anti-hexoquinasa-II de conejo, anti-Na + / K + ATPasa de conejo, caspasa-3 anti-escindida de conejo (todos de Cell Signaling), ratón anti-caspasa-2, ratón anti-caspasa-3, ratón anti-PARP1, ratón anti-citocromo c (todos de BD Transduction Lab), ratón anti-lamina B, conejo anti-Endonucleasa G, ratón anti AIF (todos de Santa Cruz Biotech), ratón anti -caspase-8 (Enzo Life Science), conejo anti-GAPDH (Trevigen), y conejo anti-ERp29 (amablemente proporcionado por el Dr. S. Mkrtchian, Karolinska Institutet). Después de lavados cuatro veces en TBST (Tween-20 al 0,05% en TBS), las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante adquiridos de Cell Signaling (1: 4000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las transferencias se desarrollaron usando ECL (Amersham Biosciences) y se documentaron usando Chemi-Doc. (Bio-Rad). Fraccionamiento subcelular . Todas las preparaciones se realizaron en hielo. Las células se lavaron con PBS, se recogieron y se resuspendieron en tampón hipotónico (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, KCl 10 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 1 mM, DTT 0,5 mM, PMSF 0,5 mM e inhibidores de proteasa completos de Roche; 300 μl fueron agregado por plato de cultivo de tejidos de 100 mm), se incubó durante 5 minutos seguido de la adición de NP-40 (Nonidet P-40) a una concentración final de 0,1%. Después de 3 min de incubación, el citoplasma y los núcleos se separaron por centrifugación a 800 g durante 8 min. Posteriormente, a 1500 g durante 5 minutos, y los sobrenadantes se recogieron como las fracciones citoplásmicas finales. Los núcleos se purificaron durante 10 min de incubación en tampón de lisis isotónico (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, KCl 150 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 1 mM, NP-40 al 0,3%, DTT 0,5 mM, PMSF 0,5 mM y Roche completa inhibidores de proteasa; se agregaron 500 μl por placa de cultivo tisular de 100 mm) y se centrifugaron a 700 g durante 7 min. La calidad de los núcleos obtenidos se evaluó mediante DIC (contraste de interferencia diferencial) / microscopía de fluorescencia usando microscopio fluorescente DMI6000B (Leica) después de tinción de ADN con Hoechst33342 (1 mg / ml en PBS) (sondas moleculares) y ER (retículo endoplasmático) con tinción con 1 μM ER-tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide, Molecular Probes). Para la digestión del ADN, los núcleos aislados se resuspendieron en tampón DNAsa (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, MgCl2 4 mM, CaCl2 1 mM, NP-40 al 1%, DTT
0,5 mM, PMSF 0,5 mM y Roche completa inhibidores de proteasa) y se incubaron con DNAse I (Thermo Scientific) o benzonase (Sigma) durante 40 min en hielo. Para la determinación de las condiciones óptimas de fraccionamiento, varios enfoques para el aislamiento nuclear fueron probado La homogenización Dounce se realizó en el tampón hipotónico descrito anteriormente con un vaso Dounce Amoladora de tejidos usando 30 a 50 golpes. Posteriormente, los componentes citoplásmico y nuclear fueron separados por centrifugando a 800 g durante 8 min. En caso de utilizar digitonina para la lisis de la membrana celular, las soluciones hipotónicas e isotónicas. Brevemente, después de la lisis de la membrana celular usando homogeneización Dounce o gránulo nuclear NP-40 se resuspendió en solución S1 (sacarosa 0,25 M, MgCl2 10 mM), se dispuso sobre la solución S2 (sacarosa 0,88 M, MgCl2 0,5 mM) y se centrifugó a 3000 g durante 15 min. Tinción DAPI. Las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio redondo de 13 mm (Thermo Scientific). Después del tratamiento, las células se enjuagaron tres veces con PBS y se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4%. Después de tres lavados con PBS, cubreobjetos se montaron con ProLong ™ Diamond Antifade Mountant con DAPI para contratinción nuclear (Invitrogen). Las muestras se examinaron bajo el microscopio de escáner láser confocal LSM 780 (Zeiss). Al menos se contaron 200 células por muestra para determinar los porcentajes de células con núcleos condensados y fragmentados. Medición de la actividad de caspasa Caspasa-2, -3 y -8 actividades fueron evaluadas
mediante la detección de la división de sustratos peptídicos fluorogénicos VDVAD-AMC, DEVD-AMC e IETD-AFC (PeptaNova), respectivamente. Células recolectadas o núcleos aislados utilizando el protocolo descrito en 2.3. Fracciones subcelulares fueron resuspendidas con PBS suplementado con 0.5 mM de PMSF e inhibidores completos de la proteasa Roche (100 μl de PBS por 1 × 106 células o núcleos aislados de 2 × 106 células). Se colocaron 25 μl de la suspensión en una placa de 96 pocillos y se mezclaron con la sustrato peptídico apropiado (100 μM) disuelto en 50 μl de caspasa-3, -8 (HEPES 100 mM, pH 7,2, sacarosa al 10%, DTT 5 mM, NP-40 al 0,001%, CHAPS al 0,1%) o tampón de reacción caspasa-2 (MES 100 mM, pH 6,5, polietileno al 10% glicol, DTT 5 mM, NP-40 al 0,001%, CHAPS al 0,1%). La escisión de péptidos fluorogénicos se controló a 37 ° C usando Detector multimodo VarioScan Flash (Thermo Scientific) por AMC o liberación AFC a 380 nm de excitación y Emisión de 460 nm, o excitación de 400 nm y longitudes de onda de emisión de 505 nm, respectivamente. Los valores de fluorescencia se normalizaron a las concentraciones de proteína medidas usando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific). Inmunofluorescencia. Las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio redondo de 13 mm (Thermo Scientific). Después del tratamiento, las células se enjuagaron tres veces con PBS, se fijaron durante 10 min en paraformaldehído al 4%, se lavaron tres veces con PBS y se permeabilizó con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 10 min. Después de tres pasos de lavado en PBS, bloqueo de sitios de unión no específicos se realizaron mediante la incubación de células en BSA al 4% en PBST (Triton X-100 al 0,05% en PBS) a 4 ° С durante 1 hora. Incubación con ant i-caspasa-2 de conejo primario (Santa Cruz Biotech, 1: 150), conejo anti-caspasa-3 (Cell Signaling, 1: 150), conejo anticaspasa-8 (Thermo Scientific, 1: 150) o anticuerpos anti-caspasa-9 de ratón (Thermo Scientific, 1: 300) se realizó durante la noche en BSA al 4% en PBST. Luego, las células se lavaron tres veces con PBST e incubadas durante 2 horas a 4 ° C con anticuerpos secundarios adecuados Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, 1: 300) en BSA al 4% en PBST. Luego, después de tres pasos de lavado en PBST, se montaron
cubreobjetos con ProLong ™ Diamond Antifade Mountant con DAPI para contratinción nuclear (Invitrogen). Las muestras fueron examinadas bajo microscopio de escáner láser confocal LSM 780 (Zeiss). El software ZEN (Zeiss) se utilizó para fusionar las imágenes. Análisis estadístico. Los datos se presentan como medias ± e.m. de al menos 3 experimentos independientes. Estadístico el análisis se realizó utilizando las pruebas t de Student a un nivel de significación de * p <0,005.
