Antibiotik merupakan senyawa organik yang dihasilkan oleh mikroorganisme hidup, yaitu bakteri dan jamur, yang berkhasiat mematikan (bakterisid) atau menghambat pertumbuhan (bakteriostatik) mikroorganisme lain serta toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Antibiotik dapat digolongkan dalam dua aspek, yaitu berdasarkan struktur kimia dan spektrum kerjanya Berdasarkan struktur kimia: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Golongan Penisilin Amoksisilin, Ampisilin Golongan - lactam Golongan Sefalosporin Sefileksin Golongan Tetrasiklin Tetrasiklin, Tetrasiklin HCl, Klortetrasiklin HCl, Oksitetrasiklin HCl Golongan Linkosamid Klindamisin Golongan Kuinolon Siprofloksasin Golongan Makrolida Eritromisin Golongan Kloramfenikol Kloramfenikol, Kloramfenikol palmitat, Kloramfenikol sodium suksinat,
Tiamfenikol 8. Golongan Aminoglikosid Neomisin Sedangkan, berdasarkan spektrumnya: 1. Spektrum luas efektif terhadap bakteri gram positif dan gram negatif. Contoh : tetrasiklin, kloramfenikol. 2. Spektrum sempit efektif terhadap bakteri gram positif atau gram negatif saja. Contoh : streptomisin (Gram negatif). Apabila antibiotik berada dalam suatu sediaan lakukan pemisahan melalui ekstraksi. Beberapa metode ekstraksi antara lain : 1.
Ekstraksi padat-cair berdasarkan kelarutan zat dalam pelarut. Prinsip: melarutkan zat uji dalam sampel padat (pengojokan kemudian disaring, sentrifugasi, atau dekantasi) dengan pelarut yang dapat melarutkan zat dengan baik.
2. Ekstraksi cair-cair bergantung pada Kd dan rasio distribusi (D) zat uji dalam pelarut organik/air. Beberapa jenis analisis pendahuluan yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi antibiotik, antara lain : 1. Warna a. Tidak berwarna Contoh : Penisilin, Eritromisin, Kloromisetin. b. Larutan coklat merah Contoh : Rifampisin 2. Rasa rasa sangat pahit kloramfenikol 3. Bau bau khas Penisilin 4. Higroskopis Streptomisin, Kanamisin, dan Rifampisin 5. Kelarutan: a. mudah larut dalam air : bentuk garam sulfat, kloridanya b. tidak larut air : garam palmitat / stearat Selanjutnya dapat dilakukan uji kualitatif: 1. Reaksi Warna a. Zat uji direaksikan dengan 2 mL H2SO4 pekat kemudian dikocok, maka akan terbentuk: — Warna kuning: Streptomisin, Eritromisin, Oksitetrasiklin, Klortetrasiklin, Kloramfenikol — Warna jingga: Tetrasiklin 3
— Warna kuning coklat: Penisilin b. Zat uji direaksikan dengan Difenilamin 1% akan menghasilkan senyawa berwarna biru, yaitu Kloramfenikol. c. Zat uji direaksikan dengan H2SO4 pekat lalu ditambahkan resorcin, maka akan terbentuk: — Warna kuning hijau: Penisilin — Warna merah: Streptomisin d. Zat uji direaksikan dengan 2 mL NaOH 40% dan dipanaskan kemudian dikocok dengan piridin, maka akan terbentuk dua lapisan yaitu lapisan piridin berwarna merah dan lapisan air berwarna kuning. Contohnya adalah Tetrasiklin, Oksitetrasiklin, dan Klortetrasiklin. e. Zat uji direaksikan dengan FeCl3, maka akan terbentuk warna coklat muda pada Tetrasiklin, Oksitetrasiklin, dan Klortetrasiklin. f. Zat uji direaksikan dengan HCl lalu ditambahkan NaOH sampai netral, kemudian ditambahkan FeCl3, maka akan terbentuk warna ungu, yaitu Streptomisin. g. Zat uji direaksikan dengan HNO3 pekat, maka akan terbentuk: — Warna kuning coklat: Tetrasiklin — Warna kuning muda: Penisilin — Warna jingga: Tetrasiklin, Oksitetrasiklin, dan Klortetrasiklin h. Zat uji direaksikan dengan H2SO4 dan NaNO2, maka akan menghasilkan larutan berwarna jingga, yaitu Tetrasiklin, Oksitetrasiklin, dan Klortetrasiklin. i. Zat uji direaksikan dengan vanilin dan H2SO4, maka akan terbentuk: — Warna ungu hijau: Tetrasiklin dan Klortetrasiklin — Warna merah hijau: Oksitetrasiklin j. Zat uji direaksikan dengan 5 tetes tembaga nitrat kemudian dipanaskan, maka akan terbentuk: — Warna hijau kuning: Penisilin — Warna kuning muda: Streptomisin — Warna abu-abu coklat: Kloramfenikol dan Eritromisin k. Zat uji direaksikan dengan Na nitroprussid, ferisianida, dan NaOH maka akan membentuk larutan berwarna merah jingga, yaitu Streptomisin. l. Zat uji diasamkan dengan HCl dan ditambahkan serbuk zink, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Setelah itu, ditambahkan 2 tetes NaNO2 10% dan dikocok dengan
-naftol basa, maka
akan membentuk larutan berwarna merah, contohnya adalah Kloramfenikol. 2. Identifikasi Gugusan a. Gugus Aromatis Reaksi Marquis Larutan zat + 1 ml formaldehid + H2SO4 (p) terbentuk cincin berwarna kuning-jingga-merah. b. Gugus OH Reaksi Diazo Reagen: Diazo A = asam sulfanilat + HCl + NaOH, Diazo B = NaNO2 dalam air Larutan zat + Diazo A:B (4:1) + NaOH panaskan merah frambors. Untuk membedakan dengan fenol, bila di tambahkan amil alkohol warna merah akan tertarik. c. Gugus Keton Reaksi Legalrothera Larutan zat + larutan Na-Nitroprussid + 1 gr NH4Cl atau (NH4)2SO4 + 2 ml NaOH ungu/biru dan lama-lama warna hilang. d. Gugus Karboksilat 4
Zat + KI + KIO3 + amilum warna biru e. Membedakan amin primer, sekunder, dan tersier Reaksi Rumini 5 ml Larutan zat uji + 2 ml larutan aseton 1% + beberapa tetes Na nitroprusid 5%. Warna ungu muncul dan lama-kelamaan berubah menjadi merah amin primer Warna biru muncul amin sekunder f. Gugus Eter Reaksi Weber Reagen : 1% fluoroglusin dalam H2O/Hg + H2SO4 Zat + pereaksi + H2SO4 merah g. Gugus Halogen Pereaksi Beilstein Kawat Cu dicelupkan ke HNO 3, kemudian dipijar sampai warna hijaunya hilang. Celupkan kawat Cu ke dalam zat, kemudian dipijar kembali dan amati warna. Reaksi ini positif bila warna pijarnya hijau. 3. Identifikasi Umum Golongan a. Reaksi Vitalli Morin 5 mg zat uji + 0,5 ml HNO3(p), kemudian diuapkan di WB sampai kering dan dinginkan berwarna kuning, dilarutkan dalam 5 ml aseton + 1 ml NaOH 0,1 N KOH-etanol warna ↓ jingga coklat. Reaksi ini untuk identifikasi gugus N Heterosiklik, khususnya pada cincin laktam golongan Penisilin dan Sefalosporin. b. Reaksi Benedict Zat uji + 0,5 ml pereaksi Benedict, kemudian dipanaskan selama 3 menit merah bata. Reaksi ini untuk identifikasi senyawa dengan 4 gugus OH pada cincin non aromatis, yaitu golongan Tetrasiklin. c. Rekasi Fehling Zat uji direaksikan dengan pereaksi fehling A-fehling B (1:1) kemudian dipanaskan, maka akan terbentuk larutan berwarna merah bata, yaitu golongan Tetrasiklin dan Aminoglikosida. d. Reaksi Mollisch 2 ml larutan zat uji + pereaksi mollisch (5 tetes α-naftol 3% dalam spiritus) + 2 ml H 2SO4 cincin ungu. Reaksi Identifikasi senyawa gula, yaitu pada golongan Aminoglikosida. e. Reaksi Mayer Pereaksi: 1 gr raksa klorida (HgCl2) + 4 gr KI. Zat + pereaksi Mayer + HCl 2N ↓ kuning / lar. Kuning Reaksi ini untuk identifikasi gugus N heterosiklik, yaitu pada golongan Linkosamid dan Fluorokuinolon. f. Reaksi Wassicky Zat uji direaksikan dengan p-DAB dan H2SO4 pekat, maka akan terbentuk warna kuning muda untuk Kloramfenikol dan Penisilin. Tabel Analisis Sediaan Antibiotik A. Golongan Penisilin a. Penisilin bau spesifik b. Reaksi Warna: 5
Zat + H2SO4(p) + DFA 1% + Resorcin kuning hijau Zat +5 tetes Cu(NH3) Nitras, panaskan hijau kuning c.
Reaksi Iodazida 2 ml lar 0,003 N Iodium (3 ml 0,1 N I2 + 100 ml air) + beberapa tetes lar kanji + 100 mg Na azida padat biru + 50 mg zat kocok warna hilang atau larutan menjadi jernih gelembung nitrogen dari penisilin.
1) AMOKSISILIN - Isolasi: Sejumlah isi kapsul yang mengandung setara dengan 0,5 g amoksisilin, ditambah dengan 5 ml air.
Spektrofotometri UV Zat dilarutkan di dalam asam encer dan diperiksa
Kemudian didapat filtrat dan residu. Residu yang
pada panjang gelombang 230 nm (A 11=225a), 272
didapat cuci dengan etanol 96% hingga didapat filtrat
nm (A11=26a); dalam basa encer dan diperiksa pada
dan residu. Lalu residunya dicuci dengan eter. Maka
panjang gelombang 247 nm (A11=286a), 291 nm
didapat filtrat dan residu. Residu yang didapatkan
(A11=62a).
dikeringkan pada tekanan tidak lebih dari 0,7 kPa selama 1 jam. Residu ini yang akan digunakan untuk identifikasi dengan TLC. TLC - Larutan standard: 4 mg/ml pada USP amoxicillin RS dalam 0.1 N asam hidroklorat. - Larutan sampel: ekuivalen dengan 4 mg/mL dari amoksisilin serbuk kapsul dalam 0,1 N asam Hidroklorat. - Adsorbent: 0,25 mm lapisan kromatografi silika Gel - Volume aplikasi: 5 mikroliter - Sistem larutan pengembang: metanol, chloroform,
High
pyridine, air (9:8:1:3) - Reagen penyemprot: 3 mg/mL dari ninhydrin dalam
(HPLC) Pada metode ini dapat digunakan dua sistem.
alcohol - Analisis sampel: Siapkan larutan sampel, larutan
Sistem pertama yaitu sistem HY yang menghasilkan
standar, dan kembangkan kromatogram. Pada saat
Gambar 2. Spektrum Serapan Amoksisilin Performance
Liquid
Chromatography
indeks retensi (RI) 226. Sistem kedua yaitu sistem HAA yang menghasilkan waktu retensi 3,1 menit.
pelarut depan telah bergerak sekitar ¾ dari panjang - Tipe: Kromatografi cair lempeng, pindahkan lempeng dari chamber, tandai - Detektor: UV 230 nm
- Kolom: 4 mm x 25 cm; berisi bahan pengisi L1 - Volume injeksi: 10 µl selama 10 menit. Buatlah titik pada lempeng sambil - Laju alir: lebih kurang 1,5 ml/menit. disemprot halus dengan reagen penyemprot dan - Faktor kapasitas (k’): 1,1 - 2,8 - Efisiensi kolom: NLT 1700 lempeng teoritis keringkan pada suhu 110°C selama 15 menit. - Kriteria penerimaan: nilai Rf untuk titik larutan - Faktor ikutan: NMT dari 2,5 - Simpangan baku relatif: NMT2,0%. pelarut depan, dan keringkan dalam udara hangat
sampel harus sesuai dengan larutan standar.
Spektrofotometri Infra Merah (IR) Zat didispersikan dalam kalium bromida P. Puncakpuncak spektrum yang utama terlihat pada bilangan 6
gelombang 1775, 1684, 1613, 1583, 1248, 1313 cm−1.
Gambar 3. HPLC Kromatogram Amoksisilin
Gambar 1. Spektrum IR Amoksisilin 2) AMPISILIN TLC
Spektrofotometri UV Sampel dilarutkan di dalam asam encer dan diperiksa
a. Ampisilin Kapsul - Larutan standar: 5 mg/ml USP Ampisilin RS serapannya pada panjang gelombang
257 nm
dalam campuran aseton dan 0,1 N asam (A11=9.2a), 262 nm, dan 268 nm. hidroklorat (4:1) - Larutan Sampel: 5 mg/ml ampisilin, dari serbuk tablet dalam campuran aseton dan 0,1 N asam hidroklorat (4:1) - Adsorbent: 0,25 mm kromatografi lapisan yang terbuat dari campuran silika gel. - Volume aplikasi: 2 mikroliter Gambar 6. Spektrum Serapan Ampisilin - Sistem pelarut pengembang: aseton, toluen, asam High Performance Liquid Chromatography asetat glasial, dan air (26:4:1:4) (HPLC) - Reagen penyemprot: 3 mg/ml ninhidrin dalam Pada metode ini dapat digunakan dua sistem. Sistem alkohol pertama yaitu sistem HY yang menghasilkan indeks - Analisis sampel: Siapkan larutan sampel, larutan retensi (RI) 226. Sistem kedua yaitu sistem HAA standar, dan kembangkan kromatogram. Pada yang menghasilkan waktu retensi 3,8 menit. saat pelarut depan telah bergerak sekitar ¾ dari - Fase Gerak: Asetonitril, air, kalium fosfat panjang lempeng, pindahkan lempeng dari monobasa 1M, asam asetat 1N (80:909:10:1) Pengencer: Air, kalium fosfat monobasa 1M, chamber, tandai pelarut depan, dan keringkan dalam udara hangat selama 10 menit. Buatlah titik pada lempeng sambil disemprot halus dengan reagen penyemprot dan keringkan pada suhu 90°C selama 15 menit. - Kriteria penerimaan: nilai Rf titik larutan sampel harus sesuai dengan larutan standar. b. Ampisilin Tablet
-
asam asetat 1N (989:10:1) Tipe: Kromatografi cair (LC) Detektor: UV 254 nm Kolom: 4 mm x 30 cm;berisi bahan pengisi L1
-
dengan ukuran partikel 5-10 µm Pre-kolom: 4 mm x 5 cm; 5-10µm L1 Laju alir: 2 ml/menit Volume injeksi: 2µl 7
- Identifikasi: Serbukkan satu atau lebih tablet ampisilin, buat larutan yang mengandung 5 mg
-
Tailing factor: NMT 1,4 Faktor kapasitas (k’): NMT 2,5 Standar deviasi relatif: NMT 2,0%
per ml dalam campuran pelarut aseton P-asam klorida 0,1 N (4:1); lakukan uji identifikasi seperti tertera pada Kapsul Ampisilin. Spektrofotometri Infra Merah (IR) Zat didispersikan dalam kalium bromida P. Puncakpuncak spektrum yang utama terlihat pada bilangan gelombang 1775, 1693, 1526, 1308, 1497, 1583 cmˉ1 . Gambar 7. HPLC Kromatogram Amoksisilin dan Ampisilin
Gambar 5. Spektrum IR Ampisilin
Perbedaan Amoksisilin dan Ampisilin Perbedaan
Amoksisilin
Ampisilin
Rumus Bangun
Reaksi Diazo Waktu Retensi Fluoresensi
(+) positif 3,1 menit (-) Gelap
3) ASAM KLAVULANAT Spektrofotometri UV
(-) negative 3,8 menit (+) Terang -
Larutan uji: Encerkan secara kuantitatif sejumlah volume Amoksisilin dan Kalium Klavulanat untuk Suspensi Oral yang diukur saksama, yang dikonstitusi seperti tertera pada etiket, dengan air hingga kadar amoksisilin lebih kurang 0,5 mg per ml. Aduk dengan pengaduk mekanik selama 10 menit dan
Gambar 9. Spektrum Serapan Amoksisilin dan
saring. Gunakan filtrat sebagai Larutan uji
Asam Klavulanat 8
High
Performance
Liquid
Chromatography
(HPLC) Definisi: Amoksisilin dan Kalium Klavulanat untuk Suspensi Oral mengandung amoksisilin,
dalam
tertera pada etiket, dan mengandung asam klavulanat, C8H9NO5, setara dengan tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 125,0% dari
jumlah
yang
tertera
pada
etiket.
-
dan bahan pensuspensi. Fase gerak: campuran dapar natrium fosfat pH
-
4,4 dan metanol P (95:5) Larutan baku: Timbang saksama sejumlah
jam
setelah
suspensi
diencerkan. Tipe: Kromatograf cair (LC) Detektor: UV 220 nm Kolom: 4 mm x 30 cm; berisi bahan pengisi
-
L1 dengan ukuran partikel 3-10 µm Laju alir: lebih kurang 2 ml per menit. Resolusi(R): NLT dari 3,5 antara puncak
-
amoksisilin dan asam klavulanat Efisiensi kolom: NLT 550 lempeng teoritis
-
untuk masing-masing puncak analit Tailing factor: NMT 1,5 untuk masing-masing
-
puncak analit Simpangan baku relatif: NMT 2,0%.
Mengandung satu atau lebih dapar, pewarna, penambah rasa, pengawet, penstabil, pemanis
1
-
C16H19N3O5S, setara dengan tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 120,0% dari yang
waktu
Amoksisilin BPFI dan Litium Klavulanat BPFI larutkan dalam air hingga diperoleh kadar berturut-turut lebih kurang 0,5 dan 0,2 mg per ml.
B.
Gambar10. HPLC Kromatogram Asam Klavulanat dan Amoksisilin
GOLONGAN TETRASIKLIN 1) TETRASIKLIN Rumini (+) Cuprifil (+)
Marquis (+)
Diazo (+) Fenol
Legalrothera (+)
Kromatografi Lapis Tipis Sistem TA-Rf 05 - Pelat: Silika Gel G, tebal 250 μm, direndam atau
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi - Sistem HX-RI 314; Sistem HY-RI 265; Sistem HAA-Waktu retensi 9,9 menit. (Clarke's Analysis of
disemprot dengan 0,1M KOH dalam metanol, dan
Drugs and Poisons, 2005) dikeringkan. - System HX - Fase Gerak: Metanol:Larutan ammoniak kuat Kolom: Lichrospher 60 RP-Select B (125 × 4.0 mm (100:1,5) 9
Sistem TB-Rf 00 - Pelat: Silika Gel G, tebal 250 μm, direndam atau disemprot dengan 0,1M KOH dalam metanol, dan dikeringkan. Fase Gerak: Sikloheksan - Toluen - Dietilamin (75:15:10) Sistem TAE-Rf 88 - Pelat: Silika Gel G, tebal 250 μm. - Fase Gerak: Metanol Dilihat di bawah sinar ultraviolet, memberikan fluoresensi orange; Diasamkan dengan larutan kalsium permanganat, memberikan hasil positif. (Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, 2005) Kromatografi Gas Berdasarkan TIAFT Book (de Zeeuw 2002): - Kolom: 3% SE-30 atau OV-1 pada 80 hingga 100 mesh Chromosorb G HP (Dicuci dengan asam
i.d., 5 μm) dengan pre-column Lichrospher 60 RPSelect B (4 × 4.0 mm i.d., 5 μm). Fase Gerak: (A:B) triethylammonium phosphate buffer (25 mM, pH 3.0) - acetonitrile. Elusi: (A:B) (100:0) to (30:70) selama 30 menit, tahan 10 menit, kembali ke kondisi semula dalam 3 menit dengan equilibrasi selama 10 menit sebelum injeksi selanjutnya. Laju alir : 1 mL/menit Detektor: UV diode-array - Sistem HY Kolom: C18 Symmetry (250 x 4.6 mm i.d., 5 μm) Suhu Kolom: 40°C Fase Gerak : Terdiri dari 2 campuran larutan, yaitu 0.5 mL Asam Sulfat 2.5M dalam air 500 mL dan 0,5 mL Asam Sulfat 2.5M dalam asetonitril 500 mL Detektor: UV diode-array
dan dimethyldichlorosilane treated), 2m x 2 mm - Sistem HAA i.d.glass column; Sangat penting bahwa support-
Kolom: C8 Symmetry (250 × 4.6 mm i.d., 5 μm)
nya dimatikan.
dengan Symmetry C18 pre-column (20 mm).
- Temperatur kolom: Normalnya antara 100o dan
Suhu Kolom: 30°C
300o; Untuk kondisi isotermal, panduan untuk
Fase Gerak : (A:B) yaitu Buffer Fosfat (pH 3.8) :
temperaturnya kira-kira adalah menggunakan
Asetonitril
RI:10.
Laju alir
: 1 mL/menit untuk 6.5 menit,
- Gas pembawa: Nitrogen 45 ml/menit.
kemudian meningkat secara linier pada 1.5 mL
- Kolom kapiler: 10 hingga 15m x 0,32 atau 0,53
untuk 6,5 hingga 25 menit dan diamkan selama 3
mm, 100%-dimethyl-PSX (X-1)dengan tebal film
menit (setimbangkan kembali dengan membuat laju
1,5 hingga 3 μm.
alir pada 1.5 mL/menit)
- Gas pembawa: Helium.
Detektor: UV diode-array
- Temperatur programme: 4 menit pada 135o, Spektrum IR (Infra Red) 13o/menit hingga 200o, 6o/menit hingga 312o, 6 Puncak-puncak spektrum yang utama nampak pada menit terakhir ditahan.
bilangan gelombang 1612, 1580, 1660, 1226, 1248,
1530 cm−1.(Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, Spektrum UV Dalam asam encer, spektrum puncak tampak pada 2005) 270 nm (A11=417a), dan 356 nm. (Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, 2005) 10
Gambar 11. Spektrum UV Tetrasiklin Gambar 12. Spektrum Infra Red Tetrasiklin 2) TETRASIKLIN HCL Legalrothera (+) Marquis (+)
Cuprifil (+)
.HCL Diazo (+) Fenol
Beilstein (+)
Rumini (+)
Spektrofotometri UV
- Larutan Uji : Larutkan 5 mg bahan ke dalam 10 ml
Menurut USP 32:
metanol. - Lempeng
: TLC octadecylsilyl silica gel - Panjang Gelombang Analisis: 380 nm - Larutan Sampel : 20 μg/mL F254plate R. - Medium : 0,25 N NaOH - Fase Gerak: Campur 20 bagian Asetonitril, 20 - Standar : USP Tetracycline Hydrochloride RS bagian Metanol, dan 60 bagian dari suatu larutan Sperktrofotometri Infra Red 63 g/L Asam Oksalat yang sebelumnya diatur Menurut FI IV: Spektrum serapan inframerah zat yang telah memiliki pH 2 dengan larutan Ammonia kuat. Penggunaan: 1 µl. didispersikan dalam KBr P menunjukkan maksimum - Lama Pengembangan/Elusi: Lebih dari ¾ lempeng hanya pada panjang gelombang yang sama seperti - Pengeringan: di udara (angin-anginkan) Tetrasiklin Hidroklorida BPFI. - Deteksi: Periksa di bawah sinar UV 254 nm Kromatografi Lapis Tipis - System suitability: Kromatogram yang diperoleh Menurut BP 2007: dari Larutan Standar (b) memperlihatkan 3 spot - Larutan Standar: yang jelas. (a)Larutkan 5 mg Tetracycline Hydrochloride CRS - Hasil: Spot di kromatogram, yang diperoleh dari dalam 10 ml metanol. Larutan Uji memiliki posisi dan ukuran yang mirip (b)Larutkan 5 mg Tetracycline Hydrochloride CRS, dengan spot yang diperoleh dari Larutan Standar (a 5 mg Demeclocycline Hydrochloride, dan 5 mg Oxytetracycline Hydrochloride dalam 10 ml metanol.
11
Perbedaan Tetrasiklin dan Tetrasiklin HCl • Pada Kelarutannya Tetrasiklin
: Larut 1 bagian dalam 2500 bagian air.
Tetrasiklin HCl
: Larut dalam 10 bagian air. Larutan dalam air jika dibiarkan menjadi keruh karena
pengendapan tetrasiklin • Uji Reaksi Klorida Tetrasiklin menunjukkan hasil negatif Tetrasiklin HCl meunjukkan hasil positif 3) OKSITETRASIKLIN HCL
Uji Reaksi Warna 1. 1 ml larutan 0,5% b/v + 2 tetes campuran Larutan FeCl3-Etanol (95%) (1:9) coklat tua 2. 1 mg zat + 2 ml H2SO4 P merah cerah, jika +1 ml air coklat tua keemasan. 3. 2 mg dalam 5 ml larutan Natrium Karbonat P 1,0% b/v + 2 ml Larutan Asam Diazobenzensulfonat P merah jingga intensif Gambar 14. Spektrum IR Oksitetrasiklin HCL yang mantap. 4. Menunjukkan reaksi Klorida yang positif. KCKT Spektrum Ultraviolet 1. System HX - RI 299 Dalam HCl 0,1 N puncak maks pada 268 nm dan Kolom : Lichrospher 60 RP-Select B
353 nm. Larutan 0,001% b/v dalam HCl 0,01 N pada 268 nm adalah 0,37 sampai 0,40; dan pada 353 nm
adalah 0,27 sampai 0,29. Suasana Asam—268 nm (A11=400a), 352 nm; Suasana Basa—246, 269 nm.
(125 × 4.0 mm i.d., 5 μm) dengan pre-column Lichrospher 60 RP-Select B (4 × 4.0 mm i.d., 5 μm). Fase Gerak : (A:B) triethylammonium phosphate buffer (25 mM, pH 3.0):acetonitrile. Elusi : (A:B) (100:0) to (30:70) selama 30 menit, tahan 10 menit, kembali ke kondisi semula dalam 3 menit dengan equilibrasi selama 10 menit sebelum
Gambar 13. Spektrum UV oksitetrasiklin HCL
injeksi selanjutnya. Laju alir : 1 mL/menit. Detektor : UV diode-array. 2. System HY - RI 260 Kolom : C18 Symmetry (250 x 4.6 mm i.d., 5 μm) Suhu Kolom : 40°C. 12
Spektrum IR
Fase Gerak : 0.5 mL Asam Sulfat 2.5M dalam air
Puncak pada bilangan gelombang 1616, 1584, 1665,
500 mL dan 0,5 mL Asam Sulfat 2.5M dalam
1235, 1180, 1138 cm−1
asetonitril 500 mL Detektor : UV diode-array
4) KLORTETRASIKLIN HCl Spektrum UV
Spektrum IR
10 ml larutan 0,001% b/v dalam H2SO4 1N dalam
Puncak utama pada 1622, 1580, 1666, 1311, 1041,
tabung imersikan dalam air mendidih 8 menit
1227 cm−1. Dapat muncul polimorfisme.
dinginkan, ganti air yang hilang karena penguapan;
KCKT
Serapan pada 274 nm = 0,74 - 0,76. (FI III)
System HY—RI 280 and 282
Suasana asam—266 nm (A11=386a), 359 nm;
Sistem HY (Clarke's):
Suasana basa—253, 284, 346 nm. (Clarke's)
Kolom : C18 Symmetry (250 x 4.6 mm i.d., 5 μm) Suhu Kolom : 40°C. Fase Gerak : 0.5 mL Asam Sulfat 2.5M dalam air 500 mL dan 0,5 mL Asam Sulfat 2.5M dalam asetonitril 500 mL Detektor : UV diode-array
Gambar15. Spektrum UV klortetrasiklin
4.
Golongan Linkosamid KLINDAMISIN
13
KLT Sistem TA—Rf 72;
Sistem TB—Rf 00;
Sistem TE—Rf 28;
Sistem TAE—Rf 81
KCKT Sistem HX—RI 354; Sistem HY—RI 291; Sistem HAA—retention time, 12.0 min.
Spektrofotometri UV Tidak ada absorpsi yang signifikan pada 230-360 nm.
Gambar 16. Spektrum UV Klindamisin Spektrofotometri IR
Rotasi Jenis Larutkan 1 gram Klindamisin dalam aquadest dan encerkan hingga 25,0 ml dengan pelarut yang sama (aquadest). Akan didapatkan hasil +130o sampai +150o, diukur dengan perbandingan zat anhidrat. Gambar 17. Spektrum Inframerah klindamisin Terdapat puncak pada bilangan gelombang A. 1690 cm-1(C=O), B. 1513 cm-1 (N-H), C. 1250 cm-1 (C-N), D. 1080 cm-1 (C-O eter), E. 640 cm-1 (C-Cl) 5.
Golongan Makrolida Azitromisin
14
(+) Heinsberg
(+) Legalrothera
-
(+) Diazo, Cuprifil
2 ml larutan azitromisin + 2 ml H2SO4
lalu Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Detektor: UV 210 nm dikocok sehingga warna menjadi kuning. Kolom : 4,6 mm x 15 cm yang berisi bahan pengisi - 2 ml larutan zat + 5 tetes Cu(NO 3)2 ammoniakal, L1 dengan ukuran partikel 5 mikrometer. lalu dibiarkan 5 menit, kemudian dipanaskan, Fase Gerak : campuran asetonitril P-Larutan dapar dan warna menjadi abu-abu coklat. fosfat (6:4) Spektrum IR Laju alir : lebih kurang 0,9 ml per menit. Baku pembanding yang digunakan ialah Suhu Kolom: 30o Waktu Retensi: lebih kurang 1 menit. azitromisin BPFI; biarkan hingga suhu kamar sebelum ampul dibuka. Higroskopik. Setelah dibuka, timbang segera dan buang sisa. Kecuali dinyatakan lain, tidak boleh dikeringkan sebelum digunakan.
Gambar19 . Kromatogram HPLC Azitromisin
Gambar18 . Spektrum IR Azitromisin Keterangan:
6.
1721 cm−1
: Karbonil (Ester)
1188 cm−1
: Eter
1052 cm−1
: C-OH
GOLONGAN AMINOGLIKOSIDA 1) Streptomisin Sulfat
15
Isolasi Streptomisin Sulfat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Timbang saksama sejumlah zat uji kemudian Kolom: Supelcosil ABZ alkylamide column (250 larutkan dan encerkan dengan air hingga kadar yang mm × 4.6 mm, 5 m) diinginkan. Jika dikemas dalam dosis tunggal, Suhu Kolom: 45o konstitusi zat uji dalam air untuk injeksi yang diukur Detektor : UV 205 nm saksama hingga volume yang tertera pada etiket. Fase Gerak: Larutan Na Sulfat, disodium-1Identifikasi 1. Reaksi Spesifik octanesulfat, asetonitril, dapar fosfat dalam air. Pereaksi Fe: Larutkan 5 g FeCl3 dalam 50 ml HCl Laju Alir: 1,0 ml/min 0,1 N. Pipet 2,5 ml lalu masukkan ke dalam labu Injeksi : 20 l tentukur 100 ml. Encerkan dengan HCl 0,01 N sampai tanda. Larutkan zat uji ke dalam air hingga mengandung 1 mg per ml. Ke dalam 5 ml larutan ini tambahkan 2 ml NaOH 1N dan panaskan dalam tangas air selama 10 menit. Dinginkan dalam air es selama 3 menit, tambahkan 2 ml HCl 1,2 N, campur dan tambahkan 5 ml pereaksi Fe violet. - Larutkan 0,1 g zat ke dalam 2 ml air. Tambahkan 1
Gambar 20. Kromatogram Hasil KCKT Streptomisin Sulfat
ml larutan α-naftol dan 2 ml campuran larutan NaClO dengan air (1:1) merah. - Larutkan 10 mg zat ke dalam 5 ml air dan tambahkan 1 ml HCl 1M. Panaskan di waterbath selama 2 menit. Tambahkan 2 ml larutan α-naftol dalam NaOH 1M. Panaskan di water bath selama 1 menit kuning. 2) Dihidrostreptomisin Sulfat
16
Reaksi Spesifik
Spektrofotometri Inframerah
4 mg zat dimasukkan dalam 2 ml air, tambahkan 0,5 ml HCl 0,1 N, panaskan dalam tangas air selama 20 menit. Angkat tabung dari tangas, tambahkan 1,0 ml larutan α-naftol dalam NaOH 1 N (1 dalam 200). Panaskan lagi selama 10 menit, dinginkan sebentar dalam tangas es dan tambahkan air hingga 25 ml merah. Kromatografi Lapis Tipis
Gambar21. Spektrum Serapan Inframerah
- Larutan uji: 10 mg serbuk dilarutkan dalam 10 ml
Dihidrostreptomisin Sulfat
pelarut - Larutan baku: Larutkan dihydrostreptomycin sulfate dalam 5 ml air - Fase diam: silica gel - Fase gerak: 70 g/L larutan potassium dihydrogen
Kromatografi Cair
phosphate - Volume totolan: 10 μl - Jarak elusi: 2/3 pelat - Deteksi: semprot menggunakan 2 g/L larutan 1,3dihydroxynaphthalene dalam ethanol 96 % dan 460 g/L larutan asam sulfat; kemudian dipanaskan pada 150° selama 5-10 menit - Hasil: Larutan uji mempunyai spot dengan posisi , warna dan ukuran yang sesuai dengan larutan baku.
Gambar22. Kromatogram Dihidrostreptomisin Sulfat
Perbedaan Streptomisin dan Dihidrosreptomisin
200 mg zat + metanol 2 ml + 0.1 ml H 2SO4. Panaskan sebentar. Streptomisin akan mengendap pada suhu kamar. Filtrat + asam pikrat → Kristal dengan titik leleh 283oC
Reaksi Benedict : Lar zat + NaOH + FeCl3 Violet tua Streptomisin
Ungu muda Dihidrostreptomisin 3) KANAMISIN SULFAT 17
Reaksi Spesifik
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Larutkan lebih kurang 10 mg zat dalam 1 ml air, + 1 ml lar ninhidrin P (1 dalam 500) dalam n-butanol dan 0.5 ml piridina. Panaskan di atas WB selama 5 menit dan + 10 ml air, terjadi warna lembayung (ungu) tua.
-
System Agilent 1200 Series SL, binary pump Fase gerak: 95% 0.2 mol/L TFA water, 5%
-
methanol Lajur alir 0.8 mL/menit Volume injeksi: 20 μL Kolom ZORBAX StableBond SB-C18, 4.6 mm × 150 mm, μm, Agilent p/n 866953-902
Kromatografi Lapis Tipis Syarat hasil: harga RF bercak utama Larutan uji sesuai dengan harga RF bercak utama Larutan baku dan jika terdapat bercak lain selain bercak utama pada Larutan uji tidak lebih intensif dari bercak utama Enceran larutan baku Spektrum Inframerah
Gambar 24. Analisis Kanamisin sulfat pada Agilent ZORBAX StableBond C18, 4.6 mm × 150 mm, 3.5 μm, column.
Gambar 23. Spektrum Inframerah Kanamisin Sulfat 4) Neomisin Sulfat
Reaksi Spesifik Larutkan lebih kurang 10 mg dalam 1 ml air + 5 ml H2SO4 15 N dan panaskan pada suhu 100 oC
-
Fase gerak: 170 mM TFA dalam air Gradient: isocratic Lajur alir: 0.7 ml/min Suhu: 30 °C 18
-
Volume: 50 μl Detection: ELSD, 50 °C, 4 bar nitrogen Senyawa: Neomycin sulphate B, Neomycin
xilena + 10 ml p-bromoanilina. Kocok terjadi
-
sulphate C Kromatogram:
warna merah muda terang setelah dibiarkan.
acidic sample solution
selama 100 menit, biarkan dingin, + 10 ml xilena, kocok selama 10 menit. Biarkan memisah dan enaptuangkan lapisan xilena, pada lapisan
Lar 5 mg zat dalam 1 ml air + 1 ml lar ninhidrin
(ointment)
0.2% b/v dalam butanol + 0.5 ml piridina,
1 Imp. 1
panaskan
akan
2 Imp. 2
menghasikan warna ungu. Biarkan selama 10
3 Imp. 3
menit, terpisah menjadi 2 lapisan, lapisan bawah
4 Neomycin sulphate C
berwarna merah kekuningan.
5 Neomycin sulphate B
di
WB
selama
5
menit
Kromatografi Lapis Tipis - Totolkan secara terpisah masing-masing 1 l larutan yang mengandung (1) zat uji 20 mg per ml dan (2) Neomisin Sulfat BPFI 20 mg per ml pada
lempeng
masukkan
kromatografi
lempeng
ke
silika
dalam
gel, bejana
Gambar25. Analisis Neomisin Sulfat
kromatografi berisi fase gerak campuran air-
menggunakan KCKT amonium hidroksida P-aseton P (71,5:8,5:20) Spektrum Inframerah yang dibuat segar dan biarkan merambat sampai lebih kurang tiga per empat tinggi lempeng. - Angkat lempeng, biarkan kering di udara dan panaskan pada suhu 105 selama 1 jam. Semprot lempeng dengan larutan ninhidrin P dalam butanol P (1 dalam 100), panaskan pada suhu 105O selama 5 menit. - Amati kromatogram: harga Rf
bercak merah
utama yang diperoleh dari Larutan uji sesuai
Gambar 26. Spektrum Inframerah Neomisin Sulfat.
dengan yang diperoleh dari Larutan baku. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) - Kolom: ProntoSil 120-5 C18 AQ, 250 x 4.0 mm
7.
ID Order No. 25WF184PSJ - Fase: ProntoSil 120-5 C18 AQ KLORAMFENIKOL 1) KLORAMFENIKOL
19
Spektrum IR
Gambar 27. Spektrum IR Kloramfenikol Spektrum serapan inframerah zat yang didispersikan dalam KBr menunjukan bilangan gelombang sebagai berikut: 600 – 800 cm-1 Cl 800 – 850 Subsitusi para 3100 – 3500 cm-1
-
1550 – 1640 cm-1 1640 – 1810 cm-1 C=O (Keton) 1000 – 1260 m-1 C-OH (Alkohol) - 1500 – 1650 cm-1 NO2 (Nitro Identifikasi dengan KCKT Mode : LC Detektor : UV 280 nm Kolom : 4,6 mm x 10 cm Laju alir : 1 mL/menit Volume injeksi : 10µl Efisiensi kolom : NLT 1800 plat Faktor ikutan :2 Standar deviasi relatif :1%
2) KLORAMFENIKOL PALMITAT
Reaksi Warna Identifikasi dengan KCKT Larutkan 0,2 g zat dalam 2 ml piridin, tambahkan 2 - Fase gerak : metanol asam asetat glasial dan ml dari 100 g/l larutan potassium hydroxide, dan air (127:1:27) panaskan dalam water bath warna merah - Mode : LC Spektrum UV - Detektor : UV 280 nm Dalam air 278 nm (A11=298a). Kloramfenikol Palmitat Alkohol —271 nm (A11=178a).
-
Kolom
: 3,9 mm X 30 cm
-
Laju alir
: 2 mL/menit
-
Volume injeksi : 10µL
-
Efisiensi kolom : NLT 2400 plat
-
Kriteria penerimaan
: 90-120%
Spektrum IR 20
Gambar 28. Spektrum UV Kloramfenikol Palmitat
Gambar 29. Spektrum IR Kloramfenikol Palmitat
3) Kloramfenikol Sodium Suksinat
Reaksi Warna Spektrum UV - Larutkan 10 mg zat dalam 1 ml etanol + 3 ml Deteksi menggunakan Spektrofotometer UV dengan
-
dari 10 g/l larutan calcium chloride R dan 50 panjang gelombang 254 nm. Identifikasi dengan KCKT mg serbuk Zn panaskan water-bath selama 10 Fase gerak : metanol dan 0,05 M menit. Saring larutan dan dinginkan. monobasic ammonium phosphate dengan 10% Tambahkan 0.1 ml benzoyl chloride R dan asam phosphoric hingga ph 2,5±0,1 (2:3) kocok selama 1 menit, + 0.5 ml larutan ferric Mode : LC Detektor : UV 275 nm chloride dan 2 ml chloroform R dan kocok. Kolom : 4,6 mm X 10 cm Laju alir: 1 mL/menit lapisan atas berwarna merah violet dan ungu. Volume injeksi : 10 µL Larutkan 50 mg dalam 1 ml piridin, tambahkan Efisiensi kolom : NLT 1750 plat teoritis 0.5 ml larutan sodium hydroxide dan 1,5 air. Faktor ikutan : NMT 1,2 Standar deviasi relatif: NMT 2 % Panaskan dalam water bath selama 3 menit warna merah. Tambahkan 2 ml asam nitrat dan dinginkan dengan air mengalir. Tambahkan 1 ml 0.1 M silver nitrate Terbentuk presipitat
putih. KLT Dengan menggunakan silika gel GF254 plate R. Fase gerak: dilute acetic acid R, metanol R, kloroform R (1:14:85 v/v/v). 21
4) Tiamfenikol Reaksi Warna Spektrum IR Zat ditambah H2O2 30 % dan 1 tetes FeCl30,5N, Lakukan identifikasi dengan Spektrofotometri UV lalu tambahkan HNO3 dan larutan BaCl2 0,5N akan pada panjang gelombang 254 nm. menghasilkan endapan BaSO4 bewarna putih KLT Menggunakan fase diam silika gel GF 254. Fase 8.
gerak: methanol R, ethyl acetate R (3:97 v/v). Golongan Sefalosporin Sefiksin
ISOLASI 1. Tablet siprofloxacin digerus hingga halus. 2. Timbang tablet yang telah digerus, setelah itu larutkan kedalam metanol. 3. Kocok larutan tersebut dan kemudian disaring. 4. Uapkan di waterbath hingga kering. 5. Serbuk siap diidentifikasi. Kromatografi Lapis Tipis Plate: silika gel with (2.5 × 10 cm) Fase Gerak: ethylacetat-acetone-methanol-water (5:2.5:2.5:1.5). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Sistem HAA -
Kolom : C8 Symmetry (250 × 4.6 mm i.d., 5 μm) dengan Symmetry C18 pre-column (20 mm). Suhu Kolom : 30°C Fase Gerak : (A:B) = Buffer Fosfat (pH 3.8) : Asetonitril Laju alir : 1 mL/menit untuk 6.5 menit, kemudian meningkat secara linier pada 1.5 mL untuk 6,5 hingga 25 menit dan diamkan selama 3 menit (setimbangkan kembali dengan membuat laju alir
-
pada1,5 mL/menit) Detektor : UV diode-array Waktu Retensi : 4,8 menit
22
